PT106082A - Composição fixadora para citologia, método de fixação de células e suas aplicações - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UMA COMPOSIÇÃO FIXADORA PARA CITOLOGIA QUE COMPREENDE UMA BASE ALCOÓLICA E AZUL DE TOLUIDINA, DE PREFERÊNCIA CÉLULAS MUCOSAS COMO AS CÉLULAS DA CAVIDADE ORAL E CÉLULAS DO EXO E ENDOCOLO DO ÚTERO.A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE AINDA UM MÉTODO PARA FIXAÇÃO PARA CITOLOGIA E A APLICAÇÃO DESTA COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA USO MÉDICO NOMEADAMENTE NA DETECÇÃO DE NEOPLASIAS, DE PREFERÊNCIA CANCRO NO COLO DO ÚTERO E NA CAVIDADE ORAL.

Description

Em ambiente laboratorial, as células são pós-fixadas, às vezes centrifugadas e de seguida são desidratadas e coradas (a coloração mais usada em citologia é a de papanicolau) .No final o tempo usado em laboratório é de cerca de 108 minutos por amostra. Acresce ainda o facto de serem exigentes as condições laboratoriais para processamento de amostras citológicas. Para o processamento convencional em citologia ginecológica ou não ginecológica são necessários diversos equipamentos como estufas, centrifugas, hotes, frigoríficos, bancas adaptadas, para além muito equipamento mais pequeno como cuvetes, pipetas várias, provetas, tinas de coloração, entre outros.

Actualmente, em citologia cervicovaginal ou em citologia não ginecológica são usados fixadores à base de álcool (metanol, etanol ou propanol) , num meio líquido ou sob a forma de spray. Estes fixadores fazem apenas preservação celular, não apresentam características tinturiais. Por defeito, um fixador faz apenas preservação celular. Não há registo do uso de fixadores que ao mesmo tempo acrescentem características tinturiais às células e possam por isso diferenciar os vários tipos de organelos celulares, sejam eles basófilos ou acidófilos. A composição desenvolvida, possui uma base alcoólica de tipo etanol associada ao azul de toluidina, que é um corante metacromático, ou seja, cora de forma diferenciada as estruturas basófilas e acidófilas. Assim, surge pela primeira vez, uma solução para citologia que é ao mesmo tempo um corante e um fixador. Vulgarmente, a fixação e a coloração 2 são passos diferentes na histoquímica de rotina, apresentam diferentes aplicações, são feitos por produtos diferentes e inclusivé, têm diferentes tempos de processamento. Os fixadores escolhidos podem ser muito diferentes (formol, metanol, etanol, propanol, bouin, gelo, ar) e os corantes apresentam um espectro muito alargado, sendo os mais usados a hematoxilina, a eosina ou o Orange. Por serem até agora considerados incompatíveis, os corantes e os fixadores não se misturam na histoquímica convencional. A composição agora proposta, rompe de forma inequívoca com estes conceitos e torna real pela primeira vez a associação numa mesma composição um fixador (etanol) e um corante (azul de toluidina). Uma associação como aquela que agora se propõe, nunca foi tentada com sucesso até agora.

No âmbito da química de laboratório aplicada ao diagnóstico em geral e à citologia em particular, nunca se entendeu possível que um corante e um fixador, associados, fossem capazes de produzir a sua acção de forma complementar e sinérgica. De facto, as variáveis em jogo são muitas e difíceis de conciliar (pH, solubilidade, temperatura, tipo de célula, organelos, objectivos de diagnóstico, tempo, entre outras) . Talvez por isso, fosse tida como uma tarefa até agora impossível. Por tudo isto, a solução agora desenvolvida é inovadora desde logo no seu conceito. Concilia e potência as características químicas dos principais produtos envolvidos sem perder o sentido prático da sua aplicação. Permite o diagnóstico de todos os tipos celulares, com elevada qualidade, diferenciação das estruturas e com um 3 tempo de execução rápido. Desta forma, obtemos ao mesmo tempo fixação e coloração.

Assim, consegue-se em cerca de 1 minuto ter uma amostra pronta a ser visualizada por contraponto com os 60 minutos até agora necessários. Este processamento rápido, pode ser realizado por qualquer profissional não treinado desde que siga as instruções que se anexam ao produto (ao contrário do processamento clássico). A composição agora desenvolvida, ao contrário da técnica já existente é bastante económico, é universal, não exige equipamento sofisticado, é rápido e não precisa de ser usado em ambiente laboratorial, não necessita de técnicos diferenciados e permite o seu uso em locais inóspitos, com poucos recursos técnicos e humanos. Acresce ainda que possui boas qualidades fisico-quimicas. Não se altera facilmente com as variações térmicas, é pouco sensivel à luz, o seu pH é estável, permitindo um transporte fácil e sem riscos, um armazenamento pouco exigente e uma preservação por períodos prolongados de tempo.

Pelos seus componentes, este fixador torna-se bastante competitivo uma vez que é barato e de fácil preparação. Pelas suas características de preservação celular o álcool escolhido é o álcool etílico ou etanol, cuja fórmula química é C2H5OH. Este álcool é bastante miscível em água. A combinação numa só composição com características de fixação e coloração é totalmente inovadora e nunca até agora foi tentada com sucesso. Trata-se de uma mais-valia para o mercado, revolucionando definitivamente a forma de tratamento 4 de células com vista à triagem ou ao diagnóstico. É aplicável a todos os tipos celulares, a qualquer ser vivo animal à escala planetária.

Esta composição é totalmente nova uma vez que o azul de toluidina nunca foi usado em soluções fixadoras, nem é usado habitualmente em soluções de tipo alcoólico e muito menos em adição ao ácido acético.

Comparação da técnica clássica usada e a agora proposta com uma nova composição fixadora: Técnica clássica (coloração de papanicolau): A coloração de papanicolau é considerada como padrão internacional de coloração cérvico-vaginal, podendo ser usada igualmente em outros materiais. As amostras são fixadas em álcool etílico, isopropílico ou polietilenoglicol. 0 material fixado em lâmina é submetido á acção de uma série de diluições de etanol, seguido de um corante e posteriormente novamente sobre a acção de álcoois e corantes citoplasmáticos. Finalmente é submetido á acção de um desidratante de álcool e xilol, de acordo com os tempos apresentados de seguida.

Materiais necessários: fixador citológico, ácido clorídrico, hidróxido de amónio, cubas para coloração, pipetas graduadas, álcool absoluto, xilol, cronómetro, tinas de coloração.

Coloração: • Álcool absoluto - 5' • Álcool a 95% - 5' 5 • Álcool a 70% - 5' • Água destilada - 5' • Hematoxilina - 2' • Água destilada - 10' • Álcool amoniacal - 5' • Água corrente - 10' • Álcool a 70% - 5' • Álcool a 95% - 5' • Álcool absoluto - 5' • OG-06 - 1' • Álcool absoluto - 10' • Álcool absoluto - 10' • EA-36 - 2' • Álcool absoluto - 10' • Álcool absoluto - 10' • Xilol - 1' • Xilol - 1' • Xilol - 1' • Tempo total: 108 minutos Sumário da invenção A composição fixadora descrita na presente invenção pretende desenvolver uma composição e método inovadores para fixação em citologia tornando este processo mais expedito permitindo de forma mais eficaz a detecção de anomalias células, preferencialmente neoplasias.

Esta composição permite: 6 preferência um ácido fraco tal como acético e/ou água destilada.

Numa realização ainda mais preferencial a base alcoólica da composição objecto da presente invenção, poderá ser etanol.

Numa realização mais preferencial da composição objecto da presente invenção a qual compreende • 80-99,5% p/v base alcoólica e • 0,5-20 % p/v azul de toluidina.

Ainda mais de preferência 98,5% p/v base alcoólica e 1 % p/v azul de toluidina, 0,5 % p/v de ácido acético.

Numa outra realização preferencial da presente invenção as células fixadas são células mucosas, de preferência células da cavidade oral e células exo e endocolo do útero. A presente invenção descreve ainda o método de fixação caracterizado por compreender os seguintes passos: • colocação de amostra de células numa lâmina, de preferência esfregaço; • secagem da lâmina; • aplicação das composições descritas nas reivindicações 1-8; • lavagem com água corrente; • observação das células.

Numa realização preferencial da presente invenção em que a composição pode ser usada para detecção e determinação do estado da amostra celular, nomeadamente detecção de 8 neoplasias como por exemplo na detecção de cancro no colo do útero e na cavidade oral. A presente invenção descreve ainda o método de obtenção da composição fixadora que compreende os seguintes passos: a) diluição do pó de azul de toluidina com álcool, agitando; b) diluição do ácido acético; c) mistura das soluções de ácido acético e do corante com agitação; d) acondicionamento do fixador.

Descrição Geral da Invenção A composição fixadora para citologia descrita nesta invenção, faz num mesmo passo a fixação e a coloração das células. A base alcoólica (álcool etílico) permite a fixação celular e a presença do corante azul de toluidina permite a coloração com uma boa definição celular. Pode também ser adicionado ácido acético de forma a aumentar o poder de fixação. Esta composição permite a obtenção da amostra para análise em um minuto. É aplicado sobre a lâmina, que de seguida é passada por água corrente de forma rápida, atingindo todo o procedimento um tempo total surpreendentemente reduzido de um minuto.

Descrição Detalhada da Invenção A novidade da presente invenção reside, essencialmente, no facto da composição fixadora para citologia descrita permitir ao mesmo tempo a coloração e fixação das células, ou seja, a sua definição celular permitindo o diagnóstico. Por 9 consequência, há uma significativa simplificação de procedimentos com encurtamento de tempos e colossal diminuição de custos. Ao mesmo tempo é inovadora a aplicação do corante azul de toluidina à citologia quer ginecológica quer não ginecológica. Até agora o azul de toluidina era usado essencialmente como marcador intraoral, para auxiliar na técnica de biópsia. 0 efeito da utilização da composição fixadora da presente invenção é de que permite, em cerca de 1 minuto, ter uma amostra pronta a ser visualizada.

Obtenção da composição fixadora: A composição fixadora é baseada numa solução alcoólica de azul de toluidina. Deve iniciar-se em primeiro lugar a pesagem do azul de toluidina que é comercializado em pó. O azul de toluidina é diluído a 1% numa solução de álcool a 70% (por exemplo, adiciona-se lg de azul de toluidina a 100 ml de álcool etílico a 70%). A preparação do álcool etílico a 70% é efectuada diluindo 30% de água destilada em 70% de álcool absoluto. Pode também ser adicionado ácido acético, diluindo-o a 0,5% em água destilada.

Etanol ou álcool comum (C2H5OH) : O etanol usado, conhecido simplesmente por álcool, ou álcool etílico ou álcool dos cereais, cuja fórmula química é C2H5OH, é o mais comum dos alcoóis. É incolor, miscível em água, apresenta uma densidade de 0,789gcrtf3, um ponto de fusão de -114,3°c e um ponto de ebulição de 78,4°c. 10 Ácido acético ou ácido etanóico (C2H4O2) : É um ácido fraco (pH de 4,76 a 25°C) , apresenta um ponto de fusão a 16,5°C e ponto de ebulição de 118,1°C. É um fixador histológico que habitualmente é usado na preparação da solução de Bouin. 0 azul de toluidina ou cloreto de tulônio (C15H16CIN3S) : 0 azul de toluidina, é um derivado do toluol. Apresenta uma solubilidade de 30g/l (25°c), um pH de 2,8 (água a 25°c), uma massa molecular de 305,82g/mol, é inodoro e de transporte não perigoso. É um corante metacromático que cora de róseo o RNA e de azul o DNA. A preparação do azul de toluidina que é comercializado em pó (vulgarmente em frascos de 25g), começa com a sua pesagem numa balança digital, devidamente calibrada. Após a pesagem de lg de azul de toluidina, este é diluído em 100 ml de etanol a 70%, previamente medidos numa proveta graduada. Esta mistura acontece de forma fácil, necessitando apenas de uma leve agitação. Numa outra proveta graduada, prepara-se uma solução de ácido acético a 0,5% diluído em água destilada. De seguida, retira-se da primeira proveta com a solução alcoólica a 1% de azul de toluidina 99,5 ml da solução a que se acrescenta, da segunda proveta, 0,5 ml da solução a 0,5% de ácido acético. Após agitar, obtemos esta nova composição fixadora pronto a ser usado. Desta forma, aproveitando a miscibilidade do etanol, a solução final está apta a exercer a sua função bivalente de fixador e corante. 11

Como os procedimentos são simplificados, há ao mesmo tempo uma proporcional redução das condições exigidas. Tornam-se desnecessários equipamentos sofisticados ou laboratórios complexos que consomem grandes recursos materiais e humanos. A composição fixadora desenvolvida permite a execução técnica em lugares remotos e por profissionais pouco diferenciados, ao contrário do que acontece até agora. Tornam-se agora viáveis planos de rastreio em grande escala, em locais remotos e sobretudo acessíveis porque são facilmente viabilizados com poucos recursos económicos. No âmbito da clinica, os profissionais podem eles próprios possuir um kit, (teste portátil), que inclui a composição e dessa forma, assegurar aos seus pacientes um despiste de patologias potencialmente graves, que de acordo com o seu enquadramento permitem ainda um auxilio à distância via email ou sms, com recurso a um computador ou telemóvel. A composição fixadora permite assim, um excelente contorno celular, evidencia bem o núcleo das células mucosas e as suas membranas. No núcleo o RNA cora de róseo e o DNA de azul. As membranas nucleares e celulares coram igualmente de azul intenso, que contrasta com o citoplasma que fica azul mais claro. Assim, é possível observar a célula perfeitamente diferenciada, clarificando os critérios de malignidade e de intervenção clínica.

Até agora, em locais remotos ou longe dos grandes centros, no interior de Portugal ou numa província de África, não era possível fazer planos de rastreio citológico por rotina ou ter acesso à visualização de uma qualquer citologia em apenas 12 1 minuto. Era preciso enviar amostras para locais distantes, para laboratórios bem equipados o que tornava impraticável muitas vezes o diaqnóstico ou pelo menos inibia bastante a sua concretização. Não menos relevante, são seguramente os custos associados a um qualquer simples procedimento para amostras citológicas.

Com esta nova composição, surge uma solução simples, rápida e económica de todo o processo. No fim, a mais-valia está do lado das pessoas, da sua saúde, no seu acesso. Torna-se possivel chegar a uma triagem ou diagnóstico em qualquer lugar do mundo, de forma fácil e cómoda, simplificado procedimentos e aproximando a medicina das populações em geral e dos mais frágeis em particular.

Com esta nova composição, foram já ensaiados vários trabalhos científicos tendo por objectivo a demonstração prática da sua utilidade e inovação. Assim, montamos um estudo em amostras citológicas provenientes da cavidade oral ou de esfregaços ginecológicos. Neste trabalho já efectuado, concluímos que em 100% dos casos, as amostras celulares ficaram bem fixadas e coradas com esta nova composição fixadora, demonstrando de forma clara a sua ambivalência para citologia ginecológica e não ginecológica. Foram ainda efectuados processamentos por indivíduos treinados e na sua maioria por indivíduos não treinados (estudante e voluntários), que aplicaram o protocolo descrito que acompanha a composição fixadora.

Foram recolhidas 500 amostras citológicas, 300 provenientes de células da cavidade oral, incluindo amostras de saliva e 13 200 de tecidos do exo e endocolo do útero. As amostras foram processadas por cerca de 200 pessoas diferentes, entre os quais se incluem 10 profissionais, com treino especifico de âmbito clinico e laboratorial.

Descrição dos procedimentos (esfregaço): • Recolha da amostra; • Aplicação da amostra na lâmina como esfregaço; • Secagem da lâmina ao ar - 1 minuto; • Aplicação da composição descrita na lâmina - 1 minuto; • Lavagem em água corrente - passagem rápida; • Observação e leitura. O processamento das amostras pode ser feito em esfregaço ou colocada a amostra em meio liquido fixador e enviado ao laboratório. No caso de se optar pelo envio ao laboratório, poderá opcionalmente e de forma complementar proceder-se também á visualização da amostra em esfregaço com a técnica que abaixo de descreve (opcional).

Descrição dos procedimentos (esfregaço e meio líquido): • Recolha da amostra; • Aplicação da amostra na lâmina como esfregaço e em meio liquido; • Rotulagem do meio liquido e envio ao laboratório; • Secagem da lâmina ao ar - 1 minuto; • Aplicação da composição descrita na lâmina - 1 minuto; • Lavagem em água corrente - passagem rápida; • Observação e leitura. 14 A presente invenção não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral da invenção, tal como definido nas reivindicações.

As realizações acima descritas são todas combinadas entre si de forma trivial.

As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção.

Lisboa, 4 de Janeiro de 2012 15

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição fixadora para citologia caracterizada por compreender os seguintes elementos: • uma base alcoólica e • azul de toluidina.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por ser constituida por uma base alcoólica e azul de toluidina.
3. 3. Composição de acordo com as reivindicações anteriores caracterizada por a base alcoólica ser etanol.
4. 4. Composição fixadora de acordo com as reivindicações anteriores caracterizada por compreender: • 80-99,5% p/v base alcoólica e • 0,5-20 % p/v azul de toluidina.
5. 5. Composição fixadora de acordo com as reivindicações anteriores caracterizada por compreender adicionalmente um ácido, de preferência um ácido fraco tal como acético.
6. 6. Composição de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por compreender ainda água destilada.
7. 7. Composição de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por as células fixadas serem células mucosas, de preferência células da cavidade oral e células exo e endocolo do útero. 1
8. 8. Composição de acordo com as reivindicações 1-3 caracterizado por compreender: • 98,5% p/v base alcoólica e • 1 % p/v azul de toluidina • 0,5 % p/v de ácido acético.
9. 9. Método para fixação de citologia caracterizado por compreender os seguintes passos: • colocação de amostra de células numa lâmina, de preferência esfregaço; • secagem da lâmina; • aplicação das composições descritas nas reivindicações 1-8; • lavagem com água corrente; • observação das células.
10. 10. Utilização da composição descrita nas reivindicações 1-8 e do método descrito na reivindicação 9 caracterizada por ser usada para detecção e determinação do estado da amostra celular.
11. 11. Utilização da composição descrita nas reivindicações 1-8 e do método descrito na reivindicação 9 caracterizada por ser usada para uso médico.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por ser usada na detecção de neoplasias. 2
13. 13. Utilização de caracterizado por ser usada útero e na cavidade oral. acordo com na a detecção reivindicação 11 de cancro no colo do Lisboa, 4 de Janeiro de 2012 3