WO2016163345A1

WO2016163345A1 - 核酸プローブ

Info

Publication number: WO2016163345A1
Application number: PCT/JP2016/061076
Authority: WO
Inventors: 義一栗原; 武寿磯田; 満関口
Original assignee: コニカミノルタ株式会社
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2016-04-05
Publication date: 2016-10-13
Also published as: JP6766804B2; JPWO2016163345A1

Abstract

[課題]本発明は、ＦＩＳＨ等を行う際に所定の長さを持つリンカーを導入したプローブを利用することで、蛍光体集積ナノ粒子との反応性を向上させることを可能にし、高精度・高感度に検出をおこなうことのできる核酸プローブを提供することを目的とする。 [解決手段]１種類または２種類以上のリンカーのうち少なくとも１種類の長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるリンカーを介してリガンドと結合しており、さらに蛍光体集積ナノ粒子がリガンドと特異的に結合可能な結合物質と結合していることで、リガンドと結合物質を介して蛍光体集積ナノ粒子と結合する核酸プローブ。

Description

核酸プローブ

　本発明は、染色体上の遺伝子に結合（ハイブリダイズ）する反応性部位を有する核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子がリンカーを介して結合しているＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等に用いられる核酸プローブ、およびこれを用いたＦＩＳＨを行う方法に関する。

　遺伝子のマッピングや染色体異常の検出など組織切片中の特定の遺伝子の検出において用いられる方法の一つであるＦＩＳＨは、蛍光物質などで標識した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を有する核酸をプローブとして用い、目的の遺伝子とハイブリダイゼーションさせ蛍光顕微鏡で検出する手法である。

　プローブを標識するために通常の蛍光色素を用いた場合では蛍光褪色による定量性低下の問題が生じることがある。そのため、酵素による蛍光・発光の増感などが行われているが、酵素の組織切片への非特異吸着などによる非特異の蛍光が問題となっている。そのような中で蛍光体集積ナノ粒子は蛍光増感手段の一つの選択肢となっている。

　特許文献１には、蛍光ナノ粒子の表面に抗体などを直接修飾すると、その蛍光特性に変化を生じることから、蛍光体集積ナノ粒子と抗体の間に二官能性ＰＥＧリンカーを導入することで、抗体などの特異的結合部分の特異性を保ちながら、蛍光体ナノ粒子の望ましい光物理学特性（光安定性および量子収率のような）を維持することを可能にする発明について記載されている。しかしながら、アビジンやビオチンを介してプローブと蛍光ナノ粒子が結合するという記載はない。

　特許文献２には、アビジン・ビオチン相互作用または抗原・抗体反応を介してプローブ（核酸）にナノ粒子を結合させたことを特徴とするナノ粒子標識プローブが開示されている。当該文献には、ナノ粒子としては金属ナノ粒子（金コロイド粒子）または半導体ナノ粒子が例示されており、また、ナノ粒子に直接プローブを結合させるのではなく、抗原・抗体またはアビジン・ビオチンを介在させることによって、ナノ粒子とプローブとの間の距離を広げ、固相法で反応効率が落ちるのを抑えるとともに、ナノ粒子の反応性（発光効率）やプローブの反応性（標的とする核酸へのハイブリダイゼーション）が低下するのを防ぐことができると示唆されている。しかしながら当該文献の実施例には、金コロイド粒子にＰＥＧを介して抗ＦＩＴＣ抗体やストレプトアビジンを結合させる実施形態は開示されているが（実施例１，３）、プローブの方には５’末端にＦＩＴＣ（抗原）やビオチンを結合させることが開示されているのみであり（実施例２，４）、プローブとＦＩＴＣ（抗原）やビオチンとの間にＰＥＧを介在させるような実施形態は開示されていない。また、当該文献に記載の発明は主に基板状の測定部材を用いる固相法におけるハイブリダイゼーションが想定されており、組織切片等を対象とするＦＩＳＨに用いることは記載されておらず、蛍光標識体として蛍光体集積ナノ粒子を用いることも記載されていない。

　なお、出願人は、蛍光体集積ナノ粒子と核酸分子とが結合する核酸プローブに係る発明について先に出願している（出願番号：特願２０１４－０５８２７１、出願日：平成２６年３月２０日）。当該出願に係る明細書には、ストレプトアビジンおよびビオチンの特異的結合を介して蛍光体集積ナノ粒子と核酸分子とを結合させる実施形態が開示されているが、核酸分子とストレプトアビジンとの間にリンカーを介在させることについては記載されていない。

特表２００８－５４１０１５号公報特開２００８－２９５３２６号公報

　本発明者は、ＦＩＳＨを行う際に、ビオチン等を直接結合させた核酸プローブと、アビジン等を結合させた蛍光体集積ナノ粒子を用いて、目的遺伝子を蛍光標識する場合、その標識効率、すなわち核酸プローブと蛍光体集積ナノ粒子との反応性が十分ではなく、改善の余地があることを見出した。

　本発明は、上記課題を解決するため、蛍光体集積ナノ粒子との反応性が高く、検出精度にすぐれた核酸プローブ、およびこれを用いたＦＩＳＨを行う方法を提供することを目的とする。

　本発明者は、核酸プローブとビオチン等のリガンドとを、ある程度の長さを有するリンカーを用いて結合することにより、上記のような課題を解決できることを見出した。すなわち、本発明は次のような核酸プローブおよびそれを用いたＦＩＳＨの方法を提供する。

　上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した核酸プローブは、蛍光体集積ナノ粒子に結合した結合物質に対して特異的に結合するリガンドにより、長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるリンカーを介して修飾されている核酸プローブである。

　上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したＦＩＳＨを行う方法は、検体が有する染色体上の遺伝子に対して、上記核酸プローブを特異的に結合させるハイブリダイゼーション工程、
　前記検体を洗浄処理する工程、
　遺伝子に結合した前記核酸プローブが有するリガンドに対して、蛍光体集積ナノ粒子に結合した結合物質を結合させて、染色体上の遺伝子を蛍光標識する工程、
を含むＦＩＳＨを行う方法である。

　上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した別のＦＩＳＨを行う方法は、蛍光体集積ナノ粒子と結合している核酸プローブを染色体上の遺伝子に対して結合させるハイブリダイゼーション工程を含む、ＦＩＳＨを行う方法である。

　本発明の核酸プローブを用いることで、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子の標識率を上げることができ、それによって安定的に強い蛍光シグナルを得ることが可能となる。

図１は、本発明の第１の実施形態に係る核酸プローブを用いて、ＦＩＳＨをしている状態を説明した図である。図２は、本発明の第２の実施形態に係る核酸プローブを用いて、ＦＩＳＨをしている状態を説明した図である。図３は、本発明の第３の実施形態に係る核酸プローブを用いて、ＦＩＳＨをしている状態を説明した図である。図４は、本発明の第４の実施形態に係る核酸プローブを用いて、ＦＩＳＨをしている状態を説明した図である。図５は、蛍光体集積ナノ粒子と結合物質とに高分子を結合させて、蛍光体集積ナノ粒子と結合物質との間にスペーサーを介在させる態様における核酸プローブを用いて、ＦＩＳＨをしている状態を説明した図である。図６は、本発明に係るＦＩＳＨに基づく生体物質の定量方法の全行程の一例を示すフローチャートである。図７は、実施例１にて作成したプローブを用いて実施例３に基づくＦＩＳＨを行った際の蛍光顕微鏡で取得した画像について示した図である。図８は、実施例２にて作成したプローブを用いて実施例３に基づくＦＩＳＨを行った際の蛍光顕微鏡で取得した画像について示した図である。図９は、比較例１にて作成したプローブを用いて実施例３に基づくＦＩＳＨを行った際の蛍光顕微鏡で取得した画像について示した図である。

　以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。

　（核酸分子）
　核酸分子は、染色体上の特定領域の一部または全部を含む配列（プローブ配列）を有する核酸分子である。核酸分子にはＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ノンコーディングＲＮＡなど）等の天然に存在する核酸やＰＮＡ、ＬＮＡ（又はＢＮＡ:ＢｒｉｄｇｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（架橋構造型の核酸分子））等の人工核酸が含まれる。したがって、核酸分子は、染色体上の核酸配列と相補鎖を形成できるものであれば制限がない。核酸分子は、天然の核酸、人工核酸、または天然の核酸と人工の核酸とが連結した核酸の分子であってもよい。これら核酸のなかの中でも、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡが特に好ましい。

　（プローブ）
　プローブとしては、ＨＥＲ２等のバイオマーカー遺伝子の検出に関連する染色体上の核酸配列の全部または一部が好適に用いられる。バイオマーカーとしては、診断用バイオマーカー、疾患段階を判断するバイオマーカー、疾患予後バイオマーカー、および治療処置に対する反応を見る目的のモニター用バイオマーカー等がある。例えば、癌の増殖や分子標的薬の奏効率に関係する遺伝子として、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｐ５３、ＭＥＴなどが挙げられる。さらに、癌関連遺伝子として知られている遺伝子として、以下のものが挙げられる。チロシンキナーゼ関連遺伝子として、ＡＬＫ、ＦＬＴ３、ＡＸＬ、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３、ＤＤＲ１、ＦＭＳ（ＣＳＦ１Ｒ）、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ４（ＥＲＢＢ４）、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ１、ＩＮＳＲ、ＥＰＨＡ２、ＩＲＲ（ＩＮＳＲＲ）、ＥＰＨＡ３、ＫＩＴ、ＥＰＨＡ４、ＬＴＫ、ＥＰＨＡ５、ＭＥＲ（ＭＥＲＴＫ）、ＥＰＨＡ６、ＭＥＴ、ＥＰＨＡ７、ＭＵＳＫ、ＥＰＨＡ８、ＮＰＭ１－ＡＬＫ、ＥＰＨＢ１、ＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲＡ）、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲＢ）ＥＰＨＢ３、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＲＯＮ（ＭＳＴ１Ｒ）、ＦＧＦＲ１、ＲＯＳ（ＲＯＳ１）、ＦＧＦＲ２、ＴＩＥ２（ＴＥＫ）、ＦＧＦＲ３、ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１）、ＦＧＦＲ４、ＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＴＲＫＣ（ＮＴＲＫ３）が挙げられる。また、乳がん関連の遺伝子としてＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ３、ＣＣＮＤ１、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ｐ５３、ＰＴＥＮが挙げられる。カルチノイド腫瘍に関連する遺伝子として、ＢＣＬ２、ＢＲＤ４、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＨＥＳ１、ＭＡＰ２、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＴ、ＲＡＦ、ＳＤＨＤ、ＶＥＧＦＡが挙げられる。大腸がん関連遺伝子として、ＡＰＣ、ＭＳＨ６、ＡＸＩＮ２、ＭＹＨ、ＢＭＰＲ１Ａ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＰＭＳ２、ＫＲＡＳ２（Ｋｉ－ｒａｓ）、ＰＴＥＮ、ＭＬＨ１、ＳＭＡＤ４、ＭＳＨ２、ＳＴＫ１１、ＭＳＨ６が挙げられる。肺がん関連の遺伝子としては、ＡＬＫ、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１、ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＥＭＬ４、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ２、ＴＰ５３、ＭＹＣが挙げられる。肝臓がん関連の遺伝子としては、Ａｘｉｎ１、ＭＡＬＡＴ１、ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ、ｐ１６　ＩＮＫ４Ａ、ｃ－ＥＲＢＢ－２、ｐ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ＳＭＡＤ２、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＩＧＦＲ２、ＴＣＦ１、ＫＲＡＳが挙げられる。腎臓がん関連遺伝子として、Ａｌｐｈａ、ＰＲＣＣ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＰＳＦ、ＣＬＴＣ、ＴＦＥ３、ｐ５４ｎｒｂ／ＮＯＮＯ、ＴＦＥＢが挙げられる。甲状腺がん関連遺伝子として、ＡＫＡＰ１０、ＮＴＲＫ１、ＡＫＡＰ９、ＲＥＴ、ＢＲＡＦ、ＴＦＧ、ＥＬＥ１、ＴＰＭ３、Ｈ４／Ｄ１０Ｓ１７０、ＴＰＲが挙げられる。卵巣がん関連遺伝子として、ＡＫＴ２、ＭＤＭ２、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＢＲＣＡ１、ＮＣＯＡ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ｐ５３、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＧＡＴＡ４、ＲＢ、ＨＲＡＳ、ＲＥＴ、ＫＲＡＳ、ＲＮＡＳＥＴ２が挙げられる。前立腺がん関連遺伝子として、ＡＲ、ＫＬＫ３、ＢＲＣＡ２、ＭＹＣ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＫＸ３．１、ＥＺＨ２、ｐ５３、ＧＳＴＰ１、ＰＴＥＮが挙げられる。骨腫瘍関連遺伝子として、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＮＢＰ、ＯＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＨＲＡＰ３、ＣＯＬ４Ａ５、ＵＳＰ６が挙げられる。

　染色体上の特定の遺伝子のコピー数をＦＩＳＨで検出する場合、プローブは、検出する染色体上の特定領域にある特異的な配列を含むように設計することが好ましく、特異的な配列を抽出するためには公開されているデータベース、たとえば「ＨＤ　ＦＩＳＨ」（http:///www.hdfish.eu./Find_probes.php）を用いることができる。また、スプライシング前のイントロンを含むゲノム配列を考慮してプローブを設計する必要がある。検出対象の遺伝子を含むゲノム配列の入手方法としては、例えば公開されている遺伝子のデータベースDDBJ （DNA Data Bank of Japan）および「Cancer cell lines BACS」等を用いて検索することにより入手することができる。

　染色体上の通常の構造遺伝子のコピー数をＦＩＳＨで検出する場合、プローブについては、ｉｎｄｅｌ, ＶＮＴＲ（Variable Number of Tandem Repeat:反復配列多型）、マイクロサテライト等の、コピー数が多型となっている遺伝子配列部分を含めないことが好ましい。例えば、ヒト（２ｎ＝４６）の細胞において、一つの細胞（核）あたりの通常の遺伝子のコピー数は１～２であるため、蛍光体の輝点の数から推定されるコピー数が３以上の場合は当該遺伝子が増幅する染色体の異常が起きており、逆にそのコピー数が０の場合は当該遺伝子が欠損する染色体の異常が起きていると判断することができる。上述したような多型の遺伝子の配列をプローブに含めると、蛍光体の輝点の数が目的とする特定の遺伝子のコピー数と一致しなくなり、上述したようなコピー数の検出に支障をきたす。

　核酸分子の入手方法については、核酸分子の塩基数が数十塩基であれば、プローブ配列を含む核酸分子の配列のデータを提出してフナコシ等の核酸合成受託サービスに依頼して核酸分子を入手することが好ましい。一方、核酸分子の塩基数が多い場合（例えば１０００塩基を超える場合）は上記のように合成することも可能であるが時間がかかるため、ＤＮＡの塩基配列のシークエンスを行って正しく核酸分子が形成されているか確認することを前提に例えば以下のようにして行ってもよい。

　一つの様態として、検出対象の生物のゲノムＤＮＡに含まれるプローブ配列部分を挟みこむようにプライマーを設計および合成し、このプライマーのセットを用いてゲノムＤＮＡ等に対して複製精度の高いｐｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法を行う。次に、ＰＣＲの反応溶液を電気泳動により分離し、目的の核酸分子の長さに相当するバンドを切り出して核酸精製キット（ＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ等のキット）を用いて溶出することにより、目的の核酸分子を入手することができる。

　（リンカー）
　核酸プローブと後述するリガンドを結合するリンカーを形成するための高分子としては、所定の長さを有する疎水性高分子や親水性高分子、およびこれらの組合せが好適に用いられる。リンカーは１種類（単一）の物質から形成されていてもよいし、２種類以上の物質から形成されていてもよい。

　ここで、「２種類以上の物質から形成されたリンカー」とは、単一の物質から形成されたリンカーを２種以上含むことを意味する。

　また、本願明細書において、「単一の物質」とは、１つの名称および化学式（繰り返し単位を含む一般式）で表記されうる化合物または化合物群を意味し、繰り返し単位数（例；ポリオキシエチレン単位数）の多少を問わない。例えば、ある商品名（商標）で市販されている高分子化合物について、平均分子量（繰り返し単位数）の異なる複数のバリエーションがあったとしても、それらは単一の物質とみなす。

　疎水性高分子の例としては、後述する所定の長さを有する、ポリアミド、飽和炭化水素、疎水性ポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリメタクリル酸エステル等が挙げられる。

　親水性高分子の例としては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、フィコール（登録商標）（エピクロロヒドリンでスクロースを共重合した、側鎖に富んだ中性の親水性ポリマー）、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸、およびこれらに類する物が挙げられる。

　これらのリンカーの中では、親水性高分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、非特異的吸着を抑制することができる点、またオキシエチレン単位の数により鎖長を設定しやすい点から好ましい。

　また、複数の種類のリンカーを用いることにより、核酸プローブと蛍光体集積ナノ粒子との反応性が安定的なものになり得る。蛍光体集積ナノ粒子の粒子表面が疎水性である場合、親水性であるＰＥＧのみをリンカーとして用い、核酸分子に該リンカーを介してビオチン標識すると、リンカーであるＰＥＧと粒子表面の両者が接触しにくくなる結果、粒子表面に結合されたアビジンと、結合反応するビオチンの量が少なくなる可能性が考えられ、そのために蛍光体集積ナノ粒子の表面の疎水性の程度に応じて、多少疎水性の高分子を混ぜることにも効果があると推測される。

　リンカーとしてＰＥＧを用いる場合は、例えばサーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermofisher scientific）社等の市販のものを購入したり、化学構造の繰り返しの単位の数を設定して、試薬メーカー等に製造を依頼したりすることで任意の長さのものを入手することができる。

　図１～図２に例示したように、ある核酸プローブに結合するリンカーは全て単一の長さのものであってもよいし（図１参照）、またそれぞれ異なった２種類以上の長さを有するリンカーを併用してもよい（図２参照）。

　特に、リンカーが２種類以上の長さを有する場合には、蛍光体集積ナノ粒子同士が立体障害などに起因する結合障害等により相互に干渉することなく核酸プローブに効率よく結合することが可能であるため、より好ましい。

　ここで、リンカーとしてある商品名（商標）で市販されている高分子化合物を用いる場合、その製品のうち特定の平均分子量の表示の下に販売されている製品に含まれる高分子化合物は、分子量（繰り返し単位数）にある程度の分布はあるが、「単一の長さ」を有するリンカーとみなす。したがって、そのような製品のうち、ある平均分子量（数平均分子量または重量平均分子量）の表示の元に販売されている製品を第１のリンカーとして用い、それとは異なる平均分子量の表示の元に販売されている製品を第２のリンカーとして用いた場合は、「２種類の長さを有する」リンカーを介して、核酸プローブをリガンドで修飾したということになる。高分子化合物についての分子長は、繰り返し単位に係る原子間の距離（例えばＰＥＧであればＣ－ＣおよびＣ－Ｏの距離）および繰り返し単位数から推定することができる。このような分子量（繰り返し単位数）にある程度の分布がある高分子化合物の集合体をリンカーとして用いる場合、その集合体の少なくとも一部の分子、好ましくは半分以上の分子、より好ましくは大部分の分子（８０％以上）の長さが、本発明で規定する所定の範囲内にあればよい。高分子化合物の分子量が平均分子量であると仮定した場合の長さ（平均分子長）が、本発明で規定する所定の範囲内にあれば、上記のように、集合体の少なくとも一部の分子の長さ、好ましくは半分以上の分子の長さが、本発明で規定する所定の範囲内にあるとみなせる。

　単一の長さのリンカーを用いる場合、リンカーは１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のものを使用する。

　上記リンカーとしては、核酸プローブを蛍光体集積ナノ粒子により好適に標識することができる観点から、７０ｎｍ以上９０ｎｍ以下のリンカー、例えば平均分子量が約１０，０００のＰＥＧ（推定される平均分子長は約８０ｎｍ）が好ましい。

　２種類以上の長さを有するリンカーを用いる場合、そのうちの少なくとも１種類のリンカーは長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のものを使用する。このとき、上記したような蛍光体集積ナノ粒子と核酸プローブの結合における立体障害を抑制する観点から、他のリンカーの長さは０．１ｎｍ以上１０ｎｍ未満であることが好ましく、７ｎｍ以上９ｎｍ以下のものがより好ましい。

　（リンカーとリガンド間の結合）
　リンカーと後述するリガンドとの結合は、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着等の適当な結合様式による結合であり、特に結合力の強さの観点から、アミド結合、エステル結合、イミド結合、マレイミド基へのチオール付加を利用した結合等の共有結合が好ましい。

　リンカーは、例えば、上記高分子の両端にそれぞれ核酸プローブおよびリガンドに結合反応する官能基（例えば、マレイミド基、アミノ基、チオール基等）をそれぞれ導入したものが好ましい。

　上記高分子に官能基を導入する方法としては、アミド化反応等が挙げられるが、特に限定されず、公知の方法で行うことができる。また、市販の官能基を導入した高分子を用いても良い。リンカーの両末端に導入されている上記のような官能基（例えば、ＮＨＳ基等）と、リガンド、核酸プローブのそれぞれが有する反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基等）とを、所定の反応様式で順次結合させることにより、リンカーを介してリガンドが結合された核酸プローブが得られる。

　（官能基の導入方法）
　官能基が導入されていない核酸プローブへ上記官能基を導入する方法としては、例えば、鋳型の核酸分子（ＢＡＣクローン等）からＰＣＲ法により上記核酸プローブを調製する際に、ＰＣＲ法で使用する基質として、官能基を有するｄＮＴＰ（Ｎはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）のいずれかである）を使用することにより、官能基が導入された核酸プローブを調製することができる。例えばアミノ基を導入する場合、官能基を有するｄＮＴＰとしては、アミノアリル‐ｄＮＴＰが用いられる。

　上記官能基の導入は、官能基が導入されていない核酸プローブに対し、官能基を有するｄＮＴＰを基質として用いたニックトランスレーション法により行ってもよい。

　（リガンド）
　本発明において、リガンドは核酸プローブに上記高分子からなるリンカーを介して結合しており、後述する蛍光体集積ナノ粒子に直接的および／または間接的に結合した後述する結合物質と特異的に結合することで、核酸プローブに蛍光体集積ナノ粒子を結合するために用いられる。

　リガンドは、後述する蛍光体集積ナノ粒子に結合している結合物質と特異的に結合する分子であればよく、例えば、アビジン、ビオチン、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジン等であり、アビジン、ビオチン、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニンが好適に用いられる。

　なお、ＰＥＧの一端がリガンドとしてのビオチンであらかじめ修飾されており、他端に核酸プローブのアミノ基と反応するＮＨＳ基が導入されている化合物（ＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎ）が市販されており、容易に入手が可能することができる。

　（結合物質）
　本発明における結合物質は蛍光体集積ナノ粒子に結合しており、蛍光体集積ナノ粒子と核酸プローブ上のリガンドとの結合を仲立ちする。蛍光体集積ナノ分子を修飾でき、かつリガンドに結合する物質であればとくに限定されないが、例えば、アビジン、ビオチン、抗ジニトロフェノール抗体、抗ジゴキシゲニン抗体、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジン等であり、特にアビジン、ビオチン、抗ジニトロフェノール抗体、抗ジゴキシゲニン抗体が好適に用いられる。

　蛍光体集積ナノ粒子と結合物質との結合は、直接的な結合であってもよいし、他の分子を介在させる間接的な結合であってもよい。蛍光体集積ナノ粒子に対して結合物質を直接的に結合させる態様としては、特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられ、公知の方法で行うことができる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。

　蛍光体集積ナノ粒子に対して結合物質を間接的に結合する場合の態様としては、蛍光体集積ナノ粒子と結合物質とに高分子を結合させて、蛍光体集積ナノ粒子と結合物質との間にスペーサーを介在させる態様が挙げられる。

　蛍光体集積ナノ粒子に対して結合物質を間接的に結合させる際に用いられる親水性高分子としては、上述したリンカーと同様の各種の分子、例えばポリエチレングリコール等の親水性高分子を用いることができる。特に、非特異的吸着を抑制する観点から、親水性高分子であるポリエチレングリコールを用いることが好ましい。

　上記スペーサーと結合物質との結合、およびスペーサーと蛍光体集積ナノ粒子との結合には、上述したリンカーとリガンドの結合、およびリンカーとプローブとの結合と同様に、上記の適当な結合様式による結合を用いることができる。結合力の強さの観点から、特にアミド結合、エステル結合、イミド結合、好ましくはマレイミド基へのチオール付加を利用した結合等の共有結合が好ましい。

　（核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子との結合）
　核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子との結合は、リガンドと結合物質の結合を介して間接的に結合する方法をとる。

　例えば結合物質としてアビジン、リガンドとしてビオチンを用いる場合、上記の間接的な結合は、例えば以下のようにしてビオチン標識された核酸分子と、ストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子とを調製し、両者を結合させることで達成される。

　（蛍光体集積ナノ粒子）
　蛍光体集積ナノ粒子は、蛍光体を集積したものである。このような蛍光体集積ナノ粒子を用いることで、蛍光体自体と比較して、１粒子当たりの発する蛍光の量、すなわち所定の生体分子を標記する輝点の輝度を高めることができる。

　（蛍光体）
　本明細書において「蛍光体」とは、外部からのＸ線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光体」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。

　また、本発明にいう「蛍光体」は、励起光を遮断してからの発光寿命によって限定されるものでもない。したがって、硫化亜鉛やアルミン酸ストロンチウム等の蓄光物質として知られている物質であってもよい。このような蛍光体は、有機蛍光体（蛍光色素）および無機蛍光体に大別することができる。

　（有機蛍光体）
　蛍光体としての使用可能な有機蛍光体の例としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素分子、クマリン系色素分子、ＮＢＤ（登録商標）系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ（登録商標）系色素分子、シアニン系色素分子、ペリレン系色素分子、オキサジン系色素分子等、有機蛍光色素として知られている物質を挙げることができる。具体的には、国際公開ＷＯ２０１２／１３３０４７号公報に例示された色素等を挙げることができる。これらの有機蛍光体は、いずれかの種類を単独で用いても、複数種を併用してもよい。

　（無機蛍光体）
　蛍光体としての使用可能な無機蛍光体の例としては、量子ドットを挙げることができる。量子ドットとしては、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物、又はＩＶ族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「ＩＩ－ＶＩ族量子ドット」、「ＩＩＩ－Ｖ族量子ドット」、「ＩＶ族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。具体的には、国際公開ＷＯ２０１２／１３３０４７号公報に例示されたＣｄＳｅ等の粒子ドットを挙げることができる。これらの無機蛍光体は、いずれかの種類を単独で用いても、複数種を併用してもよい。

　また、上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。具体的には、国際公開ＷＯ２０１２／１３３０４７号公報に例示されたＣｄＳｅ／ＺｎＳ等を挙げることができるが、これらに限定されない。

　量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、市販されている表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等を用いることが出来る。

　（蛍光体集積ナノ粒子の製造方法）
　本発明で用いられる蛍光体集積ナノ粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法により製造することができる。一般的には、樹脂またはシリカを母体として蛍光体をまとめ上げる（当該母体の内部または表面に蛍光体を固定化する）製造方法を用いることができる。例えば、蛍光体集積ナノ粒子の母体として使われる樹脂は、熱硬化性樹脂であっても、熱可塑性樹脂であってもよい。各種の樹脂についての具体例およびこれらの樹脂を母体として製造される蛍光体集積ナノ粒子の製造方法は公知の文献（ＷＯ２０１４／１３６７７６）に準じる。

　さらに、例えば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子はラングミュア８巻２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子が合成できる。半導体ナノ粒子を内包したシリカナノ粒子はニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー３３巻５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。

　蛍光体集積ナノ粒子の粒子径は、蛍光観察できる範囲の平均粒子径の範囲内であれば特に限定されないが、好適に蛍光観察する観点から、前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがより好ましい。

　製造した蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径の測定は、当該分野で知られた方法により行うことができ，たとえば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて十分な数（たとえば１０００個）の蛍光体集積ナノ粒子の粒径を測定した後、その算術平均として算出される。

　ストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積ナノ粒子の調製は、例えば、以下のようにして行うことができる。蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとにそれぞれ官能基を導入する試薬により官能基を導入し、官能基同士の結合を介してストレプトアビジンと蛍光体集積ナノ粒子とを結合させる。この官能基同士の間に上述したようにスペーサーを介在させてもよい。官能基の組み合わせの例としては、ＮＨＳエステル基‐アミノ基、チオール基－マレイミド基の組み合わせ等を例示することができる。スペーサーとしては、ＥＭＣＳ（Ｎ－［エプシロン－マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等のスペーサーを例示することができる。

　（ＦＩＳＨ）
　以下、ＦＩＳＨについて述べる。ＦＩＳＨは特に限定されず、公知の方法を用いることができる。

　（標本作成工程）
　標本として用いる検体スライドは、例えばがんが疑われる被験者（ヒト、イヌ、ネコ等）の組織について一般的な病理組織診断に用いる方法で調製することができる。たとえば一例として、被験者組織を、固定、脱水処理した後、パラフィン包埋を行い、組織試料を作製したうえで、上記組織試料を３μｍ以上４μｍ以下の切片にする。

　（脱パラフィン処理）
　上記切片をキシレンで浸漬させることで脱パラフィン処理を行い、次いでアルコールに浸漬させることでキシレンを除去し、その後さらに、水で浸漬させることによりアルコールを除去する。各浸漬時間は特に限定されるものではないが、３分以上３０分以下であることが好ましく、また、必要により各浸漬途中で水アルコールまたは水の交換を行ってもよい。

　（前処理）
　公知の方法にならい、上記処理を行った検体スライドを前処理液に浸漬し、適当な条件のもとで加熱することによって前処理を行う。前処理には緩衝液を用いても良いし、酸を用いても良い。緩衝液を用いて前処理を行う場合、緩衝液としては、クエン酸緩衝液、ＥＤＴＡ溶液、尿素、トリス塩酸緩衝液およびグッドバッファー（ＭＥＳなど）等を用い、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等の加熱機器を用いて、５０℃以上１３０℃以下、５分以上３０分以下で加温することによって行う。酸を用いて前処理を行う場合、ＨＣｌで処理したのちに洗浄を行い、ＮａＳＣＮに浸漬することで行うことができる。

　次いで、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に前処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。

　（酵素処理）
　上記処理を行ったスライドに、細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために、酵素処理を行なう。酵素処理は公知の方法にならい、プロテナーゼ、ペプシン、プロテナーゼＫなど、任意のプロテアーゼを使用することができる。例えばプロテアーゼとしてペプシンを用いる場合、１００μｇ／μＬのペプシン（２５００－３０００Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）／１０ｍＭ　ＨＣＬ［ｐＨ２．０］３７℃、１０分以上２０分以下浸漬することが好ましい。

　（脱水工程）
　上記処理を行った検体スライドに対し脱水処理を行ってもよい。脱水処理はエタノールを用いて行うこともでき、また風乾によって行ってもよい。エタノールを用いて行う場合は検体スライドを７０％エタノール、室温で２分間浸漬し、洗浄した後、検体スライドを１００％エタノール、室温で２分間浸漬し、洗浄することが好ましい。

　（染色工程）
　（検体スライドのＤＮＡの変性）
　上記処理を行った検体スライドに対してＤＮＡの変性処理を行う。ＤＮＡの変性処理は熱変性によって行ってもよいし、ホルムアミド溶液などの変性溶液で処理することにより行ってもよい。

　（ハイブリダイゼーション）
　核酸プローブを用いて、公知のＦＩＳＨ（例えば「アジレントＦＩＳＨＧｅｎｅｒａｌＰｕｒｐｏｓｅＲｅａｇｅｎｔｓプロトコル」や、「臨床ＦＩＳＨプロトコール―目で見る染色体・遺伝子診断法 (細胞工学別冊―実験プロトコールシリーズ」等）と同様に、ハイブリダイゼーション処理を行うことができる。ここで、用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための二本のＤＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡ相補鎖の結合過程、または形成された２本鎖の分子を意味する。

　ハイブリダイゼーションの条件設定については、核酸プローブのＧＣ含有率、ハイブリダイゼーションの反応系に存在する１価の陽イオンの濃度（Ｍ）、および該反応系のホルムアミド濃度（％）により、核酸プローブが染色体上の配列に結合する際の結合の精度が変化する。そのため、ハイブリダイゼーション条件（Ｔｍ値）を適宜調節し、結合の精度を調節することができる。

　また、条件設定の際には、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの一般的な条件を記述するLeitch at al. In situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks V 2 (1994)を参照することができる。

　（蛍光集積ナノ粒子の添加）
　ハイブリダイゼーション処理の後、脱イオン水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで順次洗浄し、核酸プローブのリガンド部分と特異的に結合可能な結合物質を、リンカーを介して有する蛍光体集積ナノ粒子を反応系に加えて、反応系内で蛍光標識する。

　（ブロッキング）
　蛍光体集積ナノ粒子を加える前に、タンパク質の非特異吸着を抑えるためのブロッキング処理を必要に応じて行う方が好ましい場合がある。ブロッキングは市販の試薬を用いて行なう。

　（後固定）
　さらにハイブリダイズしたプローブが試料（切片）から外れにくくなる点、また蛍光集積ナノ粒子が試料（切片）上においてより強固に固定される点から、上記試料（切片）をパラホルムアルデヒド溶液などで固定化することが好ましい。

　（核染色）
　上記処理の後、通常はさらに、細胞数をカウントするために核染色を行なう。核染色試薬としてはＤＡＰＩが一般的に用いられるが、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２またはその他の核染色試薬を用いることができる。

　（封入工程）
　ＦＩＳＨによる染色処理および核染色処理を終えた検体スライドは、ＰＢＳで数回洗浄し、風乾または脱水処理を行った後、組織切片上に封入剤を滴下する。封入剤は水系封入剤であってもよいし、油系封入剤であってもよい。油系封入剤を用いるときは、封入前に組織切片にキシレンなどにより透徹を行なう。

　（観察）
　染色した上記切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、広視野の顕微鏡画像から蛍光の輝点の数又は発光輝度を計測する。用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。輝点数又は発光輝度の計測は、市販の画像解析ソフト、例えば、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトＧ－Ｃｏｕｎｔを用いて行うことができる。なお、顕微鏡を使用した画像解析自体は周知であり、例えば、特開平９－１９７２９０に開示される手法を用いることができる。顕微鏡画像の視野は、３ｍｍ²以上であることが好ましく、３０ｍｍ²以上であることがさらに好ましく、３００ｍｍ²以上であることがさらに好ましい。顕微鏡画像から計測された輝点数、及び／又は発光輝度に基づいて、目的とする特定の遺伝子のコピー数を評価する。具体的には、例えば、コピー数が１～２つであれば正常であり、３つ以上であれば異常（増殖）が生じていると評価することができる。

　以下、上述した核酸プローブの作用・効果について説明する。
［１］　蛍光体集積ナノ粒子に結合した結合物質に対して特異的に結合するリガンドにより、長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるリンカーを介して修飾されている核酸プローブであれば、蛍光体集積ナノ粒子による標識率が上がることによって安定的に強い蛍光シグナルを得ることが可能となる。
［２］　前記リンカーが単一の物質から形成される[１]に記載の核酸プローブであれば、リンカーの種類により核酸プローブの特性（疎水性、親水性等）を変更することができ、蛍光体集積ナノ粒子の粒子表面の特性（疎水性、親水性等）に合わせて、リンカーの種類を選択することにより、上記標識を好適に行うことができる。例えば、蛍光体集積ナノ粒子の粒子表面が疎水性であるならば、疎水性のリンカーを使用することで標識されやすくなる。逆に、蛍光体集積ナノ粒子の粒子表面が親水性であるならば、親水性のリンカーを使用することで標識されやすくなる。
［３］　２種類以上の長さを有する単一の物質から形成されるリンカーを介して前記リガンドで修飾されており、少なくとも１種類のリンカーの長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である［１］または［２］の核酸プローブであれば、蛍光体集積ナノ粒子同士が立体障害などに起因する結合障害等により相互に干渉することなく核酸プローブに効率よく結合することが可能となる。
［４］　単一の長さを有する２種類以上の物質から形成されるリンカーを介してリガンドで修飾されている［１］の核酸プローブ、すなわち、単一の長さを有し、単一の物質で形成されたリンカー分子を２種以上用いた核酸プローブであれば、蛍光体集積ナノ粒子の粒子表面や染色環境の特性（疎水性や親水性の程度）に合わせて、親水性や疎水性のリンカー分子を組み合せて、核酸プローブの特性（親水性、疎水性）を調節し、上記標識やハイブリダイゼーションを好適に行うことができる。
［５］　２種類以上の長さを有する２種類以上の物質から形成されるリンカー（すなわち、単一の物質から形成されたリンカー２種以上であって、種類ごとに長さが異なるもの）を介して前記リガンドで修飾されており、その中で少なくとも１種類のリンカーの長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である［１］の核酸プローブであれば、少なくとも１種類のリンカーの長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるので、上記［１］の効果が得られる。また、リンカーの長さが種類ごとに相違することで、蛍光体集積ナノ粒子が立体障害等に起因する結合障害等により相互に干渉しにくくなる効果が得られる。さらに、リンカーが２種以上の物質で形成されている（単一の物質で形成されたリンカーが２種以上存在する）ことから、上記［４］で述べたように、核酸プローブの特性（親水性等）を調節することができる。
［６］　前記リンカーの少なくとも１種類が０．１ｎｍ以上１０ｎｍ未満の範囲である、［３］または［５］に記載の核酸プローブであれば、蛍光体集積ナノ粒子が立体障害等に起因する結合障害等により相互に干渉しにくくなる効果が特に好適に得られる。
［７］　前記リンカーのうち、少なくとも１種類のリンカーがポリエチレングリコールによって形成されている、［１］～［６］のいずれかの核酸プローブであれば、核酸プローブの切片への非特異的吸着が防止される。
［８］　前記核酸プローブとして用いられる核酸の種類がＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される［１］～［７］のいずれかに記載の核酸プローブであれば、上記効果を有するＦＩＳＨ用のプローブとして使用することができる。
［９］　前記リガンドは、前記結合物質としてのアビジン、ビオチン、抗ジニトロフェノール抗体、抗ジゴキシゲニン抗体、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンに対して特異的に結合する物質であり、ビオチン、アビジン、ジニトロフェノール、およびジゴキシゲニンからなる群から選択されたものである、［１］～［８］のいずれかに記載の核酸プローブであれば、前記核酸プローブのリガンド部分と、前記蛍光体集積ナノ粒子の結合物質部分との特異的な結合により、in vitroの反応系のみならずin vivoの反応系であっても、上記核酸プローブを好適に蛍光標識することができる。
［１０］　前記リガンドと前記結合物質との結合を介して蛍光体集積ナノ粒子と結合している［１］～［９］のいずれかの核酸プローブである場合、上記核酸プローブを好適に標識することができる点で特に好ましい。
［１１］　前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である［１０］に記載の核酸プローブであれば、上記核酸プローブを好適に標識することができる。
［１２］　検体が有する染色体上の遺伝子に対して、［１］～［９］のいずれかに記載の核酸プローブを特異的に結合させるハイブリダイゼーション工程、前記検体を洗浄処理する工程、遺伝子に結合した前記核酸プローブが有するリガンドに対して、蛍光体集積ナノ粒子に結合した結合物質を結合させて、染色体上の遺伝子を蛍光標識する工程、を含むＦＩＳＨを行う方法であれば、ハイブリダイゼーション工程により、核酸プローブが染色体上の遺伝子に対して特異的に結合し、洗浄工程により標識反応の障害となりうる反応系の夾雑物（未反応物等）が除去された状態で、蛍光標識する工程により蛍光標識反応がなされるので、in vivoにおいても、上記標識率を高めることができる。
［１３］　検体が有する染色体上の遺伝子に対して、［１０］または［１１］に記載の核酸プローブを結合させるハイブリダイゼーション工程を含む、ＦＩＳＨを行う方法であれば、in vitroで好適に標識された核酸プローブを使用したＦＩＳＨが行われる。

　［製造例１］
　（ストレプトアビジン結合テキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子の製造）
　スルホローダミン１０１（「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ１０１」、シグマアルドリッチ社製、ＴｅｘａｓＲｅｄ色素）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業社製）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。

　撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、該溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれる、蛍光体集積ナノ粒子としてのテキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子（以下、粒子Ｘと略称する。）を沈殿させて上澄みを除去した。その後、沈殿した粒子Ｘの洗浄をエタノールと水で行った。

　洗浄後の粒子Ｘ０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシランＬＳ－３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間、撹拌しながら室温で反応させて表面アミノ化処理を行った。

　表面がアミノ化された粒子Ｘの濃度を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようスペーサー試薬「ＳＭ（ＰＥＧ）_１２」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ｃａｔ.Ｎｏ. ２２１１２）を混合して、撹拌しながら室温で１時間反応した。

　反応液を１０，０００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、同一条件で再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された粒子Ｘを得た。

　一方、スルフヒドリル基を有するストレプトアビジンの作製は以下のように行った。まず、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬに対して、６４ｍｇ／ｍＬに調整したＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（Ｎ－スクシンイミジル　Ｓ－アセチルチオアセテート，ＳＡＴＡ、ｐｉｒｃｅ社製）７０μＬを室温で1時間より反応させた。すなわち、ストレプトアビジンのアミノ基に対して保護されたチオール基（－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＯ－ＣＨ_３）を導入した。

　その後、公知のヒドロキシルアミン処理により、保護されたチオール基から遊離のチオール基（－ＳＨ）を生成して、ストレプトアビジンにチオール基（－ＳＨ）を付加する処理を行った。

　このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された粒子Ｘに結合可能なストレプトアビジンを得た。

　マレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された粒子Ｘと、ＳＨ基を有する上記ストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプアビジンで末端修飾されたＰＥＧ（３３．６オングストローム（＝３．３６ｎｍ））を有するストレプトアビジン結合テキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子を得た。

　［実施例１］
　［単一のリンカー長を持つＰＥＧ－ビオチンが複数付加したプローブの調製］
　（ｉ）アミノ化プローブの作製
　０．２ｍＬＰＣＲストリップチューブ（バイオ・ラッド社）内に５×ＧｏＴａｑ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社）５μＬ、ＧｏＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（５Ｕ／μＬ、プロメガ社）　０．２５μＬ、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　（１００ｎｇ／μＬ、タカラバイオ社）０．２５μＬ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（全て１０ｍＭ、タカラバイオ社）各０．５μＬ、ｄＴＴＰ（１ｍＭ、タカラバイオ社）３．７５μＬ、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ－ｄＵＴＰ（１ｍＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）１．２５μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．５μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．５μＬ、ｍｉｌｌｉＱ７μＬの計２５μＬの溶液を調製した。本明細書における実施例および比較例で用いたｐｒｉｍｅｒはヒトＨＥＲ２Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒであり、その配列を以下に示す。
Forward primer: 5'-CGATGTGACTGTCTCCTCCC-3'
Reverse primer: 5'-ATCCTACTCCATCCCAAGCC-3'
　ストリップチューブをサーマルサイクラー（Ｃｈｒｏｍｏ４、バイオ・ラッド社）にセット後、以下に示すステップ１からステップ５までの方法にてＰＣＲを実施して約２００塩基対のアミノ化プローブとなるＰＣＲ産物を調製した。尚、ＰＣＲ産物はＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
ステップ１：９５℃、３分
ステップ２：９５℃、３０秒
ステップ３：６０℃、３０秒
ステップ４：ステップ２に戻る（３９回くり返す）
ステップ５：７２℃、３分
　（ｉｉ）ＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎを用いたビオチン付加プローブの作製
　プローブとＰＥＧ－ビオチンのモル比が１：１０になるようにアミノ化プローブ１μｇとＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎ（平均分子量：１００００、ナノックス社）１．５μｇを２００μＬの０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で室温、１時間反応させた。未反応のＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎはＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔにより除去した。

　なお、「ＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎ」（平均分子量（Ｍｗ）：１００００、ナノックス社）は、下記の計算によりＰＥＧの平均分子長が約８０ｎｍと推定され、そこに含まれるＰＥＧの大部分の長さは７０ｎｍ以上９０ｎｍ以下の範囲に収まると推定される。

　ＰＥＧ由来部分（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）に関しては、分子量４４のオキシエチレン単位「ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ」が繰り返し単位になっている。そして、Ｃ－Ｃの結合距離は約０．１５ｎｍ、Ｃ－Ｏの結合距離が約０．１４ｎｍであり、実際の原子結合はsp3混成軌道でほぼ正四面体となっているため、原子―原子間の距離はｓｉｎ（５４．７５°（四面体角の半分））＝約０．８１倍されて、０．１１～０．１２ｎｍとなる。従って、ＰＥＧの繰り返し構成（Ｃ－Ｃ－Ｏ―）はおよそ０．３５ｎｍ程度である。分子量が平均分子量通りの１００００であるＰＥＧであれば、そこに含まれるオキシエチレン単位数（ｎ）＝２２７なので、その分子長（平均分子長）は０．３５×２２７＝７９．４５ｎｍと推定される。ｎ＝２００であれば分子長は約７０ｎｍ、ｎ＝２５８であれば分子長は約９０ｎｍと推定される。

　［実施例２］
　［２種類のリンカー長を持つＰＥＧ－ビオチンが付加したプローブの調製］
（ｉ）アミノ化プローブの調製は実施例１と同様の形態にて調製した。
（ｉｉ）ＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎを用いたビオチン付加プローブの作製
　プローブとＰＥＧ－ビオチンのモル比が１：１０になるようにアミノ化プローブ１μｇとＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎ（平均分子量：１００００、ナノックス社）０．７５μｇ、ＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎ（平均分子量：１０００、ナノックス社）７．５μｇを２００μＬの０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で室温、１時間反応させた。未反応のＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎはＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔにより除去した。このＮＨＳ－ＰＥＧ－ｂｉｏｔｉｎ（平均分子量：１０００、ナノックス社）は、５ｎｍ以上８ｎｍ以下のリンカー分子を主として含むものである。

　なお、上述したような推定により、ＭＷ１０００のＰＥＧであれば、そこに含まれるオキシエチレン単位数（ｎ）＝２３で、その分子長（平均分子長）は８．０５ｎｍとなる。

　［実施例３］
　［ＰＥＧ－ビオチン付加プローブを利用したＦＩＳＨ］
　（脱パラフィン処理）
　ＨＥＲ２陽性染色対照標本の検体スライド（ロシュ社製「ＨＥＲ2 ＤｕａｌＩＳＨ３－ｉｎ－１コントロールスライド」）を、以下の（１）～（５）の順で処理することで脱パラフィン処理を行った。（１）キシレンに室温で５分間、２回浸漬する。（２）検体スライドを１００％エタノール、室温で５分間、２回浸漬する。（３）検体スライドを７０％エタノール、室温で２分間浸漬する。（４）検体スライドをｍｉｌｌｉＱ水で、室温で２分間浸漬する。

　（前処理）
　ＤＮＡプローブの到達性を向上させるために、上記検体スライドに対し以下の（１）～（２）の順で前処理を行い、細胞膜及び核膜の蛋白質の除去を行った。（１）ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＲ２　ＦＩＳＨ　ＰｈａｒｍＤｘ「ダコ」）で９５～９９℃，１０分間処理したのち、室温で１５分処理する。（２）検体スライドをＴｒｉｓ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＲ２　ＦＩＳＨ　ＰｈａｒｍＤｘ「ダコ」）で３分間浸漬し、２回洗浄する。

　（プロテアーゼ処理）
　処理を行った検体スライドに対して、以下の（１）～（４）の処理をこの順で行うことで酵素処理を行った。（１）前処理した検体スライドを取り出し、ペーパータオルにスライドグラスの下端をつけて余分な洗浄緩衝液を取り除く。（２）検体スライド上にプロテアーゼ溶液を５～６滴滴下し１０～６０分間反応させる。この浸漬処理は、細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために、Ｐｅｐｓｉｎ（ＨＥＲ２　ＦＩＳＨ　ＰｈａｒｍＤｘ「ダコ」）で室温、１０分間で処理することが望ましい。
（３）検体スライドをＴｒｉｓ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＲ２　ＦＩＳＨ　ＰｈａｒｍＤｘ「ダコ」）に３分間浸漬する。この操作を２回繰り返す。（４）検体スライドを風乾または４５～５０℃のスライドウォーマー上で２～５分間乾燥させる。

　（脱水）
　上記検体スライドに対し、検体スライドを７０％エタノール、室温で２分間浸漬し、洗浄した後、検体スライドを１００％エタノール、室温で２分間浸漬し、洗浄することで脱水処理を行った。

　（変性およびハイブリダイゼーション）
　上記脱水処理を行った検体スライドに対して以下の処理をこの順で行うことで、検体スライドに対して実施例１および２で記載したように調製したＤＮＡプローブ１μＬ（１０～５０ｎｇ）を用いてハイブリダイゼーション処理を行った。（１）検体スライドのハイブリダイゼーション領域に調製した上記ＤＮＡプローブを１μＬとＩＱＦＩＳＨ　ＦＦＰＥ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（アジレント・テクノロジー社）を９μＬ添加しスライド上でピペッティングによる混合後、すぐに、２２ｍｍ×２２ｍｍのカバーグラスをプローブの上に被せ均一にプローブを広げる。ハイブリダイゼーション領域に気泡が入らないようにする。（２）ペーパーボンド（コクヨ社）でカバーグラスをシールする。（３）ハイブリダイザー（ダコ社）に検体スライドを配置して、８０℃を１０分、４５℃を１時間の変性およびハイブリダイゼーションを行う。

　（スライドグラスの洗浄）
　上記ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドに対して以下の（１）～（６）の処理をこの順で行うことで、検体スライドの洗浄処理を行った。（１）ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液（１×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ－４０）をコプリンジャーに入れる。ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が６３℃になるまで温浴槽で予備加熱をする（６３℃の温浴槽に少なくとも３０分間置く）。
（２）ポストハイブリダイゼーション
洗浄緩衝液を入れたコプリンジャーをもうひとつ用意し、室温に維持する。（３）ピンセットでペーパーボンドのシールを取り除く。室温に維持されたポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が入ったコプリンジャーの中に検体スライドを入れて、カバーグラスを剥がす。（４）検体スライドを６３℃に保たれたポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液の中に入れて１０分間浸漬し、洗浄する。（５）Ｔｒｉｓ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＲ２　ＦＩＳＨ　ＰｈａｒｍＤｘ「ダコ」）を用いて室温で３分間浸漬し、２回洗浄する。（６）コプリンジャーから検体スライドを取り出し、遮光下（締め切った引出や締め切ったキャビネットの棚等で風乾する。

　（ブロッキング）
　ブロッキングはＩｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｃｔｏｒ）に室温で３０分間浸漬することで行った。

　（アビジン－ビオチン反応）
　製造例１で製造した、ストレプトアビジンが標識された蛍光体集積ナノ粒子（粒径：１５０ｎｍ、濃度：０．１ｎＭ）を１００μＬ検体スライド上に滴下し、室温で６０分間結合反応を行った。ＰＢＳで５分間浸漬し、３回洗浄を行った。

　（後固定）
　後固定は４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（Ｗａｋｏ）に室温で１０分間浸漬することで行った。

　（ＤＡＰＩ染色）
　ＤＡＰＩ（2-(4-アミジノフェニル)インドール-6-カルボキサミジン二塩酸塩）染色は以下のように行った。まず、１０μＬのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社：Ｄ１３０６）染色液を検体スライドのハイブリダイゼーション領域に添加した。反応を室温で、１５分間行うことで細胞核を染色し、Ａｑｕａｔｅｘ（ＭＥＲＣＫ）で封入した後、カバーガラスを被せて、シグナルの計測まで検体スライドを遮光して保存した。

　（観察）
　上記作製しＦＩＳＨを行った検体スライドについて、蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（キーエンス社製）を用いて蛍光画像を取得した。なお、ＨＥＲ２が高発現している細胞株（Ｃａｌｕ－３）を撮像の対象とした。対物レンズの倍率は１００倍、ＤＡＰＩ、蛍光体集積ナノ粒子の撮像時の励起時間はそれぞれ２０ｍｓおよび５００ｍｓとした。

　［比較例１］
　検体スライドに対するハイブリダイゼーション処理を行う際に用いるビオチン付加ＤＮＡプローブを用いた以外には実施例３と同じ手法で行った。上記ビオチン付加ＤＮＡプローブの作製は、以下の方法により実施した。

　０．２ｍＬＰＣＲストリップチューブ（バイオ・ラッド社）内に５×ＧｏＴａｑ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社）５μＬ、ＧｏＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（５Ｕ／μＬ、プロメガ社）　０．２５μＬ、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　（１００ｎｇ／μＬ、タカラバイオ社）０．２５μＬ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（全て１０ｍＭ、タカラバイオ社）各０．５μＬ、ｄＴＴＰ（１ｍＭ、タカラバイオ社）３．７５μＬ、ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ（１ｍＭ、タカラバイオ社）１．２５μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．５μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．５μＬ、ｍｉｌｌｉＱ７μＬの計２５μＬの溶液を調製した。[実施例１]に記載したプライマー配列、ＰＣＲの実施条件を実行することでビオチン付加プローブを作製した。

　実施例１および２、比較例１のプローブを用いてＦＩＳＨを行った際の蛍光顕微鏡で取得した画像について図７～９に示した。比較例１（図９）よりも実施例１（図７）および実施例２（図８）の方がＨＥＲ２遺伝子の増幅をよく捉えている様子が観察された。

　以上、本発明に係る核酸プローブ、およびこれを用いたＦＩＳＨについて実施形態および実施例に基づいて詳細に説明してきたが、本発明は、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない限り、設計変更は許容される。

１　核酸プローブ
２ａ　リンカー
２ｂ　リンカー（２ａとは異なる物質のリンカー）
３　蛍光体集積ナノ粒子
４　スペーサー
Ａ　リガンド
Ｂ　結合物質

配列番号１；ヒトＨｅｒ２　ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２；ヒトＨｅｒ２　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ

Claims

　蛍光体集積ナノ粒子に結合した結合物質に対して特異的に結合するリガンドにより、長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるリンカーを介して修飾されている核酸プローブ。
　前記リンカーが単一の物質から形成される請求項１に記載の核酸プローブ。
　２種類以上の長さを有する単一の物質から形成されるリンカーを介して前記リガンドで修飾されており、少なくとも１種類のリンカーの長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である請求項１または２に記載の核酸プローブ。
　単一の長さを有する２種類以上の物質から形成されるリンカーを介してリガンドで修飾されている請求項１に記載の核酸プローブ。
　２種類以上の長さを有する２種類以上の物質から形成されるリンカーを介して前記リガンドで修飾されており、その中で少なくとも１種類のリンカーの長さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である請求項１に記載の核酸プローブ。
　前記リンカーの少なくとも１種類の長さが０．１ｎｍ以上１０ｎｍ未満の範囲である、請求項３または５に記載の核酸プローブ。
　前記リンカーのうち、少なくとも１種類のリンカーがポリエチレングリコールによって形成されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
　前記核酸プローブとして用いられる核酸の種類がＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
　前記リガンドは、前記結合物質としてのアビジン、ビオチン、抗ジニトロフェノール抗体、抗ジゴキシゲニン抗体、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンに対して特異的に結合する物質であり、ビオチン、アビジン、ジニトロフェノール、およびジゴキシゲニンからなる群から選択されたものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
　前記リガンドと前記結合物質との結合を介して蛍光体集積ナノ粒子と結合している請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
　前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である請求項１０に記載の核酸プローブ。
　検体が有する染色体上の遺伝子に対して、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸プローブを特異的に結合させるハイブリダイゼーション工程、
　前記検体を洗浄処理する工程、
　遺伝子に結合した前記核酸プローブが有するリガンドに対して、蛍光体集積ナノ粒子に結合した結合物質を結合させて、染色体上の遺伝子を蛍光標識する工程、
を含むＦＩＳＨを行う方法。
　検体が有する染色体上の遺伝子に対して、請求項１０または１１に記載の核酸プローブを結合させるハイブリダイゼーション工程を含む、ＦＩＳＨを行う方法。