JP2006258609A - バイオマテリアル用高分子化合物およびそれを用いた高分子溶液 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ホスホリルコリン基を有する単量体(a)、及びアミノ基を有する単量体(b)を共重合して得られる高分子化合物であって、アミノ基を有する単量体(b)がアミノ基と重合性基との間に鎖状につながった原子を5〜100個有する化合物であることを特徴とするバイオマテリアル用高分子化合物。
Description
固相担体表面にDNA等の核酸の断片を固定化する手段としては、(1)固相担体表面で核酸断片を合成する手法、(2)固相担体表面に導入した官能基と共有結合、あるいは非共有結合を形成させる手法の2つに大別される。
(1)の手法は、フォトリソグラフィー技術を利用し、固相担体表面に目的の核酸を構成する塩基を一つずつ繰り返し結合していくものである。該手法によれば核酸断片を固相担体表面上に高密度で固定することができるが、長鎖の核酸の固定化には適しておらず、必ずしも広く利用可能な手法とは言えない。
(2)においては、固相担体表面にアルデヒド基やアミノ基等の官能基を導入する手法が一般的である。アルデヒド基を導入する場合においては、あらかじめ核酸に導入したアミノ基と共有結合を形成することで、固相担体表面に核酸を固定化することができるが、(1)の場合と同様、長鎖の核酸の固定化法としては適当でない。
アミノ基を導入する場合としては、ポリ−L−リジンやアミノ基を有するシランカップリング剤で固相担体表面を処理し、表面の正電荷と核酸のリン酸基の負電荷との静電的相互作用を利用して固定化する手法が知られている。この場合、長鎖の核酸の固定化が可能であるが、検出対象物質の表面への非特異的な吸着が十分に抑制できず、高いS/N比(試料検体に基づくシグナルとそれ以外の領域のシグナルとの比)を得ることができない。
長鎖の核酸の固相担体表面への固定化を目的とすれば、固相表面にアミノ基を導入する手法が最も適しているが、上述のようにアミノ基を導入した固相表面で核酸の試料検体に基づくシグナルが高く、且つ検出対象物質の固相表面への非特異的吸着を十分に抑制できるものがないため、その開発が求められていた。
ここで言うバイオマテリアル材料とは、DNAチップ、バイオチップ等のバイオデバイスの他に、ゲル、多孔体、膜、粒子など、高分子化合物自体に様々な物性、形状を持たせたバイオマトリックスを含む。
(1)ホスホリルコリン基を有する単量体(a)、及びアミノ基を有する単量体(b)を共重合して得られる高分子化合物であって、アミノ基を有する単量体(b)がアミノ基と重合性基との間に鎖状につながった原子を5〜100個有する化合物であることを特徴とするバイオマテリアル用高分子化合物、
(2)ホスホリルコリン基を有する単量体(a)、アミノ基を有する単量体(b)、及びアルキル基を有する単量体(c)を共重合して得られる高分子化合物であって、アミノ基を有する単量体(b)がアミノ基と重合性基との間に鎖状につながった原子を5〜100個有する化合物であることを特徴とするバイオマテリアル用高分子化合物、
(3)ホスホリルコリン基を有する単量体(a)が下記の一般式[1](式中R1は水素原子またはメチル基を示し、Xは炭素数1〜10のアルキレンオキシ基を示す。pは1〜20の整数を示す。pが2以上20以下の整数である場合、繰り返されるXは、同一であっても、または異なるアルキレンオキシ基の連鎖であってもよい。)で表されるものである(1)または(2)記載のバイオマテリアル用高分子化合物、
(5)アミノ基を有する単量体(b)が下記の一般式[2](式中R2は水素原子またはメチル基を示し、Yは―NH―または酸素原子を示す。Zは炭素数1〜5のアルキレンオキシ基またはアルキル基を示し、qは1〜20の整数を示す。繰り返されるZは、同一であっても、異なるアルキレンオキシ基またはアルキル基の連鎖であってもよい。Wはアミノ基またはその塩を示す。)で表されるものである(1)〜(4)いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物、
(7)式[2]のWが―NH2またはその塩である(5)又は(6)記載のバイオマテリアル用高分子化合物、
(8)アミノ基を有する単量体(b)がN―(2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エチル)メタクリルアミドである(1)〜(4)いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物、
(9)アルキル基を有する単量体(c)がn―ブチルメタクリレートである(2)〜(8)いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物、
(10)共重合がラジカル重合である(1)〜(9)いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物、
(11)(1)〜(10)いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物を溶媒に溶解させたことを特徴とする高分子溶液、
(12)溶媒がエタノール、メタノール、水のいずれか1種類以上から選ばれる単独または混合溶媒である(11)の高分子溶液、
である。
アミノ基を有する単量体(b)において、アミノ基と重合性基との間の鎖状につながった原子数が4以下の場合には、高分子化合物の高次構造からアミノ基が突出することができず、また、原子数101以上の場合では、鎖状分子構造が不規則な高次構造を形成し、アミノ基の配向が無秩序になるため、核酸等との十分な相互作用が得られない。したがって、アミノ基を有する単量体(b)において、アミノ基と重合性基との間の鎖状につながった原子数は5〜100に制限されるが、好ましくは原子数5〜50であり、より好ましくは原子数5〜20である。
一般式[2]中のqは1〜20の整数を示し、繰り返されるZは、同一であっても、異なるアルキレンオキシ基またはアルキル基の連鎖であってもよい。
一般式[2]中のWはアミノ基またはその塩であり、例えば1級のアミノ基、2級のアミノ基、3級のアミノ基、あるいは4級のアンモニウム基またはそれらの塩が挙げられるが、高分子化合物の側鎖の末端において他の低分子化合物または高分子化合物との反応に利用できる点で1級のアミノ基またはその塩が好ましい。
一般式[2]に表される単量体の好適な例としては、N―(2―(2―アミノエトキシ)エチル)メタクリルアミド、2―(2―アミノエトキシ)エチルメタクリレート、N―(2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エチル)メタクリルアミド、2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エチルメタクリレート、N―(2―(2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)メタクリルアミド、2―(2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチルメタクリレート、N―(3―(2―アミノエトキシ)プロピル)メタクリルアミド、3―(2―アミノエトキシ)プロピルメタクリレート、N―(3―(3―(2―アミノエトキシ)プロポキシ)プロピル)メタクリルアミド、3―(3―(2―アミノエトキシ)プロポキシ)プロピルメタクリレート、N―(2―(3―(3―(3―アミノエトキシ)プロポキシ)プロポキシ)プロピル)メタクリルアミド、2―(3―(3―(3―アミノエトキシ)プロポキシ)プロポキシ)プロピルメタクリレート、またはこれらの塩が挙げられるが、ホスホリルコリン基を有する単量体(a)との共重合性が優れている点でN―(2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エチル)メタクリルアミドがより好ましい。
2’−アゾビスイソブチルニトリル(以下「AIBN」という)、1,1’−アゾビス(シクロヘキサン−1−カルボニトリル)等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)、N―(2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エチル)メタクリルアミド(NAEMA)、n−ブチルメタクリレート(BMA)、をそれぞれ順に0.25mol/L、0.05mol/L、0.70mol/Lになるようにエタノールに溶解し、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに0.002mol/LのAIBNを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、60℃で4時間反応した後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。
収集した高分子物質を0.3重量%となるようにエタノール溶媒に溶解させた。前記高分子物質を溶解させたエタノール溶液に、スライドガラス形状(寸法:76mm×26mm、1mm)に飽和環状ポリオレフィン樹脂を加工したプラスチック基板を浸漬させ、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基とアミノ基とを有する高分子物質を導入した。このとき、アミノ基と重合性基との間の原子数は10個である。
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)、N―(2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エチル)メタクリルアミド(NAEMA)、n−ブチルメタクリレート(BMA)、をそれぞれ順に0.25mol/L、0.10mol/L、0.65mol/Lになるようにエタノールに溶解し、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに0.002mol/LのAIBNを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、60℃で4時間反応した後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。
その後、実施例1と同様の手法でエタノール溶媒に溶解させ、さらにそこにプラスチック基板を浸漬させ、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基とアミノ基とを有する高分子物質を導入した。このとき、アミノ基と重合性基との間の原子数は10個である。
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)、2−アミノエチルメタクリレートヒドロクロライド(AEMHCl)、n−ブチルメタクリレート(BMA)、をそれぞれ順に0.25mol/L、0.05mol/L、0.70mol/Lになるようにエタノールに溶解し、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに0.002mol/LのAIBNを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、60℃で4時間反応した後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。
その後、実施例1と同様の手法でエタノール溶媒に溶解させ、さらにそこにプラスチック基板を浸漬させ、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基とアミノ基とを有する高分子物質を導入した。このとき、アミノ基と重合性基との間の原子数は4個である。
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)、2−アミノエチルメタクリレートヒドロクロライド(AEMHCl)、n−ブチルメタクリレート(BMA)、をそれぞれ順に0.25mol/L、0.10mol/L、0.65mol/Lになるようにエタノールに溶解し、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに0.002mol/LのAIBNを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、60℃で4時間反応した後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。
その後、実施例1と同様の手法でエタノール溶媒に溶解させ、さらにそこにプラスチック基板を浸漬させ、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基とアミノ基とを有する高分子物質を導入した。このとき、アミノ基と重合性基との間の原子数は4個である。
長鎖DNAおよび蛍光標識長鎖DNAの調製は、PCR Thermal Cycler480(タカラバイオ社製)を使用して、PCRにより増幅されたDNAを用いた。プライマーとして、オリゴヌクレオチド(シグマジェノシス社製)配列1:TCGTGCGTGACATTAAGGAGAAGC(配列番号1)、配列2:CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGAT(配列番号2)を使用し、cDNAライブラリー(Humanliver)(タカラバイオ社製)を鋳型として、βアクチン遺伝子のDNA断片(502bp)を増幅した。
PCR反応液の組成は、200μM dNTP、TakaraExTaq(タカラバイオ社製)、2mMMgCl2、Ex Taq Bufferであり、PCR反応は、プレ変性:90℃、30秒;1サイクル、熱変性:90℃、30秒、アニーリング:60℃、30秒、伸長:72℃、45秒;30サイクル、伸長:72℃、3分;1サイクルで行なった。この断片をアガロースゲル電気泳動により増幅されていることを確認後、マイクロコン100(ミリポア社製)を用いて、PCR増幅産物を精製、濃縮した。
蛍光標識長鎖DNAの調製は、Cy3標識オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の方法で行なった。
上記で得られた長鎖DNAを所定の水溶液を用いて、所定濃度に溶解し、96穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて実施例、比較例で作製した基板にそれぞれ点着させた。
点着後、80℃で1時間熱処理、UVを照射(120mJ)することにより長鎖DNAを固定化し、0.1%SDSで洗浄を行なった。その後、2×SSC(クエン酸ナトリウム緩衝液)、0.1%SDSの水溶液を調製し、ホットプレート上で沸騰させた後、基板を1分間浸漬し、次いで純水中に1分間浸漬させた。
前記基板を5×SSC、0.3%SDS、0.1mg/mlのBSA水溶液中に50℃で1時間浸すことで、DNAが点着されていない部分のブロッキングを行なった。次いで、水で洗浄した後、ハイブリダイゼーション反応を50℃で16時間行なった。ハイブリダイゼーション溶液として、上記で得られた蛍光標識長鎖DNAを所定の濃度に溶解した、5×SSC、0.3%SDSを用いた。
ハイブリダイゼーション終了後、0.2×SSC、0.1%SDS中で42℃、10分浸漬した。その後、0.2×SSC、0.1%SDS中、室温で10分浸漬し、2×SSC、1×SSC、0.1×SSCの順に洗浄を行なった。次いで、基板を遠心することにより乾燥させた。
マイクロアレイ用スキャナ「ScanArray Lite」(パッカードバイオチップテクノロジー社製)を用いて、上記で得られた各基板のスポットの蛍光を検出した。このときの測定条件は、レーザー出力90%、PMT感度65%、励起波長550nm、測定波長570nm、解像度50μmであった。
スポットの蛍光強度の数値化は、スキャナに付属の解析用ソフトウェア「QuantArray」を用いて行なった。
実施例1および2では、比較例1および2と比較して、蛍光シグナル値の大幅な増加が認められ、CV値も良好な値を示した。この結果は、本発明の効果を支持するものであった。
Claims (12)
- ホスホリルコリン基を有する単量体(a)、及びアミノ基を有する単量体(b)を共重合して得られる高分子化合物であって、アミノ基を有する単量体(b)がアミノ基と重合性基との間に鎖状につながった原子を5〜100個有する化合物であることを特徴とするバイオマテリアル用高分子化合物。
- ホスホリルコリン基を有する単量体(a)、アミノ基を有する単量体(b)、及びアルキル基を有する単量体(c)を共重合して得られる高分子化合物であって、アミノ基を有する単量体(b)がアミノ基と重合性基との間に鎖状につながった原子を5〜100個有する化合物であることを特徴とするバイオマテリアル用高分子化合物。
- ホスホリルコリン基を有する単量体(a)が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである請求項1または2記載のバイオマテリアル用高分子化合物。
- 式[2]のZがエチレンオキシ基である請求項5記載のバイオマテリアル用高分子化合物。
- 式[2]のWが―NH2またはその塩である請求項5又は6記載のバイオマテリアル用高分子化合物。
- アミノ基を有する単量体(b)がN―(2―(2―(2―アミノエトキシ)エトキシ)エチル)メタクリルアミドである請求項1〜4いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物。
- アルキル基を有する単量体(c)がn―ブチルメタクリレートである請求項2〜8いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物。
- 共重合がラジカル重合である請求項1〜9いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物。
- 請求項1〜10いずれか記載のバイオマテリアル用高分子化合物を溶媒に溶解させたことを特徴とする高分子溶液。
- 溶媒がエタノール、メタノール、及び水のいずれか1種類以上から選ばれる単独または混合溶媒である請求項11記載の高分子溶液。
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