JP2003033177A

JP2003033177A - 高密度細胞アレイ用基板、製造法、及びその利用方法

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Publication number: JP2003033177A
Application number: JP2001223593A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Yamato; 雅之大和; Mitsuo Okano; 光夫岡野
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-07-24
Filing date: 2001-07-24
Publication date: 2003-02-04
Anticipated expiration: 2021-07-24
Also published as: JP4755368B2

Abstract

(57)【要約】【課題】多種の薬物・毒物等の化学物質を簡便にアッ
セイするために必要な培養基板、細胞アレイ、化学物質
の自動注入装置、アッセイ系を提供すること。【解決手段】細胞付着性高分子に被覆された領域が不
連続に微細に規則正しく並べられ、そのまわりを細胞非
付着性の親水性高分子に被覆された領域が囲み、さらに
そのまわりを細胞非付着性の強疎水性材料に被覆された
領域が連続的に囲んでいる表面を持つことを特徴とする
高密度細胞アレイ用基板を用いる。この高密度細胞アレ
イ基板、及びそれを利用したアッセイ系により、使用す
る薬剤（例えば、抗ガン剤）の種類、使用濃度の最適化
をおこなうことで、薬剤の副作用を大きく減少させると
共に、疾患の薬物治療成績を大きく向上させることが可
能である。また、本技術は、医薬品開発や環境アセスメ
ント、基礎生命科学的研究にも利用でき、極めて有効な
技術である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な培養基板、
該培養基板を用いる高密度細胞アレイ用基板およびそれ
らの製造法に関する。また、本発明は、高密度細胞アレ
イ用基板上で培地が分離された各細胞を化学物質等に対
する評価、及び遺伝子導入操作等に利用する方法に関す
る。さらに、本発明は、その細胞評価、或いは遺伝子操
作後、特定の活性を持つ細胞のみを剥離、回収する方法
に関する。また、さらに、本発明は上記操作による医薬
・毒物等の化学物質のスクリーニング方法、遺伝子導入
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ガンの薬物治療は血液細胞のガンなどで
は非常に大きな成果をあげているが、ある種の固形ガン
ではいまだ十分な成果をあげるに至っていない。その理
由の一つに、抗ガン剤の効果がガン細胞間で一様でない
にもかかわらず、実際に投与する前にその有効性、必要
量を調べる有効な手段がないことがあげられる。抗ガン
剤の種類は多く、その処方も一様ではないため、簡便に
複数の抗ガン剤をアッセイできる培養細胞を利用したシ
ステムが開発できれば、実際に患者に処方する前に、腫
瘍から採取したガン細胞を培養し、多種の抗ガン剤につ
いてその効果の有無や必要な処方量を決定でき、現状で
は副作用の問題を十分回避できていないガンの薬物治療
を大きく進展させることが期待できる。しかし、生検で
採取できる細胞の量は微量であり従来の培養法では多種
類の処方を検定できず、また従来の培養法では、多検体
とすればそれだけの培養容器が必要となり、臨床の場に
おいて行うことはその規模の点からもまた必要な労力の
点からもまったく現実的でない。近年、実験動物の希少
性や個体差に起因する低再現性、ヒトとの種差などの問
題点が指摘され、ヒトなどの培養細胞を用いた薬物・毒
物評価技術の開発が大きく注目されている。また、新薬
開発の低コスト化、医薬品の安全性の確認、環境アセス
メントなどの観点から、多種の薬物・毒物を同時に短時
間でアッセイする技術の開発の必要性も強く指摘されて
いる。これらの要求に対して、半導体加工技術として知
られていたマイクロファブリケーション（微細加工）技
術を応用して、数cm〜10cm程度の大きさをもつ基坂上で
電気泳動やクロマトグラフィをおこなうデバイス（“ラ
ボ・オン・チップ”）の開発が注目を集めている。たと
えば核酸の電気泳動においては、従来別々の装置で行わ
れていたゲルの作成、電気泳動、バンドの検出、データ
解析の全てを全自動化したシステムがすでに市販されて
いる。“ラボ・オン・チップ”技術を用いることで
（１）少量のサンプルしか必要としない、（２）多検体
を同時に大規模で並列的にアッセイできる、（３）シス
テム化により手作業を自動化でき、高再現性が得られ
る、（４）廃液量が激減し環境に与える影響を極小にで
きる、（５）毒性のある試薬の使用量が激減し、安全性
が高い、（６）分析コストの軽減化などが達成できるな
どのメリットが得られる。

【０００３】抗体や酵素がその高い特異性による微量測
定、定量化を目的としている一方、生体が示す反応を理
解するには、これまで実験動物に頼らねばならなかっ
た。細胞はたとえ一個であってもコンピュータや化学コ
ンビナートにも匹敵する複雑な情報処理能力と化学反応
を示すため、単にその量を計測するのではなく、いわば
対象となる薬物・毒物が生体に与える影響の質を計測す
るのに使えるのではないかとの視点から大きな期待がも
たれている。１細胞単位の計測をおこなうシステムとし
ては、フローサイトメーターがあり、膜表面抗原の定量
的な計測が可能になるなど、免疫学の進歩に大きく貢献
したが、すでに２０年以上の歴史をもち、今後も大きな
進歩はないと考えられる。フローサイトメーターは血球
などの浮遊系の細胞を対象としており、培養皿上で培養
した付着性の細胞の場合には培養皿から回収して懸濁す
る必要があり、例えば、付着性ガン細胞の超多検体同時
評価などには用いることができない。近年、レーザース
キャンサイトメトリーと呼ばれる、コンピュータ制御の
Ｘ−Ｙステージと蛍光顕微鏡を組み合わせた機械が市販
されている。これはスライドグラス上の組織標本中の細
胞を一個ずつ計測することを目的としている。すなわち
一枚のプレパラート上の細胞はすべて同じ条件下の細胞
であり、薬物の評価にこれを用いる場合、薬物の種類、
条件の数だけプレパラートが必要となるため、多数の異
なる薬物を異なる条件下で同時に評価するために用いる
ことは困難であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記の
問題点の重要性を痛感し、多検体を同時にアッセイする
システムの研究開発を重ねた。その結果、本発明者ら
は、水との親和性が異なる材料を用いて、１ｃｍ²に細
胞５００〜１００，０００個という高密度で、またそれ
ぞれの細胞の培地を完全に分離して培養できる高密度細
胞アレイ用培養基板を作製することに成功した。また、
本発明者らは、様々な化学物質を種々の濃度で自動注入
するインクジェットプリンタヘッドを改造した化学物質
自動注入装置（ナノディスペンサ）を製造し、1枚の高
密度細胞アレイ用培養基板を使うだけで、一度に多検体
のアッセイを行うことのできるシステムを完成させた。
さらに、アッセイ後、基板上の特定の細胞のみを剥離、
回収させることもできるようになり、その細胞をさらに
別の用途へ利用することもできる技術を完成させた。本
発明はかかる知見に基づいて完成したものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、細胞付着性高
分子に被覆された領域が高密度に並べられ、そのまわり
を細胞非付着性の親水性高分子に被覆された領域、さら
にそのまわりを細胞非付着性の強疎水性材料に被覆され
た領域が囲んだ新規な表面を有する高密度細胞アレイ用
基板を提供する。また、本発明は、少なくとも３種類の
材料が積層化された支持体に対し、それぞれの層の一部
が基板表面の一部として現れるようにレーザーアブレー
ションするという高密度細胞アレイ用基板の製造方法を
提供する。加えて、本発明は、高密度細胞アレイ用基板
上で培地が分離された各細胞を化学物質等に対する評
価、及び遺伝子導入操作等に利用する方法を提供する。
さらに、本発明は、その細胞評価、或いは遺伝子操作
後、特定の活性を持つ細胞のみを剥離、回収する方法を
提供する。さらに、加えて、本発明は上記高密度細胞ア
レイを用いることを特徴とする医薬、毒物等の化学物質
のスクリーニング方法、遺伝子導入方法を提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本願明細書において用いられてい
る、本発明に係る用語について以下に説明する。細胞アレイ：大規模並列アッセイを目的として、多数の
ＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）を固定化したＤＮＡ
アレイが注目を集めている。アレイは元来「整列してい
る」という程度の意味であるが、一部のＤＮＡアレイが
半導体作製に用いる光リソグラフィを用いて作製される
ためＤＮＡチップなどとも呼ばれる。ＤＮＡアレイ技術
の延長として多数の抗体を配列させたプロテインアレイ
が開発されている。細胞アレイでは、ＤＮＡアレイ、プ
ロテインアレイに続く次世代技術として細胞を高密度に
細胞を配列させる。本発明においては、並列多検体アッ
セイを目的として細胞付着性高分子に被覆された領域に
１細胞ずつ付着させ、一枚の高密度細胞アレイ用基板上
に細胞５００個〜１００，０００個を配列させる。ナノディスペンサ：本発明の細胞アレイ上では、各細胞
毎に完全に分離した培地中で細胞培養をおこなうため、
同時に５００種類〜１００，０００種類の培養条件を検
討できる。化学物質を指定された量だけ注入する装置を
ディスペンサと呼び、ここでは各々のドメイン内の培地
中にナノ〜マイクロリットルの薬物溶液を注入するため
ナノディスペンサと呼ぶ。ハイスループットスクリーニング：これまで新薬の開発
や毒性評価において大量の培養皿や実験動物を用いざる
をえず、活性のある薬物の探索に要するスクリーニング
のコストは莫大なものであった。近年のコンビナトリア
ルケミストリ技術の発展にともない評価すべき物質の数
は飛躍的に増加しており、低コストで高速な評価・探索
の重要性がますます高まり、超並列化可能な新技術「ハ
イスループットスクリーニング」が強く求められてい
る。インクジェットプリンタヘッド：市販のカラーインクジ
ェットプリンタの多くのヘッドは使い捨てであり、ヘッ
ド単体の価格は１，０００円程度である。この安価な，
ヘッドで数ピコリットルの液滴が十分な精度で噴射でき
る。本システムでも薬剤毎にヘッドを使い捨てにするこ
とにより、汚染の可能性やメンテナンスを最小限にする
ことができる。共焦点レーザー走査顕微鏡：光源にレーザーを用い、検
出器に光電子倍増管を用いることで、高精度に再現性良
い蛍光の検出が可能である。レーザー光はガルバノミラ
ーを用いて焦点面上の必要な範囲のみを走査するので、
大面積の観察でも退色がないため、本発明のシステムに
は最適である。ラボオンチップ：マイクロファブリケーション技術を用
いて、反応層や流路などを一枚のチップ上にマイクロメ
ートルサイズで作製し、一枚のチップで電気泳動やＰＣ
Ｒをおこなう新技術。必要な薬剤の微量化、高速化など
が可能となる。電子線重合：電子線照射により発生させたラジカルを利
用してラジカル重合をおこなう。大面積への共有結合的
固定化が可能。すでに広く産業応用されており、低コス
トで運転できる。レーザーアブレーション：照射したレーザーのエネルギ
ーにより表面を構成する分子間の結合を切ることで、照
射表面を微細加工する技術。

【０００７】決められたサイズの細胞付着性領域を作製
して１細胞を基板上に多数配列させる技術は、これまで
に少数、萌芽的な研究が報告されている。基本的に光リ
ソグラフィ技術を用い、基材としてはシリコンまたはガ
ラスを用いている。しかし、これらの方法は大量生産に
は向いておらず、またいずれの報告もミリメートル程度
の大きさに数十から百個程度の細胞が配列しているだけ
である。これに対し本発明では、シリコンやガラスでは
なく安価なプラスチック材料を用いて基板を作製し、大
量生産に適した加工法を選択しており、大幅な低コスト
化が期待できる。また、本発明で利用する電子線重合お
よびレーザーアブレーションは大面積化が容易であり、
高密度でセンチメートルの大きさをもつ基板を容易に作
製できる。なお、ＹａｍａｔｏＭ．，Ｋｗｏｎ
Ｏ．Ｈ．，ＨｉｒｏｓｅＭ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ
Ａ．，ＯｋａｎｏＴ．， ”Ｎｏｖｅｌｐａｔｔ
ｅｒｎｅｄｃｅｌｌｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｕｔｉ
ｌｉｚｉｎｇｔｈｅｒｍａｌｌｙｒｅｓｐｏｎｓｉ
ｖｅｇｒａｆｔｅｄｐｏｌｙｍｅｒｓｕｒｆａｃ
ｅｓ”，Ｊ．ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭｅｔｅｒｉａ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈ，５５，１３７（２００１）
には、本発明でも用いる電子線照射法によりパターン伏
に高分子を培養皿表面に固定化して、従来にない安価か
つ簡便に複数種の細胞のパターン化共培養を達成したこ
とが記載されている。また、ＨｉｒｏｓｅＨ．，Ｋ
ｗｏｎＯ．Ｈ．，ＹａｍａｔｏＭ．，Ｋｉｋｕ
ｃｈｉＡ．，ＯｋａｎｏＴ．， ”Ｃｒｅａｔｉｏ
ｎｏｆｄｅｓｉｇｎｅｄｃｅｌｌｓｈｅｅｔｓ
ｔｈａｔａｒｅｎｉｎｉｎｖａｓｉｖｅｌｙｈａ
ｒｖｅｓｔｅｄａｎｄｍｏｖｅｄｔｏａｎｏｔ
ｈｅｒｓｕｒｆａｃｅ”，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌ
ｅｃｕｌｅｓ，１，３７７−３８１（２０００）に
は、同一表面に二種類の高分子を固定化して細胞接着性
弱疎水性ドメインと細胞非接着性高親水性ドメインを作
製することが記載されている。いずれも本願発明の要素
技術を示すものである。

【０００８】本発明において、「高密度」とは、培養基
板１ｃｍ²あたり５００〜１００，０００ヶ所の細胞付
着性高分子が被覆された領域が各々分離した状態で配列
することができる表面であることを意味する。好ましく
は、培養基板が１ｃｍ²あたり１，０００〜５０，００
０ヶ所、特に好ましくは、１０，０００〜３０，０００
ヶ所を各々分離した状態で配列することできる表面を有
することが特に好ましい。本発明では、その細胞付着性
領域それぞれに細胞を付着させるが、その付着させる細
胞数には何ら制約はないが、細胞付着性領域の広さと細
胞の大きさを考え、1ヶ所の細胞付着性領域に１〜２０
個の細胞を付着させるのが良く、好ましくは１〜５個、
さらに好ましくは１〜２個の細胞を付着させるのが良
い。本発明の細胞付着性高分子とは、例えば、イオン性
基、親／疎水性基等を有するもの、また、それらを支持
体表面に被覆後、グロー放電、コロナ放電などで表面処
理を施したもの、さらには、フィブロネクチン、コラー
ゲン、ラミニン等の細胞接着性蛋白質のいずれかもしく
は組み合わせた高分子或いはそれらの処理物で良く、特
に限定されるものではない。

【０００９】本発明では、細胞付着性高分子として、刺
激応答性高分子を用いることで、化学物質による検定、
或いは遺伝子導入後等に、特定の活性を有する細胞のみ
を選択的に剥離させられる。その刺激応答性高分子の一
例である温度応答性高分子は、ホモポリマーであっても
共重合体であってもよい。使用し得る温度応答性高分子
の基本構成単位としては、例えば、アクリルアミド、メ
タクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ
−エチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温
度７２℃）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（同２１
℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７
℃）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、
Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、Ｎ−
シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、Ｎ−シク
ロプロピルメタクリルアミド（同６０℃）、Ｎ−エトキ
シエチルアクリルアミド（同約３５℃）、Ｎ−エトキシ
エチルメタクリルアミド（同約４５℃）、Ｎ−テトラヒ
ドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、Ｎ−テ
トラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）
等のＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、
Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エ
チルメチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解
温度５６℃）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３
２℃）等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルア
ミド誘導体、さらに１−（１−オキソ−２−プロペニ
ル）−ピロリジン（同５６℃）、１−（１−オキソ−２
−プロペニル）−ピペリジン（同約６℃）、４−（１−
オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オ
キソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１
−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペ
リジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニ
ル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリル
アミド誘導体、メチルビニルエーテル（単独重合体の下
限臨界溶解温度３５℃）等のビニルエーテル誘導体、ま
た細胞の種類によって臨界溶解温度を調節する必要があ
る場合や、被覆物質と支持体との相互作用を高める必要
が生じた場合や、細胞付着性表面の親水、疎水性のバラ
ンスを調整する等の目的で、上記以外のモノマー類との
共重合、重合体同士のグラフト重合または共重合、ある
いは重合体、共重合体の混合物を用いてもよい。また、
重合体本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可
能である。また、刺激応答性高分子の一例である光応答
性高分子としては、アゾベンゼン基を有する吸収性高分
子のように光異性化反応を起こす高分子、トリフェニル
メタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリ
ルアミド系単量体との共重合体のように光イオン解離す
る感応基を有する温度応答性高分子、或いはスピロベン
ゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲルの
ように疎水性相互作用が光変化する温度応答性高分子を
用いることができる。被覆を施される支持体の材質は、
通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリス
チレン、ポリメチルメタクリレート等の物質のみなら
ず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以
外の高分子化合物、セラミックス、金属類など全て用い
ることができる。その形状は、ペトリ皿等の細胞培養皿
に限定されることはなく、プレートであってもよい。

【００１０】支持体への細胞付着性高分子の被覆方法
は、支持体と被覆物質を、（１）化学的な反応によって
結合させる方法、（２）物理的な相互作用を利用する方
法、を単独でまたは併用して行うことができる。すなわ
ち、（１）化学的な反応によって結合させる場合は、電
子線照射（ｅｌｅｃｔｒｏｎｂｅａｍ；ＥＢ）、γ線
照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用い
ることができる。さらに、支持体と被覆材料が適当な反
応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反
応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用
することができる。（２）物理的な相互作用による方法
としては、被覆材料単独または支持体との相溶性のよい
マトリックスを媒体とし（例えば、支持体を形成するモ
ノマーまたは支持体と相溶性のよいモノマーと被覆材料
とのグラフトポリマー、ブロックポリマー等）、塗布、
混練等の物理的吸着を用いる方法等がある。細胞付着性
高分子として刺激応答性高分子を選択しない場合、その
被覆量に制約はないが、細胞付着性高分子として刺激応
答性高分子を選択した場合、その被覆量は、０．１〜
５．０μｇ／ｃｍ²の範囲が良く、好ましくは０．３〜
３．０μｇ／ｃｍ²であり、さらに好ましくは０．５〜
２．５μｇ／ｃｍ²である。０．１μｇ／ｃｍ²より少な
い被覆量のとき、刺激を与えても当該高分子上の細胞は
剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。
逆に５．０μｇ／ｃｍ²以上であると、その領域に細胞
が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難とな
る。高分子の被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光計
全反射法（ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ法）、被覆領域の染色や
蛍光物質の染色による分析、さらに接触角測定等による
表面分析を単独或いは併用して求めることができる。本
発明の細胞付着領域の広さが分析可能な範囲より狭い場
合は、あらかじめ分析可能な広さで被覆量を求めておく
必要があり、その条件と同条件で被覆すれば良い。

【００１１】本発明の高密度細胞アレイ基板は、上記細
胞付着性高分子が被覆された領域の周りを細胞非付着性
の親水性高分子が被覆された領域で囲んだものである。
その細胞非付着性の親水性高分子が被覆された領域内に
ある細胞付着性高分子が被覆された領域の数は何ら制約
されるものではないが、好ましくは1〜５０個、さらに
好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜５個であ
る。本発明の高密度細胞アレイ基板はこの細胞非付着性
の親水性高分子毎に培地が分割されるので、細胞非付着
性の親水性高分子が被覆された領域内にある細胞付着性
高分子が被覆された領域の数が少ないほど、多くの細胞
を異なる条件下で培養できるようになり、したがって検
体数も多くなり好ましい。細胞非付着性の親水性高分子
として、例えば、ポリアクリルアミド、ポリジメチルア
クリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロースな
どが挙げられるが、細胞を付着させず、水と親和性の高
いものならばいずれのものでも良い。細胞非付着性の親
水性高分子の被覆量は、微量の培地の保持ができれば何
ら制約されないが、その被覆量は、０．１〜２０．０μ
ｇ／ｃｍ²の範囲が良く、好ましくは０．３〜１０．０
μｇ／ｃｍ²であり、さらに好ましくは０．５〜５．０
μｇ／ｃｍ²である。０．１μｇ／ｃｍ²より少ない被覆
量のとき、微量の培地のを保持し難く、逆に２０．０μ
ｇ／ｃｍ²以上であると顕微鏡下で観察する際、この領
域の凹凸の像が顕著となり好ましくない。ここに示す各
分析値は、上記の方法に従えば求めることができる。ま
た、支持体への細胞非付着性の親水性高分子の固定は、
細胞付着性高分子を被覆したときの方法に従えば良い。

【００１２】本発明では、この細胞非付着性の親水性高
分子が被覆された領域の周りをさらに細胞非付着性の強
疎水性材料に被覆された領域が連続的に囲んだものであ
る。その材料は、細胞を付着させず、また水をもはじく
ものであれば何ら制約させないが、例えば、シリコーン
高分子やその誘導体、フッ素含有高分子やその誘導体等
が挙げられる。なお、本願明細書および図面において、
「高分子」と「ポリマー」は同じ意味を有し、それぞれ
置き換え可能である。細胞非付着性の親水性高分子の被
覆量は、微量の培地の保持ができれば何ら制約されない
が、その被覆量は、０．１〜２０．０μｇ／ｃｍ²の範
囲が良く、好ましくは０．３〜１０．０μｇ／ｃｍ²で
あり、さらに好ましくは０．５〜５．０μｇ／ｃｍ²で
ある。０．１μｇ／ｃｍ²より少ない被覆量のとき、微
量の培地をはじき難く、逆に２０．０μｇ／ｃｍ²以上
であると顕微鏡下で観察する際、この領域の凹凸の像が
顕著となり好ましくない。ここに示す各分析値は、上記
の方法に従えば求めることができる。また、支持体への
細胞非付着性の強疎水性高分子の固定は、細胞付着性高
分子を被覆したときの方法に従えば良い。

【００１３】本発明の高密度細胞アレイ基板の製造は、
得られた高密度細胞アレイ基板表面に、少なくとも細胞
を付着させられる領域、その外側に微量の培地を保持さ
せられる領域、さらにその外側に微量の培地をはじける
領域が形成されていれば何ら制約されるものではない
が、例えば支持体側から細胞付着性高分子層、親水性高
分子層、強疎水性材料層の順に積層されたものを用い、
レーザーアブレーションにより各層の一部が基板の表面
に現れるように削っていく方法が挙げられる。得られる
構造体を図１に示す。その製造法は、図２に示す通りで
ある。すなわち、ポリスチレンを基板として用い、プラ
ズマ照射することにより細胞が接着できる細胞付着性領
域となる。このポリスチレンの基板上に、親水性、強疎
水性の２つの高分子を電子線照射法により順次、積層さ
せた後、ＵＶエキシマレーザーの強度を変えながら、一
層および二層の厚さだけ削って、親水性領域、細胞付着
性領域を露出させる。この方法により、１細胞の大きさ
（約５〜４０マイクロメートル四方）に十分な広さの細
胞付着性領域を露出させることができる。この作業を繰
り返して、５００個〜１００，０００個／ｃｍ²の密度
で細胞アレイを作製することができる(図３)。

【００１４】こうして得られた高密度細胞アレイ基板に
対し、以下に示す方法で、細胞を付着させ、さらに親水
性高分子の被覆領域ごとに独立して培地を付着させる。
まず、高密度細胞アレイ基板への細胞付着は、常法通
り、基板全体を覆うに十分な量の培地中に所定の細胞を
分散させ、静置させるだけで良い。分散された細胞は沈
降し、細胞付着性領域にのみ付着する。次に、過剰な培
地を静かに吸引し続ければ、培地を親水性高分子の被覆
領域ごとに独立して残すことができる。その際、さらに
吸引して、インクジェットプリンタヘッドを用いてあら
ためて個々の細胞に対し培地の微量液滴を付着させる方
法でも良い。上記高密度細胞アレイの各々の細胞を含む
培地に任意の濃度で化学物質（例えば、薬物、毒物等）
を自動注入は、例えば、図４に示すようなインクジェッ
トプリンタヘッドを改造した化学物質の自動希釈機能付
き自動注入装置（ナノディスペンサー）を用いることで
できる。本装置によれば、化学物質貯蔵タンク、希釈用
培地貯蔵タンク、マイクロポンプ、マイクロバルブから
なる自動希釈回路をプリンタヘッド流路に接続し、ポン
プ、バルブおよびヘッドをコンピュータで制御し、薬物
を任意の濃度で出力できる。出力する液量はすでに２〜
数十ピコリットルオーダーの液滴の出力が実現しており
問題ない。これをコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに
設置した細胞アレイの真上に設置し、細胞アレイの位置
を移動させながら注入する。

【００１５】上記高密度細胞アレイ基板および上記自動
注入装置に既存の共焦点レーザー走査顕微鏡，コンピュ
ータ制御Ｘ−Ｙステージ、および細胞の生死、細胞活性
を検出するための蛍光分析装置を組み合わせることによ
り、アッセイ系を確立することができる。

【００１６】以下に本発明の技術の具体的に述べる。細
胞アレイ用支持体としては、安価でありまた透明である
ため光学顕微鏡観察に適したプラズマ処理ポリスチレン
利用することができる。この上に刺激応答性高分子、さ
らにその上に、１細胞毎の培地の保持するために必要な
親水性領域を形成する親水性高分子、そして、１細胞毎
に培地を隔離させるために必要な疎水性領域を形成する
疎水性高分子を積層して共有結合的に固定化する。各層
の固定は、まず、最下層のモノマーを展開した後に電子
線照射することで行い、これをくり返すことで完了す
る。これをＵＶレーザーを用いて任意サイズ、形にアブ
レーションすることにより、細胞付着性高分子に被覆さ
れた領域が高密度（１ｃｍ²に細胞５００個〜１００，
０００個）で配列した基板を作製する。また、インクジ
ェットプリンタヘッドを改造した自動希釈機能付きナノ
ディスペンサーを用いることにより、各々の細胞を含む
培地に任意の濃度で薬物の自動注入が可能となる。スル
ープットは細胞５００個〜１００，０００個あたり流路
の洗浄なしで１分以内を実現する。洗浄は希釈系列の変
更すなわち薬物の変更毎におこなうが、一洗浄あたり１
０秒〜６０秒で行なうことが可能である。細胞反応の検
出については、既存の共焦点レーザー走査顕微鏡を用
い、Ｘ−Ｙステージをコンピュータ制御のものに交換し
て用いる。なお、ＴＯＦ−ＳＩＭＳと接続することによ
り１細胞中に発現する全タンパク質を定量的に検出する
ことも可能である。例えば、１枚の細胞アレイにガン細
胞と正常細胞をそれぞれ１万個ずつ播種し、薬物を作用
させた後、細胞の生死、細胞活性を検出する蛍光性物質
を用いて、多種類の薬物の濃度依存的なガン細胞殺傷
能、細胞毒性を１枚の細胞アレイで同時にアッセイでき
る。これによって、超多検体細胞アッセイ自動化システ
ムが安価で構築できる。また、本システムは、臨床現場
における抗ガン剤のスクリーニングのみならず、新薬開
発や環境アセスメントなどにも用いることができる。さ
らに、本発明の技術によれば、アレイ状に高密度に配置
した細胞に遺伝子導入を行い、遺伝子発現した細胞のみ
選択的にアレイ基板上から回収したり、あるいは化学物
質に対する細胞活性を測定し、特定の反応性を示す細胞
のみを選択的にアレイ基板上から回収することができ
る。回収した細胞を増殖させ組織として利用したり、細
胞医薬や医療用具として利用可能である。

【００１７】本発明ではヒトに作用する薬物・毒物を対
象としてヒトおよび動物細胞を培養するが、これらの細
胞を用いて１細胞〜少数の細胞づつ培地を分離して培養
できる培養系に関する報告は存在しない。また、本発明
においては超多検体アッセイの全自動化を目的として、
自動希釈機能付きナノディスペンサーを提供するが、マ
イクロメートルの空間制御とナノリットルの液滴量を実
現する、このような精度のナノディスペンサーについて
も報告はない。インクジェットプリンタヘッドを改造し
たマイクロディスペンサーに関する報告はいずれも数桁
大きなサイズである。最新のヘッドとＸ−Ｙステージを
組み合わせることにより本発明のナノディぺンサーを作
製することが可能となった。本発明では、培地が完全に
分離された１細胞１培養環境が５００〜１００，０００
個配列した高密度細胞アレイ基板と自動希釈機能付ナノ
ディスペンサを組み合わせることで、一枚のプレパラー
ト上で５００〜１００，０００種類の異なる培養条件を
達成し、薬物・毒物の迅速な超多検体評価を行なうこと
が可能であり、これらの点は従来技術には全く見られな
い。また、本発明は、特に莫大な情報量の高速処理が求
められる新薬開発や環境アセスメントにも対応できる超
多検体同時計測を可能にする点でも世界に類を見ない独
創的な技術である。本発明においては、臨床の現場で実
際に医師が用いることを目的として、簡便でランニング
コストが安価であることを１つの目的として最大眼重視
している。以上のように、本発明はきわめて独創的で、
また従来の基礎研究的なレベルを大きく超えて産業応用
可能性を大きくもつものである。

【００１８】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されな
い。

【実施例１〜５】細胞付着性高分子としてポリ−Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド、親水性高分子としてポリア
クリルアミド、さらに強疎水性高分子としてポリジメチ
ルシロキサンを使用した。それぞれの層を作成するため
の使用したモノマー、及びポリマー溶液濃度を表１に示
す。これらの溶液を用い、以下の方法で各層を作成し
た。まず、細胞付着性高分子被覆領域を作成するため、
表1に示す濃度のＮ−イソプロピルアクリルアミドモノ
マーのイソプロピルアルコール溶液を０．０１ｍｌ／ｃ
ｍ²の割合でポリスチレン製支持体上に塗布をした。こ
のものへ０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射し、支持
体表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを被覆
させた。照射後、基板を水で十分に洗浄し、乾燥させる
ことでポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層を有す
る基板を得た。基板上のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド被覆量を表２に示す。次に、この上へ細胞非付
着性の親水性高分子被覆領域を作成するため、表1に示
す濃度のアクリルアミドモノマーのイソプロピルアルコ
ール溶液を０．０１ｍｌ／ｃｍ²の割合で基板上に塗布
をした。このものへ上記方法と同様な強度の電子線を照
射させ、その後、洗浄、乾燥を行うことでポリ−Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド層の上にポリアクリルアミド
層を有する基板を得た。基板上のポリアクリルアミド被
覆量を表２に示す。さらに、この上へ細胞非付着性の強
疎水性高分子被覆領域を作成するため、表1に示す濃度
のポリジメチルシロキサンのエタノール溶液を０．０１
ｍｌ／ｃｍ²の割合で基板上に塗布をした。このものへ
上記方法と同様な強度の電子線を照射させ、その後、洗
浄、乾燥を行うことで上記基板上にポリジメチルシロキ
サン層を有する基板を得た。基板上のポリジメチルシロ
キサン被覆量を表２に示す。得られた基板をコンピュー
タ制御のＸ−Ｙステージ上に置き、ＡｒＦエキシマレー
ザー（波長１９３ｎｍのパルスレーザー、浜松ホトニク
ス製Ｌ５９１０）を用いて、各層が基材表面に現れるよ
うに削っていった。その際、ポリアクリルアミド層を露
出させるために０．１Ｊ／ｃｍ²の強度のレーザーを用
いた。さらにその中心部に約３０μｍの正方形のポリ−
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層を露出させるため
に、さらに０．１Ｊ／ｃｍ²の強度のレーザーで表面を
削った。これらの操作を繰り返し、１０，０００ヶ所／
ｃｍ²のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層を露
出させた。反射型レーザー共焦点顕微鏡により、削られ
た表面がきわめて平坦であり、エッジもシャープである
こと、アブレートした結果、各層の厚さは約３０ｎｍで
あることが明らかになった。また、基材表面の元素分析
をＥＳＣＡによって行ったところ、ポリアクリルアミド
層としたところにＳｉ元素の存在は認められず、ポリ−
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド層としている領域のＮ
元素濃度はポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとそ
れと一致していることから、本実施例の操作により各層
が基材の表面として露出できていることを確認すること
ができた。次に、得られた基板上にシリコーンゴムを介
して壁を設け、その中へ５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、
１０^-8Ｍデキサメサゾン、１０^-7Ｍインスリン、１０ｍ
Ｍニコチンアミド、さらに１０ｎｇ／ｍｌ上皮細胞成長
因子（ＦＧＦ）を含むウィリアムズＥ培地を培地として
１０⁵個／ｍｌ濃度で分散されたラット初代肝実質細胞
を播種した。５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で３時間
静置させることで各ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド層に１個のラット初代肝実質細胞が付着した。その
一例として、実施例１の高密度細胞アレイ基板上の肝実
質細胞のようすを図５に示す。細胞は細胞付着性高分子
領域を認識し、選択的に接着していた。次に、基板上の
培地を静かに吸引し、インクジェットプリンタヘッドを
改造したマイクロディスペンサーにより各親水性高分子
被覆領域に１０ピコリットル上記培地中にの０〜４．５
ｍＭのジクロルベンゼンを分散させたもの（０．５ｍＭ
毎に１０種類。１０００個の各親水性高分子被覆領域毎
に濃度を変えた。）を３７℃下で付着させた。１０分
後、２．５ｍＭ以上のジクロルベンゼンが分散された培
地中の細胞が形態的に異なっていた。その後、本基板全
体を上記培地で十分洗浄し、最終的に再び静かに培地を
吸引し、各親水性高分子被覆領域のみに培地が残るよう
にした。そのまま２０℃で１５分間冷却し、基材表面か
ら剥離しかけている細胞を、ジクロルベンゼン分散濃度
別にシリンジを用いて剥離、回収することができた。

【００１９】

【比較例１〜４】表１に示す溶液濃度のものを使う以外
は、実施例１〜５と同様な製造法によって高密度細胞ア
レイ基板を得た。その後、同様な操作で細胞を播種し、
親水性高分子被覆領域のみに培地を残すことを試みた。
得られた基板の被覆量を表２に示す。親水性高分子の被
覆量が少ないと培地を保持させることは困難であった。
また、多すぎると含水した高分子層の凹凸が顕著にな
り、顕微鏡下での観察の際、視野が悪くなり、基材とし
て適当なものではなかった。強疎水性高分子の被覆量が
少ないと培地をはじかせることは困難であった。また、
多すぎると高分子層の凹凸が顕著になり、顕微鏡下での
観察の際、視野が悪くなり、基材として適当なものでは
なかった。

【００２０】

【表１】

【００２１】

【表２】

【００２２】

【実施例６】細胞付着性高分子被覆領域を作成するた
め、２０ｗｔ％１，２−ナフトキノンジアジド−４−ス
ルホン酸を側鎖に有するフェノール樹脂のジオキサン溶
液を用いる以外、実施例１と同様な製造法によって高密
度細胞アレイ基板を得た。得られた基板上の上記ポリマ
ーの被覆量は１．１μｇ／ｃｍ²であった。その後、同
様な操作で細胞を播種し、ジクロルベンゼンによるアッ
セイを行った。細胞の剥離、回収は各親水性高分子被覆
領域毎に５分間、ＵＶ光を照射することで行えた。この
方法によれば、光を各親水性高分子被覆領域毎に集めら
れ、１ヶ所の親水性高分子被覆領域内にある細胞を選択
的に剥離、回収できることを確認することができた。

【００２３】

【発明の効果】本発明の高密度細胞アレイ基板、及びそ
れを利用したアッセイ系により、使用する薬剤（例え
ば、抗ガン剤）の種類、使用濃度の最適化をおこなうこ
とで、薬剤の副作用を大きく減少させると共に、疾患の
薬物治療成績を大きく向上させることが可能である。こ
のことは、患者の予後を向上させ、また再発率を下げる
ことで、医療経済にも大きく貢献すること期待される。
また、本技術は、医薬品開発や環境アセスメント、基礎
生命科学的研究にも利用でき、極めて有効な技術であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の高密度細胞アレイ基板の一例を示す図
である。

【図２】本発明の高密度細胞アレイ基板を製造する一方
法を示す工程図である。

【図３】（ａ）は高密度細胞アレイ基板に細胞と培地を
配置した一部を示す図である。（ｂ）は本発明の高密度
細胞アレイ基板の一例を示す図である。

【図４】本発明のインクジェットプリンターを用いた多
検体細胞のアッセイ方法を説明する図である。

【図５】本発明の高密度細胞アレイ基板表面上に配列し
た肝細胞の図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｄ４Ｂ０６５Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ａ４Ｃ０８４ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｍ 33/53 33/566 33/566 37/00 １０２ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B024 AA11 BA80 GA11 GA16 HA11 4B029 AA02 AA07 AA23 BB01 CC08 DG01 DG06 DG08 FA04 FA12 4B033 NA11 NB02 NB36 NB67 NC06 NC12 NC16 ND08 ND12 ND20 4B063 QA01 QA05 QA19 QA20 QQ20 QQ61 QQ91 QR74 QR82 QS22 QS24 QS28 QS40 QX01 4B065 AA90X AC20 BC41 BC48 4C084 AA17 NA20 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞付着性高分子に被覆された領域が不
連続に微細に規則正しく並べられ、そのまわりを細胞非
付着性の親水性高分子に被覆された領域が囲み、さらに
そのまわりを細胞非付着性の強疎水性材料に被覆された
領域が連続的に囲んでいる表面を持つことを特徴とする
高密度細胞アレイ用基板。
【請求項２】細胞付着性高分子に被覆された領域が５
００〜１００，０００個／ｃｍ²の割合で配列されたも
のであることを特徴とする請求項１記載の高密度細胞ア
レイ用基板。
【請求項３】細胞付着性高分子が刺激応答性高分子で
あることを特徴とする請求項１、２記載の高密度細胞ア
レイ用基板。
【請求項４】刺激応答性高分子が光に応答するもので
あることを特徴とする請求項３記載の高密度細胞アレイ
用基板。
【請求項５】細胞非付着性の親水性高分子に被覆され
た領域が、細胞付着性高分子に被覆された領域を一ヶ所
づつ囲んでいることを特徴とする高密度細胞アレイ用基
板。
【請求項６】支持体上に少なくとも細胞付着性高分子
層、細胞非付着性の親水性高分子層、さらに細胞非付着
性の強疎水性材料層が積層されたものに対し、それぞれ
の層の一部が基板表面の一部として現れるようにレーザ
ーアブレーションすることを特徴とする請求項１〜５記
載の高密度細胞アレイ用基板の製造方法。
【請求項７】積層されたものが支持体側から刺激応答
性高分子層、親水性高分子層、強疎水性高分子層の順に
積層されたものであることを特徴とする請求項６記載の
高密度細胞アレイ用基板の製造方法。
【請求項８】細胞付着性高分子に被覆された領域毎に
細胞を付着させ、細胞非付着性の親水性高分子に被覆さ
れた領域毎に微量の培地を付着させて利用することを特
徴する請求項１〜５記載の高密度細胞アレイ用基板の利
用方法。
【請求項９】微小領域で培養している細胞毎に、イン
クジェットプリンタヘッドを利用した任意に希釈もでき
る化学物質自動注入装置を用いて、さまざまな濃度の化
学物質、或いはさまざまな種類の化学物質を投入し、そ
の後、細胞毎に生死の判定、或いは活性測定することを
特徴とする請求項８記載の高密度細胞アレイ用基板の利
用方法。
【請求項１０】微小領域で培養している細胞毎に、特
定の遺伝子を導入し、その後、細胞毎に活性測定するこ
とを特徴とする請求項８記載の高密度細胞アレイ用基板
の利用方法。
【請求項１１】細胞評価、或いは遺伝子操作後、特定
の活性を持つ細胞のみを、それが付着している細胞付着
性高分子領域に刺激を与えることで剥離、回収すること
を特徴とする請求項８〜１０記載の高密度細胞アレイ用
基板の利用方法。
【請求項１２】細胞付着性高分子に被覆された領域に
与える刺激が光であることを特徴とする請求項１１記載
の高密度細胞アレイ用基板の利用方法。
【請求項１３】請求項１〜５記載の高密度細胞アレイ
を用いることを特徴とする化学物質のスクリーニング方
法。
【請求項１４】化学物質が医薬品である請求項１３記
載のスクリーニング方法。
【請求項１５】医薬品が抗ガン剤である請求項１４記
載のスクリーニング方法。
【請求項１６】化学物質が毒物、環境有害物質である
請求項１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】請求項１〜５記載の高密度細胞アレイ
用基板を用いることを特徴とする遺伝子導入方法。