WO2007063736A1 - マイクロアレイチップ、これを用いた細胞アレイ、およびその製造方法 - Google Patents

マイクロアレイチップ、これを用いた細胞アレイ、およびその製造方法 Download PDF

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WO2007063736A1
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WO
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cells
microarray chip
cell array
flow paths
photoresponsive material
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PCT/JP2006/323145
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kimio Sumaru
Yuuichi Tada
Shinji Sugiura
Junichi Edahiro
Toshiyuki Kanamori
Toshiyuki Takagi
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Definitions

  • Microarray chip cell array using the same, and manufacturing method thereof
  • the present invention relates to a microarray chip used for drug screening, a cell array using the same, and a method for producing the same.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-46121
  • the conventional technique has a problem that it takes time and effort to arrange cells on a chip.
  • antibodies may affect the physiological state of cells, so the state of cells is not constant, and it is important to accurately measure the effect of drugs on cells. It was sometimes difficult.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances.
  • a microarray chip that can easily hold cells on a chip and enables accurate measurement when examining the action of a drug on cells. It is an object of the present invention to provide a cell array using the above and a method for producing the same.
  • a microarray chip having a plurality of flow paths, wherein a photoresponsive material layer made of a photoresponsive material is formed on an inner surface of the flow path, and the photoresponsive material layer irradiates light.
  • a microarray chip characterized in that cells can adhere by doing so.
  • the test method is characterized in that these drugs are brought into contact with the cells and the action of the drugs on the cells is detected.
  • a photoresponsive material layer is formed in the flow path! Therefore, by irradiating the light-responsive material layer with light, the irradiated portion can be cell-adhered.
  • the cells can be directly adhered to the photoresponsive material layer on the inner surface of the flow path without interposing a substance (such as an antibody) for adhesion. Therefore, the cells can be held in the flow path by an easy operation.
  • a physiologically active substance such as an antibody
  • this physiologically active substance may have some influence on the physiological state of the cell, whereas in the present invention, the photoresponsive material is attached to the cell. Since the physiological effect is small, the physiological state of the cell can be kept constant and the action of the drug on the cell can be accurately measured.
  • FIG. 1 is a configuration diagram showing an example of a cell array of the present invention.
  • FIG. 2 is a process diagram showing a method for producing the cell array shown in FIG. 1.
  • FIG. 3 is a process diagram following the previous diagram.
  • FIG. 4 is a process diagram following the previous diagram.
  • FIG. 5 is a process diagram following the previous diagram.
  • FIG. 6 is an explanatory view showing an example of a method using the cell array shown in FIG. 1.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram showing a method for detecting a reaction between a cell and a drug using the cell array shown in FIG. 1.
  • FIG. 8 Fluorescence microscope images of CHO-K1 cells and MDCK cells independently carried in different predetermined regions in the same channel, based on fixation by local light irradiation.
  • FIG. 9 CHOs that are independently supported on different predetermined areas in the same channel, where the cell adhesion area is previously localized in the form of dots by PDMS pattern application, based on fixation by local light irradiation. -Fluorescence microscope images of K1 cells and MDCK cells.
  • FIG. 1 shows an example of the cell array of the present invention.
  • the first to fourth cells 4a to 4d are held in the first to fourth flow paths 3a to 3d formed in the microarray chip 2.
  • Suitable materials for the microarray chip 2 include silicone resin (for example, polydimethylsiloxane resin), acrylic resin (for example, polymethyl methacrylate resin), polystyrene resin (S), polyethylene resin. ⁇ S, polypropylene ⁇ S, polycarbonate ⁇ resin, epoxy ⁇ resin, glass, silicon and the like.
  • silicone resin for example, polydimethylsiloxane resin
  • acrylic resin for example, polymethyl methacrylate resin
  • S polystyrene resin
  • S polyethylene resin. ⁇ S, polypropylene ⁇ S, polycarbonate ⁇ resin, epoxy ⁇ resin, glass, silicon and the like.
  • the shape of the first to fourth flow paths 3a to 3d is not particularly limited.
  • the cross-sectional shape thereof may be a rectangle, a triangle, a trapezoid, a circle, a semicircle, an ellipse, or the like.
  • the flow paths 3a to 3d have a linear shape in plan view and are formed substantially parallel to each other.
  • the flow paths 3a to 3d are preferably closed flow paths formed by, for example, disposing a cover material on a base material on which grooves are formed.
  • a photoresponsive material layer 5 is formed on the inner surfaces of the flow paths 3a to 3d.
  • the photoresponsive material layer 5 also has a photoresponsive material force in which spirobenzopyran whose structure and charge state change by light irradiation is supported on the side chain or terminal of the main polymer.
  • the main polymer is not particularly limited, but a polymer of N-substituted acrylamide is suitable as such a polymer that is preferably a nonionic and moderately hydrated polymer.
  • N-substituted acrylamide examples include N-alkyl acrylamide and N-alkylene acrylamide.
  • N-alkylacrylamide examples include N-isopropylacrylamide, N-ethylacrylamide, N, N-jetylacrylamide, and Nn-propylacrylamide.
  • Spirobenzopyran is a photochromic molecule.
  • a photochromic molecule is one that reversibly generates isomers with different properties such as dipole moment and charge in the molecule when the molecular structure is changed by irradiation with light of a specific wavelength.
  • Examples of spirobenzopyran that can be used in the present invention include those represented by the following formula (1).
  • Rl, R2, and R3 each represent a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group.
  • X is preferably a hydrogen atom or an electron donating group as a substituent.
  • electron donating groups include alkyl groups, aryl groups, alkoxy groups, furan groups, amino groups, (alkyl substituted) amino groups, (dialkyl substituted) amino groups, and the like.
  • Y is preferably a hydrogen atom or an electron-withdrawing group as a substituent.
  • Spirobenzopyran reversibly generates isomers with different charges or different dipole moments in the molecule upon irradiation with light.
  • the concentration of spirobenzopyran is too low or too high, the photoresponsive force of the photoresponsive material becomes small, so the concentration of the spirobenzopyran is 0.5 with respect to the polymerizable monomer constituting the main polymer. ⁇ 20 mol% (for example, 2 ⁇ : L0 mol%) is preferable.
  • the photoresponsive material is preferably a non-crosslinked (that is, linear) polymer.
  • a polymerization initiator an organic peroxide such as peroxybenzoyl
  • An azo polymerization initiator such as 2,2′-azobis (isobutyric-tolyl) can be used.
  • DMPA 2,2-dimethoxy-2-phenolacetophenone
  • spirobenzopyran When the photoresponsive material is irradiated with light of a specific wavelength, spirobenzopyran generates isomers having different charges, and is easily adsorbed on the cell surface.
  • the photoresponsive material represented by the above formula (2) is supported by spirobenzopyran on the side chain of the main polymer (poly (N-isopropylacrylamide)) via a linker containing two amide bonds. It has been.
  • Spirobenzopyran has a -tro group introduced as a substituent.
  • the photoresponsive material is opened by irradiating light (near ultraviolet light) having a wavelength of 350 to 380 nm, and is closed by irradiating light (visible light) having a wavelength of 450 to 600 nm.
  • irradiating light near ultraviolet light
  • visible light visible light
  • the first to fourth cells 4a to 4d are arranged side by side in the channel length direction on the surface of the photoresponsive material layer 5 in the first channel 3a. Similarly to the first flow path 3a, the first to fourth cells 4a to 4d are also arranged on the inner surfaces of the second to fourth flow paths 3b to 3d.
  • the photoresponsive material layer 5 is formed on the inner surfaces of the flow paths 3 a to 3 d of the microarray chip 2.
  • the following method is possible.
  • photoresponsive materials eg N-isopropylacrylamide, spirobenzopyran, and photoinitiator.
  • An organic solvent such as alcohol, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetone, or tetrahydrofuran can be added to the raw materials.
  • the photoresponsive material layer 5 can be formed by applying the raw material to the inner surfaces of the flow paths 3a to 3d.
  • light 10 having a specific wavelength is locally irradiated onto a part of the flow paths 3a to 3d.
  • linear light 10 is irradiated along the direction perpendicular to the flow paths 3a to 3d.
  • a light having a wavelength that allows the photoresponsive material to be adsorbed on the cell surface is used.
  • light having a wavelength of 350 to 380 nm can be used.
  • the charge of the photoresponsive material constituting the photoresponsive material layer 5 changes and is adsorbed on the cell surface. It becomes possible.
  • the first cells 4a adhere to the first irradiated portions 6a to 6d.
  • light having a specific wavelength is irradiated to a position that is a part of the flow paths 3a to 3d and is different from the first irradiation portions 6a to 6d.
  • light is irradiated on the upstream side of the drug flow direction (described later) from the irradiation portions 6a to 6d.
  • the charge of the photoresponsive material changes and can be adsorbed on the cell surface (see FIG. 1).
  • the liquid containing the second cells 4b is caused to flow through the flow paths 3a to 3d, and the second cells 4b are adhered to the second irradiated portions 7a to 7d.
  • a liquid containing the third cells 4c is caused to flow through the flow paths 3a to 3d, and the third cells 4c are adhered to the third irradiated portions 8a to 8d.
  • a specific wavelength is provided at a position that is a part of the flow paths 3a to 3d and is different from the irradiated portions 6a to 6d, 7a to 7d, and 8a to 8d (in the illustrated example, slightly upstream from the irradiated portions 8a to 8d). (Hereinafter referred to as fourth irradiated portions 9a to 9d, see FIG. 1).
  • a liquid containing the fourth cells 4d is caused to flow through the flow paths 3a to 3d, and the fourth cells 4d are adhered to the fourth irradiated portions 9a to 9d.
  • Different cells can be used as the first to fourth cells 4a to 4d.
  • the first to fourth drug-containing liquids 11a to: Lid are allowed to flow through the flow paths 3a to 3d, respectively.
  • Drug-containing liquid 11a-: Lid is preferably a liquid containing different drugs.
  • the first to fourth drug-containing liquids l la to l ld all come into contact with the first to fourth cells 4a to 4d.
  • 16 combinations of all 4 drugs and 4 cells can be performed simultaneously.
  • the detection method is not particularly limited, for example, a drug-containing solution l la to l ld labeled with a fluorescent dye or a radioactive substance is used, and the amount of these taken into the cells 4a to 4d is detected by the intensity of fluorescence or the like. Can be used.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the photoresponsive material layer 5 is formed in the flow paths 3a to 3d, by irradiating the photoresponsive material layer 5 with light, the irradiated portion can be cell-attached. be able to. For this reason, the cells 4a to 4d can be directly adhered to the photoresponsive material layer 5 on the inner surface of the flow paths 3a to 3d without interposing an adhesion substance (such as an antibody). Therefore, the cells 4a to 4d can be adhered to the flow paths 3a to 3d by an easy operation.
  • a method of selecting and separating cells there is a method of adhering cells using an antibody that specifically binds to the target cells. This method is suitable for cells in which antibodies are obtained. Cannot be used.
  • the method using the cell array 1 has the advantage that it can be applied regardless of the cell type.
  • this physiologically active substance may have some influence on the physiological state of the cell.
  • the method using the cell array 1 is advantageous in terms of cost because it does not require a cell adhesion substance such as an antibody.
  • the cell array 1 using the user's individual cells 4a to 4d, it is possible to cope with the user's individual characteristics. For example, in medical treatment, treatment according to the characteristics of individual patients becomes possible. [0032] In addition, in the prior art, it is difficult to prevent contamination, which is often performed by spotting in an open system, in the operation of placing the cells on the microarray chip. However, in the method using the cell array 1, A series of operations can be performed in the closed system flow paths 3a to 3d.
  • the cell array 1 shown in Fig. 1 was prepared as follows.
  • a microarray chip 2 made of polydimethylsiloxane resin was prepared.
  • the flow paths 3a to 3d were formed in a rectangular cross section having a width of 600 m and a depth of 200 m.
  • the flow paths 3a to 3 of the microarray chip 2 are used.
  • the photoresponsive material layer 5 was formed on the 3d inner surface.
  • the cell suspension was filled in the flow paths 3a to 3d, and near ultraviolet light (wavelength 365 nm) was locally irradiated to a part of the flow paths 3a to 3d for 2.5 minutes. Dose was 260mWZcm 2. Thereby, the 1st cell 4a was made to adhere to the 1st irradiation parts 6a-6d.
  • the second to fourth cells 4b to 4d are bonded to the irradiated portions 7a to 7d, 8a to 8d, and 9a to 9d by the same operation. I let you.
  • CMFD A (5-chloromethyltluorescein aiacetate), a fluorescent dye that can stain only living cells.
  • a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate having a flow channel structure is manufactured using a saddle mold manufactured by using a photolithography method on a silicon wafer, and the PDMS substrate has a photoresponsive property.
  • a flow channel chip was constructed by pressure bonding to the surface of a spirospirane-supported poly (N-isopropylacrylamide) modified substrate.
  • a suspension of CHO-K1 cells was injected into the flow channel chip, and stationary culture was performed in an incubator for an appropriate time. Thereafter, light irradiation was performed on a predetermined cell existence site to capture CHO-K1 cells at the irradiation site, and unadherent cells in the flow path were removed with a phosphate buffer solution.
  • the captured CHO-K1 cells are stained with the green fluorescent dye CMFDA, then the MDCK cells pre-stained with the red fluorescent dye CMTPX are uniformly seeded, cultured, irradiated to light at a predetermined position, and washed. Went.
  • the light irradiation conditions for capturing the cells were a wavelength of 365 nm, 260 mW / cm 2 , and 2.5 minutes.
  • Figure 8 shows a microscopic image of the cell culture surface after each experimental operation.
  • Cell culture in a microspace is difficult, but as a result of examining the chip structure and culture conditions, it became possible to uniformly seed and culture cells in the microspace (a).
  • the cells were detached by the washing operation at the non-irradiated site, whereas the cells remained on the photoresponsive cell culture substrate at the irradiated site.
  • CHO-K1 cells stained with CMFDA which emits fluorescence based on esterase activity, are still fluorescent after light irradiation, confirming that the cells were captured by light irradiation without impairing viability.
  • B Furthermore, MDCK cells were introduced (c), and light irradiation and washing were performed in the same manner, indicating that MDCK cells and CHO-K1 cells can be placed at different positions in the same microchannel (d, e). .
  • PDMS which inhibits cell adhesion along a specific pattern, was applied by a micro contact printing method in order to prevent cells from moving and proliferating beyond a predetermined area and to keep the cell arrangement stable.
  • a microchannel similar to that in Example 2 with the culture substrate as the bottom surface was prepared, and CHO-K1 cells and MDCK cells were arrayed in the same procedure as in Example 2.
  • Fig. 9 shows a fluorescence microscope image of the cell-carrying channel. In the flow channel, each cell is in a sufficiently separated culture state. Confirmed to remain stable for about 1 day

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Abstract

【課題】細胞を容易にチップ上に保持させることができ、しかも細胞に対する薬剤の作用 を検査するにあたって、正確な測定が可能となるマイクロアレイチップ、これを用いた細 胞アレイ、およびその製造方法を提供する。 【解決手段】複数の流路3a~3dが形成されたマイクロアレイチップ2であって、流路 3a~3dの内面に、光応答性材料からなる光応答性材料層5が形成され、光応答性材料 層5は、光を照射することによって細胞が接着可能とされている。  

Description

明 細 書
マイクロアレイチップ、これを用いた細胞アレイ、およびその製造方法 技術分野
[0001] 本発明は、薬剤スクリーニングなどに用いられるマイクロアレイチップ、これを用いた 細胞アレイ、およびその製造方法に関する。
背景技術
[0002] 生体に対する薬剤の影響を確認するための薬剤スクリーニングは、新薬の開発に 欠くことができない技術である。薬剤スクリーニングには、チップ上に細胞がアレイ状 に保持された細胞アレイが用いられる (例えば特許文献 1を参照)。
細胞をチップ上に配置する技術としては、目的とする細胞と特異的に結合する抗体 を用いて細胞を接着する手法がある。
特許文献 1 :特開 2005— 46121号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] し力しながら、従来技術では、細胞をチップ上に配置するのに手間が力かるという 問題がある。
また、抗体を用いて細胞を接着する技術では、抗体が細胞の生理状態に影響を与 えるおそれがあるため、細胞の状態が一定でなくなり、細胞に対する薬剤の作用を正 確に測定するのが難しくなることがあった。
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、細胞を容易にチップ上に保持させる ことができ、し力も細胞に対する薬剤の作用を検査するにあたって、正確な測定が可 能となるマイクロアレイチップ、これを用いた細胞アレイ、およびその製造方法を提供 することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明の構成は以下の通りである。
(1)複数の流路が形成されたマイクロアレイチップであって、前記流路の内面に、光 応答性材料からなる光応答性材料層が形成され、この光応答性材料層は、光を照射 することによって細胞が接着可能となることを特徴とするマイクロアレイチップ。
(2)前記光応答性材料は、主剤ポリマーの側鎖または末端に、光照射によって構造 と荷電状態が変化するスピロべンゾピランが担持されていることを特徴とする(1)に記 載のマイクロアレイチップ。
(3)前記主剤ポリマーは、 N置換アクリルアミドの重合体であることを特徴とする(2)に 記載のマイクロアレイチップ。
(4)前記主剤ポリマーは、ポリ(N—イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とす る(2)または(3)に記載のマイクロアレイチップ。
(5) (1)〜(4)のうちいずれ力 1つに記載のマイクロアレイチップの複数の流路の光応 答性材料層に、それぞれ複数の細胞が接着しており、前記流路のうち少なくとも 1つ において、この流路に保持された前記複数の細胞のうち 2以上が互いに異なることを 特徴とする細胞アレイ。
(6) (1)〜(4)のうちいずれ力 1つに記載のマイクロアレイチップの複数の流路の光応 答性材料層に、それぞれ複数の細胞が接着した細胞アレイを製造する方法であって 、前記流路の一部に光を照射し、この照射部分に細胞を接着させる工程と、前記流 路の前記照射部分以外の位置に光を照射し、この照射部分に、前記細胞とは異なる 細胞を接着させる工程とを含むことを特徴とする細胞アレイの製造方法。
(7) (5)に記載の細胞アレイを用いて、前記細胞に対する薬剤の作用を検査する方 法であって、前記流路のうち少なくとも 2つに、それぞれ互いに異なる薬剤を含む液 を流すことによって、これら薬剤を前記細胞に接触させ、これら細胞に対する前記薬 剤の作用を検出することを特徴とする検査方法。
発明の効果
本発明のマイクロアレイチップでは、流路に光応答性材料層が形成されて!、るので 、光応答性材料層に光を照射することによって、照射部分を細胞接着可能とすること ができる。
このため、細胞を、接着用の物質 (抗体など)を介在させずに、直接、流路内面の光 応答性材料層に接着させることができる。従って、細胞を容易な操作で流路に保持さ せることができる。 抗体などの生理活性物質を介して細胞を接着する場合には、この生理活性物質が 細胞の生理状態に何らかの影響を与えるおそれがあるのに対し、本発明では、光応 答性材料が細胞に与える生理的な影響が小さいため、細胞の生理状態を一定とし、 細胞に対する薬剤の作用を正確に測定することができる。
また、複数の流路に複数種類の細胞を保持させることによって、多種類のアツセィ を効率よく行うことができる。このため、多種類の薬剤の作用を、容易かつ低コストで 調べることができる。
従って、ユーザー個人の細胞を用いて細胞アレイを作製することによって、ユーザ 一個人の特性に応じた対応が可能となる。例えば、医療において、患者個人の特性 に応じた治療が可能となる。
図面の簡単な説明
[0006] [図 1]本発明の細胞アレイの一例を示す構成図である。
[図 2]図 1に示す細胞アレイの製造方法を示す工程図である。
[図 3]前図に続く工程図である。
[図 4]前図に続く工程図である。
[図 5]前図に続く工程図である。
[図 6]図 1に示す細胞アレイを使用する方法の一例を示す説明図である。
[図 7]図 1に示す細胞アレイを用いて、細胞と薬剤との反応を検出する方法を示す説 明図である。
[図 8]同一流路内の異なる所定の領域に、局所光照射による固定ィ匕に基づいて、そ れぞれ独立に担持された CHO-K1細胞と MDCK細胞の蛍光顕微鏡観察像。
[図 9]PDMSのパターン塗布によって予めドット状に細胞接着領域が限局された同一 流路内の異なる所定の領域に、局所光照射による固定ィ匕に基づいて、それぞれ独 立に担持された CHO- K1細胞と MDCK細胞の蛍光顕微鏡観察像。
符号の説明
[0007] 1…細胞アレイ、 2…マイクロアレイチップ、 3a〜3d…第 1〜第 4流路、 4a〜4d…第 1 〜第 4細胞、 5· · ·光応答性材料層、 6a〜6d、 7a〜7d、 8a〜8d、 9a〜9d" -照射部分 、 11a〜: L id…第 1〜第 4薬剤含有液、 12…検出系。 発明を実施するための最良の形態
[0008] 図 1は、本発明の細胞アレイの一例を示すものである。
ここに示す細胞アレイ 1は、マイクロアレイチップ 2に形成された第 1〜第 4流路 3a〜 3dに、第 1〜第 4細胞 4a〜4dが保持されている。
マイクロアレイチップ 2の構成材料として好適なものとしては、シリコーン系榭脂(例 えばポリジメチルシロキサン榭脂)、アクリル系榭脂(例えばポリメタクリル酸メチル榭 月旨)、ポリスチレン系榭 S旨、ポリエチレン系榭 S旨、ポリプロピレン系榭 S旨、ポリカーボネ 一ト系榭脂、エポキシ系榭脂、ガラス、シリコンなどを挙げることができる。
第 1〜第 4流路 3a〜3dの形状は特に限定されず、例えばその断面形状を矩形、三 角形、台形、円形、半円形、楕円形などとすることができる。
流路 3a〜3dは、平面視形状が直線状とされ、互いにほぼ平行に形成されている。 流路 3a〜3dは、例えば、溝が形成された基材の上にカバー材を配置することなど によって形成された閉鎖系の流路であることが好ましい。
[0009] 流路 3a〜3dの内面には、光応答性材料層 5が形成されている。
光応答性材料層 5は、主剤ポリマーの側鎖または末端に、光照射によって構造と荷 電状態が変化するスピロべンゾピランが担持された光応答性材料力もなる。
主剤ポリマーは、特に限定されないが、非イオン性で水和性が中程度のポリマーが 好ましぐこのようなポリマーとしては、 N置換アクリルアミドの重合体が好適である。
N置換アクリルアミドとしては、 N—アルキルアクリルアミド、 N—アルキレンアクリル アミドを挙げることができる。
N—アルキルアクリルアミドとしては、 N—イソプロピルアクリルアミド、 N—ェチルァ クリルアミド、 N, N—ジェチルアクリルアミド、 N— n—プロピルアクリルアミドを挙げる ことができる。
[0010] スピロべンゾピランは、フォトクロミック分子である。フォトクロミック分子とは、特定波 長の光の照射により分子構造が変化し、分子内の双極子モーメント、荷電などの性 質が異なる異性体を可逆的に生成するものをいう。 本発明で使用できるスピロベンゾピランとしては、次の式(1)に示すものがある。
[化 1]
Figure imgf000007_0001
Rl、 R2、 R3は水素原子、アルキル基、ァリール基、または複素環基を示す。
Xとしては水素原子、または置換基として電子供与性基を導入することが好ま 、。 電子供与性基の例としては、アルキル基、ァリール基、アルコキシ基、フ 二ル基、ァ ミノ基、(アルキル置換)アミノ基、(ジアルキル置換)アミノ基などが挙げられる。
Yとしては水素原子、または置換基として電子吸引性基を導入することが好ましい。 電子吸引性基の例としては、 c ( = o)—で表わされるカルボ二ル基を連結基として 、その一方に置換基が結合して形成される置換カルボニル基や、ホルミル基、ニトロ 基、ハロゲン化アルキル基、シァノ基、ハロゲン原子、ァルケ-ル基、アルキニル基等 が挙げられる。
スピロべンゾピランは、光の照射によって荷電、もしくは分子内の双極子モーメント が異なる異性体を可逆的に生成する。
なお、本発明では、例示したものに限らず、上記式(1)に示すものの誘導体も使用 できる。
スピロべンゾピランの濃度は、低すぎる場合、および高すぎる場合のいずれにおい ても光応答性材料の光応答性力 、さくなるため、主剤ポリマーを構成する重合性モノ マーに対して、 0. 5〜20mol% (例えば 2〜: L0mol%)が好ましい。
上記光応答性材料は、架橋がな ヽ (すなわち直鎖状)ポリマーであることが好ま 、 光応答性材料には、重合開始剤として、過酸ィ匕ベンゾィルなどの有機過酸ィ匕物や 、 2, 2'—ァゾビス (イソブチ口-トリル)などのァゾ重合開始剤を用いることができる。 また、光重合開始剤として、 2, 2—ジメトキシ— 2—フエ-ルァセトフエノン(DMPA) を添加するのが好ましい。
[0014] 上記光応答性材料は、特定波長の光を照射すると、スピロべンゾピランが荷電の異 なる異性体を生成し、細胞表面に吸着しやすくなる。
光応答性材料の具体的な例を以下に示す。
[0015] [化 2]
Figure imgf000008_0001
[0016] 上記式(2)に示す光応答性材料は、主剤ポリマー(ポリ(N—イソプロピルアクリルァ ミド) )の側鎖に、 2つのアミド結合を含むリンカ一を介してスピロべンゾピランが担持さ れている。スピロべンゾピランには、置換基として-トロ基が導入されている。
上記光応答性材料は、波長 350〜380nmの光 (近紫外線)を照射することによつ て開環し、波長 450〜600nmの光(可視光)を照射することによって閉環する。
[0017] 図 1に示すように、第 1流路 3a内の光応答性材料層 5表面には、第 1〜第 4細胞 4a 〜4d力 流路長さ方向に並んで配置されている。第 2〜第 4流路 3b〜3dの内面にも 、第 1流路 3aと同様に、第 1〜第 4細胞 4a〜4dが配置されている。
[0018] 次に、細胞アレイ 1を製造する方法を説明する。
図 2に示すように、マイクロアレイチップ 2の流路 3a〜3d内面に、光応答性材料層 5 を形成する。 光応答性材料層 5を形成するには、例えば次の方法が可能である。
光応答性材料の原料 (例えば N—イソプロピルアクリルアミド、スピロべンゾピラン、 および光重合開始剤)を調製する。上記原料には、アルコール、 N, N—ジメチルホ ルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトン、テトラヒドロフランなど の有機溶媒を添加することができる。上記原料を流路 3a〜3dの内面に塗布すること によって光応答性材料層 5を形成することができる。
[0019] 次いで、図 3に示すように、流路 3a〜3dの一部に、特定波長の光 10を局所的に照 射する。図示例では、流路 3a〜3dに対し垂直な方向に沿う直線状の光 10を照射す る。
流路 3a〜3dに照射する光 10としては、光応答性材料が細胞表面に吸着可能とな る波長のものを使用する。例えば、波長 350〜380nmの光が使用できる。
光 10が照射された部分の流路 3a〜3d (以下、第 1照射部分 6a〜6dという)では、 光応答性材料層 5を構成する光応答性材料の荷電が変化し、細胞表面に吸着可能 となる。
[0020] 次 、で、図 4に示すように、第 1細胞 4aを含む液を流路 3a〜3dに流す。
これによつて、図 5に示すように、第 1細胞 4aは、第 1照射部分 6a〜6dに接着する。
[0021] 次いで、流路 3a〜3dの一部であり第 1照射部分 6a〜6dとは異なる位置に、特定波 長の光を照射する。図示例では、照射部分 6a〜6dよりも薬剤流れ方向(後述)の上 流側に光を照射する。
光が照射された部分の流路 3a〜3d (以下、第 2照射部分 7a〜7dという)では、光 応答性材料の荷電が変化し、細胞表面に吸着可能となる(図 1参照)。
第 2細胞 4bを含む液を流路 3a〜3dに流し、第 2細胞 4bを第 2照射部分 7a〜7dに 接着させる。
[0022] 次!、で、流路 3a〜3dの一部であり照射部分 6a〜6d、 7a〜7dとは異なる位置(図 示例では照射部分 7a〜7dよりもやや上流側)に特定波長の光を照射する(以下、第 3照射部分 8a〜8dという。図 1参照)。
第 3細胞 4cを含む液を流路 3a〜3dに流し、第 3細胞 4cを第 3照射部分 8a〜8dに 接着させる。 [0023] 次いで、流路 3a〜3dの一部であり照射部分 6a〜6d、 7a〜7d、 8a〜8dとは異なる 位置(図示例では照射部分 8a〜8dよりもやや上流側)に特定波長の光を照射する( 以下、第 4照射部分 9a〜9dという。図 1参照)。
第 4細胞 4dを含む液を流路 3a〜3dに流し、第 4細胞 4dを第 4照射部分 9a〜9dに 接着させる。
第 1〜第 4細胞 4a〜4dとしては、互いに異なるものを用いることができる。
[0024] 図 1に示すように、以上の操作によって、 4つの流路 3a〜3dに、 V、ずれも細胞 4a〜
4dが接着された細胞アレイ 1が得られる。
[0025] 次に、細胞アレイ 1を用いて、細胞 4a〜4dに対する薬剤の作用を検査する方法の 一例を説明する。
図 6に示すように、第 1〜第 4薬剤含有液 11a〜: L idを、それぞれ流路 3a〜3dに流 す。薬剤含有液 11a〜: L idは、互いに異なる薬剤を含む液が好ましい。
これによつて、第 1〜第 4薬剤含有液 l la〜l ldは、いずれも第 1〜第 4細胞 4a〜4 dに接触することになる。すなわち、 4種の薬剤と 4種の細胞のすべての組み合わせ である 16通りのアツセィを同時に行うことができる。
[0026] 次いで、図 7に示すように、薬剤含有液 l la〜l ldと細胞 4a〜4dとの反応を、検出 系 12を用いて検出する。
検出方法は特に限定されないが、例えば、蛍光色素や放射性物質で標識した薬 剤含有液 l la〜l ldを使用し、これらが細胞 4a〜4dに取り込まれた量を、蛍光等の 強度により検出する方法が採用できる。
このほか、細胞 4a〜4dに GFP (Green Fluorescent Protein)遺伝子を導入し、産生 した GFP量を蛍光強度に基いて検出する方法、エステラーゼなどの酵素活性に基い て蛍光を発する標識を用い、蛍光強度によって細胞の生存率 (バイアビリティ)を検 出する方法、細胞が産生した生理活性物質を抗体染色することにより細胞の生理活 性を検出する方法なども採用できる。
[0027] マイクロアレイチップ 2では、流路 3a〜3dに光応答性材料層 5が形成されているの で、光応答性材料層 5に光を照射することによって、照射部分を細胞接着可能とする ことができる。 このため、細胞 4a〜4dを、接着用の物質 (抗体など)を介在させずに、直接、流路 3 a〜3d内面の光応答性材料層 5に接着させることができる。従って、細胞 4a〜4dを 容易な操作で流路 3a〜3dに接着させることができる。
[0028] 細胞を選抜、分離する方法としては、目的とする細胞と特異的に結合する抗体を用 いて細胞を接着する方法があるが、この方法は、抗体が得られている細胞にし力適 用できない。
これに対し、細胞アレイ 1を用いる方法は、細胞の種類によらず適用できるという利 点がある。
[0029] また、抗体などの生理活性物質を介して細胞を接着する方法では、この生理活性 物質が細胞の生理状態に何らかの影響を与えるおそれがある。
これに対し、細胞アレイ 1を用いる方法では、光応答性材料が細胞 4a〜4dに与え る生理的な影響が小さいため、細胞 4a〜4dの生理状態を一定とし、薬剤含有液 11a 〜: L idの細胞 4a〜4dに対する作用を正確に測定することができる。
[0030] また、細胞アレイ 1を用いる方法では、抗体などの細胞接着用の物質を必要としな いため、コスト面でも有利である。
さらには、細胞 4a〜4dを、直接、流路 3a〜3d内に接着するので、抗体などを介在 させる場合に比べ、コンタミネーシヨンが起こりにく!/、。
[0031] 従来の細胞アレイでは、細胞に対する薬剤の作用を調べる場合には、細胞が全て 同じ環境下に置かれることが多 、。
これに対し、本発明の一例である細胞アレイ 1を用いる方法では、複数の流路 3a〜 3dに複数種類の細胞 4a〜4dを保持させることによって、細胞 4a〜4dと薬剤含有液 l la〜l Idの全ての組み合わせに関するアツセィを同時に行うことができるため、多 種類のアツセィを効率よく行うことができる。
このため、多種類の薬剤含有液 l la〜l Idの作用を、容易かつ低コストで調べるこ とがでさる。
従って、ユーザー個人の細胞 4a〜4dを用いて細胞アレイ 1を作製することによって 、ユーザー個人の特性に応じた対応が可能となる。例えば、医療において、患者個 人の特性に応じた治療が可能となる。 [0032] また、従来技術では、細胞をマイクロアレイチップ上に配置する操作は、開放系で スポッティングにより行われることが多ぐコンタミネーシヨンを防止するのが難しいが、 細胞アレイ 1を用いる方法では、一連の操作を、すべて閉鎖系の流路 3a〜3d内で行 うことができる。
従って、コンタミネーシヨンを防ぎ、無菌環境下で正確なアツセィが可能である。
[0033] 上記検査方法では、各流路 3a〜3dに、互いに異なる細胞 4a〜4dを接着させたが 、本発明では、複数の流路のうち少なくとも 1つにおいて、この流路に配置された複 数の細胞のうち 2以上が互いに異なって!/、ればよ!/、。
また、上記検査方法では、流路 3a〜3dにそれぞれ異なる薬剤含有液 11a〜: L idを 流したが、本発明では、流路のうち少なくとも 2つに、それぞれ互いに異なる薬剤含 有液を流せばよい。
実施例 1
[0034] 図 1に示す細胞アレイ 1を次のようにして作製した。
ポリジメチルシロキサン榭脂からなるマイクロアレイチップ 2を用意した。流路 3a〜3 dは、幅 600 m、深さ 200 mの断面矩形に形成した。
上述の式(2)に示すように、ポリ(N—イソプロピルアクリルアミド)の側鎖に-トロスピ 口べンゾピランを担持させて得られた光応答性材料を用いて、マイクロアレイチップ 2 の流路 3a〜3d内面に光応答性材料層 5を形成した。
細胞懸濁液を流路 3a〜3d内に満たし、近紫外線 (波長 365nm)を流路 3a〜3dの 一部に局所的に 2. 5分間照射した。照射量は 260mWZcm2とした。これによつて、 第 1照射部分 6a〜6dに第 1細胞 4aを接着させた。
リン酸緩衝液を用いて流路 3a〜3dを洗浄した後、同様の操作により、第 2〜第 4細 胞 4b〜4dを、それぞれ照射部分 7a〜7d、 8a〜8d、 9a〜9dに接着させた。
以上の操作によって、 4つの流路 3a〜3dに細胞 4a〜4dが接着された細胞アレイ 1 を得た。
光応答性材料層 5の表面を、生きた細胞のみを染色できる蛍光色素である CMFD A (5-chloromethyltluorescein aiacetate)で処理しに。
観察の結果、流路 3a〜3dに、生細胞である細胞 4a〜4dが接着されたことが確認さ れた。
実施例 2
[0035] シリコンウェハ上にフォトリソグラフィ一法を用いて作製した铸型を用いて、流路構造 を有するポリジメチルシロキサン(PDMS)基板を作製し、この PDMS基板を、光応答性 を有する-トロスピロスピラン担持ポリ (N-イソプロピルアクリルアミド)修飾基板表面に 圧着することで流路型チップを構築した。この流路型チップ内に CHO- K1細胞の懸 濁液を注入し、適当時間インキュベーター内で静置培養を行った。その後、所定の 細胞存在部位に光照射を行い照射部位の CHO-K1細胞を捕捉し、リン酸緩衝溶液 で流路内の未接着細胞を除去した。続いて捕捉した CHO-K1細胞を緑色蛍光色素 CMFDAで染色した後、赤色蛍光色素 CMTPXで予め染色した MDCK細胞を均一に 播種して培養を行い所定の位置に対し光照射を行った後、洗浄を行った。なお、細 胞捕捉のための光照射条件は、波長 365 nm, 260 mW/cm2、 2.5分とした。
各実験操作後の細胞培養表面の顕微鏡観察像を図 8に示す。微小空間における 細胞培養は困難を伴うが、チップ構造と培養条件を検討した結果、微小空間内で細 胞を均一に播種'培養することが可能となった(a)。また細胞播種後に所定の細胞接 着部位に紫外光照射を行った結果、非照射部位では洗浄操作により細胞が剥離し たのに対して照射部位では光応答性細胞培養基板上に細胞が残存、エステラーゼ 活性に基づ 、て蛍光を発する CMFDAで染色された CHO-K1細胞は、光照射後も蛍 光を発しており viabilityを損なうことなく光照射により細胞が捕捉されていることが確 認された (b)。さらに MDCK細胞を導入し (c)、同様の方法で光照射および洗浄を行 い、 MDCK細胞と CHO-K1細胞を同一微小流路内の異なる位置に配置できることが 示さされた (d,e)。
実施例 3
[0036] 所定の領域を越えて細胞が移動 ·増殖することを防ぎ、細胞配列を安定に保つこと を目的として、特定のパターンに沿って細胞接着を阻害する PDMSをマイクロコンタク トプリント法により塗布した培養基材を底面とする実施例 2と同様の微小流路を作製し 、実施例 2と同様の手順で CHO-K1細胞と MDCK細胞を配列した。細胞担持流路の 蛍光顕微鏡観察像を図 9に示す。流路内で各細胞は互いに十分離れた培養状態を 約 1日間、安定に保つことが確認された

Claims

請求の範囲
[1] 複数の流路が形成されたマイクロアレイチップであって、
前記流路の内面に、光を照射することによって細胞が接着可能な光応答性材料か らなる光応答性材料層が形成されたことを特徴とするマイクロアレイチップ。
[2] 前記光応答性材料は、主剤ポリマーの側鎖または末端に、光照射によって構造と 荷電状態が変化するスピロべンゾピランが担持されていることを特徴とする請求項 1 に記載のマイクロアレイチップ。
[3] 前記主剤ポリマーは、 N置換アクリルアミドの重合体であることを特徴とする請求項
2に記載のマイクロアレイチップ。
[4] 前記主剤ポリマーは、ポリ(N—イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする 請求項 2または 3に記載のマイクロアレイチップ。
[5] 請求項 1〜4のうちいずれ力 1項に記載のマイクロアレイチップの複数の流路の光 応答性材料層に、それぞれ複数の細胞が接着しており、
前記流路のうち少なくとも 1つにお 、て、この流路に保持された前記複数の細胞の うち 2以上が互いに異なることを特徴とする細胞アレイ。
[6] 請求項 1〜4のうちいずれ力 1項に記載のマイクロアレイチップの複数の流路の光 応答性材料層に、それぞれ複数の細胞が接着した細胞アレイを製造する方法であつ て、
前記流路の一部に光を照射し、この照射部分に細胞を接着させる工程と、 前記流路の前記照射部分以外の位置に光を照射し、この照射部分に、前記細胞と は異なる細胞を接着させる工程とを含むことを特徴とする細胞アレイの製造方法。
[7] 請求項 5に記載の細胞アレイを用いて、前記細胞に対する薬剤の作用を検査する 方法であって、
前記流路のうち少なくとも 2つに、それぞれ互いに異なる薬剤を含む液を流すことに よって、これら薬剤を前記細胞に接触させ、これら細胞に対する前記薬剤の作用を 検出することを特徴とする検査方法。
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