JP4365216B2 - 生体触媒ゾルゲルマイクロアレイ - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

発明の背景
化学物質は、陽性および陰性様式の両方で生存生物に影響を与える。新規薬物は生命を救うことができ、あるいは環境汚染は健康問題を引き起しうる。ときどき、同じ化学物質が、陽性および陰性効果の両方を有しうる（疾患を治すが、副作用もまた有する薬物など）。複数の化学物質は相互作用して、予期しない効果を生じ得、例えば、組み合わされたある医薬品は副作用を生じる。例えば、テルフェナジン（SELDANE （登録商標））は、他の薬物とのその相互作用が致命的な心臓不整脈を生じたので、1998年に市場から除かれた。米国におけるある研究は、米国における１年当たり100,000 人の多数の死亡をかかる医薬品副作用(ADR) にあるとし、それが死亡の主な原因の4 番目〜6 番目となっている。

化学物質は、異なる生物において異なる効果) を有しうる( 例えば、動物研究において作用するが、後のヒト試験において失敗する潜在的薬物) 。化学物質の効果はまた、個体間で異なる。多くの医薬品は、患者の１パーセントを助けるのみである。なぜなら、患者は異なる様式で薬物に応答するからである。化学物質の効果はまた、体組織間で変化する。例えば、ある環境毒素は、肝臓または脳などの特定の器官に影響を及ぼす。

これらの差異に対する主な理由は、種、個体、および器官の全ては、異なる種類および量の酵素を有することである。酵素は、細胞が薬物と反応して、化学物質を分解することを可能にする生存細胞の機構の一部である。ヒトにおいて、肝臓における酵素の大きな群は、薬物相互作用および副作用の大部分を担っている。これらの酵素の異なるレベルは、化学物質の影響における多くの変動を担っている。

化学物質の健康への影響を迅速に、有効におよび経済的に試験するための技術が必要である。かかる化学物質としては、数あるなかでも、潜在的新規救命薬、環境汚染物質、職場毒素、潜在的発癌物質、および有益な食物化学物質が挙げられる。現在の方法は、時間および費用がかかりうる生存動物における試験を伴うか、またはしばしばヒトの健康に関連性のない実験室における試験を伴う。

同時に、薬物開発プロセスをスピードアップする技術の必要性がある。新規救命処置を開発するための競争における１つの主要な障害は、新規薬物候補の最適化である。潜在的新規薬物が発見される場合、化学者のチームはしばしばその化学構造を改変して新規化合物を作製し、次いで改善された効力および低減された副作用に対してそれらをスクリーニングする。このプロセスは現在、非常に高価で、複雑で、時間がかかり、かつ労働が強いものであり、著しい量の化学廃棄物を生じる。これらの欠点は、試みられうる最適化の数を大幅に制限し、その結果このプロセスから生じる最終薬物は、可能である最も良好な薬物であり得ない。

したがって、多くの異なる分野にわたり、化学物質の健康への影響を迅速に、有効におよび経済的に試験するための技術に対する必要性がある。とりわけ、ヒト代謝酵素について化学物質、特に医薬を試験するための技術に対する必要性がある。さらに、新規薬物候補を迅速におよび経済的に最適化する必要性がある。

発明の要旨
本明細書に開示されるのは、医薬を含む化学物質の生物学的効果の迅速な、有効なおよび経済的な試験を可能にするマイクロアレイチップである。本発明はまた、迅速におよび経済的に薬物候補のバリエーションを合成し、その生物学的効果を試験するために使用されうる。

本発明の装置は、１つ以上の試験組成物、および少なくとも１つの試験組成物を各々被包する、複数の独立した浸透可能なマイクロマトリックスを含有する。

本発明の方法は、所望の特徴を有する反応を検出するための開示された装置を用いる高スループットスクリーニングである。この方法は、適用される組成物と試験組成物とを反応させるのに適切な条件下で１つ以上の別個の適用される組成物と装置のマイクロマトリックスと組み合わせる工程を含む。別の工程は、所望の特徴に対して上記各反応をアッセイすることである。

本明細書に開示された本発明の利点は、異議深い。本発明は、医薬的利点、毒性、副作用、および薬物間の相互作用についての化学物質の迅速な試験を組み合わせる。マイクロアレイを提供することにより、本発明は、高価な酵素および化学物質の顕微鏡的少量の使用を可能にする。マイクロマトリックス中に試験組成物を被包することにより、本発明は、貴重な構成要素が再利用されることを可能にする。細胞ベースアッセイとマイクロアレイとを組み合わせることにより、本発明は、生物学的に関連する結果が直接得られることを可能にする。

さらに、本発明は、薬物候補の高スループットを導く最適化において著しくかつ驚くべき進歩を提供する。本発明は、多数の薬物候補が化学的に改変されることを可能にし、薬物バリアントの範囲を作製し、次いで改善された医薬的利益および低減された副作用に対して直接スクリーニングされうる。

発明の詳細な説明
本発明は、一般に、高スループット、微小規模化学反応、および各反応の所望の特徴の検出を行なうための方法およびシステムに関する。本発明は、例えば、ヒトにおける薬物の副作用を試験するために使用されうる。装置における薬物と被包されたヒト代謝酵素との間の反応は、代謝産物と呼ばれる生成物を作製しうる。ヒト細胞を用いる細胞ベースアッセイが装置に適用され、ある位置にある細胞が死滅するか、さもなければその位置で作製される代謝産物により測定可能な生理学的または形態学的変化を受ける場合、薬物はおそらく毒性でありうる効果を有することを示す。本発明はまた、例えば、潜在的な薬物候補または薬物団(pharmacophore) を最適化してその効力を改善するおよび／またはその副作用を低減するために使用されうる。例えば、見込みのある抗癌剤が装置に適用されうる。アレイにおける薬物と各被包された酵素との間の反応は、密接に関連する薬物のアレイを作製しうる。例えば癌細胞を含む細胞ベースアッセイは、アレイに適用されうる。この場合、特定の位置での細胞の死滅は、その位置で出発薬物および酵素により作製された化合物の抗癌活性をおそらく示す。このアプローチを副作用試験と組み合わせる装置が構築され得、それにより新しい、より有効な薬物を作製し、新規薬物を副作用に対して同時に試験する。

本明細書で使用される場合、独立したマイクロマトリックスは、約1 マイクロリットル容量未満であるマトリックス材料の一部である。マイクロマトリックスは、一般に1 ピコリットル容量よりも大きく、一般に約100 ピコリットルよりも小さい。代替的には、マイクロマトリックスは、約1 マイクロリットル容量よりも小さく、好ましくは約500 ナノリットル容量よりも小さく、または約250 ナノリットル容量よりも小さくまたは約50ナノリットル容量よりも小さくまたは約5 ナノリットル容量よりも小さい。代替的には、マイクロマトリックスは、約500 ピコリットル容量よりも小さい。好ましくは、マイクロマトリックスは約250 ピコリットル容量〜約10ナノリットル容量である。

マイクロマトリックスの材料は、薬物および試験組成物とのその反応産物などの適用される組成物の構成要素を含む小分子に対して浸透可能である。好ましくは、マイクロマトリックスは、被包された酵素または他の試験組成物に対して不浸透性（または実質的に不浸透性）であり、それによりマイクロマトリックスの外への浸出から試験組成物または酵素を保持または実質的に保持する。適切なマイクロマトリックス材料としては、置換および非置換のゾルゲルおよびヒドロゲルが挙げられる。各マイクロマトリックスは、同一であるかまたは異なる材料でありうる。マトリックス材料は、置換または非置換であり得、ゾルゲル、ヒドロゲル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、またはポリビニルシリケート、例えばスクロース、グルコース、ガラクトース、トレハロース、マンノース、またはラクトースを含有する糖で置換されたポリアクリレートなどが挙げられる。別の態様において、マトリックス材料は、置換または非置換のゾルゲルである。好ましい態様において、マトリックス材料は、酵素活性を増強する量のポリビニルアルコールを含有する置換または非置換のゾルゲルである。

ゾルゲルは、例えば、テトラメトキシオルトシリケート、メチルトリメトキシオルトシリケート、テトラアルコキシオルトシリケート、またはトリアルコキシオルトシリケートである。ヒドロゲルは、例えば、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、糖置換ポリアクリレート、またはポリビニルアルコールである。多糖ゲルは、例えば、アルギネート、デキストラン、でんぷん、セルロース、カラゲナン、ポリ（ヒアルロン酸）、ヘパリン、グアール、またはイヌリンである。他のポリマーとしては、ポリビニレン、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（エチルビニルエーテル、ポリメチルメタクリレートなどのポリアクリレート、ポリスチレン、ポリビニルシリケート、ポリウレタン、ポリアルカノエート、ポリ（乳酸）、ポリ（3-ヒトロキシブチレート）、またはそれらの置換バリエーションが挙げられる。

被包とは、試験組成物が本質的にマイクロマトリックスの容量内に含められることを意味する。これは、２つの理由のために表面固定化との重要な区別である。マトリックスの容量内で被包することは、しばしば酵素の活性を表面固定化よりも良好に維持する。さらに、マトリックスの容量は、マイクロマトリックスのフットプリントに等しい表面領域に付着されうるよりもさらに多くの酵素を含みうる。より多い酵素は、より速く、より完全な反応をもたらし、それは例えば、より多くの反応産物が作製され得、より容易な検出をもたらすことを意味する。マトリックス材料前駆体に依存して、試験組成物は、物理的に捕捉または拘束(caged) され得、および／または化学結合により共有結合されうるか、またはつながれうる。好ましくは、試験組成物（例えば酵素）の共有結合の改変はその活性を低減しうるために、試験組成物は物理的に捕捉されるのみである。

適切なマトリックス材料、および本明細書の組成物の被包は、米国特許第5,854,030 号；米国特許第5,618,933 号；米国特許第5,474,915 号；Park, C.; Clark, D. 2002 Biotechnol Bioeng., 78,229-235; Kim, Y; Park, C.; Clark, D. 2001 Biotechnol Bioeng., 73, 331-337; Wang, P., Sergeeva, M.V., Lim, L.およびDordick, J.S. 1997, Nature:Biotechnology 15:789-793; Novick, S.J. およびDordick, J.S. 2000, Biotechnol. Bioeng. 68:665-671; Sergeeva, M.V., Paradkar, V.M.およびDordick, J.S. 1997, Enzyme Microb. Technol. 20: 623-628; Novick, S.J. およびDordick, J.S. 1998, Chem. Mat. 10:955-958; Kim, J., Dedeo, R. およびDordick, J.S. 2002; Biotechnol. Progressを含む文献に記載されている。先行する研究の全教示は、本明細書に参照により組み込まれる。より詳細には実施例１および２を参照のこと。

装置の別の態様において、マイクロマトリックスは、固体支持体に固定化される。固体支持体は、例えば、半導体ウエハー、ガラスまたは石英顕微鏡スライド、金属表面、高分子表面、表面上の単層被覆、プローブ(probe) の外側表面、チャンネルまたは導管の内部表面などでありうる。好ましくは、固体支持体は、ガラス顕微鏡スライドまたはシリコンウエハーなどの平らで薄い固体である。マイクロマトリックスはまた、固体支持体上で分離される。好ましくは、マイクロマトリックスは、固体支持体上の規則正しく間隔をあけた二次元アレイに固定化され、例えば支持体の表面上の架空の四角格子の頂点に位置する。

好ましくは、固体支持体は、少なくとも１つのマイクロマトリックスを少なくとも１つの他のマイクロマトリックスから単離する物理的障壁を含む。例えば、各マイクロマトリックスまたはマイクロマトリックスの群は、ウエル、チャンネル、導管または凹部に固定化されうるか；あるいは隆起したプラットフォームに固定化されうるか；あるいは隆起した壁または障壁により部分的にまたは全体的に囲まれうるか；あるいは陥没したチャンネルにより部分的にまたは全体的に囲まれうるか；あるいはそれらの組み合わせでありうる。

物理的障壁の包含は、マイクロアレイに関連する潜在的な問題を克服し、すなわち隣接したマイクロマトリックス間での適用される組成物と反応産物との混合または希釈に由来する「クロストーク」を制御する。この問題はまた、適用される組成物において使用される液体の容量を制御することにより克服されうる。例えば、約１マイクロリットルの容量を占める各マイクロマトリックスが総容量約10マイクロリットルのマイクロウエルに配置される場合、適用される組成物の容量は、約9 マイクロリットル未満であろう。

代替的には、「クロストーク」は、特定の実験において望ましい。例えば、薬物は、１つの酵素に由来するその代謝産物と第２酵素との反応により生じる副作用に関して試験されうる。２つのマイクロマトリックスは、同一のマイクロウエル、または代替的には物理的障壁のない支持体に各々位置され得、代謝産物がその開始マイクロマトリックスから隣接するマイクロマトリックスに洗浄されるように、過剰容量の適用される組成物が使用されうる。

マイクロマトリックスを分離する距離は、マイクロマトリックスの大きさ、マイクロマトリックス組立技術の解像度、適用される組成物における液体の容量、マイクロマトリックスを分離する固体支持体における物理的障壁の存在などを含む多数の因子に依存する。例えば、マイクロマトリックスが固体支持体上に手で堆積される場合、間隔は実験者の器用さにより制限されるであろう。100 ピコリットル以下の少容量を送達しうる市販のロボットマイクロアレイスポッターがある。実用的な限界として、隣接するマイクロマトリックスは、平均スポットの直径の約２倍より大きく互いに離れるであろう。

別の態様において、２つ以上のマイクロマトリックスは、別個の試験組成物を各々被包する。代替的な態様において、マイクロマトリックスの群が含まれ、ここで群の内部の各マイクロマトリックスは、その群における互いのマイクロマトリックスと比較して別個の試験組成物を被包する。例えば、生体異物に対する一般的代謝プロフィールの反応を決定するためのマイクロアレイは、各々25マイクロマトリックスの5X5 サブアレイを含みうる。各マイクロマトリックスは、目的の25個の酵素の１つを含みうる。各サブアレイは、各マイクロマトリックスにおける25個の酵素の各々の量により、または25個の酵素の各々の特定のアミノ酸配列などにより異なりうる。例えば、100 個の異なる代謝肝臓酵素プロフィールのモデルを作製するために設計された高スループット能力マイクロアレイに対して、スライド当たり100 個のサブアレイが調製され得、各サブアレイは、個体、関連する個体の群、母集団部分集合、病理学的プロフィールなどの肝臓P450代謝プロフィールを表わす。好ましい態様において、各マイクロマトリックスは、別個の組成物を被包する。

個々のマイクロマトリックスが、手動のピペッティングを用いて前駆体の溶液から調製されうるが、高スループット解析のためのマイクロアレイの作製は、市販のロボットマイクロアレイスポッターを用いることにより最良に達成されうる。スポッティングおよび反応は、ロボットスポッター内部の一定の湿度チャンバーにおいて行われるべきであり、それにより一度形成されたゾルゲルマイクロマトリックスの乾燥(dessication) を防ぐ。必要な場合、グリセロールは、総溶液の約0.01〜約5 重量％の量で蒸発を遅らせるためにスポッティング溶液に添加されうる。代替的な態様において、被包する工程は、１つ以上の別個の試験組成物の存在下にマイクロマトリックスを作製することからなる群より選ばれる。この方法の別の態様は、1 つ以上の別個の試験組成物とマイクロマトリックス材料とを組み合わせる工程である。より詳細については、実施例１および２を参照のこと。

ロボットマイクロアレイスポッターは、表面上のマイクロマトリックスのアレイを調製すること、適用される組成物を個々の試験組成物に添加すること、多数の相互作用部位から並行して多数の試料を取り出すこと、および細胞ベースアッセイ調製物をマイクロアレイに添加することを含む、本発明に関連する多数の方法において使用されうる。多くの市販されているスポッターのうち、例えば、GeneTAC G³(Genomic Solutions, Lansing, MI)などの接触ピンスポッターおよびNANO-PLOTTER NP1.2^TM(GeSiM mbH, Grosserkmansdorf, Germany)などの圧電( インクジェット機構) スポッターがある。

本明細書で使用される場合、試験組成物または適用される組成物は同一でありうるか、または異なりうるものである。別個であるものは、ある測定可能な物理学的、化学的、または生物学的特性において変化するものであり、成分の数、分子式、同位体組成、構造式、pH、（アミノ酸、DNA 塩基、RNA 塩基、モノマーなどの）配列、タンパク質折り畳み構造、補因子の存在または不在、種、アイソフォーム、ライフサイクル、組織起源、癌／非癌性状態などにおいて異なりうるものである。

試験組成物は、指示薬、化学化合物、生化学化合物、触媒、細胞抽出物、細胞断片、または細胞を含有し、ここで少なくとも１つの試験組成物は、生物学的起源の構成要素を含有する。例えば生物学的起源のものである構成要素は、生物から直接誘導されうるか、あるいは化学的に合成されたかまたは遺伝子操作された、生物に由来する構成要素のコピーまたはアナログでありうる。任意に、試験組成物は、哺乳動物起源の構成要素を含有する。別の代替において、試験組成物は、ヒト起源の構成要素を含有する。さらに別の態様において、試験組成物は、酵素、補因子、抗体、細胞、細胞断片、または細胞抽出物を含有する。代替的には、各試験組成物は、少なくとも１つの酵素およびその関連する補因子を含有する。好ましい酵素は、６クラスの酵素に属するものの任意の１つであり得、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼを含む。より好ましくは、各試験組成物は、少なくとも１つのシトクロムP450酵素アイソフォームおよびその関連する補因子を含む。最も好ましくは、試験組成物は、単一のシトクロムP450酵素アイソフォームおよびその関連する補因子を含む。

適用される組成物は、試験組成物との反応の可能性を有する１つ以上の構成要素を含む。例えば、試験組成物がヒト代謝酵素である場合、適用される組成物は薬物でありうる。一般に、適用される組成物は、生物に異質である任意の化合物である生体異物と呼ばれうる少なくとも１つの構成要素を含む。本明細書で使用される場合、生体異物はまた、生物の通常の機能に異質である化合物を含む。例としては、病んだ生物において高い濃度を有する天然のペプチド、またはプリオン関連疾患におけるような非天然折り畳み構造を有する天然のタンパク質が挙げられる。１つの態様において、適用される組成物は、ヒドロゲル、タンパク質ゲル、多糖ゲル、セルロース、ゼラチン、ポリスチレンまたはポリアクリルアミドをさらに含有する。好ましい態様において、適用される組成物は、ポリビニルアルコール、コラーゲン、カラゲナン、ポリ（ヒアルロン酸）、およびイヌリンからなる群より選択されるヒドロゲルをさらに含有する。好ましい態様において、適用される組成物は、コラーゲンを含む。

適用される組成物は、多数の方法でマイクロアレイに添加されうる。単一の適用される組成物が別個の試験組成物を含むアレイに添加される場合、生体触媒反応は、適用される組成物の溶液（水、有機、または混合された水性有機共溶媒）にアレイを浸し、およびプリントされた生体触媒に基質が拡散するのを可能にすることにより開始されうる。マイクロアレイをバルク基質溶液から取り出し、過剰の基質を揺らして除き、および／またはスライドを乾燥した後、リード化合物の生体内変化は各マトリックス内で続行する。第２の方法において、リード化合物は、アレイにおいて別個の適用される組成物の正確な量を別個の試験組成物に送達しうるロボットマイクロアレイスポッターを用いて、アレイに添加されうる。

添加される適用される組成物溶液の容量は、各マイクロマトリックスの効率的な浸潤を提供するために最適化され、適用される組成物のマイクロマトリックスへの有効な分割を可能にするであろう。例えば、添加される適用される組成物溶液の容量は、各マイクロマトリックスの容量の約0.2 〜約5 倍でありうる。代替的には、添加される適用される組成物溶液の容量は、各マイクロマトリックスの容量の約0.5 〜約2 倍でありうる。好ましい実施において、適用される組成物溶液の容量は、およそ各マイクロマトリックスの容量であろう。

特定の濃度の活性な構成要素を含む適用される組成物溶液が、スポットされるであろう。例えば、リード最適化において、目的は、各試験組成物により各マイクロマトリックスにおいて触媒作用によりリード化合物を化学修飾することである。したがって、活性な構成要素の濃度がアレイにおいて１つ以上の酵素を有効に飽和する場合、適用される組成物を使用することは有効でありうる。対照的に、毒性実験において、アレイにおいて酵素を飽和するのに十分高い濃度を使用することは、特に濃度がいっそう弱く結合した構成要素の飽和結合を強いるのに十分高い場合、あるいは濃度が生物学系においておそらく予期されうるよりも非常に高い場合に、生物学的に関連した情報を与えることができない。各場合において、濃度の決定は、目的および適用される組成物と試験組成物の組成に関してなされなければならない。

方法のさらなる態様は、別個の適用される組成物と別個の試験組成物とを組み合わせる工程を含む。多くの可能性のあるバリエーションは、この態様において本来備わっている。例えば、適用される組成物は、多数の別個の試験組成物に対して並行に試験され得、例えば、数千の別個の被包された酵素を有するチップは、単一薬物を含む溶液中に浸されうる。別のバリエーションにおいて、多数の別個の適用される組成物は、個々の試験組成物に対して並行に各々試験されうる。例えば、10個の別個の酵素の10X10 アレイを有するチップにおいて、列における各酵素は同一であり、ロボットマイクロアレイスポッターは、10個の別個の薬物候補を10行にわたって適用し、100 個の別個の反応を導く。代替的には、多数の別個の適用される組成物は、多数の別個の試験組成物と並行に規定の様式で組み合わされうる。例えば、10X10 アレイは100 個の別個の酵素を含み得、ロボットマイクロアレイスポッターは100 個の別個の薬物候補を適用し得、100 個の別個の反応を生じる。代替的には、反応の産物は、第２試験組成物と組み合わされ得、第２産物を生じる。例えば、反応後、吸引プローブは第１の被包された酵素から反応産物を含む試料を除去し、それを第２の被包された酵素に適用し得、それにより第２の産物を作製しうる。

本発明の方法の別の態様は、相互作用部位から試料を取り出す工程、および第２の別個の試験組成物を被包するマイクロマトリックスに試料を適用する工程を含む。これは、例えば、試料を取り出すために吸引プローブまたは接触プローブなどのプローブを使用すること、次いで異なる試験組成物に試料を適用するためにプローブを使用することにより達成されうる。プローブは、例えば、単一プローブでありうるか、またはロボットマイクロアレイスポッターの一部としてのプローブのアレイの一部でありうる。代替的には、多数の相互作用は、大過剰の適用される組成物を用いることにより行なわれ得、それにより適用される組成物の過剰な溶媒は隣接するマイクロマトリックスに相互作用の産物を導く。

別の態様において、適用される組成物は、試験組成物の構成要素の拮抗阻害剤をさらに含む。別の態様において、試験組成物は、試験組成物の構成要素の拮抗阻害剤を含む。さらに別の態様において、適用される組成物は、別個の試験組成物と組み合わされる。さらに別の態様において、別個の適用される組成物は、試験組成物と組み合わされる。好ましい態様において、別個の適用される組成物は、別個の試験組成物と組み合わされる。

開示される装置で実施されうる反応としては、適用される組成物を反応産物に変換する化学反応（例えば、薬物がヒト代謝酵素と反応して薬物代謝産物を作製する）が挙げられる。化学反応はまた、シグナル伝達事象を導く化合物の間の一時的相互作用（色変化をもたらす酵素による基質の可逆結合など）を含む。反応を行うために、適用される組成物、例えば薬物は、アレイにおける各マイクロマトリックス被包された酵素に適用される。

本明細書に開示される方法を使用して、多数の特定の種類の化学反応（中でも、縮合、アシル化、二量体化、アルキル化、再配列、転位、脱カルボニル化、カップリング、芳香族化、エポキシ化、不均化、水素化、酸化、還元、置換、異性化、立体異性化、官能基転化、官能基付加、脱離、結合開裂、光分解、光二量体化（photodimerization ）、環化、加水分解、重合、例えば、レセプターとリガンドの間の結合；例えば、酵素とインヒビターとの間の阻害；例えば、抗体とハプテンとの間の認識；例えば、アゴニストとレセプターとの間の活性か；例えば、アゴニストとレセプターとの間の不活化；などが挙げられる）を実施し得る。

反応を実施するのに適切な条件としては、温度、圧力、および反応時間などの物理的条件が挙げられる。化学的条件としてはまた、濃度、溶媒、および共基質（co-substrate）などの消費可能試薬、酵素補因子、pH、消費可能試薬（例えば、アデノシン三リン酸およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）などが挙げられる。細胞系アッセイに関して、適切な条件としては、温度、水、増殖時間、増殖栄養素などが挙げられる。

開示された装置の一態様としては、検出器が挙げられる。検出器は、所望の特徴、すなわち、反応の物理的、化学的、または生物学的証拠、例えば、抗体による薬物の結合に起因する色変化、代謝酵素によって生成された薬物代謝産物の分子量、または癌細胞に対する薬物代謝産物の毒性をアッセイする。検出器は、吸引探針、レーザー脱着探針、イオンビーム脱着探針、気体脱着探針、液体脱着探針、接触探針、光学分光計、顕微鏡、映像装置（imager）、質量分析計、クロマトグラフィー装置、電気化学検出器、粒子検出器、化学親和性検出器、放射能検出器、磁気共鳴分光計、細胞増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、免疫学的測定、結合アッセイ、または染色アッセイを含む。検出器に含まれる成分の幾つか、例えば、種々の探針は、それ自体で必ずしも検出器ではないが、試料を除去して検出器の別の成分にそれを指向するように機能する。代替的態様において、検出器は、吸引探針、光学分光計、顕微鏡、映像装置、質量分析計、または細胞増殖アッセイもしくは細胞傷害性アッセイなどの細胞系アッセイを含む。好ましい態様において、検出器としては、細胞増殖アッセイまたは細胞傷害性アッセイが挙げられる。

開示された方法において、反応の所望の特性は、インサイチュ検出を介してまたは分析のために試料を除去することによりアッセイされ得る。インサイチュ検出は、開示された装置の検出器により実施され得る。装置を離れた検出については、試料は、吸引、レーザー脱着、イオンビーム脱着、気体脱着、液体脱着、接触除去などを用いて除去され得る。例えば、吸引はバキュームを引くことにより液体試料を除去する、レーザー脱着はレーザーエネルギーを使用して、固相または液相から気相に試料を揮発させる、接触除去は試料に探針をあてがい、その結果、試料の一部が探針に接着する、吸引に類似する気体脱着は気体を部位を横切って指向して、試料を気体流に引きずる、などである。除去された試料は、開示された装置の検出器、または別の検出器によりアッセイされ得る。特定の態様は、細胞系アッセイ（細胞増殖、細胞死（細胞傷害性）、および細胞における他の代謝または形態学的変化を検出することが挙げられる）の使用に関する。これらのアッセイは、装置の少なくとも一部を覆う細胞単層オーバーレイおよび１つのマイクロマトリックス（micromatrix ）のみを覆うゲル小滴の両方を使用して実施され得る。単層オーバーレイおよびゲル小滴において使用される細胞は、天然または合成ゲル（ヒドロゲル、タンパク質ゲル、多糖類ゲル、セルロース、ゼラチン、ポリスチレン、またはポリアクリルアミドが挙げられる）において培養され得る。

従って、本発明はまた、装置またはマイクロアレイが第２の試験組成物を含む第２のマトリックスによりオーバーレイされるかまたは覆われる態様を含む。適切な試験組成物としては、マイクロマトリックスに使用されるものが挙げられる。第２のマトリックスは、全基板の全域で単一の層またはフィルムとしてマイクロアレイにあてがわれる。あるいは、第２のマトリックスは、各マイクロマトリックスにわたって別々におよび独立した小滴で付加され得、それにより、第２のマトリックスにおける試験組成物が異なることを可能にする。

ヒト肝臓に見出されたP450アイソフォームは、試験組成物構成が本発明においてどのようにして選択され使用され得るかの代表的な例を提供する。ヒト肝臓は、非常に多数の生体異物代謝を担う16個の主要なアイソフォームを含む（表１）。非誘導ヒト肝臓における薬物代謝を担うP450アイソフォームの相対量のまとめを表２に示す。この分布はマトリックスサブアレイにおいて再現され得る。さらにこの能力は拡張されて、P450アイソフォームレベルにおける差、およびアイソフォームの中の変異を配慮して、個人、個人の同族群、母集団小群、病理プロファイルなどにおける薬物代謝に対するP450変動性の影響の研究を可能にする。

前述において、各試験組成物は個々のP450アイソフォームを含む。目的の標的、例えば、肝臓のインビボ環境をより正確に表すため、P450アイソフォームの種々および／または複数の組み合わせが、各別個の試験組成物に含まれ得る。例えば、5 ×5 サブアレイフォーマットを使用して、種々のレベルおよび比のP450アイソフォームの存在下で薬物または生体異物の代謝産物を試験し得る。例えば、適用される組成物は、5 ×5 サブアレイと組み合わせたシクロホスファミド（4-ヒドロキシシクロホスファミドのプロドラッグ前駆体）を含み得、ここで、25個のマイクロマトリックスのそれぞれは種々のレベルのCYP3A4およびCYP2B6（2 つのヒト肝臓P450アイソフォーム）を封じ込めている。5 ×5 サブアレイが調製され得、ここで、クラスターの各マイクロマトリックスは2 つのP450アイソフォームのいずれかまたは両方を含み、2 つのP450アイソフォームの相対量は種々の比を配置することにより調整され得る。シクロホスファミドを添加する際に、これは、第２のP450アイソフォームによる二次反応を生じ得るか、または第２のP450アイソフォームの阻害を生じ得る。別の代替において、唯一のアイソフォームが試験組成物あたりに使用される場合、過剰な適用組成物溶液が添加され得、それにより過剰容積を用いた1 つのアイソフォームとの反応による生成物は隣接する試験組成物に接触する。いずれの代替も、ヒト肝臓におけるシクロホスファミド代謝の作用に近づき得る。より詳細については実施例２を参照のこと。

前述において、ヒト代謝におけるその重要性から、肝臓P450酵素を特定の例示的な例として使用した。しかしながら、これは限定として解釈されるべきではない。例えば、他の器官、および他の生物由来の広範な種々の他の酵素が、上記のように使用され得る。レセプターなどの基質を転換する代わりに基質を認識する酵素が使用され得る。タンパク質酵素以外の触媒、例えば、触媒抗体、化学触媒、またはRNA 酵素が使用され得る。複数の細胞成分を含む細胞抽出物が封じ込められ、適用組成物の多段階相互作用に備え得る。

開示された方法における検出技術としての細胞系アッセイ（細胞傷害性および細胞増殖が挙げられる）の応用は、細胞増殖アッセイの以下の手段において理解され得る。アッセイに使用されるべき細胞はヒドロゲル小滴に閉じ込められ得、各相互作用部位の上に直接配置され得る。細胞を支持および拘束するためのヒドロゲルの使用は、細胞系アッセイが各マイクロマトリックス部位に適用されることを可能にし、それにより各アッセイがそれが覆うマイクロマトリックスに結合された生成物に応答し、従って、各アッセイ結果は区別され得る。ヒドロゲルは、特定の範囲に細胞を支持および拘束するために使用されるコラーゲン、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール、多糖類などのマトリックス材料である。細胞系アッセイに使用されるヒドロゲルマトリックス材料は、潜在的にマイクロマトリックスと同じ材料で作製されるが、マイクロマトリックスとは異なることに注意のこと。

ヒドロゲル小滴培養の適用後、細胞は、標準的なプロトコルに従って増殖培地を交換しながら、長期間、例えば、１週間増殖させられ得、この期間、増殖は標準的な染色および画像解析技術によりモニターされ得る。適切なインキュベーション時間の決定は、使用および実験目的における細胞のための標準的プロトコルに基づく個々の実験的な決定である。

かかるアッセイに使用され得る幅広い種々の細胞がある。どの細胞を使用するかの決定は、特定の実験の目的に依存する。例えば、新規な癌薬物リードを最適化する際には、１つの実験は、細胞死が求められている結果である癌細胞を使用する細胞傷害性アッセイを使用する。別の実験において、例えば、癌細胞と同じ器官についての正常細胞と組み合わせた同じアレイが、最適化された薬物リードの毒性を決定するために使用され得る；ここでは細胞増殖が所望の結果である。２つの実験の相関により、最適化されたリード化合物が、癌細胞に対するその所望の毒性vs正常細胞に対する所望でない毒性に従ってランク付けされることを可能にする。使用され得る細胞、または細胞が由来し得る組織／器官としては、骨髄、皮膚、軟骨、腱、骨、筋肉（心筋を含む）、血管、角膜、神経、脳、胃腸、腎臓、肝臓、膵臓（島細胞を含む）、心臓、肺、下垂体、甲状腺、副腎、リンパ管、唾液腺、卵巣、精巣、頸部、膀胱、子宮内膜、前立腺、外陰部、食道などが挙げられるが、それらに限定されない。免疫系の種々の細胞、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、多形核白血球、マクロファージ、および樹状細胞もまた挙げられる。ヒト細胞、または他の哺乳動物細胞に加えて、他の生物が使用され得る。例えば、農薬リード化合物を最適化する際に、標的生物由来の神経細胞が使用され得る。別の例において、工業用化学薬品の環境影響について試験する際に、化学薬品に曝露され得る水生微生物が使用され得る。さらに別の例において、特定の形質を有するかまたはまたは欠くように遺伝子工学により作製された細菌などの生物が使用され得る。例えば、抗生物質耐性生物と戦うための抗菌リード化合物の最適化において、細胞アッセイは、抗菌耐性のために１つ以上の遺伝子を発現するように遺伝子工学により作製されている細胞を含み得る。

抗癌薬物リード最適化において、例えば、細胞傷害性アッセイは癌細胞を使用する。使用され得る細胞の例としては、乳癌細胞株（MCF7）、ヒト肝細胞（HepG2 細胞）、および腎臓細胞株（A-498 細胞）が挙げられる。MCF7細胞は、10％（v/v ）ウシ胎仔血清、グルコース（4.5g/L）、およびグルタミン（2mM ）で補充した緩衝化フェノールレッドなしDMEM培地を含むT-25フラスコで、37℃5 ％（v/v ）CO₂ にて加湿インキュベーターで単層として増殖させ得る。細胞培養培地は、抗生物質で補充されるであろう。HepG2 、ヒト肺芽腫細胞株の単層培養物は、抗生物質が培地に添加されるべきでないということを除き、American Type Culture Collectionにより推奨され、Scharnagl ら（2001）³²により記載されたDMEM培地で増殖させ得る。ATCCは、HepG2 細胞を培養する際、抗生物質を使用しない（against using ）ことを推奨し（ATCC Technical Services ）、一般的に、抗生物質は、マイクロマトリックスにおいて酵素により触媒される所望でない生体内変化をうけ得る。A-498 細胞、ヒト腎臓癌細胞株は、ATCCにより推奨されるような補充培地で増殖させ得る。

適用組成物と試験組成物との間の反応を進行させた後、細胞単層は、組織培養フラスコから細胞傷害性アッセイ用のマイクロアレイに移動させられ得る。移動手順は、規定のcDNAを発現する細胞マイクロアレイについてZiauddinおよびSabatini（2001）³³によって記載された手順と同様である。次いで、マイクロアレイは、適切な培地を含む細胞培養皿に浸され、37℃にて48時間インキュベートされ、生存力に対して染色され得る。

固体支持体の前記節で考察したのと同様に、ヒドロゲル細胞アッセイ方法を用いる潜在的な問題が議論され（cross talk）得る。ここで、試験化合物生成産物の混合および希釈は、個々の小滴を取り囲む液体培地中で起こり得る。３つのシナリオがあり得る：（ａ）コラーゲンゲルが過剰な液体培地により取り囲まれる（すなわち、チップが成長阻害アッセイ中に培地溶液に浸され得る）；（ｂ）増殖培地がコラーゲンゲルのみに閉じ込められ、従って１つのコラーゲンゲル小滴から別の小滴への化合物の可能な限りの輸送を妨げる；あるいは（ｃ）装置について開示される場合、物理的バリアを有するマイクロアレイの各部位または部位の各サブアレイが提供され（例えば、マイクロウェル）、それにより付随する液体増殖培地がバリアにより封じ込められる。

シナリオ（ａ）において、研究対象の特定の相互作用が、分析時間に対して緩徐に拡散する組成物または次の生成物を利用するので、議論はない。シナリオ（ｃ）は前記節で考察された。シナリオ（ｂ）は、細胞が取り囲む液体蓄積の存在なしに培地充填ヒドロゲルマトリックスで増殖し得ることを必要とする。例えば、ヒドロゲル小滴は、以下の変更と共に前記のように調製され、細胞を接種され得る。細胞懸濁液（約4 ×10⁵ 細胞/mL を含む）がUV滅菌コラーゲン溶液および30X 培地（10％FBS を含む30X DMEM）と混合され得る。種々の濃度の培地を含むコラーゲンゲル小滴は、これらの試薬を以下の割合で混合することにより調製され得る：0.1mL 細胞懸濁液＋1mL コラーゲン＋0.2mL 30X 培地；0.1mL 細胞懸濁液＋0.8mL コラーゲン＋0.4mL 30X 培地；0.1mL 細胞懸濁液＋0.6mL コラーゲン＋0.6mL 30X 培地。次いで、コラーゲンをスポットしたスライドは、3 日までの間37℃にて5 ％（v/v ）CO₂ でインキュベートされ、細胞はLive/Dead 試験キット（Molecular Probes）で生存力について染色され得る。より詳細については実施例２を参照のこと。

本発明は以下の実施例により説明され、これはいかなる限定も意図されない。

実施例１：ゾルゲル酵素マイクロアレイ
活性酵素を含むゾルゲルマイクロマトリックスを、中性近くのpHで室温にてガラスに安定化した。ポリジメチルシロキサン（PDMS）のマルチウェル二分子層を使用して、マトリックスアレイを支え、反応培地を含有させた。ゾルゲル中の酵素は、その溶液対照物を触媒反応的に表した；ゾルゲル酵素の活性を可溶性加水分解酵素の活性に対してプロットした場合、良好な線形相関（R ＝0.98）が得られた。ゾルゲルアレイは再利用可能であり、可溶性酵素と比較した場合、より熱安定性を示した。

酵素含有ゾルゲルアレイをさらに、顕微鏡スライドにマイクロマトリックスをスポットすることにより小型化した。顕微鏡スライドガラス上に300 のゾルゲルマイクロマトリックスを含む酵素含有ゾルゲルマイクロアレイを生成した。

実施例２：P450マイクロアレイ
ゾル溶液を、25μl メチルトリメトキシシラン（MTMOS ）を10μl ポリビニルアルコール（PVA 、MW10,000）を含有する蒸留水（10％w/w ）と混合することにより調製した。得られたゾルは2 のpHを有しており、次いで、形成したゲルを水性緩衝液で洗浄することにより速やかに中和した。スライドガラスからのゾルゲルマトリックスの剥離を防ぐためおよび半球状マトリックスを作製するために、MTMOS 溶液（pH7 ）をガラス上にスピンコートした（30秒間3000rpm にて2 μl ）。反応を、150 のゾルゲルマトリックス（それぞれ手動マイクロピペッターを使用して調製された1 μl の容積を有する）を含むアレイ中で実施した。P450活性を以下のように試験した：0.5 μl 緑色蛍光基質（2mM 、DBOMF 、フルオレセインアナログ）、2.5 μl のNADP⁺ （10mM）および2.5 μl 再生系（グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ＋グルコース6-リン酸）を94.5μl リン酸緩衝液（200mM 、pH8 ）に添加した。P450活性を、P450（0.14pmolまたは約5.6 μl/mLのヒドロキシラーゼ（hydroxlase）成分）を含む1 μl ゾルゲルマトリックス上に5 μl の適用組成物溶液をスポットすることによりアッセイし、反応性蛍光強度を、プレートリーダー（384 ウェルプレートの頂上にあるスライドガラス）を用いて485nm の励起波長および535nm の放出波長で時間に対してモニターした。

水溶液中の酵素と比較したゾルゲルマトリックスにおけるCYP3A4の反応性を表３にまとめる。ゾルゲルにおけるP450の固有の活性は高く、V _max は水溶液中の天然酵素製剤とほぼ同一であった。従って、複数成分（multicomponent）CYP3A4試験組成物をゾルゲルに組込む方法は、酵素のV _max に影響を及ぼさない。さらに、酵素反応は拡散に限定されなかった；可観係数（Observable Modulus）の計算により1 未満の値を生じ、これは反応が動的に限定されることを示した。

表３にまとめた動的定数に加えて、1 μl 以下のゾルゲル調製物について、以下のデータを得ている。これらの値を表４に示す。これらの結果を、マイクロアレイスポッターを使用して顕微鏡スライドガラス上にゾルをスポットすることにより得た。

実施例３：コラーゲンゲル小滴における細胞増殖およびプロドラッグ活性
ゾルゲルマトリックスを、スピンコーティングに関する１つの変更を除き、上記のように調製した。具体的には、MTMOS スピンコートは疎水性であり得、コラーゲンゲルによって不十分に濡れ得、従って、スライドへのコラーゲンゲルの不十分な付着を生じる。スライドガラスからのゾルゲルマトリックスの剥離を防ぐために、かつ半球状のマトリックスを生成するため、ポリマレイン酸無水物-alt- α- オレフィン（PMA-OL）を含有するトルエンを、ガラス上にスピンコートした（30秒間3000rpm にて2ml ）。次いで、P450反応（CYP3A4を含む）を、40ゾルゲルマトリックス（それぞれ手動マイクロピペッターを使用して調製された1 μl の容積を有する）を含むアレイ中で実施した。P450反応のために、5 μl 基質溶液（1mM シクロホスファミドおよび2mM のNADPH ）をP450ゾルゲル上にスポットし、30℃にて2 時間インキュベートして、MCF7乳癌細胞に対して毒性の生成物として4-ヒドロキシシクロホスファミドを生成した³¹。シクロホスファミドはMCF7細胞に対する公知のプロドラッグであり、肝臓中のCYP3A4により活性化合物（例えば、4-ヒドロキシシクロホスファミドなど）へ代謝され得る（スキームＩ）。

スキームＩはシクロホスファミドのCYP3A4触媒代謝を示す。一次代謝産物は4-ヒドロキシシクロホスファミドであり、これはアルドホスファミドと平衡である。アルドホスファミドは、ホスホルアミド（phosporamide）マスタード、アルキル化剤、およびアクロレインに自発的に分解する。

MCF7細胞を含むコラーゲンゲルマトリックスの調製およびオーバーレイを、T-25細胞培養フラスコからMCF7細胞の融合性層をトリプシン処理し、細胞溶液を8000rpm で10分間遠心分離し、1mL のFBS 補充DMEM培地に細胞を再懸濁することにより実施した。次いで、細胞懸濁液（0.2mL 、約4 ×10⁵ 細胞/mL を含む）を2mL のUV滅菌コラーゲン溶液（ラット尾由来）およびpH7 に調整した0.4mL の10X 培地（10％FBS を含む10X DMEM）と混合した。次いで、コラーゲンゲル小滴（5 μL 、約900 細胞を含む）を、各ゾルゲルマトリックスの先端にスポットした。室温にて30分のプレインキュベーション後、スポットしたスライドを増殖培地で表面を覆い、2 日間インキュベートした。

2 日後、培地を捨て、Live/Dead 試験キット（Molecular Probes）を使用して、生存細胞による緑色蛍光応答および死亡細胞による赤色蛍光シグナルを生成した。このため、20μl のエチジウムホモダイマー-1（2mM ）および5 μl のカルセインAM（4mM ）を、10mLの滅菌組織培養グレードのPBS 緩衝液に添加し、5 μL のこの混合物を各コラーゲン小滴に塗布した。30分37℃のインキュベーション後、各コラーゲンゲルマトリックスを蛍光顕微鏡で観察した。CYP3A4を含むコラーゲンゲルマトリックスにおける死亡細胞（赤色スポット）の数および生存細胞に対する死亡細胞の比が有意に増加していた。

これらの結果は、CYP3A4がシクロホスファミドをその4-ヒドロキシ誘導体（MCF7乳癌細胞に対して毒性）に変換するのにゾルゲルマトリックスにおいて十分に活性であり得ることを示す。

実施例４：特定のアレイを最適化するための階乗（factorial ）実験の設計
ゾルゲルに封入された酵素は、活性かつ安定であり、水溶液とほぼ同じ高さのV _max を有し得る。酵素活性を最適化し、これらの予備的結果を他の酵素アイソフォームに広げるため、幅広い階乗設計が、試験組成物活性および安定性へのゾルゲル製剤化条件の影響を解明するために所望され得る。例えば、p450アイソフォームについて、重要な変数、および研究対象のパラメーターの範囲を表５にまとめる。二次階乗設計を使用して、P450酵素活性および安定性に影響を及ぼすのに重大であるとして同定されている因子の影響を研究した：H₂O/MTMOS 比、MTMPS/TMOS比、溶液pHポリ（ビニルアルコール）（PVA ）濃度、およびP450濃度。市販の蛍光生成（fluorogenic ）酵素バリアントを用いることにより、この最適化段階が容易になり得る。

階乗設計の例において、2 つのレベルおよび5 つの因子は、2⁵の実施対象実験を生じる。この最適化段階において、ゾルゲルを手動で配列して、マイクロマトリックスに対する視覚鋳型として384 ウェルプレートを使用して顕微鏡スライドあたり150 のマイクロマトリックスを与え得る。これは、P450アッセイ用に蛍光プレートリーダーを使用することを可能にする。次いで、速度定数（V _max およびK _m ）およびCYP3A4の室温での可観半減期を、研究対象の32の実験条件それぞれについて決定し得る。中程度のスループット手動スポッティングは、この数のCYP3A4の実験、および他のP450アイソフォームに適切であり得る（表１を参照のこと）。

本発明はその好ましい態様を参照して詳細に示され記載されたが、形態及び詳細における種々の変更は、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなくその範囲内でなされ得ることは、当業者により理解される。

Claims (35)

1. （ａ）固体支持体；ならびに
   （ｂ）該固体支持体上の複数の独立したマイクロマトリックス
   を含んでなる装置であって、ここで該マイクロマトリックスの各々が、
   （ｉ）１ピコリットルよりも大きく１マイクロリットル未満の容量を有し、
   （ｉｉ）タンパク質を含む少なくとも１つの試験組成物を、該試験組成物のマイクロマトリックスへの共有結合の非存在下および該試験組成物の固体支持体への共有結合の非存在下で被包し、
   （ｉｉｉ）物理的障壁によって互いから引き離されておらず、
   （ｉｖ）該試験組成物に対して実質的に不浸透性であり、
   （ｖ）該試験組成物との反応の可能性を有する構成要素を含む適用される組成物に対し浸透可能であり、
   該適用される組成物が該試験組成物とは異なるものであり、前記マイクロマトリックスの各々が独立して、ゾルゲル、ヒドロゲル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、またはポリビニルシリケートを含有する材料からなり、該材料は置換されているかまたは非置換である、装置。
2. 各マイクロマトリックスが１ピコリットルよりも大きく250 ナノリットル未満の容量を有する請求項１記載の装置。
3. 前記マイクロマトリックスが、前記固体支持体上の規則正しく間隔をあけた二次元アレイに固定化される請求項２記載の装置。
4. 前記マイクロマトリックスの少なくとも２つが、各々別個の試験組成物を被包する請求項２記載の装置。
5. 前記材料がゾルゲルである請求項３記載の装置。
6. 前記試験組成物が、生物学的起源の少なくとも１つのタンパク質構成要素を含む、請求項１〜５いずれか記載の装置。
7. 検出器をさらに含み、該検出器が、細胞増殖アッセイ、細胞毒性アッセイ、イムノアッセイ、結合アッセイ、または染色アッセイを実施するための成分を含有してなる請求項６記載の装置。
8. 試験組成物が、哺乳動物起源の構成要素を含有する請求項６記載の装置。
9. 試験組成物が、ヒト起源の構成要素を含有する請求項８記載の装置。
10. 前記試験組成物の各々が、酵素およびその関連する補因子を含有する請求項９記載の装置。
11. 前記試験組成物の各々が、シトクロムP450酵素アイソフォームおよびその関連する補因子を含有する請求項１０記載の装置。
12. 前記試験組成物の各々が、単一のシトクロムP450酵素アイソフォームおよびその関連する補因子からなる請求項１１記載の装置。
13. ａ．試験組成物の各々が少なくとも１つの酵素およびその関連する補因子を含有し、該試験組成物の少なくとも２つが別個のものである、複数の試験組成物；ならびに
    ｂ．固体支持体上の固定化アレイに空間的に分離されている複数の独立した浸透可能なマイクロマトリックスであって、
    ｉ．該マイクロマトリックスの各々は、該試験組成物のマイクロマトリックスへの共有結合の非存在下および該試験組成物の固体支持体への共有結合の非存在下で、１つの該試験組成物を被包しており、該試験組成物に対して不浸透性である；
    ii．該マイクロマトリックスの各々はゾルゲルまたはポリアクリレートヒドロゲルを含有する材料であり、該材料は置換されているかまたは非置換である；
    iii ．該マイクロマトリックスの各々は１ピコリットルよりも大きく1 マイクロリットル未満の容量を有する；
    iv.該マイクロマトリックスは物理的障壁によって互いから引き離されていない；および
    v. 各マイクロマトリックスは該試験組成物との反応の可能性を有する構成要素を含む適用される組成物に対し浸透可能である、
    マイクロマトリックス、ここで該適用される組成物が該試験組成物とは異なるものである、
    を含んでなるマイクロアレイ。
14. ａ．請求項１記載の装置を提供する工程；
    ｂ．適用される組成物と該試験組成物とが反応するように、該装置上で１つ以上の別個の適用される組成物と該マイクロマトリックスとを組み合わせる工程；および
    ｃ．工程（ｂ）における各々の反応または反応産物をアッセイする工程
    を含む、反応または反応産物を検出するための高スループットスクリーニング方法。
15. 適用される組成物がポリビニルアルコール、コラーゲン、またはヒアルロン酸を含有する請求項１４記載の方法。
16. 反応または反応産物が吸引、レーザー脱着、イオンビーム脱着、ガス脱着、液体脱着、接触移動、光学分光測定、顕微鏡検査、デジタル画像化、写真画像化、質量分析、クロマトグラフィー、電気化学、粒子測定学、化学親和性、放射能測定学、磁気共鳴分光測定、細胞増殖アッセイ、細胞毒性アッセイ、イムノアッセイ、結合または染色を含む工程によりアッセイされる請求項１４記載の方法。
17. 前記マイクロマトリックスが、前記固体支持体上の規則正しく間隔をあけた二次元アレイに固定化される請求項１６記載の方法。
18. 反応または反応産物が、吸引、光学分光測定、クロマトグラフィー、顕微鏡検査、デジタル画像化および質量分析によりアッセイされる請求項１７記載の方法。
19. 別個の適用される組成物と別個の試験組成物とを組み合わせる工程をさらに含む請求項１７記載の方法。
20. ｅ．工程（ｂ）における反応から試料を除去する工程；および
    ｆ．該試料を第２の別個の試験組成物に適用する工程
    をさらに含む請求項１９記載の方法。
21. 前記マイクロマトリックスの各々が同じ材料からなる請求項２０記載の方法。
22. 適用される組成物を含有する溶液中にマイクロマトリックスを沈めさせることにより、適用される組成物とマイクロマトリックスが組み合わされる請求項２１記載の方法。
23. 工程（ｂ）の反応産物が、
    ｇ．装置を細胞で覆う工程；
    ｈ．細胞を培養する工程；および
    ｉ．生物学的応答についてマイクロマトリックスの各々の微環境において細胞をアッセイする工程
    によりアッセイされる、請求項２２記載の方法。
24. 細胞が哺乳動物細胞である請求項２３記載の方法。
25. 細胞がコラーゲンゲル培養における培養物である請求項２３記載の方法。
26. 試験組成物の各々がP450酵素を含有する請求項２３記載の方法。
27. 試験組成物の各々が独立して選択されたP450酵素またはP450酵素の組み合わせを含有する請求項２６記載の方法。
28. 試験組成物の各々が独立して選択された組織型において見出されるP450酵素の組み合わせを含有する請求項２７記載の方法。
29. 適用される組成物が薬物物質または生体異物を含有する請求項２８記載の方法。
30. 工程（ｂ）の反応産物が、
    Ｊ．装置を細胞で覆う工程；
    ｋ．細胞を培養する工程；および
    ｌ．細胞毒性についてマイクロマトリックスの各々の近傍において細胞をアッセイする工程
    によりアッセイされる、請求項２９記載の方法。
31. 細胞が、ヒドロゲル、多糖ゲル、セルロース、ゼラチン、ポリスチレンまたはポリアクリルアミドを含有するマトリックスにおいて培養される請求項２３記載の方法。
32. 各マイクロマトリックスが１ピコリットルよりも大きく５０ナノリットル未満の容量を有する請求項１記載の装置。
33. 各マイクロマトリックスが１ピコリットルよりも大きく５ナノリットル未満の容量を有する請求項１記載の装置。
34. 細胞増殖アッセイまたは細胞毒性アッセイを実施するための成分をさらに含有してなる請求項１１記載の装置。
35. 成分がヒト細胞を含む請求項３４記載の装置。