CN102893149B - 用于制备生物芯片的溶胶-凝胶试剂盒及使用其制备芯片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过使溶胶混合物凝胶化来制备蛋白质芯片的方法。在该方法中，按顺序混合特定的硅酸盐单体，如SolB1、SolB2和SolB3、SolBH的混合物以及SolBS、蒸馏水和检测蛋白质的混合物，从而延迟溶胶混合物的凝胶化速度，因此包括混合物的稳定成胶。此外，通过使用阵列器或如吸液管的工具，手工地分配溶胶混合物，可简单且容易地构建生物芯片。另外，可通过按顺序地将溶胶混合物、溶液I(SolBH)和溶液II(缓冲液、SolBS、蒸馏水和检测蛋白质的混合物)分配到基底上，无需传统的、如混合的预处理工艺，来制备均匀的生物芯片。
Description
技术领域
本发明涉及一种以简单的方式制备生物芯片的方法以及一种用于制备生物芯片的溶胶-凝胶试剂盒，所述方法或者使用通过按顺序地混合特定溶液而制备的溶胶组合物或者直接将这些溶液按顺序地分配到基底上而不用预处理工艺。
背景技术
生物芯片技术是基于纳米技术(NT)、生物技术(BT)和信息技术(IT)结合的新技术的典型实例。生物芯片是高密度的微阵列，包括在固体支持物表面上的多种生物材料，并根据附在固体支持物表面的生物材料种类而可以分类为DNA芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、神经元芯片等。此外，生物芯片技术与微观流体技术的结合使得LOC(芯片上的实验室)技术得以发展。生物芯片技术包括固定化生物材料的技术、使固体支持物与生物材料相容的技术、制作生物材料微阵列的技术、在制备的芯片上进行多种生物反应的分析技术、检测反应结果的技术、制备待被固定化的生物材料的蛋白质工程、基因重组技术等等。
蛋白质芯片是一种生物芯片，是在单位面积的固体支持物表面的上包括多种蛋白质的高密度微阵列。近年来，人们试图用制作市售可得的DNA芯片的原理和技术来制作蛋白质芯片。通常，市售可得的DNA芯片大多数是通过将DNA固定化到玻璃基底上而制作，基底表面用包覆材料进行预处理。当用与制作DNA芯片相似的方法来制作蛋白质芯片时，也就是说，当通过将蛋白质固定到玻璃基底(基底表面用包覆材料进行预处理)上来制作蛋白质芯片时，由于待固定化的目标蛋白质之间的物理和化学性质的差异，会导致许多问题。
以前的蛋白质芯片是通过将蛋白质固定化到经表面处理过的玻璃基底上而制作的并用于进行简单的结合分析。蛋白质芯片的性能是通过固定化的蛋白质的活性来测定并且所述蛋白质芯片很难成功地工作(MacBeathandSchreiber，Science289：1760，2000)。这些问题是由于蛋白质间固有的物理和化学性质的差异所引起的蛋白质变性、失活和降解造成的。为了克服这些问题，人们进行了与DNA不同的、符合蛋白质特性的、用于固定化蛋白质的表面处理技术以及对用于固定化蛋白质的材料的研究。这些研究致力于在蛋白质芯片表面上执行固定化同时维持蛋白质活性的方法。实例包括HydrogelTM-包覆的载片(PerkinElmer)、Versalinx芯片(Prolinx)、PDC芯片(可自Zyomyx购得的生物芯片)，等等。
同时，溶胶-凝胶工艺是一种被用于通过微处理以制造微结构的技术。具体地，溶胶-凝胶工艺是一种包括，通过温和加工来形成结合网，并通过用共价结合方法以外的方法，在结合网内固定化生物分子以代替将生物分子化学地附着于无机材料的技术(Gill，I.和Ballesteros，A.，TrendsBiotechnol.，18：282，2000)。
此外，许多生物分子，包括酶，被固定在一团溶胶-凝胶基质上并用于制作生物催化剂或生物传感器(Reetz等人，Adv.Mater.，9：943，1997)。具体地，由于这些生物分子的光学透明性质，它们还用于检测光学颜色的产生(Edminston等人，Coll.Interf.Sci.，163：395，1994)。此外，已知生物分子当被固定化到溶胶-凝胶基质上时，不仅有化学的稳定性还有热力学的稳定性(Dave等人，Anal.Chem.，66：1120，1994)。
以生物传感器为例，溶胶-凝胶反应被用作在固体支持物上形成微结构并对该微结构图案化的方法，以及用作简单的固定化的方法。就这方面而言，图案化的方法包括使用模具，通过流体动力学成型液体状态的溶胶，使成型的材料胶化并去除模具，从而形成图案。例如，一种被称为毛细血管内微模块化(MIMIC)的技术是使介观二氧化硅图案化的技术(KimE，XiaY，WhitesidesGM.1995.Polymermicrostructuresformedbymouldingincapillaries.Nature376：581-584；Marzolin等人，Adv.Mater10：571，1998；Schuller等人，Appl.Optics38：5799，1999)。这种技术可以用于微流体工程的基础图案化。
然而，由于蛋白质的活性会受到诸如pH的多种因素的影响，因此在溶胶-凝胶的过程中通过加入来自其溶胶状态的蛋白质来设定用于保持活性的条件很重要。为了这个目的，提出了通过用多种温和的条件，如中性pH使溶胶与蛋白质预混合而将蛋白质图案化的技术(Kim等人，Biotechnol.Bioeng.73：331-337，2001)，但却存在一些问题，因为在中性pH下，溶胶-凝胶过程快速进行，因此根据添加剂的选择，可能会出现裂缝或者凝胶变得不透明。此外，还有另外一个问题，因为要进行溶胶与蛋白质混合的预处理工艺，所以各样点(spot)的浓度可能不均匀。
在涉及溶胶-凝胶工艺的现有专利中，有专利涉及用于改善生物材料反应性的溶胶-凝胶生物芯片，其中溶胶-凝胶生物芯片的制作是通过将含有生物材料的溶胶混合物在芯片基底上进行胶凝，从而将生物材料包封到凝胶基质的孔中并通过在凝胶基质上形成的孔成为胶囊式结构。另外，还有专利涉及用溶胶-凝胶工艺制作生物芯片的方法，所述方法包括筛选用于溶胶-凝胶生物芯片的溶胶组合物，该组合物防止所固定化的生物材料发生改变或者该组合物增加生物材料的灵敏性。然而，因为制作方法复杂，还因为在制备溶胶组合物的工艺中，生物材料的活性下降或者生物材料分解，所以存在许多问题。
因此，为了防止在制备溶胶组合物的过程中生物材料活性下降以及生物材料分解，本发明人付出了许多努力，结果发现，当以特定的顺序先后混合特定的硅酸盐单体和添加剂并将它们分配到基底上，或者当将这些组分按顺序直接分配到基底上并胶凝，与常规的制作方法相比较，其凝胶化速度可以被延迟，从而使得制作明显均匀的生物芯片成为可能，并且通过上述组分可以防止生物材料的活性下降和分解，从而使制作极高灵敏度的生物芯片成为可能，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种试剂盒形式的溶胶-凝胶材料，从而任何人都可以用所述试剂盒来容易地制造并分析生物芯片，而无需特殊的设备或技术。
本发明的另一个目的是提供一种无需任何预处理工艺而制备均匀的生物芯片的方法，其建立了这样的方法：其中将通过按顺序地混合溶液所获得的特定的溶胶组合物分配到基底上，或者其中将溶液按顺序地直接分配到基底上。
本发明的又另一个目的是提供一种用所述生物芯片来分析目标材料的方法。
为了达到上述目的，本发明的一个实施方式提供一种制备生物芯片的方法，所述方法包括步骤：按顺序混合溶胶-凝胶试剂盒(SolB试剂盒)中的液体，所述液体包括：SolB1、SolB2、SolB3、SolBH和SolBS；将混合液体与检测材料(如蛋白质)相混合；以及将混合物分配到基底上。
本发明的另一个实施方式提供一种通过将溶胶组合物胶凝而无需任何预处理工艺来制备生物芯片的方法，所述方法包括步骤：将由SolB1、SolB2和SolB3组成的溶胶组合物分配到基底上；将SolBH分配到基底上；以及将包括SolBS、检测蛋白质和蒸馏水的溶液分配到基底上，然后使分配的溶液胶凝。
关于可以用来制备生物芯片的SolB试剂盒中的SolB1、SolB2和SolB3，
(i)所述SolB1可为至少一种第一硅酸酯/盐单体，所述第一硅酸酯/盐单体选自甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETrEOS)、硅酸钠、原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)和四甲氧基硅酸酯/盐(TMS)；
(ii)所述SolB2可为至少一种第二硅酸酯/盐单体，所述第二硅酸酯/盐单体选自3-氨基三甲氧基硅烷(3-ATMS)、双甘油基硅烷(DGS)、甲基三甲氧基硅酸酯/盐(MTMS)、聚甘油基硅酸酯/盐(PGS)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、1，3，5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(SIT8189.5)、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺(SIT8189.0)、PluronicL121和四甲基氢氧化铵；和
(iii)所述SolB3可为至少一种添加剂，所述添加剂选自氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯(PEOU)、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000。
详细地，本发明还提供一种通过使溶胶组合物凝胶化来制备生物芯片的方法，所述方法的步骤：
(a)向包括SolB1、SolB2和SolB3的溶胶组合物中加入选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH溶液(溶液I)；
(b)将步骤(a)的溶液与缓冲液SolBS以及蒸馏水混合，并然后在-20℃到4℃的温度范围内使混合溶液稳定化；和
(c)将步骤(b)的稳定溶液与包含与目标生物材料相互作用的生物材料的溶液混合，将混合溶液分配到基底上并使分配的溶液胶凝，
其中，(i)所述SolB1为至少一种第一硅酸酯/盐单体，所述第一硅酸酯/盐单体选自甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETrEOS)、硅酸钠、原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)和四甲氧基硅酸酯/盐(TMS)；
其中，(ii)所述SolB2为至少一种第二硅酸酯/盐单体，所述第二硅酸酯/盐单体选自3-氨基三甲氧基硅烷(3-ATMS)、双甘油基硅烷(DGS)、甲基三甲氧基硅酸酯/盐(MTMS)、聚甘油基硅酸酯/盐(PGS)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、1，3，5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(SIT8189.5)、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺(SIT8189.0)、PluronicL121和四甲基氢氧化铵；和
其中，(iii)所述SolB3为至少一种添加剂，所述添加剂选自氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯(PEOU)、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000。
本发明还提供一种通过使溶胶组合物凝胶化来制备生物芯片的方法，所述方法包括步骤：
(a)将由SolB1、SolB2和SolB3组成的溶胶组合物分配到基底上，并将选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH溶液(溶液I)分配到已分配有溶胶组合物的基底上；和
(b)将包括缓冲液SolBS、与目标生物材料相互作用的生物材料以及蒸馏水的溶液II分配到已经分配有溶液I的基底上，然后使分配的溶液胶凝，
其中，(i)所述SolB1为至少一种第一硅酸酯/盐单体，所述第一硅酸酯/盐单体选自甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETrEOS)、硅酸钠、原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)和四甲氧基硅酸酯/盐(TMS)；
其中，(ii)所述SolB2为至少一种第二硅酸酯/盐单体，所述第二硅酸酯/盐单体选自3-氨基三甲氧基硅烷(3-ATMS)、双甘油基硅烷(DGS)、甲基三甲氧基硅酸酯/盐(MTMS)、聚甘油基硅酸酯/盐(PGS)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、1，3，5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(SIT8189.5)、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺(SIT8189.0)、PluronicL121和四甲基氢氧化铵；和
其中，(iii)所述SolB3为至少一种添加剂，所述添加剂选自氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯(PEOU)、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000。
本发明还提供一种制备生物芯片的试剂盒，其中所述试剂盒用于所述制备方法并包括含有至少一种第一硅酸酯/盐单体(SolB1)的第一容器，所述第一硅酸酯/盐单体选自甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETrEOS)、硅酸钠、原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)和四甲氧基硅酸酯/盐(TMS)；
含有至少一种第二硅酸酯/盐单体(SolB2)的第二容器，所述第二硅酸酯/盐单体包括选自3-氨基三甲氧基硅烷(3-ATMS)、双甘油基硅烷(DGS)、甲基三甲氧基硅酸酯/盐(MTMS)、聚甘油基硅酸酯/盐(PGS)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、1，3，5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(SIT8189.5)、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺(SIT8189.0)、PluronicL121和四甲基氢氧化铵；
含有至少一种添加剂(SolB3)的第三容器，所述添加剂选自氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯(PEOU)、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000；
含有SolBH的第四容器，所述SolBH选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH；和
含有缓冲液SolBS的第五容器，
其中，选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH、缓冲液SolBS、蒸馏水以及与目标生物材料相互作用的生物材料，按顺序地加入由SolB1、SolB2和SolB3组成的溶胶组合物中，从而使溶胶混合物胶凝。
本发明还提供一种用所述制备方法和溶胶组合物制备而成生物芯片、一种用所述生物芯片分析目标生物材料的方法以及一种分析目标生物材料的方法，所述方法包括将样品加入到所述方法制备的生物芯片上的步骤，所述样品包括能与生物材料相互作用的目标生物材料，所述生物材料与目标生物材料相互作用。
附图说明
图1示出用阵列器分配本发明溶胶组合物(S-Sol)、溶液I和溶液II的混合溶胶溶液来制作生物芯片。
图2示出在包括五种HIV1抗原(①、②、③、④和⑤是用于诊断HIV1抗体的标记且它们分别为p24、p31、gp41、gp120和gp160)的样点中的HIV患者的血清反应。
图3示出在包括连续稀释的抗原的样点中的HIV患者连续稀释的血清反应。
图4是示出在包括五种抗原中的一种(①、②、③、④和⑤是诊断HIV1抗体的标记且它们分别为p24、p31、gp41、gp120和gp160)的样点中量化标准HIV血清反应的结果图表。
图5是示出用本发明的蛋白质芯片和传统的诊断试剂盒对在感染后不同的天数所收集的HIV1患者的血清进行的检测结果的对比表。
图6示出用sciFLEXARRYERS11制作的芯片的AxonGenePix扫描照片(A)和照像机图像照片(B)。
图7示意性地示出本发明蛋白质芯片的构造，其包括，当在表面上形成微通道时胶囊式结构检测蛋白质。
图8是一组示出本发明的生物芯片(右)和传统的生物芯片(左)之间均匀性的对比照片。
图9是一组示出本发明的溶胶混合物(A)和通过随机混合溶液所得到的溶胶混合物(B)之间均匀性以及凝胶化速度的对比照片。
图10示出用本发明的蛋白质芯片分析特定蛋白质的结果。
图11示出用本发明的蛋白质芯片分析特定抗原的结果。
图12示出用本发明的蛋白质芯片分析特定疾病抗体的结果。
图13示出用本发明的溶胶-凝胶芯片对特定化合物(双酚A)和DNA适体之间结合的检查结果。
图14是包括本发明的溶胶-凝胶蛋白质芯片的商品的图像。
发明的详细描述及优选实施方式
以下将详细描述本发明。
一方面，本发明涉及一种通过使溶胶组合物凝胶化来制备生物芯片的方法，所述方法包括步骤：
(a)向包括SolB1、SolB2和SolB3的溶胶组合物中加入选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH溶液(溶液I)；
(b)将步骤(a)的溶液与缓冲液SolBS以及蒸馏水混合，然后在-20℃到4℃的温度范围内使混合溶液稳定化；和
(c)将步骤(b)的稳定溶液与包括与目标生物材料相互作用的生物材料的溶液混合，将混合溶液分配于基底上并使分配的溶液胶凝，
其中，(i)所述SolB1为至少一种第一硅酸酯/盐单体，所述第一硅酸酯/盐单体选自甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETrEOS)、硅酸钠、原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)和四甲氧基硅酸酯/盐(TMS)；
其中，(ii)所述SolB2为至少一种第二硅酸酯/盐单体，所述第二硅酸酯/盐单体选自3-氨基三甲氧基硅烷(3-ATMS)、双甘油基硅烷(DGS)、甲基三甲氧基硅酸酯/盐(MTMS)、聚甘油基硅酸酯/盐(PGS)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、1，3，5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(SIT8189.5)、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺(SIT8189.0)、PluronicL121和四甲基氢氧化铵；和
其中，(iii)所述SolB3为至少一种添加剂，所述添加剂选自氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯(PEOU)、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000。
在本发明中，SolBH优选具有1mM到100mM的浓度范围。
在本发明中，SolBS为选自NaH2PO4、Na2HPO4和Na3PO4中的至少一种溶液，浓度范围为1mM到100mM。
用溶胶-凝胶工艺制作生物芯片的传统方法包括以随机顺序混合溶胶组合物、缓冲液以及与目标生物材料相互作用的生物材料来制备混合的溶胶溶液，使混合的溶胶溶液进行后处理，如真空工艺，并使经后处理的溶液胶凝。所述混合溶胶组合物、缓冲液以及检测蛋白质的方法包括漩涡或超声混合，而制备溶胶-凝胶形状的方法包括在基底孔板上形成样点的方法、用溶胶-凝胶溶液包覆基底表面的方法或者将溶胶-凝胶溶液倾倒入模具中并使倾倒的溶液胶凝的方法。
在这些方法中，在由混合的溶胶溶液形成的样点间，与目标生物材料相互作用的生物材料的浓度会不同且会根据操作人员而变化。此外，在混合工艺过程中的污染可能性高，且样品间的溶胶-凝胶混合物的黏性也可能不同，因此样品之间的样点形成程度以及样点形状和大小也会不同。为此，需要一种能制备可克服这些问题的均匀的生物芯片的方法。
根据本发明的生物芯片的制备方法，用简单的溶胶-凝胶工艺来制备生物芯片，且与目标生物材料相互作用的生物材料的浓度遍布样点都是均匀的，从而使得以更精确的方式来高效地检测蛋白质成为可能。
现在将详细描述本发明制备生物芯片的一个实施方式。
首先，按顺序混合第一硅酸酯/盐单体SolB1、第二硅酸酯/盐单体SolB2和添加剂SolB3以制备溶胶组合物。
本发明使用的SolB1为选自甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETrEOS)、硅酸钠、原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)和四甲氧基硅酸酯/盐(TMS)中的一或多种化合物。在本发明的一个实例中，将TEOS用作第一硅酸酯/盐单体。
本发明使用的SolB2为选自3-氨基三甲氧基硅烷(3-ATMS)、双甘油基硅烷(DGS)、甲基三甲氧基硅酸酯/盐(MTMS)、聚甘油基硅酸酯/盐(PGS)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、1，3，5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(SIT8189.5)、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺(SIT8189.0)、PluronicL121和四甲基氢氧化铵中的一或多种化合物。在本发明的一个实例中，将DGS用作第二硅酸酯/盐单体。
此外，本发明使用的添加剂SolB3为选自氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯(PEOU)、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000中的一或多种化合物。在本发明的一个实例中，将PEG用作添加剂SolB3。
可以根据要放置在单体中的生物材料的性质或要制备的溶胶-凝胶芯片的构造，适当地选择第一硅酸酯/盐单体、第二硅酸酯/盐单体和添加剂。
根据本发明制备生物芯片的溶胶组合物优选包括，基于溶胶组合物的总体积，约2-30vol％的第一硅酸酯/盐单体、约2-8vol％的第二硅酸酯/盐单体以及0-5vol％体积的添加剂。因为吸入溶胶组合物对人体是有害的，因此在通风良好的条件下制备溶胶组合物。
本发明用于制备生物芯片的溶胶组合物的特征在于：当组合物胶凝时，由于孔而形成微通道。即，这些通道提供了能与待分析的目标生物材料相互作用的手段。具体地，添加剂(iii)用来控制凝胶中微通道的尺寸。
在本发明中，不使用任何阵列器来执行手工点样技术或者使用非接触阵列器。
在本发明中，可以在使用前，在高于露点的温度下对基底进行优化，“高于露点的温度”是指比形成露点的温度更高的温度，且该温度可以根据湿度条件而变化，例如，当大气温度为20℃且相对湿度高于50％时，露点是8.6℃，通常，当湿度为70-80％时，露点温度为14-17℃。
在本发明中，可以用选自聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、硅和玻璃中的任一种来制备基底。
在本发明中，与目标生物材料相互作用的生物材料可以选自核酸、蛋白质、肽、低分子量材料和细胞中的任一种。
在本发明中，可将步骤(a)中加入的溶液，溶胶混合物，放置在范围为-20℃到4℃的温度下30分钟或更长来使之稳定化。此外，可将用阵列器向其中引入溶胶组合物的容器设定在14-17℃(高于湿度为70-80％时的露点温度)的条件下，以及可在湿度为70-80％且大气温度(空气温度)为20℃的条件下分配溶胶组合物，其中所述温度和湿度条件是对于溶胶-凝胶转化最佳的。
经过这些稳定化和优化工艺，可以延迟凝胶组合物的凝胶化速度，从而可以有助于孔的形成，防止凝胶化后的孔破裂，并有助于芯片中微通道的形成。
在本发明中，溶胶组合物、SolBH和SolBS的混合溶液、蒸馏水以及与目标生物材料相互作用的生物材料相互以3∶1∶4到1∶2∶8之间的比例混合。
在本发明中，SolBH和SolBS的浓度范围为1mM到100mM。
在本发明中，SolBS∶蒸馏水∶与目标生物材料相互作用的生物材料间的体积比为1∶2∶1到2∶5∶1之间。
在本发明中，缓冲液是pH范围为3到8的磷酸钠缓冲液。
在本发明中，基底进行等离子体表面处理、进行蚀刻或用PDMS、硅酸盐单体或聚合物材料处理。
另一方面，本发明涉及一种通过使溶胶组合物凝胶化来制备生物芯片的方法，所述方法包括步骤：
(a)将由SolB1、SolB2和SolB3组成的溶胶组合物分配到基底上，并将选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH溶液(溶液I)分配到已分配有溶胶组合物的基底上；和
(b)将包括缓冲液SolBS、与目标生物材料相互作用的生物材料以及蒸馏水的溶液II分配到已经分配有溶液I的基底上，然后使分配的溶液胶凝，
其中，(i)所述SolB1为至少一种第一硅酸酯/盐单体，所述第一硅酸酯/盐单体选自甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETrEOS)、硅酸钠、原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)和四甲氧基硅酸酯/盐(TMS)；
其中，(ii)所述SolB2为至少一种第二硅酸酯/盐单体，所述第二硅酸酯/盐单体选自3-氨基三甲氧基硅烷(3-ATMS)、双甘油基硅烷(DGS)、甲基三甲氧基硅酸酯/盐(MTMS)、聚甘油基硅酸酯/盐(PGS)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、1，3，5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(SIT8189.5)、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺(SIT8189.0)、PluronicL121和四甲基氢氧化铵；
其中，(iii)所述SolB3为至少一种添加剂，所述添加剂选自氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯(PEOU)、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000。
其中(iv)所述SolBH溶液为至少一种选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH中的溶液，浓度范围为1mM到100mM；和
其中(v)所述SolBS溶液为至少一种选自NaH2PO4、Na2HPO4和Na3PO4中的溶液，浓度范围为1mM到100mM。
在本发明中，可以在使用前，在高于露点的温度下对基底进行优化，“高于露点的温度”是指比形成露点的温度更高的温度，且该温度可以根据湿度条件而变化，例如，当大气温度为20℃且相对湿度高于50％时，露点是8.6℃，通常，当湿度为70-80％时，露点温度为14-17℃。
这样做，当按顺序地将溶液分配到基底上时，可以延迟溶胶组合物的凝胶化速度，从而可以有助于样点的形成，防止凝胶化后的孔破裂，并有助于芯片中微通道的形成。
根据本发明的方法，在分配完溶胶组合物后，在该溶胶组合物上分配选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH(溶液I)。溶液I用于制造诱导溶胶组合物凝胶化的pH环境。所述HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的浓度优选5-30mM。溶液I用于将溶胶组合物的pH调节到1-3。
最后，将包括缓冲液SolBS、检测蛋白质和蒸馏水的溶液II分配到基底上，并使分配的溶液胶凝。
在本发明中，缓冲液SolBS为pH范围为3-8的磷酸钠缓冲液。
缓冲液和双蒸馏水具有防止生物材料(如蛋白质)降解的功能。超出适当的pH范围时，生物材料可能会活性下降或分解，并且在较高的pH下，溶胶凝胶化的速度较慢，而在较低的pH时溶胶凝胶化的速度较快。为此，调节溶胶组合物的pH很重要，从而使组合物的凝胶化在适当的时间内进行，同时防止生物材料活性下降或生物材料分解。通常，生物材料在pH范围5-8的条件下稳定存在，为此，使用缓冲液来防止生物材料因溶液I造成的pH环境而分解。用于本发明的缓冲液没有特别的限制并可以由本领域的普通技术人员根据所添加的生物材料进行适当的选择。在本发明的一个实例中，将pH范围为3-8的磷酸钠用作缓冲液。此外，如在此使用，术语“与目标生物材料相互作用的生物材料”或“生物材料”是指可以与目标生物材料(如目标蛋白质)相互作用的生物材料，其实例包括核酸、蛋白质、肽、低分子量材料、细胞等。可以用适当的缓冲液来将这种与目标生物材料相互作用的生物材料掺入溶液II中。即，将目的生物材料加入到缓冲液溶液中以制备用于检测的样品溶液。例如，如果生物材料是蛋白质，则可使用PBS缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水)，而如果存在酶反应，需要的话，可使用不同浓度的HEPES、NaCl、EDTA等。在本发明的一个实例中，使用源自HVI1(人免疫缺陷病毒1)患者的抗体作为目标生物材料(目标蛋白质)，并使用在PBS缓冲液中的五种抗原标记(能结合HIV抗体)作为检测蛋白质。
在本发明中，在溶液II中缓冲液SolBS∶蒸馏水∶与目标生物材料相互作用的生物材料的体积比优选在1∶2∶1和2∶5∶1之间，更优选1∶2∶1。例如，溶液II可包括：基于溶液II的总体积，约20-30vol％的缓冲液，约40-60vol％的蒸馏水和约20-30vol％的检测蛋白质。在本发明的一个实例中，以含有10μl缓冲液、20μl蒸馏水和10μl检测蛋白质的混合物作为溶液II。
本发明的特征在于溶胶组合物、溶液I和溶液II以精确的量、按顺序地分配，从而制作均匀的蛋白质芯片。
在本发明中，溶胶组合物∶溶液I∶溶液II的分配量之比为3∶1∶4和1∶2∶8之间，更优选3∶1∶4。例如，溶胶组合物的分配量优选为25-35μl，最优选约30μl。此外，溶液I的分配量优选为5-15μl，最优选约10μl。另外，溶液II的分配量优选为35-45μl，最优选约40μl。
在根据本发明制备生物芯片的方法中，溶胶组合物、溶液I和溶液II彼此混合，然后分配到基底上。这种情况，优选用吸液管或其它工具执行手工样点技术，或使用非接触阵列器。
在本发明中，所述方法没有预处理工艺。所述预处理工艺可以为选自下组的一种或多种：(i)SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS或与目标生物材料相互作用的生物材料的混合工艺；(ii)步骤(i)的混合溶液的漩涡工艺；和(iii)步骤(i)或步骤(ii)的混合溶液的稳定化工艺。
在本发明中，SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS以及与目标生物材料相互作用的生物材料，在分配前可以被包含在容器中，且可以通过喷嘴吸出进行分配。
在本发明中，SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS以及与目标生物材料相互作用的生物材料可以被包含在与分配喷嘴相连接的大规模生产用卡盒中，且分配量可以是用喷嘴吸取工艺的100倍以上，因此本方法能实现大规模生产。
当无需预处理工艺而将溶胶组合物、溶液I和溶液II按顺序直接分配到基底上以构建芯片时，可以用分配阵列器进行分配，所述阵列器允许以精确的量分配溶胶组合物、溶液I和溶液II。在这点上，由于可以使用阵列器以精确的量来分配溶胶组合物、溶液I和溶液II，优选使用非接触阵列器。
根据在生物芯片上排列检测材料的方法，阵列器分为“接触阵列器”和“非接触阵列器”。例如，接触阵列器用其中具有很窄空间的插针将检测蛋白质排列在芯片表面上。这种方法中，包括检测蛋白质的溶液一点接一点地从插针流出来并且当直接与芯片表面接触时便排列在芯片表面上。这种方法的优势在于，它可以在短时间内排列多种检测蛋白，但它不能精确地控制溶液的体积，因此所产生的生物芯片的均匀性会下降。另一方面，非接触阵列器是通过将含检测蛋白的溶液放置在薄管中，将该管放于芯片表面正上方并对该管施加一定的压力，从而不直接接触而将检测蛋白排列在芯片表面上的方法。这种方法的优势是可以精确地确定溶液的分配量。相应地，当无需预处理工艺而按顺序地分配溶胶组合物、溶液I和溶液II来构建芯片时，非接触阵列器使得将被分配的各溶液的体积控制为预设体积成为可能。因此，在本发明中，优选使用这种非接触阵列器。
用非接触阵列器按顺序将溶胶组合物、选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的溶液I以及溶液II(与目标生物材料相互作用的生物材料、缓冲液和蒸馏水的混溶液)分配到基底孔板上，所述非接触阵列器可将这些组分以精确的体积进行分配。当另一溶液分配到已经分配在表面的小样点上时，由于溶液的表面张力，所述溶液将形成样点的形状而不会扩散开。此时，当溶液落下时产生的表面能量将转化成震动，从而在样点内产生材料流动(对流)，因此两种溶液很容易地彼此混合。利用这种原理，本发明人设计了一种自动制作溶胶-凝胶芯片的方法，所述方法将材料直接在芯片上形成样点而无需对材料进行预处理。
例如，可使用微阵列器(购自ScienionAG)。具体地，露点控制技术(ScienionAG))的使用能使平板表面上由于水气凝固导致的浓度不确定性最小化，从而制作体积和尺寸更精确的样点。在本发明的一个实例中，将sciFLEXARRAYERS11(ScienionAG，德国)用作阵列器。
即，在本发明中，用非接触微阵列器来制作生物芯片，通过将精确体积的各溶液分配到基底上从而以更便捷的方法制作生物芯片，且可以制作更均匀的生物芯片，因为不像传统方法那样，本发明的方法不需要预混合溶胶-凝胶单体、缓冲液、检测蛋白质样品等的预处理工艺。
同时，本发明使用的基底具有在溶胶组合物胶凝后为透明的性质，且因为这个原因，基底孔板或载片优选用可维持良好透明性的材料制备而成。例如，基底可由塑料材料，如高度透明的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、硅或玻璃制备而成。
此外，用于本发明的基底表面是经过表面处理后才使用的，因此混合的溶胶溶液胶凝时可以被固定于基底。本发明生物芯片的一个重要的要求是当混合的溶胶溶液胶凝时，应坚固地固定于基底，从而当它们与包含目标生物材料的溶液反应时，样点不会脱落。因为这个原因，在用生物芯片分析目标生物材料时，与目标生物材料反应后需要强烈的冲洗工艺，因而，为了承受住这种物理力，坚固地固定样点是必要的。为了这个目的，优选使用表面未经处理的塑料基底、表面用等离子体处理过的塑料基底、表面未经处理的玻璃基底、表面经处理的玻璃基底(如蚀刻的玻璃基底)或具有多孔结构的硅芯片。
在本发明中，基底的表面可以用等离子体预处理。或者，本发明的基底可以预先被蚀刻或者用PDMS或硅酸盐单体或聚合物材料处理。
当根据本发明用阵列器来制作生物芯片时，应注意以下事项。
首先，因为生物芯片是用特殊材料(溶胶)制备的，且具有随时间推移而胶凝的性质，不像DNA芯片，用阵列器在尽可能的短的时间内进行分配非常重要，以防止溶胶在分配的过程中胶凝。
其次，湿度和温度是重要的因素。因为凝胶化速度和在基底上形成的样点的活性是由形成样点的环境湿度和温度决定的，初始湿度和温度非常重要。因此，用溶胶-凝胶溶液制作生物芯片时，预设阵列器周围的温度和湿度非常重要。
在本发明中，排列工艺是在湿度为约50％或更高的条件下进行的，且更具体地为70-80％，进行排列工艺时的温度优选为约25℃或更低，且更具体地为10-25℃(室温)。具体地，因为高的初始湿度是样点凝胶化的重要因素，所以在排列之前应将湿度设为约80％。此外，如果温度为25℃或更高，溶胶可能迅速胶凝，为了这个原因，排列工艺优选在尽可能低的温度下进行。
如上所述，在预设温度和湿度且已准备快速排列的程序后，按顺序分配溶液。
在本发明中，与目标生物材料相互作用的生物材料为选自核酸、蛋白质、肽、低分子量材料和细胞中的任一种。
另一方面，本发明涉及一种用于制备生物芯片的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一容器，包含选自甲基三乙氧基硅烷(MTES)、乙基三乙氧基硅烷(ETrEOS)、硅酸钠、原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)和四甲氧基硅酸酯/盐(TMS)的第一硅酸酯/盐单体SolB1中的至少一种；第二容器，包含选自3-氨基三甲氧基硅烷(3-ATMS)、双甘油基硅烷(DGS)、甲基三甲氧基硅酸酯/盐(MTMS)、聚甘油基硅酸酯/盐(PGS)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、1，3，5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(SIT8189.5)、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺(SIT8189.0)、PluronicL121和四甲基氢氧化铵的第二硅酸酯/盐单体SolB2中的至少一种；第三容器，包含选自氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯(PEOU)、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000的添加剂SolB3中的至少一种；第四容器，包含选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH；以及第五容器，包含缓冲液SolBS，
其中，选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH、缓冲液SolBS、蒸馏水以及与目标生物材料相互作用的生物材料按顺序添加到由SolB1、SolB2和SolB3组成的溶胶组合物中，从而使溶胶组合物胶凝。
容器的材料不受限制。试剂盒的形式可以是瓶、桶、袋、包、管、安瓿及之类，其部分或全部可由塑料、玻璃、纸、箔、蜡及类似物形成。传感器容器可装配有可全部或部分分离的盖子，所述盖子可以是容器的初始组成部分或可以是通过机械、黏着或其它方式固定于容器。试剂盒可包括外包装，其可包括有关组分使用的说明书。
另一方面，本发明涉及一种用根据所述制备方法制备而成的生物芯片来分析目标生物材料的方法。
更具体地，本发明涉及一种分析目标生物材料的方法，所述方法包括向根据所述制备方法制备的生物芯片中添加样品的步骤，所述样品包含能与生物材料相互作用的目标生物材料，所述生物材料与待检测的目标生物材料相互作用。
按上述方法制备将与目标生物材料反应的蛋白质芯片之后，该蛋白质芯片能与包括目标生物材料的溶液反应。在96-孔芯片的情况下，反应溶液的量优选为50-100μl，反应时间优选为约1小时。与生物材料(与目标生物材料相互作用)相互作用的目标生物材料同样也是一种生物材料，该生物材料的实例包括核酸、蛋白质、肽、低分子量材料和细胞。
含有目标生物材料的反应溶液通过样点上的微孔结构渗入到孔中并与固定在胶囊式结构(encapsulatedstructure)中的蛋白质相互作用与结合(第一次孵育)。反应后，为了分析的确与样点中的生物材料(与目标生物材料相互作用)相结合的目标生物材料，可以使所述目标生物材料与标记蛋白质反应以检测目标生物材料。在本发明的一个实例中，使用针对目标蛋白质的荧光染料(Cy3)-缀合的标记(第二次孵育)。在这方面，反应时间设为30分钟，反应溶液的量设为50-100μl。上述第一次和第二次孵育工艺都是在室温下进行的。如果含有目标生物材料的反应溶液是包括多种材料的混合物，那么可在第一次孵育工艺之前采取封闭工艺以防止与下述生物材料的非-特异性结合，所述生物材料与在蛋白质芯片中含有的目标生物蛋白相互作用。在封闭工艺中，可用如脱脂乳、BSA(牛血清白蛋白)或IgG作为封闭液。
在第一次和第二次孵育工艺各者之后，用传统的冲洗缓冲液进行冲洗工艺。在本发明的一个实例中，使用含0.2％Tween-20的PBS缓冲液。在冲洗工艺中，使用ELISA洗涤器。第一次冲洗工艺重复4次，而第二次冲洗工艺重复4次。进行完冲洗工艺后，进行干燥工艺，直到完全去除各孔中的溶液为止。
干燥工艺完成之后，可以用可检测荧光染料的图像扫描仪对在其中发生反应的孔进行扫描，以检测是否发生了实际的反应。此外，可以用软件通过测量图像的暗度来测定反应的程度。即，本发明分析目标生物材料的方法还额外包括使目标生物材料与诸如由放射性同位素、荧光染料或其它标记物质标记的蛋白质或适体的生物材料反应的步骤。本发明使用的术语“适体”是指可以高亲和度同与目标生物材料相互作用的生物材料特异性结合的小单链寡核苷酸。
本发明还提供一种包括由所述制备方法制备的生物芯片的检测试剂盒。
用于对检测生物材料进行检测的试剂盒可以是瓶、桶、袋、包、管、安瓿及之类的形式，其部分或全部由塑料、玻璃、纸、箔、蜡及类似物形成。传感器容器装配有可全部或部分分离的盖子，所述盖子可以是容器的初始组成部分或可以是通过机械、黏着或其它方式固定于容器。试剂盒可包括外包装，其可包括有关组分使用的说明书。
以下，将参考实施例进一步详细描述本发明。然而，应理解这些实施例仅是作为解释的目的，不能理解为是对本发明范围的限制。
实施例1：用于制备生物芯片的各组成溶液的制备
将各自选自下表1中显示的组分的20μlSolB1、6μlSolB2和4μlSolB3相互混合以制备溶胶组合物。制备10μlSolBH作为溶液I。
表1：各溶液的组分
同时，将10μl选自NaH2PO4、Na2HPO4和Na3PO4中的至少一种SolBS和20μl双蒸馏水(DDW)相互混合，同时将能与HIV1抗体相互作用的、各为10-200ng的五种检测蛋白质(p24、p31、gp41、gp120和gp160)与PBS缓冲液混合以制备10μl样品溶液。将样品溶液添加到混合物中，然后漩涡5秒并旋转减慢以制备溶液II。
表2：溶胶组合物、溶液I、溶液II和检测蛋白质的组分
| 组分 | |
| 溶胶组合物 | 20μl SolB1、6μl SolB2和4μl SolB3 |
| 溶液I | 10μl SolBH |
| 溶液II | 10μl SolBS和20μl DDW、10μl含有5种HIV抗原的PBS溶液 |
实施例2：生物芯片的制作
(1)基底孔板的制备
自SPL有限公司(韩国)购买由PMMA制成的市售96-孔板，其表面已用等离子体处理过。
(2)生物芯片(蛋白质芯片)的制作
为了制作蛋白质芯片，将阵列器设定在温度为16℃和湿度为80％，对于实施例1所获得的混合溶胶溶液将加入的源孔板，制备常规的384-孔板，而对于目标孔板，制备上述(1)部分制备的由PMMA制成的96-孔板。此外，还准备按预定的精确体积进行分配的sciFLEXARRYERS11阵列器(Scienion，德国)。
然后，将30μl通过混合实施例1中20μlSolB1、6μlSolB2和4μlSolB3所制备的溶胶组合物、10μlSolBH(溶液I)和40μl溶液II加入到sciFLEXARRYERS11阵列器(Scienion，德国)的源板中。
将预定体积的溶胶组合物、溶液I和溶液II按顺序分配到所制备的由PMMA制成的96-孔板上。用喷嘴PDC90(ScienionAG，德国)以每孔450pl或更少的量分配这些溶液。将形成样点的频率设定为500Hz。所形成的样点的尺寸约为300μm(每样点8滴)。
图6显示的图片(A)是用AxonGenePix扫描仪(Axon)在532nm处扫描得到的，而图片(B)是用装配有照像机的sciFLEXARRAYER获得的。蛋白质芯片上样点间的距离(点距)为600μm。
比较例1：与传统蛋白芯片的均匀性比较
将根据本发明的蛋白质芯片与传统的蛋白质芯片相比较，以确定本发明的蛋白质芯片与传统的蛋白质芯片相比较是否具有很高的均匀性。
首先，以公知的传统方法制作的蛋白质芯片作为对照。按顺序混合硅酸盐单体、HCl、DW、SP以及样品溶液，并用插针阵列器将混合的溶液分配到源板上并在PMMA制成的96-孔板上形成样点。以OnmiGridAccent阵列器(染色体组溶液，美国)作为插针阵列器。
此外，在显微镜下，用数字照相机拍摄根据这个方法制作的蛋白质芯片的图像，并将所得的照片与根据本发明的实施例1和2所制作的蛋白质芯片的照片(图6B)进行比较。
结果如图8所示，在使用特定的溶胶组合物并按顺序分配溶液I和溶液II而没有混合溶液I和溶液II的预处理过程，来制作的本发明的蛋白质芯片的情况下，样点的形状和尺寸恒定，但在根据传统方法制作的蛋白质芯片的情况下，样点的形状和尺寸不恒定。这表明根据本发明的蛋白质芯片与传统的蛋白质芯片相比具有显著高的均匀性。
比较例2：与混合顺序改变的实例的比较
将根据本发明的混合顺序来混合溶液所获得的溶胶混合物与和本发明的混合顺序不同的顺序来混合溶液所获得的溶胶混合物进行比较。
根据本发明的混合顺序，SolBH、SolBS、蒸馏水和缓冲液按顺序地加入到由SolB1、SolB2和SolB3组成的溶胶组合物中以制备混合物。作为比较，以相同的方法制备混合物，只是最后加入SolBH。用数码照像机拍摄这两种混合物，并将照片进行相互比较。
结果见图9，当混合物是根据本发明的混合顺序制备而成时，溶液容易相互混合，因此它们是清澈的且很长时间内不会胶凝(图9A)，但当根据不同的混合顺序制备混合物时，溶液不容易相互混合且很快胶凝(图9B)。
实施例3：用蛋白质芯片分析和诊断HIV
用10％的脱脂奶溶液封闭实施例2制作的蛋白质芯片，之后向芯片的每个孔中加入50μl稀释的HIV患者的血清并在室温下初次孵育1小时。初次孵育完成后，去除血清，并重复在ELISA洗涤器中用含0.2％Tween-20的冲洗缓冲液来漩涡芯片5分钟的步骤4次(第一次冲洗)。第一次冲洗完成后，向芯片加入50μl识别人抗体的-人-Cy3抗体(JacksonImmunoResearch)稀释液，然后在室温下进行第二次孵育1小时。第二次孵育完成后，去除-人-Cy3，并重复在ELISA洗涤器中用冲洗溶液来漩涡芯片5分钟的步骤4次(第二次冲洗)。
完成第二次冲洗后，将各孔在室温下放置10分钟或更长以干燥，并用激光扫描仪，FUJIFLA-9000图像扫描仪，对发生反应的样点进行扫描。此外，用图像分析程序ImageQuantTL来测量发生反应的各个样点处的荧光信号的强度，从而量化反应并分析反应程度。
如图2所示，五个标记(p24、p31、gp41、gp120和gp160；Abcam有限公司、Fitzerald有限公司)显示出对患者血清有反应，而不含抗原标记的阴性对照芯片则显示没有反应。
图3显示的结果是通过将五种抗原和一种HIVO-型抗原中最具反应活性的4种抗原(p24、p31、gp41、gp120)各自连续稀释，将各稀释液点样到各孔中并使稀释液与HIV标准血清反应而得到的。如所料，可以看到正确地完成了定量反应。上述结果表明：在本发明制作的蛋白质芯片上特异地产生了抗原-抗体反应。
图4显了在含有五种抗原中每一种的样点中，HIV1标准血清定量反应的结果。图4的X轴表示当使用传统的ELISA诊断试剂盒诊断HIV的标准血清时所测量的滴度，并如图4所示，用本发明的蛋白质芯片所获得的分析结果与用传统诊断芯片所获得的分析结果相关。X轴中的PRB204-00是购自Bostonbiomedica公司的患者标准血清样品。该产品的名称是抗-HIV1混合滴度性能板，编号为PRB204(M)。用传统试剂盒检测的滴度值是s/co数值且该数值是切断比率(阳性和阴性的标准值)的信号，当该数值大于1时，结果判定为阳性。图4的Y轴表示样点中荧光信号的强度(“信号”)除以阴性对照样点中的荧光信号的强度(“对照”)。
图5的表格显示了与传统诊断试剂盒相比较，在不同天数收集自HIV感染患者的血清转化板的反应。患者的血清标准样品购自Bostonbiomedica公司。还提供了用传统诊断试剂盒和标准样品的检测结果。样品的名称为抗-HIV血清转化板V，编号为PRB922。
由此可见，HIV感染数天后，用传统的ELISA诊断试剂盒无法检测出HIV感染，但与抗原检测试剂盒一样，即使在感染的最初阶段，本发明的蛋白质芯片也能够检测出HIV感染。
这表明本发明的蛋白质芯片与传统的抗体诊断ELISA试剂盒相比较，具有显著高的敏感性。
实施例4：用蛋白质芯片代替蛋白质印迹(Westernblot)法
蛋白质印迹和免疫染色法是一种从多种蛋白质的混合物中找出特定蛋白质的技术，并且是一种通过用所要找的蛋白质的抗体来引起抗原-抗体反应从而检测特定蛋白存在的方法。
通常，用蛋白质印迹来寻找特定蛋白质的过程包括：使蛋白质混合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳以根据大小来分离混合物，将蛋白质转移到硝化纤维或尼龙膜，并在被转移有蛋白质的膜上用抗原-抗体反应来寻找对应特定抗体的抗原。以放射性同位素或缀合特定的酶(如辣根过氧化物酶)或荧光染料来标记用于该工艺的抗体，并因此使得要寻找的蛋白质显现成为可能。
当用实施例2制备的蛋白质芯片来代替包括复杂步骤的蛋白质印迹时，通过固定蛋白质混合物然后用荧光染料缀合的抗体来分析蛋白质混合物便可容易且简单地从蛋白质混合物中找到特定的蛋白质。
此外，因为蛋白质电泳通常是在还原状态下进行，使得蛋白质在变性状态下与抗体结合。如果特定的抗体只能识别天然形式的蛋白质，则通常的蛋白质印迹无法找到该蛋白质。然而，根据本发明的溶胶-凝胶蛋白质芯片则使得以天然的形式固定蛋白质成为可能，表明本发明的芯片更有用。
以下实验是用实施例2制备的溶胶-凝胶芯片进行的。
(1)根据天然形式和变性形式的p24的比较实验
(i)首先，用只与天然形式结合而不与变性形式结合的抗体进行实验。结果，在蛋白质印迹中没有出现条带，且仅在溶胶-凝胶芯片上只有该抗体为阳性。
(ii)用抗相同抗原但结合变性形式的抗体来进行蛋白质印迹分析和溶胶-凝胶蛋白质芯片分析。结果，抗体在蛋白质印迹和溶胶-凝胶芯片中均为阳性。
这表明根据本发明的溶胶-凝胶芯片可以检测变性和天然两种形式。
(2)用表达了p24蛋白质的大肠杆菌的粗提取物进行实验。
(i)将表达了p24蛋白质的大肠杆菌粗提取物以不同的浓度(溶菌液1、2和3)固定到溶胶-凝胶蛋白质芯片，然后用该被表达的蛋白质的抗体进行分析。结果，抗体在溶胶-凝胶蛋白质芯片上为阳性(图10)。
(ii)将未表达特定蛋白质的大肠杆菌粗提取物(N)固定到溶胶-凝胶蛋白质芯片，然后用上述抗体进行分析。结果，如图10所示，抗体在溶胶-凝胶蛋白质芯片上为阴性(图10)。
在图10中，“N”为未附着大肠杆菌粗提取物的阴性对照，其中没有表达特定的蛋白质；溶菌液1是以0.09ug/ul的浓度固定表达特定蛋白质的大肠杆菌粗提取物组；溶菌液2是以0.18ug/ul的浓度固定表达特定蛋白质的大肠杆菌粗提取物组；以及溶菌液3是以0.27ug/ul的浓度固定表达特定蛋白质的大肠杆菌粗提取物组。另外，“P”是固定了Cy3荧光材料的阳性对照。
(3)(i)将p24蛋白质的抗体以不同浓度固定到溶胶-凝胶蛋白芯片，然后以过量表达p24蛋白质的大肠杆菌粗提取物用夹心分析法来分析。然后，使抗体结合蛋白质芯片并分析。结果，蛋白质在溶胶-凝胶芯片上为阳性(图11)。
(ii)使待检测抗原的抗体以不同浓度固定到溶胶-凝胶蛋白质芯片，然后用夹心法分析未表达特定抗原的大肠杆菌粗提取物。然后使抗体结合蛋白质芯片并分析。结合，抗体在溶胶-凝胶芯片上为阴性(图11)。
(4)(i)使将要检测的疾病(AIDS)的抗体对应的抗原(p24、p31、gp41、gp120和gp160)固定到溶胶-凝胶芯片，然后用包括特定抗体的材料(阳性血清)进行分析。结合，抗体在溶胶-凝胶芯片上显示为阳性(图12)。
(ii)将针对要检测的抗体的抗原固定到溶胶-凝胶芯片上，然后用不包括特定抗体(例如血清)的材料(阴性血清)进行分析。结果，抗体在溶胶-凝胶芯片上显示为阴性(图12)。
实施例5：蛋白质或特定材料结合化合物的检测
如图13所示，将特定化合物(双酚A)固定到实施例2制作的溶胶-凝胶芯片上。作为阴性对照，只将用于溶解化合物的缓冲溶液固定到芯片上。另外，用荧光染料(cy3)-标记的、能结合双酚A的单链DNA适体(PCL公司)来分析芯片。
可以通过酵母双杂交或免疫沉淀(IP)检测蛋白质-蛋白质结合，但是能容易地检测化合物-蛋白质结合或化合物-DNA结合的方法却很少。从上述实验结果可以看出，实施例2制作的蛋白质芯片可以固定多种材料，包括低分子量材料，如化合物或DNA、蛋白质和抗体，并因此容易地检测多种材料的结合。
尽管参照特定特征详细地描述了本发明，但是很明显，对本领域的技术人员来说，这种描述仅作为优选的实施方式而并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等效物来限定。
工业应用性
如上所述，根据本发明，通过溶胶组合物凝胶化来制备生物芯片时，由SolB1、SolB2和SolB3组成的溶胶组合物、SolBH、SolBS、蒸馏水和缓冲溶液按顺序混合，然后在低温下稳定化，从而可以延迟溶胶组合物的凝胶化速度并诱导稳定的组合物凝胶化，因此便于分配溶胶溶液以及维持样点的活性。此外，通过用阵列器在基底表面上点样溶液，可以以简单且容易的方式来构建均匀的生物芯片，而无需溶液预混合的预处理工艺。
Claims (22)
1.一种通过使溶胶组合物凝胶化来制备生物芯片的方法，所述方法按顺序包括步骤(a)和(b)：
(a)将由SolB1、SolB2和SolB3组成的溶胶组合物分配到基底上，并将包括选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH溶液的溶液I分配到已分配有溶胶组合物的基底上；和
(b)将包括缓冲液SolBS、与目标生物材料相互作用的生物材料以及蒸馏水的溶液II分配到已经分配有溶液I的基底上，然后使分配的溶液胶凝，
其中所述方法没有预处理工艺，所述预处理工艺为选自下组的一种或多种：(i)溶胶组合物、溶液I和溶液II的混合工艺；(ii)步骤(i)的混合溶液的漩涡工艺；和(iii)步骤(i)或步骤(ii)的混合溶液的稳定化工艺；
其中，所述SolB1为选自甲基三乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、硅酸钠、原硅酸四甲酯、原硅酸四乙酯和四甲氧基硅酸酯/盐的第一硅酸酯/盐单体中的至少一种；
其中，所述SolB2为选自3-氨基三甲氧基硅烷、双甘油基硅烷、甲基三甲氧基硅酸酯/盐、聚甘油基硅酸酯/盐、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯、1,3,5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺、普兰尼克L121和四甲基氢氧化铵的第二硅酸酯/盐单体中的至少一种；
其中，所述SolB3为选自氨丙基三乙氧基硅烷、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000的添加剂中的至少一种。
2.权利要求1所述的方法，其中不用任何阵列器而执行手工样点技术或使用非接触式的阵列器。
3.权利要求1所述的方法，其中SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS以及与目标生物材料相互作用的生物材料，在分配前被包含在容器里，且通过喷嘴吸出进行分配。
4.权利要求1所述的方法，其中SolB1、SolB2、SolB3、SolBH、SolBS以及与目标生物材料相互作用的生物材料被包含在与分配喷嘴相连接的大规模生产用卡盒中，且分配量与喷嘴吸取工艺相比高100倍，因此本方法能达到大规模生产。
5.权利要求1所述的方法，其中所述基底由选自聚甲基丙烯酸甲酯、塑料、硅和玻璃中的任一种制备而成。
6.权利要求1所述的方法，其中所述与目标生物材料相互作用的生物材料选自核酸、蛋白质、肽和细胞中的任一种。
7.权利要求1所述的方法，其中所述基底在使用前，在高于露点的温度下进行优化，并在湿度高于50％下将第二溶液分配到基底上。
8.权利要求1所述的方法，其中所述溶胶组合物:溶液I:溶液II的分配量是3:1:4。
9.权利要求1所述的方法，其中所述SolBH和SolBS的浓度范围为1mM到100mM。
10.权利要求1所述的方法，其中所述SolBS:蒸馏水:与目标生物材料相互作用的生物材料的体积比为1:2:1。
11.权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液SolBS是pH范围为3-8的磷酸钠缓冲液。
12.权利要求1所述的方法，其中所述基底经等离子体表面处理、经蚀刻或经PDMS、硅酸盐单体或聚合物材料处理。
13.一种通过使溶胶组合物凝胶化来制备生物芯片的方法，所述方法按顺序包括步骤(a)至(c)：
(a)向包括SolB1、SolB2和SolB3的溶胶组合物中添加包括选自HCl、H2SO4、HNO3和CH3COOH的SolBH溶液的溶液I；
(b)将步骤(a)的溶液与包括缓冲液SolBS的溶液II以及蒸馏水混合，然后在-20℃到低于4℃的温度范围内稳定化混合后的溶液；
(c)将步骤(b)的稳定化的溶液和含有与目标生物材料相互作用的生物材料的溶液混合，将混合溶液分配到基底上并使分配的溶液胶凝；
其中所述SolB1为选自甲基三乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、硅酸钠、原硅酸四甲酯、原硅酸四乙酯和四甲氧基硅酸酯/盐的第一硅酸酯/盐单体中的至少一种；
其中所述SolB2为选自3-氨基三甲氧基硅烷、双甘油基硅烷、甲基三甲氧基硅酸酯/盐、聚甘油基硅酸酯/盐、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟乙酯、N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯、1,3,5-三甲苯、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、3-(三乙氧硅基)丙基琥珀酸酐、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺、N-(三乙氧基硅基丙基)葡糖酰胺、普兰尼克L121和四甲基氢氧化铵的第二硅酸酯/盐单体中的至少一种；
其中所述SolB3为选自氨丙基三乙氧基硅烷、3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷、N-三乙氧基硅基丙基-O-聚氧乙烯氨基甲酸酯、甘油、PEG200、PEG400、PEG600、PEG1350和PEG8000的添加剂中的至少一种。
14.一种分析目标生物材料的方法，所述方法包括向通过权利要求1所述的方法制备而成的生物芯片中添加样品的步骤，所述样品包括能与生物材料相互作用的目标生物材料，所述生物材料与目标生物材料相互作用。
15.权利要求14所述的方法，其中所述目标生物材料为选自核酸、蛋白质、肽和细胞中的任一种。
16.权利要求14所述的方法，进一步包括使目标生物材料与可检测目标生物材料的、用发光材料标记的蛋白质反应的步骤。
17.权利要求14所述的方法，进一步包括使目标生物材料与可检测目标生物材料的、用发光材料标记的抗体反应的步骤。
18.权利要求14所述的方法，进一步包括使目标生物材料与可检测目标生物材料的、用发光材料标记的适体反应的步骤。
19.权利要求14所述的方法，进一步包括使目标生物材料与可检测目标生物材料的、用放射性同位素或染料标记的蛋白质反应的步骤。
20.权利要求14所述的方法，进一步包括使目标生物材料与可检测目标生物材料的、用放射性同位素或染料标记的抗体反应的步骤。
21.权利要求14所述的方法，进一步包括使目标生物材料与可检测目标生物材料的、用放射性同位素或染料标记的适体反应的步骤。
22.权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述染料是荧光染料。
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