CN101124483B - 通过最少能量吸附最优化被分析物和抗体基质结合的方法和装置 - Google Patents

通过最少能量吸附最优化被分析物和抗体基质结合的方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种制造用于进行测定以检测样品流体中被分析物浓度的测定装置的方法。所述测定装置通常具有基本上平坦的表面，所述表面具有一系列定点固定化校准点阵列，校准点阵列含印制在该表面上的预定量的被分析物。此外，包括用于结合被分析物蛋白质的捕获抗体的一系列定点固定化测试点阵列印制在测定装置上。所述方法包括首先修饰平坦表面以提供疏水结合部位、亲水连接以及共价结合部位，然后该方法要求在基本上平坦的表面上印制系列的定点固定化测试点阵列以及系列的定点固定化校准点阵列，下一步骤为将流体样品涂覆在测定装置上，接下来通过测试测定的灵敏度以及调控疏水、亲水以及共价结合部位的比例以使测定的灵敏度最优化。

Description

通过最少能量吸附最优化被分析物和抗体基质结合的方法和装置
技术领域
本发明涉及检测测试样品中存在的抗体的测定装置和测定方法以及为检测测试样品中存在的被分析物和测量其量而做出的内部标准/校准算法曲线。 
背景技术
免疫诊断测定的分析方法结合了测量当测定完成时由有缺陷的测定技术所产生的误差的技术。例如，测定灵敏度的测量通过基于下述测量的标准的统计分析描述灵敏度：反复测量低浓度的样品以确定样品结果在统计上不为零。由于产生的标准误差与实际测量数的平方根成反比，该方法不测量固有的测定灵敏度。 
本技术领域已知的分析灵敏度是最小限度地可检测的或改变浓度，其中零点标准被测量几次并且灵敏度限度为自M(平均值)等于2-3SD(标准偏差)的浓度。然而，精度在本技术领域中被认为是在一单一和均质量的基质的多份测定用量中被分析物各次测量结果的接近程度，该精度的错误可达一个数量级。任何导出的校准曲线的伴随配合线不产生真值剂量反应曲线。这在实际的测定灵敏度中导致相当大的误差。 
为了测量精确度，精确性在本技术领域中被认为是通过被分析物的真实浓度的方法获得的平均测试结果的接近程度，精确性用于详细说明平均测量值与真值的接近度。测量上的差异被认为是偏差或精确程度。偏差可以超过测定的范围变化。可以知道本技术领域中用于测量该真值的方法需要发展。 
测定的可复验性或精确度，定义为当步骤重复应用于单一均质量的基质的多份测定用量时，被分析物的各次测量的接近程度或分析测定中的估计误差，在本技术领域中称为变异系数百分比(％CV)。样品的浓度、温度、热以及边缘效应的变化、颗粒的不完全悬浮以及固相沉淀可以影响自动测定分析机器。分级分离(fraction separation)以及计算误差 也影响精密度结果。在光学系统中，由于浊度的影响、荧光团的存在、灯以及检测装置的老化以及试剂随着时间的老化会产生误差。这些因素通常引起信噪比的显著降低。差的吸量作用(pipetting)以及仪器的准备周期可引起机械操作误差。 
因此，用于任何分析方法的精密度的评估均要求使用限定的或标准的对照溶液测量已知以及有关的浓度的变异性以产生基线校准标准。这种校准器的精确测定基于测量在预定的间隔的系列稀释的已知浓度，然后将其以内插值替换。可以使用商品参照溶液以及自行制备的参照溶液或参照标准，但通常使用标准的、外部的或共有的基质(pooledmatrices)校准，这些基质可能与实际的病人测试样品相差甚远。克服这些误差的部分解决方案为在宽浓度范围内绘制精密度图以获得精密度分布图或测定的定量校准。 
交叉反应、测定专一性、偏差引起的干扰、抗原、抗体、结合部位的改变、低剂量(竞争测定)以及高剂量(三明治夹心测定)钩状效应(hook effects)、异嗜性抗体干扰、内源性干扰的自体抗体、补体、类风湿因子、固相抗体结合中的干扰、内源信号发生物质、酶抑制剂、催化剂以及辅助因子也已经被显示出表现测定中的混杂活性(confoundingactivity)，该混杂活性包括交叉反应、基质效应以及自动免疫测定仪器与取样器中样品的遗留物(carry over)。 
对于临床应用而言，质量控制的样品可能不反映病人体内的实际浓度，可能不反映处理中的被分析物的光谱并且干扰样品基质而不再反映病人样品的含量。质量控制的样品可以测量不同浓度差的性能，该性能可能不反映临床决定要点。 
本申请人已经开发出微阵列测定，该测定提供样品中存在的被分析物的快速检测。这在2004年5月28日提交的名称为“用于宏基质以及微基质快速检测的方法与装置”的第10/856,785号美国专利申请中得到了描述，其通过引用并入此处。该测定允许样品中被分析物浓度的快速定量、定性测量。被分析物用与一可检测的标记物结合的第一抗体标记。典型的测定装置在装载部与读数部之间限定一腔，以使样品中的液体部 分通过毛细作用从装载部移动至读数部。测试点的定点固定化阵列印制在读数部上。测试点包括与测定装置表面结合并且适合结合、标记被分析物的第二抗体。测定装置也具有校准点的定点固定化阵列，所述校准点包含用于与过量的用可检测标记物标记的第一抗体反应的预定量的已结合的被分析物。一旦结合的被分析物与测试点结合，就可以通过比较测试点的标记强度与校准点的标记强度并且从适当的校准曲线上读取被分析物的浓度确定测试点中的被分析物的测量值。 
一般而言，免疫测定无疑地取决于直接检测以及测量由抗体吸附部位的抗原数目产生的信号。通过使用第二标记的抗体，非竞争性的测定确定这些吸附部位，而竞争性的测定测量空着的吸附部位。由于免疫测定是抗体浓度、体积以及亲合常数的函数，因此只有这些值保持恒定才可能获得比较精确的测量值。样品中被分析物的实际量仍尚需测量。通过比较内部参照标准的定点固定化阵列的预校准浓度测得被分析物的浓度。 
如果预先校准的外部参照标准浓度被用于绘制外部校准曲线，它们在以内插值替换的检测信号转化为被认为是测试样品中存在的被分析物浓度的过程中提供一致的源头误差。通过使用吸附了抗原或抗体的载体或基质，可能引起抗体对被分析物的测量中更多的误差。虽然增加基质上的结合电荷进一步复合了外部参照误差，但是周围的被分析物测定相应地被扭曲。 
虽然通过增加疏水结合力增加了载体表面的吸附，但是增强了的表面修饰可能引起蛋白质被分析物结构以及抗体结构的改变，从而显著地改变复合体形态。引起复合体形态改变的结构变化对由检测器测定的用以确定标记物与浓度比例的信号量有直接的影响，例如光子计算误差。 
因此，当测试在一定条件下产生的流体中的被分析物时，需要存在一种方法以使定点固定化阵列的诊断值最优化。需要一种装置，该装置具有定点固定化阵列与载体的无偏差地安全的、可复验的、可以计量的、可复制的、被调控的以及可靠的结合，以提高此种免疫测定的灵敏度至具有每毫升的被分析物飞摩尔(femtomol)至纳摩尔(nanomol)的浓度 的动态的检测范围。被调控的基质表面修饰加强了诸如FDA(美国食品药品管理局)的管理机构要求的可靠的动态内部校准。 
发明内容
本发明涉及一种测试定点固定化阵列的方法，具有用于结合被分析物以及校准定点固定化阵列的捕获抗体(capture antibody)，包括待印制在测定装置的共同表面上的已知浓度的被分析物。所述测定装置优选地被表面修饰以使需要的分子种类以及其集合物能被调控地、定点可计量地与一表面结合。为了使在测定特定的基础上的测定的灵敏度最优化，调控装置中测定基质表面上亲水、疏水、共价连接部位与结合部位的比例。在多重测试的情形下，在测定对，即抗原/抗体的基础上调控表面能量。 
免疫诊断装置具有一载体，该载体的表面已经被修饰以允许调控，因而使补偿的亲水与疏水力最优化。此修饰允许被分析物蛋白质以及抗体的最佳吸附。定点固定化阵列的诊断点的印制直径为5微米至500微米，优选直径范围为50微米至125微米，该印制直径也是恒定相对湿度的函数。出乎意料地，通过在定点固定化阵列中印制已知浓度的被分析物的测试的内部校准允许通过使用剩余的抗体可检测的标记物复合物确定测量比例。此方法属于这种参数的组合，以确定用于获得更精确的诊断测试结果的最佳设置。 
根据本发明的一方面，提供了一种制造测定装置的方法，所述测定装置用于进行测定以检测样品流体中被分析物浓度，所述测定装置具有一表面，所述表面具有一定点固定化的校准点和一测试点，所述校准点含印制在该表面上的预定量的被分析物，所述测试点包括用于结合所述被分析物的捕获抗体，所述方法包括下述步骤： 
●修饰所述表面以提供疏水结合部位、亲水连接部位以及共价连接部位； 
●在所述表面上印制所述测试点以及所述校准点； 
●将样品测试流体涂覆在测定装置上；
●测试测定的灵敏度；以及 
●为了使测定的灵敏度最优化，调控所述疏水结合部位、所述亲水 
附图说明
连接部位、所述共价部位之间的比例。 
图1是用于实施固定化阵列测试的本发明测定装置的立体图； 
图2是示出了环氧树脂基质上十种不同印制缓冲液的一种点形态的本发明的测定装置顶部表面的照片； 
图3是示出了点状BSA.RB结合物稀释液的平均荧光强度的本发明的测定装置顶部表面的照片； 
图4A是使用Erie Superchip Epoxy的点状BSA.RB结合物稀释液的平均荧光强度的曲线图； 
图4B是使用Epoxy Batch 40309的Erie Superchip Epoxy的点状BSA.RB结合物稀释液的平均荧光强度的曲线图； 
图4C是使用Epoxy Batch 40406的Erie Superchip Epoxy的点状BSA.RB结合物稀释液的平均荧光强度的曲线图； 
图4D是使用Epoxy Batch 40721的Erie Superchip Epoxy的点状BSA.RB结合物稀释液的平均荧光强度的曲线图； 
图5示出了本发明的ERI E以及三批环氧硅烷(Epoxysilane)的点状的BSA.RB结合物稀释液冲洗后的平均荧光强度(W)相对于插入空白冲洗后的平均荧光强度(WC)比例的曲线图； 
图6是本发明的测定装置的一种可选择的实施方案的顶部表面的照片； 
图7是描绘了为实现内部动态校准曲线的剂量/反应曲线图； 
图8是示出了结合物上的电荷密度与修饰的载体表面的相互关系的图； 
图9是示出了装置的支撑表面的适当表面修饰的测定装置的照片； 
图10是示出了与在一点内的被分析物的结块的、斑驳的、环形的以及均匀地间隔分布对比的定点固定化阵列的点的照片； 
图11是示出了小鼠胚胎的定点固定化杂交寡核苷酸的照片； 
图12是示出了小鼠脾的定点固定杂交的寡核苷酸的照片；以及 
图13是示出了病人IgG以及IgM血清对十个病原体微阵列加上IgG以及IgM校准标准的反应的照片。 
具体实施方式
本发明的方法优选地结合一种测定装置实施，所述装置具有在其上印制的定点校准点的固定阵列以及定点测试点的固定阵列。图1示出了一种优选的测定装置。该测定装置具有一个基本上平的表面16。在该基本上平的表面16上印制至少一个、优选地至少三个测试捕获点(testcapture)20和印制在读数区域中的定点固定化阵列的校准点22。更优选地，检测被分析物存在性的多重的定点固定阵列的测试点在读数区域16印制。定点固定化阵列的测试点20优选地包括与蛋白质被分析物特异地结合的结合抗体。该结合抗体优选地在空间上隔开以使各个结合抗体可以在没有与相邻的抗原复合体发生空间位阻的情况下与测试抗原结合。优选地，不反应的蛋白质在各个定点固定化阵列的测试点中将结合抗体隔开。 
读数区域16上印制有校准点22的定点固定化阵列。该校准点包括预定量的所述被分析物，以用于与未反应的源自与可检测的标记物结合的器具的试剂反应。校准点的定点固定化阵列可以使标记的强度与存在的抗原的量相关。然后，测试点的定点固定阵列的标记强度用于获得被测样品总量中存在的抗原的量。 
测定固定基质可以选自允许表面被修饰的材料，包括：硅、玻璃和聚合材料，但在一优选实施方案中，该基质由如聚苯乙烯、聚丙烯等塑料支撑基质制成。该聚合物表面可以容易地被修饰以吸附抗原与抗体。蛋白质吸附需要疏水结合部位，以与测定装置的表面产生最佳结合，而抗体与亲水的带电荷的键(linkages)很好地结合，包括共价键。作为增加单位面积有效电荷的密度所导致的表面修饰的函数，这些测试点的定点固定化阵列被成比例地吸附至读数区域。增加或改变范德华作用力、 亲水力、疏水力间的作用力的平衡和调控共价键的强度可以选择性地增加读数区域表面以及测试点的定点固定化阵列的亲、疏水特性。 
由于接触角度改变引起的点状流体量的扩散增加也是相对湿度与温度的函数。当相对湿度增加时，点的干燥时间增加，这对于测试流体的类似的分配量，可以在表面上形成更大的点。该净效应得到薄得多的点，从而获得理想的单分子层被吸附物，该被吸附物形成更敏感的分子层，以通过捕获抗体获得最佳的被分析物捕获。出乎意料地，被分析物的在全部定点固定化的测试点阵列的均匀分配在三维上使测试点的形态最优化。 
待捕获与测量的被分析物通过一个与被分析物特异的标记物抗体结合的标记剂识别。荧光染料是本技术领域公知的用于提供精确地标记的可检测的标记物。出乎意料地，当被分析物与源自用作标准的内部被分析物校准物的定点固定化阵列的基线等同时，被分析物-抗体-染料复合体提供一种被分析物浓度的测量方法。相比而言，使用外部校准物是免疫测定中通常发现的公认误差的主要来源。 
不与各个被分析物结合的与抗被分析物的抗体结合的过量的染料通常被认为是多余的并且被清洗掉，这在本技术领域中是公知的。出乎意料地，本发明的该方法使用抗被分析物的抗体以直接由定点固定化校准阵列产生多重内部的、装置内的校准线。 
如图1所示，与用于捕获被分析物的已知的捕获抗体定点固定化阵列测试点一起，一系列定点固定化阵列校准点直接地印制在与所述定点固定化阵列测试点的邻近处。该第二套定点固定化校准点22包括递减的已知的被分析物浓度的每点的浓度。因此，当在该装置上进行测定时，该测定已经被简化至单步骤测定，而不必定需要用以去掉过多的抗被分析物抗体的中间清洗步骤，这是因为通过结合至含已知浓度的校准抗原的支配的定点固定化阵列点，结合的标记抗体背景浓度的过量被有效地降低。 
出乎意料地，本发明的方法为固定化阵列的环氧硅烷基质提供与氨基末端寡核苷酸库(libraries)、cDNA库、蛋白质、肽、糖蛋白、脂多糖以及如生物素-3，6-二氧杂辛烷二胺( biotinyl-3，6-dioxaoctanediamine)(Pierce，EZ-LinkBiotin-PEO-Amine)的小分子的调控的、共价、高能力的结合。在该方法中未使用有机溶剂。不需要通风橱，也不需要特别的处理预防措施。当使用印制缓冲液3X至6X SSC pH 7、0.15M磷酸钠缓冲液8.5、0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.2以及0.1M重碳酸钠缓冲液pH 8.6时得到最佳的效果。通过添加少量的清洁剂(0.01％-0.05％SDS)可以调控点的大小。 
当包括被分析物-抗体-染料复合体以及过量的抗被分析物-抗体-染料复合体的测试流体在印制在测定装置中测试点的两种类型的定点固定化阵列上流过时，过量的复合体与已知的被分析物点结合以在读数器上读取燃料浓度时产生用于校准的参照浓度。被分析物-抗体-染料复合体与测试点的捕获抗体定点固定化阵列结合并且在测试溶液中读取被分析物的浓度。用于内部动态校准(Internal Dynamic Calibration)(IDC)的本发明方法，将对比内部校准标准曲线与图8中所示的对比测试曲线相结合。由于同时提供了该测试的特定内部校准标准，测试流体中被分析物的真实浓度得以精确地测定。 
当与该装置结合使用时，由于高密度结合，即测定装置每单位表面积上键的数量的结果，该方法提供了一种测定装置上引起的电荷正确增加的经验确定法，以充分地结合测定成分而未引起检测信号的损失。 
为了使本发明的测定装置获得最好的灵敏度，该测定装置在校准点中标有抗原的已知浓度。通过与过量的抗原-抗体加荧光标记校准复合体结合，在测定过程中读出增高的抗原浓度。无论该抗原是必需蛋白质及/或核酸或衍生物，抗原都需要与测定装置的固定化的基质表面牢固地结合以防止在测定处理过程中该抗原溶解以及被清洗掉。通过包含有用于使被分析物在全部印制测试点均匀分配的分子间隔物(molecularspacer)的被分析物悬浮缓冲液的调控，实现疏水力、亲水力以及共价键的平衡，从而使测试点的被分析物定点固定化阵列的结合最佳化。均匀分配确保每个测试点的均匀发光水平并且使空间位阻最小化。 
出乎意料地，用于最佳吸附蛋白质的表面修饰的程度可能与图9中所示抗体吸附的作用相反。最佳的表面电荷密度可以使抗体与改变电荷的表面牢固地结合至这样的程度：虽然存在抗体，但是未发现结合的抗原。作为直接结果，没有可以被捕获的自由抗原-标记剂复合体。 
根据本发明，将抗体与基质未修饰的露面直接结合，可能引起抗体构象的变化，该变化降低了抗体对被分析物的亲和力。被分析物也被动地吸附至带能量的表面。结合的被分析物的比例可以在5％-95％的范围，因此仔细地使表面修饰以及涂覆处理最优化是重要的。例如，由于水分子彼此之间的亲和力远比对疏水区域的亲和力强，会发生蛋白质与塑料的结合。溶液中疏水部位的排斥引起部分蛋白质被吸附至基质。 
测定装置载体的表面被修饰以具有下述平衡：结合抗体的亲水力的增加、测试流体的流动特性与疏水力的维持以及蛋白吸附的共价结合。悬浮在包含有分子间隔物的调控缓冲液中的校准和测试点被分析物在修饰的表面上的印制在控制恒定湿度的情形下进行，以确保点的厚度趋向最小，使导致形成定点固定化阵列测试点的分子层厚度。本发明所产生的模表面的关键属性包括测定精确度、灵敏度以及再现性的维持。 
如图6所示，一种测定的内部校准方法包括多重反复以支持用于确诊的高置信限度。一种将点结合至修饰的表面的应用参数的有效平衡通过进行测试样品流体的免疫诊断得以证实。当用于具体测定的最佳条件已被证实时，大规模生产开始，其在要求的时间间隔内具有质量控制测试。 
为了为基质表面生产一致的、调控的环氧硅烷涂覆层，基质在清洁剂溶液中被清洗几个小时，然后被传送漂白。该环氧硅烷涂覆层作为添加　有　3-　缩　水　甘　油　基　丙　酮　基　三　甲　氧　基　硅　烷(Glycidyloxypropyltrimethoxysilane)的新鲜的2-吗啉乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonic)一水合物(MES)溶液涂覆。过量的水从基质中去掉，基质转移至环氧硅烷/MES溶液中。基质优选地在DI水中洗3次但可选地变更为1次或2次，然后干燥。在涂覆环氧硅烷后的即刻，该基质表面呈亲水性。在不降解该表面上活性环氧基，然而使该表面吸水性减弱的情况下对该表面进行烘干脱水。基质最好在室温储藏。
由于共价反应在热力学上有利于能量最小化并且可以应用烘烤时间以及温度调控环氧硅烷表面以控制表面能(接触角)从很亲水至适度地疏水，本发明共价的环氧硅烷处理已经证明是产生表面能调控的最佳方法。 
如果涂覆层的表面张力比基质的表面能大，涂覆层将不展开形成薄膜。当基质的表面能增加时，涂覆层将展开形成薄膜，但是当变干时将具有弱的粘附力。进一步增加基质的表面能将导致湿薄膜的形成更容易而干薄膜的附着性更好。 
实施例
实施例1印制缓冲液对点形态以及结合能力的影响
对于环氧表面，图3，0.150M磷酸盐缓冲液又产生最佳的结果。10％的丙三醇产生最低的信号。对该表面而言，50％的DMSO也在空白点显示错误信号。总的信号强度以及结合能力很明显地比在所有缓冲液中和所有BPA浓度下的相应的水凝胶-环氧表面的信号强度以及结合能力弱。 
图2示出了环氧基质上10种不同印制缓冲液的点形态。BPA的八种稀释液(5x)从左边的最大值1000μg/ml至右边的0.0重复印制了三次。基质用封闭缓冲液封闭2小时。通过在同样的封闭缓冲液中用4μg/ml链霉亲和素-Cy3处理1小时而报告结合的BPA。磷酸盐pH8.510％DMSO/水空白50％DMSO/水10％丙三醇/水空白MES pH4.7硼酸盐pH9.3碳酸盐pH9.66x SSC pH7.23x SSC pH7.2水。 
实施例2共价结合微阵列基质的印制最优化以及质量控制
许多方法通常可接受用于针印制(pin-printed)微阵列的质量控制。在寡核苷酸(oligo)或cDNA阵列的印制库中，用诸如SYBR555(Invitrogen/分子探针P32930)的DNA插入染料以及通过使用AlexaFluor染料标记的随机的9聚体(Invitrogen/分子探针P32934以及P32937)杂交可以显现点形态以及缺失的点。带有标准的绿色激光或红色激光波长都不能激发的荧光标记的示踪DNA可以被添加至库中的每一 寡核苷酸或cDNA。这是理想的，并且当在使用第三个激光器以及用于标记的示踪物的干扰滤波器在共聚焦显微镜中读数时，在杂交信号的同时为每一点的DNA进行了定量。 
在成批的基质上努力且花费印制一个库之前，优选地检查各批本身的结合能力、点的形态以及批与批间的一致性。 
无论微阵列基质上印制的溶液是寡核苷酸、cDNA、蛋白质还是小分子，都存在该溶液的最佳浓度。各表面都具有一个最佳的结合量。过量的印制浪费了宝贵的材料，并且可能引起更高的背景水平以及增多的遗留物或库的交叉污染。少于最佳量的印制产生较弱的信号且潜在地降低信噪比。 
BSA.若丹明B(Rhodamine B)结合物(BSA.RB)。异硫氰酸若丹明B(RBITC，Sigma-Aldrich#283984)是吸收用于Cy3的绿色激光波长的荧光团，并且在标准的扫描共焦显微镜的Cy3以及Cy5两个通道中发出更宽的光谱。将6mgRBITC溶于600微升乳酸乙酯中。在pH9.6的碳酸盐/重碳酸盐缓冲液中制备三份1ml的20mg/ml的牛血清蛋白(BSA，Sigma-Aldrich#A7517)等份试样。每份试样与100、200或300微升的RBITC溶液混合并且允许过夜反应。该反应通过在每份试样中添加10mg的赖氨酸并且使其反应2小时而结束。一微型柱(minicolumn)充满塞法戴克斯(Sephadex)G50并且用3X SSC清洗。各试样在G50柱上成凝胶过滤，在目标微阵列印制缓冲液3X SSC中洗提。收集第一个有色峰(BSA.RB结合物)并且丢弃随后的峰。由RBITC的比例增高产生的结合物比例估计为从纯BSA、纯RBITC以及结合物的比较吸光率光谱为每个BSA分子大约2:1、5.5:1以及12.8:1的染料分子。 
选择5.5:1的结合物在下述基础上印制。BSA具有与200聚体的cDNA链大约相同的分子量以占据与被杂交至200聚体的靶子的70聚体的寡核苷酸探针大约相同的表面积。此外，推荐的用于杂交标记的转录物的核苷酸/染料比例大约为40:1或每200聚体5个荧光团。这样，BSA.RB结合物分子模拟每个探针寡核苷酸分子的结合表面区域以及微阵列中期望目标的荧光标记。Qiagen/Operon库的70聚体寡核苷酸具有用于与诸如 环氧树脂、乙醛以及NHS酯的活性表面共价反应的氨基末端。未与RBITC反应的BSA表面的赖氨酸残基的氨基可以通过相同的化学过程与该表面反应。 
用于Qiagen/Operon70聚体寡核苷酸库的推荐印制浓度为15微摩尔(15pM/微升)。3X SSC中的BSA.RB结合物的2X连续的稀释液在384孔板中制备，这样空白(仅3X SSC缓冲液)在结合物稀释液之间交替。这被指定用于测试阵列的印制针的清洗以及确定孔至孔遗留物(carryover)或交叉污染的严重程度。因此，起始浓度被调整为比推荐的浓度稍高，18pM/微升。 
本发明的环氧硅烷共价涂覆了的载片以及由制造商提供的ErieSuperChip Epoxy样品通过Perkin Elmer SpotArray用PointTechnologies的钨开口针(tungstensplitpins)由384孔连续稀释板印制。清洗溶液为R0水中10％的乙醇，SpotArray被设定为2秒3个周期的喷射清洗，接着在孔之间真空干燥2秒。如图3所示，每排12个点，点之间隔开340微米距离，各BSA.RB稀释液的6份复制品在相同的线条上跟随有相应空白处的6份复制品。 
图3示出了与微阵列基质共价结合的商业环氧硅烷(左)以及用连续稀释的BSA.若丹明B结合物印制的在用1％的乙醇胺+1％BSA pH8.5封闭缓冲液清洗24小时之前成像的(顶部)以及清洗之后成像(底部)的三个内部制造的批次。每套顶部图像以及底部图像用同样的激光和获得设置扫描，但是并非各套图像都全部相同。 
BSA.RB稀释阵列在Perkin Elmer ScanArray Express共焦激光显微镜上扫描。通常，设置为激光60％，光电倍增器55％，但并非全部载片都完全相同。这些预先冲洗的tif文档被存储用于随后的分析。载片在封闭缓冲液(1％乙醇胺+1％用HCl调至pH8.5的BSA)冲洗24小时，然后在相同的设置下再次扫描以获得冲洗后的图像文档。在冲洗之前以及之后，用ScanAlyze(EisenLabs，斯坦福)分析图像。每个阵列的栅格以及圆周被调至最佳以使圆周恰好围住荧光点。
蛋白质保留以及遗留物的分析
根据批次，如图3中所示，点的直径在160微米-250微米的范围之间。由于可以清楚地看到每一BSA.RB结合物稀释液的六个点右边的六个更模糊的点，针的冲洗是不完全的。这可能引起库的交叉污染，从而限制了在必需丢弃库之前可以进行的印制数目。这使得制备库等分试样的重要性更加突出，以延长其使用期限从而降低成本。 
图4A、4B、4C以及4D示出了点的荧光强度相对于BSA.RB结合物(每幅图上部的紫色曲线)以及其相应的相邻空白(每幅图下部的紫色曲线)的印制(预洗)浓度的曲线图。这些图也示出冲洗后结合物的保留曲线(上部暗处)以及空白(下部模糊处)。在由Qiagen/Operon推荐的用于其70聚体库(15pM/μL)印制的浓度，该遗留物是很高的。分析表明，在该浓度印制比在约5pM/μL(1/3浓度)印制产生较少的保留蛋白质。这样，浪费了库材料。此外，即使在彻底冲洗后，由于更多的蛋白质或寡核苷酸在针上被从一孔带至另一孔，浓度越高，遗留物/交叉污染越高。 
  
基质     ％保留          100*(P/W)       2.5-10pM/□L之间 ％污染          100*(WC/W)      2.5-10pM/□L之间
ESCE 403094040640721 47-5833-3716-4735-48 4.7-5.86.1-7.42.5-7.72.5-2.7
表2：图2中图表的数字分析总结，从图中可以看出最佳的印制浓度范围为2.5-10pM/μL之间。超过该范围时，虽然遗留物减少了，但是最多的保留蛋白(信号)得以保持。 
图5示出了由ScanAlyze分析的ERIE与本发明的3批环氧硅烷的有斑点的BSA.RB结合物稀释液冲洗后(W)的平均荧光强度相对于插入空白冲洗后(WC)的平均荧光强度比例的图解。这些平均值为如图1中的图像所示的冲洗前和冲洗后的6个复制品的平均值。(词表：P印制的 BSA.RB稀释液，PC印制的空白遗留物，W-BSA.RB稀释液柱子冲洗，WC-空白遗留物柱子冲洗。)
荧光团标记的蛋白质或70聚体寡核苷酸的直接印制是一种迅速的检查针式印制微阵列结合能力或最少能量吸附基质结合的保留百分比的方法。不同批的载片在被接收印制宝贵的库之前可以进行结合与点形态的比较。此外，这也是一种评价针冲洗的质量以及设置库的最佳印制浓度的颇有价值的方法。确定最低浓度以及遗留物的最佳印制浓度或最强的信号保存库并且通过使交叉污染最小化延长其使用期。基于这些研究，我们的600pMOperon/Qiagen人类70聚体库被分成各为150pM的4等份试样。保存三份用于印制整个22K(2.1.2版)库，一份关注于挑选200-800寡核苷酸的蛋白酶基因、乳腺癌相关基因、环指蛋白基因、时钟(生理节奏相关的)基因以及HOX基因等子集。这些子集被进一步分成75pM的复制品。 
本发明的三批环氧硅烷以及一种商业的环氧硅烷载片(ErieSuperChip Epoxy)作为本方法的实施例展示。即使结合能力可能是可接受的，点形态可以显著地超出公差(例如批号40406)。 
在该实验中，对所有载片而言，最大的信号以及蛋白质保留落入2.5-10pM/微升的印制浓度范围内。在使用9聚体-70聚体的寡核苷酸进行的其它实验中也发现接近的最佳范围(数据未示出)。事实上，在更高浓度印制很可能由于空间位阻而减弱了信号和保持力。本发明的环氧树脂基质提供了最佳的信号与背景的比例，在最佳印制范围比商业上的基质提高达2倍，这在图3的图像中是显而易见的。 
实施例3  多重定点固定化校准以及测试阵列
点的多重阵列已吸附到修饰的载体表面基质上。 
如图6所示，测定装置的一个实施方案示出了同样的被分析物浓度的校准点22的十个印制柱。在右边，测试点20的最后两个柱子为带有吸附了待确定浓度的测试样品的捕获抗体点。每行表示具有内部动态校准(IDB)的一单个阵列。该测试行重复10次。对IDB而言，完整的测试矩阵为10点×10点，对测试样品而言，完整的测试矩阵为2点×10点。测得的荧光强度决定了被分析物的相对浓度。 
实施例4动态内部校准
如图7所示，曲线A表示当使用一内部形成的浓度曲线测量测试样品时剂量反应的典型变化。曲线B是得到的外部校准线，由测量的低剂量外部校准读数以及高剂量外部校准参照读数确定错误地插入数值。然后，通过在低数值点以及高数值点之间的各个数值划一条线即曲线B使其结合。内部动态校准产生一线条图，该图是以如图8所示由几个图产生的表示测试样品的真实标定反应的曲线为基础的。 
实施例5比较高密度表面电荷与具有平衡电荷的最佳表面修饰效果而测试装置
将最优化装置载体(上部“最优化”曲线)与高度带电的载体修饰表面(下部“带电”曲线)的剂量反应进行比较。动力点CK-MB被分析物的蛋白质浓度范围为图8所示的26微微克/ml-26,200微微克/ml。该高度带电的表面面积有效地防止被分析物在低于浓度2620微微克/ml时结合。 
实施例6用于生产测试装置的方法
图9描述了一种典型装置表面，被修饰以示出比较的印制排列矩阵以及确定被分析物与抗体吸附具有适当的载体表面修饰。该方法在分配的点容量中递增地比较点的相对大小。 
实施例7湿度点大小
表面修饰的载体在24℃，18％以及47％的湿度下测试亲水流动效果。测量了点直径的相对增加。对于相同体积的点流体，在较高湿度时表面积增加51％，点厚度大约减少50％。
实施例8在一点内包括均匀间隔分布的被分析物的定点固定化阵列的点
图10中，标记A示出了在pH9.0使用重碳酸盐缓冲液以形成浓缩的被分析物的中央集合物的效果，这导致一发射峰以及错误的数据结果。标记B示出了引起分散的被分析物集合物的另外的盐酸胍的作用。标记C示出了在pH5.0使用硼酸盐以及盐酸胍。示出了在点周界上形成的被分析物的环面，使中央留有最低的浓度。出乎意料地，本发明的分子间隔成分，在图10的标记D中形成最好的点的形态以及信号。使用硼酸盐(50mM H3BO3，pH5.0)使被分析物均匀地分布在整个点上，但是添加氯化镁(50mM MgCl2)使被分析物有效地在整个点上隔开。 
当与被分析物以及与基质不相容的缓冲液结合使用时，本发明的调控的环氧硅烷基质固定包括有缺陷的、最后的被分析物图案以及如图10所示的被分析物集合物的阵列点。当获得被分析物浓度的比较测量结果时阵列点中被分析物的分子集合物以及分布是关键的。如图10中的标记D所示，当阵列点包括均匀分布的被分析物时才获得临床诊断中可接受的CV％(变异系数百分比)。几乎每一表面上的最佳的点形态以及信号通常通过50mM H3BO3，pH5.0获得，在大多数情况下还添加50mM MgCl2。 
实施例9本发明环氧硅烷基质上核酸的固定
阵列为从Operon小鼠基因组库集中的一套72寡核苷酸，定点定位在本发明的环氧硅烷基质上。基质在2mg/ml2-氨基乙醇+1％BSA中封闭24小时，然后用去离子水清洗、旋转干燥(spundry)。 
使用Promega′s　SV总RNA提取系统，如图11所示从9天的整个小鼠胚胎，以及如图12所示从成年的鼠脾组织中提取的RNA使用Agilent生物分析器(Agilent Bioanalyzer)进行质量检测。通过NuGen′s　Ovation方法对RNA扩增以产生扩增约5000倍的氨基烯丙基-c-DNA。这与Cy5-NHS酯结合以产生荧光团标记的c-DNA。使用Nanodrop1000的光纤分光光度计测定c-DNA的数量以及确定结合的标记剂的比例。使Cy5-c-DNA(80微升中总c-DNA0.5微克)在5X SSC+0.1％SDS中在定点固定化阵列 上杂交20小时。该阵列连续地用3X SSC清洗两次，用1X SSC清洗两次，用0.1X SSC清洗一次，然后旋转干燥。定点固定化点阵列用PE ScanArray共焦扫描显微镜在激光<65％并且增益(gain)<60％的相对较低的设置中读数。在这些低设置下获得的结果表明c-DNA被良好地标记并且本发明的环氧硅烷基质为待杂交目标保留最佳的探针寡核苷酸。 
实施例10应用于本发明的APT装置的本发明的方法；通过最少的能量吸附使被分析物以及抗体测量最优化的微孔(Microwell)装置
适于抗病原体抗体滴度测定(APT装置)的血清学诊断的蛋白组微阵列如下述方法制备。人的IgG以及IgM的连续的稀释液印制为校准标准，细菌的以及病毒的抗体印制成如下表所示的三份。 
IgM900ug/ml        H.pylori       T.gondii          IgG900ug/ml 
IgM300ug/ml                                         IgG300ug/ml 
IgM100ug/ml        Herpes1        Rubella           IgG100ug/ml 
IgM33.3ug/ml                                        IgG33.3ug/ml 
IgM11.1ug/ml       Herpes2        Rubeola           IgG11.1ug/m l 
IgM3.7ug/ml                                         IgG3.7ug/ml 
IgM1.2ug/ml        CMV            C.trachomatis     IgG1.2ug/ml 
IgM0.4ug/ml                                         IgG0.4ug/ml 
IgM0.14ug/ml       EBV            C.jejuni          IgG0.14ug/ml 
IgM0ug/ml                                           IgG0ug/ml 
表10：印制的校准标准以及细菌与病毒抗原
表面用在pH8的Tris缓冲液中的1％BSA(封闭缓冲液)封闭18小时。来自已知感染了幽门螺杆菌(Helicobacter　pylori)(H.pylori)的病人的、并且已通过参考文献中的方法测试其抗体滴度的血清样品用封闭缓冲液以体积比为1:10稀释。这些稀释的样品然后在微阵列上培 养15分钟，每孔的每个样品为200uL。轻轻倒出样品，用pH7.4的磷酸盐缓冲液通过装入孔中，摇动20秒，轻轻倒出清洗两轮。用封闭缓冲液第三次清洗20秒。然后将200uL的封闭缓冲液中的3ug/ml的羊抗人IgG.Cy3结合物和羊抗人IgM.Dy647结合物的组合物注入孔中培养15分钟。轻轻倒出结合物，各孔用pH7.4的磷酸盐缓冲液注入孔中，摇动20秒，轻轻倒出清洗两轮。用一楔子移去孔的塑料侧边而留下扁平的载玻片底部，其用去离子水清洗20秒，然后在离心机中以500RPM通过旋转干燥1分钟。 
使用Perkin Elmer ScanArray激光扫描共焦显微镜以下述设置成像阵列：Cy3(绿色)通道(IgG)激光70％光电倍增器70％，Cy5(红色)通道(IgM)激光75％光电倍增器75％。图13示出了该实验的代表性的阵列图像。从而提供了进行大约35分钟的多元蛋白组诊断分析，得到抗十份人病原体的病人血清中IgG以及IgM的定量滴度。 
本领域普通技术人员将认识到或可以确定：仅仅通过常规的实验，可以得到许多上述本发明实施方案的等同实施方式。这些等同实施方式是意图包括在下述权利要求范围之中的。

Claims (19)

1.一种最优化用于检测样品流体中被分析物浓度的测定的方法，所述测定使用具有表面的测定装置，所述表面具有定点固定化校准点和测试点，所述校准点包括印制在该表面上的预定量的被分析物，所述测试点包括用于结合所述被分析物的捕获抗体，所述方法包括下述步骤：
●通过使用环氧硅烷涂覆层修饰所述表面以提供疏水结合部位、亲水连接部位以及共价连接部位；
●在所述表面上印制所述测试点以及所述校准点；
●将样品测试流体涂覆在测定装置上;
●测试测定的灵敏度;以及
●为了使测定的灵敏度最优化，通过调控所述环氧硅烷涂覆层的烘烤时间和温度调控所述疏水结合部位、所述亲水连接部位、所述共价连接部位之间的比例。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面基本上是平的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表面包括用于接收样品的装载部以及用于从所述装载部接受所述样品的读数部，校准点以及测试点印制在所述读数部上。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述测试点以及校准点在恒定相对湿度条件下印制在所述表面上。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述测试点以及校准点的厚度为一单分子层被吸附物的厚度。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述恒定相对湿度范围为15％至90％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疏水结合部位、所述亲水连接部位、所述共价连接部位的比例在相对的范围内，以确保在保持标记物抗体的最佳结合以及作用的同时，具有最佳结合的被分析物的最佳结合比例的吸附。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，确保捕获抗体的最佳吸附而未导致抗体结构的构造的以及空间的重新排列从而抑制抗体－被分析物的结合。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定点固定化点包含分子间隔物。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定点固定化点显示均匀地散布的被分析物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述定点固定化点显示以最小的空间位阻均匀地散布的被分析物。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定点固定化点包括最优化的表面调控缓冲液以获得与结合物的最佳结合和最佳的复合物-结合物被分析物集合物。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面包括用于通过氨基、硫醇基与羟基官能团结合DNA、蛋白质、糖蛋白、脂多糖、肽、药物、外源凝集素以及其它分子的基质，所述基团是环氧硅烷活化的。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述表面包括用于通过氨基、硫醇基与羟基官能团共价结合DNA、蛋白质、糖蛋白、脂多糖、肽、药物、外源凝集素以及其它分子的环氧硅烷活化的玻璃。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定装置包括多重固定梯度的测试点阵列以及校准点阵列。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，还包括将第一份样品与第二份样品引入测定装置以及使第二份样品接触定点固定化点阵列的步骤，第二份样品包含指定的物质。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定装置被设置成最佳的流体流动接触角以确保装置中测试流体的适当的以及受调控的流速。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定装置被设置成确保被分析物的最佳吸附而没有引起被分析物结构构造的以及空间的重新排列从而抑制抗体-被分析物的结合。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定装置包括多个样品舱，所述样品舱包括一体的结构，每个舱包括印制在舱上的多重固定梯度的测试点阵列以及校准点阵列。
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