WO2021090945A1 - 下肢の疾患を処置するための細胞培養物 - Google Patents

下肢の疾患を処置するための細胞培養物 Download PDF

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cells
sheet
cell
extracellular matrix
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芳樹 澤
繁 宮川
啓介 三宅
賢二 大山
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国立大学法人大阪大学
テルモ株式会社
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture having an extracellular matrix on the outer surface, a method for producing the cell culture, a method for treating peripheral arterial disease using the cell culture, and the like.
  • Non-Patent Document 1 a method of transplanting a mononuclear cell fraction of autologous bone marrow cells into a target ischemic limb
  • Patent Document 3 a method of transplanting iPS cell-derived vascular progenitor cells formed into a sheet of gel into a subject having lower limb ischemia
  • An object of the present invention is to provide a cell culture having an extracellular matrix on the outer surface, a method for producing the cell culture, a method for treating peripheral arterial disease using the cell culture, and the like.
  • peripheral blood mononuclear cells or mesenchymal stem cells described in Patent Documents 1 and 2 are administered in a single cell state.
  • the problem remains that the engraftment of the administered cells at the administration site is insufficient.
  • the present inventors have found that by administering a cell culture containing skeletal myoblasts having an extracellular matrix on the outer surface, high engraftment property can be ensured in vivo and angiogenesis can be promoted. As a result of further research based on the findings, the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following.
  • the cell culture having a size of 100 to 500 ⁇ m for treating a disease of the lower limbs and having an extracellular matrix on the outer surface of the cell culture.
  • [7] A method for preparing crushed pieces of sheet-shaped cell culture, which is described below. Steps of seeding cells on a substrate, A step of sheeting the seeded cells and a step of disrupting the formed sheet-like cell culture, The method described above. [8] The method according to [7], wherein the disruption of the sheet-shaped cell culture is suspension 4 to 6 times using a syringe. [9] A pharmaceutical composition containing a cell culture containing skeletal myoblasts and an extracellular matrix for treating peripheral arterial disease. [10] A method for treating peripheral arterial disease, comprising administering a fragment of a sheet-like cell culture containing skeletal myoblasts and having an extracellular matrix. [11] A method for treating peripheral arterial disease, which comprises administering a pharmaceutical composition containing a cell culture containing skeletal myoblasts and an extracellular matrix. [12] The method according to [10] or [11], wherein the administration is intramuscular administration.
  • angiogenesis can be promoted and peripheral arterial disease can be treated.
  • the cell culture of the present invention can engraft for a long time at the site of administration.
  • the cell culture of the present invention can be directly administered to the affected area of the target by injection, for example, even if the affected area of the target is wide, it can be easily administered to a plurality of sites. More specifically, by administering the cell culture of the present invention to the affected area, for example, muscle fibers having a nucleus in the center can be generated and blood flow can be improved.
  • FIG. 1 shows the measurement results of cell purity using FACS of the cells used for preparing the sheet-shaped cell culture.
  • FIG. 2A is a photograph of the prepared sheet-shaped cell culture.
  • FIG. 2B is a photomicrograph of a cross section of a sheet cell culture stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 2C is a photomicrograph of a cross section of an immunostained sheet cell culture.
  • FIG. 3 shows a photomicrograph of a suspension of sheet-like cell culture.
  • FIG. 3A is a photograph of a suspension in which the set of suction and discharge was repeated 5 times as a suspension.
  • FIG. 3B is an enlarged photomicrograph of the suspension of FIG. 3A.
  • FIG. 3C is an enlarged photomicrograph of a suspension in which the set of suction and discharge was repeated 10 times as a suspension.
  • FIG. 4 shows the blood flow rate of the mice in each group on the 0th, 7th, 14th, 21st, and 28th days when the blood flow rate before the mouse ischemia model was created, which was measured by laser Doppler perfusion imaging (LDPI). It is a graph which shows the result of%.
  • Clustered cells indicate mice in the fragment administration group
  • Single cells indicate mice in the single cell administration group
  • Saline indicates mice in the saline administration group.
  • * in the figure indicates that the Dunnett's test was performed on the physiological saline administration group and P ⁇ 0.05.
  • FIG. 5 shows the results of imaging representative mice of the respective groups on days 7, 14, 21 and 28 as measured by LDPI.
  • Clustered cells indicate mice in the fragment administration group
  • Single cells indicate mice in the single cell administration group
  • Saline indicates mice in the saline administration group.
  • FIG. 6 shows the results of RT-PCR in tissues collected from mice in the fragment-administered group, the single-cell-administered group, and the saline-administered group on the third, fifth, seventh, and 28th days.
  • Clustered cells indicate mice in the fragment administration group
  • Single cells indicate mice in the single cell administration group
  • Saline indicates mice in the saline administration group.
  • FIG. 6A is for VEGF
  • FIG. 6B is for HGF
  • FIG. 6C is for FGF
  • FIG. 6D is for Ang-1
  • FIG. 6E is for Ang-2
  • FIG. 6F is RT-for SDF-1.
  • the result of PCR is shown.
  • FIG. 6G shows the results of RT-PCR for Pax7
  • FIG. 6H shows the results of RT-PCR for MyoD.
  • FIG. 6A is for VEGF
  • FIG. 6B is for HGF
  • FIG. 6C is for FGF
  • FIG. 6D is for Ang-1
  • FIG. 6E is for Ang-2
  • FIG. 6F is RT-for SDF-1.
  • the result of PCR is shown.
  • FIG. 6G shows the results of RT-PCR for Pax7
  • FIG. 6H shows the results of RT-PCR for MyoD.
  • FIG. 7 is a hematoxylin / eosin-stained micrograph of tissues collected from mice in the fragment-administered group 2, the single-cell-administered group 2, and the physiological saline-administered group 2 on the third, fifth, seventh, and 28th days. Is shown.
  • Clustered cells indicate mice in the fragment administration group 2
  • Single cells indicate mice in the single cell administration group 2
  • Saline indicates mice in the saline administration group 2.
  • FIG. 8A shows the result of counting the number of muscle fibers (neoplastic muscle fibers) having a nucleus in the center in each tissue stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 8A shows the result of counting the number of muscle fibers (neoplastic muscle fibers) having a nucleus in the center in each tissue stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 8B shows the results of calculating the ratio of the number of muscle fibers having a nucleus in the center (new muscle fibers) to the number of mature muscle fibers having a nucleus in the margin in each hematoxylin / eosin-stained tissue. ..
  • Clustered cells indicate mice in the fragment administration group 2
  • Single cells indicate mice in the single cell administration group 2
  • Saline indicates mice in the saline administration group 2.
  • * indicates that Dunnett's test was performed on the physiological saline administration group 2 and P ⁇ 0.05
  • + in the figure indicates that Dunnett's test was performed on the single cell administration group 2 and P ⁇ 0. Shows what was .05.
  • FIG. 8C shows the results of counting the number of embryonic MHC-positive cells in the tissues collected from the mice of the fragment administration group 2, the single cell administration group 2, and the physiological saline administration group 2 on the third day. Shown. MHC is a marker for skeletal muscle, and a positive marker indicates that the cell is a muscle cell.
  • FIG. 9 shows micrographs of frozen specimens of tissues collected from the mice of the debris-administered group 2 and the single-cell-administered group 2 on the 7th day.
  • FIG. 9 (A) shows a photograph of a sample taken from the mouse of the fragment administration group 2
  • FIG. 9 (B) shows a photograph of the sample taken from the mouse of the single cell administration group 2.
  • One aspect of the present invention relates to a cell culture having a size of 100-500 ⁇ m for treating a disease of the lower limbs and having an extracellular matrix on the outer surface of the cell culture.
  • cell culture refers to a composition obtained through a cell culture step.
  • the cell culture of the present invention at least a part of the cells are joined to each other via an extracellular matrix produced by the cells constituting the cell culture.
  • the cell culture has an extracellular matrix not only between cells inside the cell culture but also on the outer surface of the cell culture.
  • the cell culture of the present invention has a layer of extracellular matrix over the entire outer surface of the cell culture.
  • the cell culture of the present invention has a sheet-like morphology, wherein the sheet-like morphology refers to a morphology having a first surface and a second surface substantially parallel to it.
  • the cell culture has a layer of extracellular matrix on one surface thereof.
  • the cell culture of the present invention forms a spheroid, and in the portion where the spheroid was in contact with the substrate, for example, about half of the outer surface portion of the substantially spherical spheroid, of the extracellular matrix. It has a layer.
  • the extracellular matrix produced by the cells constituting the cell culture depends on various conditions, for example, 24 hours or more after seeding of the cells, for example, 24 hours, 30 hours, 36 hours, 42 hours. , 48 hours, 54 hours, 60 hours, 66 hours, 72 hours by culturing.
  • the extracellular matrix contributes to the adhesion of the cell culture to the administration site and can improve the engraftment rate of the cell culture at the administration site when the cell culture is administered. Further, since the extracellular matrix is a cell-derived component, there is no problem in administering it together with the cell culture of the present invention.
  • the cell culture of the present invention preferably has an extracellular matrix on the outer surface, but is sufficient for the cell culture to adhere to the administration site, for example, when a single cell is used as the cell culture. If it does not have an extracellular matrix, it may be administered in combination with a required amount of extracellular matrix.
  • a sheet cell culture made from 7-10 ⁇ 10 5 cells has sufficient extracellular matrix to adhere to the administration site, and a corresponding amount of extracellular matrix is provided. It may be administered in combination with a cell culture.
  • a single cell refers to a cell that does not adhere to each other and exists in a single state, in which a plurality of originally adhered cells are separated into a single cell and a single cell. Includes cells prepared in the cellular state of. Further, in the present specification, a single cell includes a cell having a form close to that of a single cell.
  • the morphology close to a single cell refers to a morphology in which at least a part of cells are adhered to each other with a small number of cells, but the behavior is similar to that of a single cell.
  • the cells having a morphology close to a single cell contain 1 to 30%, preferably 1 to 20%, and more preferably 1 to 10% of cells in a state where the cells are adhered to each other.
  • the cells contained in the cell culture of the present invention are not particularly limited as long as they can produce an extracellular matrix, and include, for example, adherent cells (adherent cells).
  • Adhesive cells include, for example, adherent somatic cells (eg, myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin.
  • stem cells eg, tissue stem cells such as myoblasts, heart stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.
  • Somatic cells may be stem cells, particularly those differentiated from iPS cells (iPS cell-derived adherent cells).
  • Non-limiting examples of cells contained in the cell culture of the present invention include, for example, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair roots).
  • iPS cells are cells having pluripotency and self-renewal ability, which are induced by introducing a gene.
  • iPS cell-derived adherent cells include iPS cell-derived myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, and bone membrane cells. , Skin cells, synovial cells, cartilage cells and the like.
  • the cells contained in the cell culture of the present invention are particularly preferably cells capable of promoting angiogenesis, for example, cells capable of secreting a factor promoting angiogenesis, for example, a cytokine such as VEGF.
  • the cells that make up the cell culture can be derived from any organism that is treated with the cell culture, such as, but not limited to, humans, primates, dogs, cats, pigs. , Horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits and the like. Further, the cells constituting the cell culture may be only one type, but two or more types of cells can also be used. In a preferred embodiment of the present invention, when there are two or more types of cells constituting the cell culture, the content ratio (purity) of the most abundant cells is 60% or more, preferably 70% or more at the end of cell culture production. , More preferably 75% or more.
  • the cell may be a heterologous cell or an allogeneic cell.
  • heterologous cell means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the cell culture is used for transplantation.
  • cells derived from monkeys and pigs correspond to heterologous cells.
  • homoogeneous cell means a cell derived from an organism of the same species as the recipient.
  • the human cell corresponds to an allogeneic cell. Allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), ie, recipient-derived cells and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells).
  • Autologous cells are preferred in the present disclosure because they do not cause rejection when transplanted. However, it is also possible to utilize heterologous cells and allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection.
  • cells other than autologous cells that is, allogeneic non-self-derived cells and allogeneic non-self-derived cells may be collectively referred to as non-autologous cells.
  • the cell is an autologous cell or an allogeneic cell.
  • the cell is an autologous cell.
  • the cell is an allogeneic cell.
  • the cell culture is administered within the tissue of the subject, preferably to the lesion site of the subject having a disease of the lower extremities.
  • the cell culture is administered to a lesion site where blood flow is impaired, eg, the adductor muscles of the lower extremities, in a patient with peripheral arterial disease.
  • the cell culture can be administered to the lesion site, for example, 7 days after administration, to improve blood flow to, for example, 35%, 40%, 45% as compared to a healthy state.
  • administration of the cell culture to the lesion site improves, for example, blood flow by about 1.5-fold, about 2-fold, and about 2.5-fold as compared to control saline. Can be done.
  • the cell culture is administered intra-tissue by injection. Therefore, the cell culture of the present invention has a size that allows the cell culture to pass through the inside of the injection needle used for administration and to prevent the cell culture from entering the microvessels after administration. Examples of such a size include cell cultures having an average diameter of 30 ⁇ m to 1000 ⁇ m, preferably 100 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the cell culture of 100 ⁇ m to 500 ⁇ m is any line connecting arbitrary corners when the observed shape is polygonal when the cell culture is observed in a plane under a microscope or the like.
  • the cell culture having a length of 100 ⁇ m to 500 ⁇ m, or a cell culture having a major axis and a minor axis of 100 ⁇ m to 500 ⁇ m, respectively, when the observed shape is substantially circular.
  • the cell culture of such magnitude the sheet-like cell culture having about 10 2 to 10 6 cells, debris of a sheet-like cell cultures, and the like spheroids.
  • lower limb disease includes any disease having a disorder in the lower limb.
  • diseases include, but are not limited to, peripheral arterial disease, varicose veins of the lower extremities, deep vein thrombosis, and the like.
  • the disease of the lower limbs in the present invention is a disease in which blood vessels are narrowed or occluded in the lower limbs and the blood flow of the lower limbs is deteriorated, for example, a peripheral arterial disease.
  • peripheral arterial disease includes, but is not limited to, lower limb arteriosclerosis obliterans, Buerger's disease, collagen disease, etc., and particularly severe lower limb arteriosclerosis obliterans is severely ischemic. It is called.
  • treating includes performing all kinds of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions for the purpose of curing, temporary remission or prevention of a disease.
  • “treating” refers to medicine for a variety of purposes, including delaying or stopping the progression of a disease associated with a tissue abnormality, regressing or eliminating a lesion, preventing the onset or recurrence of the disease, and the like. Includes performing a physically acceptable intervention.
  • the effect of the cell culture of the present invention on peripheral arterial disease is that cytokines such as VEGF, which are continuously secreted from the administered cell culture of the present invention, are deficient.
  • the cell culture of the present invention contains an extracellular matrix, it is considered that the engraftment rate of the cell culture at the ischemic site is high and it acts efficiently on the cells at the ischemic site. As described above, it is considered that the cell culture of the present invention has a high engraftment rate at the ischemic site and acts on the cells at the ischemic site to promote angioplasty, so that myogenesis can be caused at an early stage. Be done. For example, in mice, it takes two months for ischemia model muscle recovery to occur (see Mohiuddin M et.al, Scientific Reports volume 9, Article number: 9551 (2019)).
  • muscle fibers can be generated in 3 days and myogenesis can be completed in 1 month.
  • muscle fibers having a nucleus in the center can be generated, and the generation of such muscle fibers can be generated.
  • tissue stained with hematoxylin and eosin by counting the number of mature muscle fibers with a nucleus at the margin and the number of muscle fibers with a nucleus in the center (neoplastic muscle fibers) in the tissue.
  • angiogenesis-related factors such as VEGF, HGF, FGF, Ang-1, Ang-2 and SDF-1, and muscle differentiation regulators such as Pax7, MyoD. It can be confirmed by analyzing gene expression.
  • a muscle fiber having a central nucleus can be generated, as described above. As you can see, muscle healing can be confirmed.
  • the cell culture comprises cells derived from skeletal muscle.
  • the cells derived from skeletal muscle refer to satellite cells, skeletal myoblasts, skeletal muscle cells, skeletal myotubes and skeletal muscle fibers.
  • the cell derived from skeletal muscle is skeletal myoblast.
  • the cells constituting the cell culture of the present invention are 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more of cells derived from skeletal muscle. Alternatively, it contains 90% or more, preferably 60% or more.
  • Skeletal myoblasts are well known in the art, and can be prepared from skeletal muscle by any known method (for example, the method described in JP-A-2007-89442), for example, Lonza Japan.
  • the catalog number of the corporation: CC-2580, the product code of Cosmo Bio Co., Ltd. 3520, etc. can also be obtained commercially.
  • Skeletal myoblasts are, but are not limited to, CD56, ⁇ 7 integrin, myosin heavy chain IIa, myosin heavy chain IIb, myosin heavy chain IId (IIx), MyoD, Myf5, Myf6, myogenin, desmin, PAX3. It can be identified by markers such as.
  • skeletal myoblasts are CD56 positive.
  • skeletal myoblasts are CD56 positive and desmin positive.
  • the prepared cell population includes fibroblasts.
  • the cell population contains a certain amount of fibroblasts.
  • Fibroblasts are well known in the art and are TE-7 (eg Rosendal et al., J Cell Sci. 1994; 107 (Pt1): 29-37, Goodpaster et al. J Histochem Cytochem. 2008; It can be identified by markers such as 56 (4): 347-358, etc.).
  • the cells constituting the cell culture of the present invention include skeletal myoblasts prepared from striated muscle tissue.
  • the cell population used in the production of the cell culture of the present invention may include skeletal myoblasts and fibroblasts.
  • the cell population used in the production of the cell culture of the present invention has a CD56 positive rate of 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more. , 90% or more, preferably 60% or more.
  • the cell population used in the production of the cell culture of the present invention may contain fibroblasts, but if the content of fibroblasts is too high, the content of skeletal myoblasts decreases, which is not preferable. Therefore, in one embodiment, the cell population used in the production of the cell culture of the present invention has a TE-7 positive rate of 50% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less. It can be 15% or less, 10% or less, preferably 40% or less.
  • the cell population used in the production of the cell culture of the present invention may include cells other than skeletal myoblasts and fibroblasts, but the smaller the number of such cells, the more preferable.
  • the total value of the CD56 positive rate and the TE-7 positive rate is preferably high, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99. % Or more, preferably 90% or more.
  • cytokines are secreted from cell cultures containing cells derived from skeletal muscle.
  • cytokines secreted from cell cultures containing cells derived from skeletal muscle are not limited to these, but are, for example, IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL.
  • IL-6 IL-7
  • IL-8 IL-9
  • IL-10 IL-12, IL-13, IL-15, IL-17
  • eotaxin FGF-basic, G-CSF, GM -CSF, IFN-g, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-1a, PDGF-bb, MIP-1b, RANTES, TNF-a, HGF-1, SDF-1, VEGF and the like. ..
  • the cell culture of the present invention is a fragment of a sheet-like cell culture.
  • the "crushed piece of the sheet-shaped cell culture” refers to a piece obtained by crushing the sheet-shaped cell culture and dividing it into a plurality of crushed pieces.
  • the size of the crushed piece is not limited to this, but it is preferable that most of the crushed piece does not enter the microvessel and passes through the inside of the injection needle.
  • the average length of the diagonal lines of the sheet-shaped plane is 30 ⁇ m to 1000 ⁇ m, preferably 100 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • crushing can be performed by any known method as long as crushed pieces of the sheet-shaped cell culture can be obtained, and includes the sheet-shaped cell culture by, for example, a syringe and a needle or a pipette. This can be done by suspending the liquid.
  • the "sheet-shaped cell culture” refers to cells connected to each other to form a sheet.
  • the cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the mediator is preferably derived from cells, particularly from the cells that make up the cell culture.
  • the cells are at least physically (mechanically) connected, but may be more functionally, for example, chemically or electrically connected.
  • the sheet-like cell culture may be composed of one cell layer (single layer) or two or more cell layers (laminated (multilayer) body, for example, two layers, three layers, etc. It may be 4 layers, 5 layers, 6 layers, etc.). Further, the sheet-shaped cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one cell without showing a clear layered structure of the cells. For example, in the vertical cross section of a sheet-shaped cell culture, cells may be present in a non-uniformly (for example, mosaic-like) arrangement without being uniformly aligned in the horizontal direction.
  • a non-uniformly for example, mosaic-like
  • the sheet-like cell culture preferably does not contain a scaffold (support). Scaffolds may be used in the art to attach cells to and / or inside the surface and maintain the physical integrity of sheet cell cultures, such as polyvinylidene fluoride (polyvinylidene fluoride). Although membranes made of PVDF) and the like are known, the sheet-shaped cell cultures of the present disclosure can maintain their physical integrity even in the absence of such scaffolds.
  • the sheet-shaped cell culture of the present disclosure preferably comprises only the cell-derived substances constituting the sheet-shaped cell culture, and does not contain any other substances.
  • the thickness of the sheet-shaped cell culture is not particularly limited.
  • the thickness is usually one cell or more, and the thickness varies depending on the type of cells forming the sheet of the sheet-shaped cell culture.
  • the sheet-like cell culture of the present invention has a thickness of 30 ⁇ m or more, and in a preferred embodiment, it has a thickness of 50 ⁇ m or more.
  • the range of values for the sheet-like cell material of the present invention includes, for example, 30 ⁇ m to 200 ⁇ m, preferably 50 ⁇ m to 150 ⁇ m, and more preferably 60 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the thickness does not exceed the thickness of the single-layer sheet x the number of laminated sheets. Therefore, for example, when a sheet in which five single-layer sheets are stacked is used as one embodiment, the thickness thereof is 150 ⁇ m or more, and in a preferred embodiment, the thickness is 250 ⁇ m or more. In that case, the range of values of the sheet-like cell material is, for example, 150 ⁇ m to 1000 ⁇ m, preferably 250 ⁇ m to 750 ⁇ m, and more preferably 300 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • Another aspect of the invention is a fragment of a sheet cell culture that comprises the steps of seeding cells on a substrate, sheeting the seeded cells, and disrupting the formed sheet cell culture. Regarding the method for producing.
  • the sheet-shaped cell culture can be obtained by any method known to those skilled in the art (for example, Patent Document 1, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-081829, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-110368, etc.). Can be manufactured in (see).
  • the method for producing a sheet-shaped cell culture typically includes a step of seeding cells on a substrate, a step of forming the seeded cells into a sheet, and a step of peeling the formed sheet-shaped cell culture from the substrate. Including, but not limited to.
  • an extracellular matrix layer is formed on one surface of the sheet-shaped cell culture on the substrate side, and the subsequently formed sheet-shaped cell culture is peeled from the substrate.
  • the sheet-like cell culture is peeled from the substrate with a layer of extracellular matrix on one surface thereof.
  • a step of freezing the cells and a step of thawing the cells may be performed prior to the step of seeding the cells on the substrate.
  • a step of washing the cells may be performed after the step of thawing the cells.
  • the step of producing the sheet-shaped cell culture may include one or more of the steps according to the method for producing the sheet-shaped cell culture as a sub-step. In one embodiment, it does not include the step of growing the cells after the step of thawing the cells and before the step of seeding the cells on a substrate.
  • the method for producing crushed pieces of a sheet-shaped cell culture of the present invention further comprises a step of crushing the sheet-shaped cell culture formed after the production of the sheet-shaped cell culture.
  • the step of crushing the sheet-shaped cell culture is performed by any known method as long as the sheet-shaped cell culture can be separated into a plurality of cell cultures and crushed pieces of the above-mentioned sheet-shaped cell culture can be prepared. be able to.
  • crushing the sheet-shaped cell culture is to suspend the sheet-shaped cell culture by repeating the set of suction and discharge 2 to 8 times using a syringe and a needle, preferably 4 to 6 times.
  • the set of suction and discharge is repeated and suspended.
  • the base material is not particularly limited as long as the cells can form a cell culture on it, and includes, for example, a container of various materials, a solid or semi-solid surface in the container, and the like.
  • the container preferably has a structure / material that does not allow a liquid such as a culture solution to permeate.
  • Such materials include, without limitation, for example, polyethylene, polypropylene, Teflon®, polyethylene terephthalate, polymethylmethacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethyl.
  • Acrylamide, metals (eg, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass) and the like can be mentioned.
  • the container preferably has at least one flat surface.
  • Examples of such a container include, without limitation, a culture container having a bottom surface made of a base material capable of forming a cell culture and a liquid-impermeable side surface.
  • a culture vessel include, but are not limited to, a cell culture dish, a cell culture bottle, and the like.
  • the bottom surface of the container may be transparent or opaque. If the bottom surface of the container is transparent, cells can be observed and counted from the back side of the container.
  • the container may have a solid or semi-solid surface inside the container. Examples of the solid surface include plates and containers of various materials as described above, and examples of the semi-solid surface include gels and soft polymer matrices.
  • the base material may be produced using the above materials, or a commercially available material may be used.
  • Preferred substrates include, without limitation, for example, substrates with an adhesive surface suitable for the formation of sheet cell cultures.
  • a base material having a hydrophilic surface for example, a base material coated with a hydrophilic compound such as corona discharge-treated polystyrene, collagen gel or hydrophilic polymer, and further, collagen, vitronectin, laminin. , Vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan and other extracellular matrices, and base materials coated with cell adhesion factors such as cadoherin family, selectin family and integrin family on the surface.
  • a base material is commercially available (for example, Corning (registered trademark) TC-Treated Culture Dish, Corning, etc.).
  • the substrate may be transparent or opaque in whole or in part.
  • the surface of the base material may be coated with a material whose physical properties change in response to a stimulus, for example, temperature or light.
  • a material whose physical properties change in response to a stimulus, for example, temperature or light.
  • Such materials include, but are not limited to, for example, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, etc.
  • Known materials such as a copolymer with a body and a photoresponsive material such as N-isopropylacrylamide gel containing spirobenzopyran can be used (see, for example, JP-A-2-21186 and JP-A-2003-33177). ).
  • a predetermined stimulus By giving a predetermined stimulus to these materials, their physical characteristics, for example, hydrophilicity and hydrophobicity can be changed, and the exfoliation of the cell culture adhering on the material can be promoted.
  • Culture dishes coated with a temperature-responsive material are commercially available (eg, CellSeed, Inc.'s UpCell® and DIC Corporation's Petri dish®), and these may be used in the production methods of the present disclosure. Can be done.
  • the base material may have various shapes, but is preferably flat.
  • the area thereof is not particularly limited, but may be, for example, about 1 cm 2 to about 200 cm 2 , about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , about 3 cm 2 to about 50 cm 2 .
  • a circular culture dish having a diameter of 10 cm can be mentioned as a base material.
  • the area is 56.7 cm 2 .
  • the substrate may be coated (coated or coated) with serum. By using a serum-coated substrate, a higher density sheet-like cell culture can be formed.
  • Coated with serum means a state in which serum components are attached to the surface of the base material. Such a state can be obtained without limitation, for example, by treating the substrate with serum. Treatment with serum involves contacting the serum with the substrate and, if necessary, incubating for a predetermined period of time.
  • heterologous serum means serum derived from an organism of a different species from its recipient when the sheet cell culture is used for transplantation.
  • serum derived from bovine or horse for example, fetal bovine serum (FBS, FCS), calf serum (CS), horse serum (HS), etc. correspond to heterologous sera.
  • homologous serum means serum derived from an organism of the same species as the recipient. For example, if the recipient is human, human serum corresponds to allogeneic serum.
  • Allogeneic sera include autologous sera (also referred to as autologous sera), that is, sera derived from the recipient and allogeneic sera derived from allogeneic individuals other than the recipient.
  • autologous sera also referred to as autologous sera
  • sera other than autologous serum that is, allogeneic serum and allogeneic serum may be collectively referred to as non-autologous serum.
  • Serum for coating the substrate can be commercially available or prepared by routine from blood collected from the desired organism. Specifically, for example, a method in which the collected blood is left at room temperature for about 20 minutes to about 60 minutes to coagulate, and this is centrifuged at about 1000 ⁇ g to about 1200 ⁇ g, and the supernatant is collected. And so on.
  • serum When incubating on a substrate, serum may be used as a stock solution or diluted. Dilution can be made in any medium, such as, but not limited to, water, saline, various buffers (eg, PBS, HBSS, etc.), various liquid media (eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, etc.). It can be performed in DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, etc.).
  • MCDB MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.
  • L15 SkBM, RITC80-7, etc.
  • the dilution concentration is not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, and is, for example, about 0.5% to about 100% (v / v), preferably about 1% to about 60% (v / v). v), more preferably about 5% to about 40% (v / v).
  • the incubation time is also not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, for example, about 1 hour to about 72 hours, preferably about 2 hours to about 48 hours, more preferably about 2 hours to about 24 hours. The time, more preferably about 2 hours to about 12 hours.
  • the incubation temperature is also not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, for example, at about 0 ° C. to about 60 ° C., preferably about 4 ° C. to about 45 ° C., more preferably room temperature to about 40 ° C. is there.
  • Serum may be discarded after incubation.
  • a serum disposal method suction with a pipette or the like or a conventional liquid disposal method such as decantation can be used.
  • the substrate may be washed with a serum-free wash after serum disposal.
  • the serum-free cleaning solution is not particularly limited as long as it is a liquid medium that does not contain serum and does not adversely affect the serum components adhering to the substrate.
  • water, physiological saline, and various buffer solutions are not particularly limited.
  • various liquid media eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, etc.
  • the cleaning method include a conventional substrate cleaning method, for example, a method in which a serum-free cleaning solution is added onto the substrate, stirred for a predetermined time (for example, about 5 seconds to about 60 seconds), and then discarded without limitation. Can be used.
  • the substrate may be coated with a growth factor.
  • growth factor means any substance that promotes cell growth as compared to its absence, eg, epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblasts. Includes cell growth factor (FGF) and the like.
  • the dilution concentration during incubation is, for example, about 0.0001 ⁇ g / mL to about 1 ⁇ g / mL, preferably about 0.0005 ⁇ g / mL to about 0.05 ⁇ g. It is basically the same as serum except that it is / mL, more preferably about 0.001 ⁇ g / mL to about 0.01 ⁇ g / mL.
  • the base material may be coated with a steroid agent.
  • the "steroid agent” refers to a compound having a steroid nucleus that can adversely affect the living body such as adrenocortical insufficiency and Cushing's syndrome.
  • Such compounds include, but are not limited to, for example, cortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone and the like.
  • the dilution concentration at the time of incubation is, for example, about 0.1 ⁇ g / mL to about 100 ⁇ g / mL, preferably about 0.4 ⁇ g / mL to about as dexamethasone. It is basically the same as serum except that it is 40 ⁇ g / mL, more preferably about 1 ⁇ g / mL to about 10 ⁇ g / mL.
  • the substrate may be coated with any one of serum, growth factors and steroids and any combination of these, ie serum and growth factors, serum and steroids, serum and growth factors and steroids, or , May be coated with a combination of growth factors and steroids.
  • these components may be mixed and coated at the same time, or may be coated in separate steps.
  • the base material may be seeded with cells immediately after being coated with serum or the like, or may be stored after being coated and then seeded with cells.
  • the coated substrate can be stored for a long period of time, for example, by keeping it at about 4 ° C. or lower, preferably about ⁇ 20 ° C. or lower, more preferably about ⁇ 80 ° C. or lower.
  • the seeding of cells on the substrate can be performed by any known method and conditions.
  • the seeding of cells on a base material may be carried out, for example, by injecting a cell suspension in which cells are suspended in a culture solution into a base material (culture container).
  • a cell suspension in which cells are suspended in a culture solution into a base material (culture container).
  • an instrument suitable for the operation of injecting the cell suspension such as a dropper or a pipette, can be used.
  • the seeding is about 7.1 ⁇ 10 5 pcs / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 pcs / cm 2 , about 7.3 ⁇ 10 5 pcs / cm 2 to about 2.8 ⁇ 10 6 Pieces / cm 2 , about 7.5 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.5 x 10 6 pieces / cm 2 , about 7.8 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.3 x 10 6 pieces / cm cm 2 , about 8.0 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.0 x 10 6 pieces / cm 2 , about 8.5 x 10 5 pieces / cm 2 to about 1.8 x 10 6 pieces / cm 2 , Approximately 9.0 x 10 5 pcs / cm 2 to Approximately 1.6 x 10 6 pcs / cm 2 , Approximately 1.0 x 10 6 pcs / cm 2 to Approximately 1.6 x 10 6 pcs / cm 2 etc. It can be done with density
  • compositions comprising a cell culture containing skeletal myoblasts and an extracellular matrix for treating peripheral arterial disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain various additional ingredients such as extracellular matrix, such as a pharmaceutically acceptable carrier, and the viability, engraftment and engraftment of the cell culture.
  • additional ingredients such as extracellular matrix, such as a pharmaceutically acceptable carrier, and the viability, engraftment and engraftment of the cell culture.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with an ingredient that enhances the viability, engraftment and / or function of a cell culture, and other active ingredients that are useful for treating a target disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for use in the treatment of diseases of the lower extremities.
  • the tissues and diseases to be treated are as described above for the cell culture of the present invention.
  • the cell culture and the extracellular matrix may be prepared separately and administered at the same time.
  • the cell culture described above can be used, but a single cell is used as long as it is used in combination with an extracellular matrix in an amount sufficient to adhere to the administration site. You may.
  • an amount of cell matrix sufficient to adhere to the ischemic site is applied to the adhesive surface with the substrate when the sheet-shaped cell culture is prepared. Therefore, it is not necessary to separately administer the extracellular matrix.
  • the amount that is insufficient for the amount of extracellular matrix contained in the sheet-like cell culture formed from the same number of cells may be administered, for example, spheroid. If the cell culture has half the amount of extracellular matrix of the sheet-like cell culture, the corresponding amount may be administered to the other half.
  • the extracellular matrix is commercially available (for example, Advanced BioMatrix / VitroCol TM human-derived type I collagen, etc.), and these can be used in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Another aspect of the invention relates to a method of treating peripheral arterial disease in a subject, comprising the step of administering an effective amount of the cell culture or pharmaceutical composition of the invention to the subject in need thereof.
  • the tissues and diseases targeted by the treatment method of the present invention are as described above for the cell culture of the present invention.
  • a component that enhances the viability, engraftment and / or function of the cell culture, other active ingredients useful for treating the target disease, and the like are used in the cell culture of the present invention.
  • it can be used in combination with a pharmaceutical composition.
  • the term "subject” means any individual organism, preferably an animal, more preferably a mammal, even more preferably a human.
  • treatment shall include all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions aimed at the cure, temporary remission or prevention of the disease.
  • treatment includes medically acceptable interventions for a variety of purposes, including delaying or stopping the progression of a disease, regressing or eliminating lesions, preventing the onset or recurrence of the disease, and the like. ..
  • the "effective amount” is, for example, an amount capable of suppressing the onset or recurrence of a disease, reducing symptoms, or delaying or stopping the progression (for example, the number of cells contained in a cell culture, cell culture).
  • the size, weight, etc. of the object preferably an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease.
  • an amount that does not cause an adverse effect exceeding the benefit of administration is preferable.
  • Such an amount can be appropriately determined by, for example, a test in an experimental animal such as a mouse, a rat, a dog or a pig, or a disease model animal, and such a test method is well known to those skilled in the art.
  • the size of the tissue lesion to be treated can be an important index for determining the effective amount.
  • a total of 7 ⁇ 10 ⁇ 10 5 cells are administered in the form of a cell culture comprising 1 per about 10 2 to 10 6 cells be able to.
  • administering to a human having a peripheral artery disease a total of 7 ⁇ 10 ⁇ 10 6 cells, in the form of a cell culture comprising 1 per about 10 2 to 10 6 cells can be done.
  • Yet another aspect of the invention is a method for treating peripheral arterial disease, comprising shredded sheet-like cell cultures or skeletal myoblasts comprising skeletal myoblasts and having an extracellular matrix. It relates to a method comprising administering a pharmaceutical composition comprising a cell culture and an extracellular matrix.
  • the treatment method of the present invention may further include a step of producing a fragment of the sheet-shaped cell culture of the present invention according to the production method of the present invention.
  • the treatment method of the present invention is a cell for producing a fragment of a sheet-like cell culture from a subject (for example, in the case of using iPS cells, for example, skin) before the step of producing a fragment of the sheet-like cell culture. It may further include the step of collecting cells (cells, blood cells, etc.) or tissues that are the source of the cells (for example, skin tissue, blood, etc. when using iPS cells).
  • the subject from which the cell or the tissue that is the source of the cell is collected is the same individual as the subject to which the fragment of the sheet-shaped cell culture or the pharmaceutical composition is administered.
  • the subject from which the cell or tissue from which the cell is sourced is collected is a separate body of the same species as the subject receiving the administration, such as a fragment of a sheet-like cell culture or a pharmaceutical composition.
  • the subject from which the cell or the tissue to be the source of the cell is collected is an individual different from the subject to which the fragment of the sheet-shaped cell culture or the pharmaceutical composition is administered.
  • the administration method typically includes direct application to tissues, preferably direct application to muscle tissue to be administered.
  • the cell cultures and pharmaceutical compositions of the present invention can be administered by injection in various routes such as intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intraarterial, when using a fragment of the sheet cell culture. It may be administered from a route such as intraportal vein, intraventricular, or intraperitoneal route.
  • the method of administration is intramuscular injection of the subject to be administered.
  • the injection may be divided into a plurality of points in one treatment.
  • the frequency of administration is typically once per treatment, but multiple doses can be administered if the desired effect is not obtained.
  • a cell culture having an extracellular matrix on the outer surface when administered, it may be injected at a plurality of sites or may be injected at the same site multiple times.
  • the single cell and the extracellular matrix when administered, the single cell and the extracellular matrix may be separately injected once or multiple times, or a mixture of the single cell and the extracellular matrix may be injected once. Alternatively, it may be injected multiple times at the same location or at multiple locations.
  • Example 1 Preparation of crushed fragments of mouse-derived skeletal myoblast sheet
  • Skeletal muscle was collected from the lower limbs of a 4-week-old C57BL / 6 mouse (Nippon Claire Co., Ltd.), and collagenase and trypsin were collected. Was treated with a solution containing, and dispersed in a single cell.
  • Such cells were cultured under MCDB131 medium containing 20% FBS under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions until they became confluent, and the cells were collected.
  • the recovered cells were measured using FACS. The measurement results are shown in FIG. More than 95% of the recovered cells were skeletal myoblasts.
  • the collected cells were seeded in a 12-well temperature-responsive culture vessel (UpCell®, 12-well multiwell, CS3003, CellSeed Co., Ltd.) at a concentration of 7 to 10 ⁇ 10 5 / cm 2 and 20% FBS.
  • the cells were cultured in DMEM / F12 medium containing the medium for 6 hours or more to form a sheet. Then, the sheet-like cell culture was exfoliated from the temperature-responsive culture vessel by lowering the temperature to 20 ° C.
  • FIG. 2A is a photograph of the sheet-like cell culture
  • FIG. 2B is a photomicrograph of a cross section of the sheet-like cell culture stained with hematoxylin and eosin
  • FIG. 2C is a photomicrograph of the cross section of the immunostained sheet-like cell culture. The photograph is shown.
  • FIG. 3A is a photograph of the suspension in which the suction / discharge set was repeated 5 times
  • FIG. 3B is an enlarged micrograph of the suspension
  • FIG. 3C is an enlarged photomicrograph of the suspension in which the suction / discharge set was repeated 5 times.
  • crushed pieces of about 300 to 500 ⁇ m were confirmed.
  • the crushed product obtained in Example 1 was considered to be a crushed product in which a large amount of extracellular matrix (ECM) was present on the surface on which the sheet-shaped cell culture was adhered to the culture substrate.
  • ECM extracellular matrix
  • Example 2 Administration of fragment of sheet-shaped cell culture in mouse ischemia model
  • (1) Preparation of mouse ischemia model Right hind limb of 8-week-old C57BL / 6 mouse (Nippon Claire Co., Ltd.) 7 days before the start of administration test Ligature and vascular resection were performed beyond the femoral artery. Before ligation and revascularization, laser Doppler perfusion imaging (LDPI) was used to measure blood flow in healthy mice.
  • LDPI laser Doppler perfusion imaging
  • the mouse ischemia model prepared in (1) was randomly divided into three groups so that there were 10 mice in each group. The mice in the first group were injected with the suspension prepared in Example 1 in which the suction / excretion set was repeated 5 times (hereinafter referred to as the fragment administration group).
  • mice As a control, for the second group of mice, 0.3 mL of cells of the same origin as the cells used in the sheet cell culture , 7-10 ⁇ 10 5 cells, in a single cell state without culturing, were physiologically available. Those suspended in saline were injected (hereinafter referred to as the single cell administration group), and only 0.3 mL of physiological saline was injected into the mice in the third group (hereinafter, physiological saline administration). Called a group). In both groups of mice, the infusion was performed in two places in the muscle of the ischemic limb of the mouse ischemia model in which the blood vessels were removed.
  • Test plan The test was carried out until the 28th day, counting the number of days after the start of the test, with the day of injection as the 0th day. Blood flow was measured by LDPI on days 0, 7, 14, 21 and 28 for each mouse. In addition, on the 1st, 3rd, 5th, 7th and 28th days, the tissue of the administration site was collected to confirm the expression of the gene. The expression of genes in tissues collected from each group of mice was evaluated by RT-PCR.
  • the blood flow decreased to less than 20% at the time of preparing the mouse ischemia model on the 0th day, but on the 7th, 14th, 21st and 28th days, the blood flow decreased.
  • the mice in the fragment-administered group a significant improvement in blood flow was observed as compared with the mice in the saline-administered group and the mice in the single-cell-administered group.
  • the mice in the fragment-administered group had higher blood flow than the saline-administered group and the single-cell-administered group in all the measurements on the 7th, 14th, 21st and 28th days.
  • VEGF VEGF
  • VEGF was at extremely high levels in the tissues collected from the debris-administered mice compared to the tissues collected from the mice in the single cell-administered group and the tissues collected from the mice in the saline-administered group. It was confirmed that HGF, FGF, Ang-1, Ang-2, SDF-1, Pax7, and MyoD were expressed.
  • Example 3 Confirmation of engraftment of administered cells (1) Test plan Skeletal muscle was collected from the lower limbs of 4-week-old GFP-introduced C57BL / 6 mice (Nippon SLC Co., Ltd.), and the sheet was collected in the same manner as in Example 1 (under the same conditions). The physiological saline solution was repeatedly sucked and discharged together with the cell culture, and the sheet-shaped cell culture was crushed and suspended in the physiological saline to prepare a suspension. Next, a mouse ischemia model was prepared in the same manner as in Example 2 (1) and divided into three groups. The prepared suspension was injected into the first group of mice (hereinafter referred to as fragment administration group 2).
  • mice As a control, for the second group of mice, 0.3 mL of 7-10 ⁇ 10 5 skeletal muscle cells collected from the lower limbs of GFP-introduced C57BL / 6 mice in a single cell state without culturing. Those suspended in saline were injected (hereinafter referred to as single cell administration group 2), and only 0.3 mL of saline was injected into the mice in the third group (hereinafter referred to as saline). Water administration group 2). In both groups of mice, the infusion was performed in two places in the muscle of the ischemic limb of the mouse ischemia model in which the blood vessels were removed.
  • the number of days after the start of the test was counted with the day of injection as the 0th day, and the mice in each group were sacrificed on the 1st, 3rd, 5th, 7th and 28th days, and the adductor muscle was collected. Hematoxylin-eosin staining was performed on a part of the tissue obtained from the adduction muscle collected from each mouse after fixing with a formalin solution, and a frozen specimen was prepared after fixing with a paraformaldehyde solution for another part. did. For each hematoxylin-eosin-stained tissue, the number of centrally-nucleated muscle fibers (neoplastic muscle fibers) and marginally-nucleated mature muscle fibers was counted. For frozen specimens, the GFP area was confirmed. The number of embryonic MHC-positive cells was further counted in the tissues collected from each group of mice on day 3.
  • FIG. 8A shows that the nucleus is present in the center in each tissue stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 8B shows that * indicates that Dunnett's test was performed on the physiological saline administration group 2 and P ⁇ 0.05, and + in the figure indicates that Dunnett's test was performed on the single cell administration group 2 and P ⁇ 0. Shows what was .05.
  • FIG. 8C shows the results of counting the number of embryonic MHC-positive cells in the tissues collected from the mice of the fragment administration group 2, the single cell administration group 2, and the physiological saline administration group 2 on the third day.
  • FIGS. 8A and 8B the mice in the fragment administration group 2 on the 28th day had almost completed myogenesis, whereas in the single cell administration group 2 and the physiological saline administration group 2. Since myogenesis continued, it was confirmed that myogenesis occurred early in the mice of the fragment administration group 2.
  • FIG. 8C the number of embryonic MHC-positive cells on the third day was higher in the fragment-administered group 2 than in the tissues collected from the mice in the single-cell-administered group 2 and the saline-administered group 2. It was confirmed that it was remarkably abundant in the tissues collected from mice.
  • FIG. 8C the number of embryonic MHC-positive cells on the third day was higher in the fragment-administered group 2 than in the tissues collected from the mice in the single-cell-administered group 2 and the saline-administered group 2. It was confirmed that it was remarkably abundant in the tissues collected from mice.
  • FIG. 9 shows micrographs of frozen specimens of tissues collected from the mice of the debris-administered group 2 and the single-cell-administered group 2 on the 7th day. As shown in FIG. 9, it was confirmed that the tissue sample collected from the debris-administered mouse had a wider GFP area than the tissue sample collected from the single-cell-administered mouse. ..

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Abstract

本発明は、末梢動脈疾患を処置するための細胞培養物、該細胞培養物の製造方法および該細胞培養物を用いた末梢動脈疾患の処置方法等を提供することを目的とする。本明細書により、１００～５００μｍの大きさを有する細胞培養物であって、該細胞培養物の外表面に細胞外マトリクスを有する、前記細胞培養物などが提供されたことにより上記課題が解決された。

Description

下肢の疾患を処置するための細胞培養物
　本発明は、細胞外マトリクスを外表面に有する細胞培養物、該細胞培養物の製造方法、および該細胞培養物を用いた末梢動脈疾患の処置方法等に関する。
　近年、高齢化の進展や食生活の欧米化、運動不足などに伴い、動脈硬化症の患者が増加しており、それに関連して末梢動脈疾患の患者数も増加している。かかる疾患の治療方法として、疾患が軽度であるうちは、生活習慣改善の指導や薬物治療が選択され、重症下肢虚血などの重度の疾患になると、カテーテルを用いた血管形成療法、バイパス手術といった治療法が選択される。しかし、さらに重症化するとそのような治療法でも治療が不可能となり、虚血肢の切断が必要となる。このため、侵襲性が低く、重症化した患者にも使用できるような新たな治療法の開発が望まれている。
　これに対して、血管内皮前駆細胞の発見を契機として、かかる疾患に対する再生医療を利用した治療法について開発が進められるようになった。そのような治療法として、例えば、自己骨髄細胞の単核細胞分画を対象の虚血肢に移植する方法（非特許文献１）、末梢血単核球や間葉系幹細胞を末梢動脈疾患の対象に投与する方法（特許文献１、２）、ゲルでシート状に成形したｉＰＳ細胞由来血管前駆細胞を下肢虚血を有する対象に移植する方法（特許文献３）などが挙げられる。
特表２０１２－５１２８４３号公報 特表２０１５－５２４４３７号公報 国際公開２０１３／０６９６６１号公報
吉岡徹他、J Jpn Coll Angiol, 2005, 45: 161-165
　本発明は、細胞外マトリクスを外表面に有する細胞培養物、該細胞培養物の製造方法および該細胞培養物を用いた末梢動脈疾患の処置方法等を提供することを目的とする。
　特許文献１、２に記載の自己骨髄細胞の単核細胞分画、末梢血単核球または間葉系幹細胞を末梢動脈疾患を有する対象に投与する方法においては、それぞれシングルセルの状態で投与されており、投与部位における投与した細胞の生着が不十分であるという課題が残存している。
　本発明者らは、細胞外マトリクスを外表面に有する、骨格筋芽細胞を含む細胞培養物を投与することにより、生体内において高い生着性を確保し、血管新生を促進できることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下に関する。
［１］下肢の疾患を処置するための１００～５００μｍの大きさを有する細胞培養物であって、該細胞培養物の外表面に細胞外マトリクスを有する、前記細胞培養物。
［２］血管新生を促進するための、［１］に記載の細胞培養物。
［３］骨格筋芽細胞を含む、［１］または［２］に記載の細胞培養物。
［４］細胞培養物がシート状細胞培養物の破砕片である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の細胞培養物。
［５］下肢の疾患が末梢動脈疾患である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の細胞培養物。
［６］細胞外マトリクスを有する、シート状細胞培養物の破砕片。
［７］シート状細胞培養物の破砕片を作製するための方法であって、以下：
基材上に細胞を播種するステップ、
播種した細胞をシート化するステップ、および
形成されたシート状細胞培養物を破砕するステップ、
を含む、前記方法。
［８］シート状細胞培養物の破砕が、シリンジを用いて４～６回懸濁することである、［７］に記載の方法。
［９］末梢動脈疾患を処置するための、骨格筋芽細胞を含む細胞培養物と細胞外マトリクスとを含む医薬組成物。
［１０］末梢動脈疾患を処置するための方法であって、骨格筋芽細胞を含み、細胞外マトリクスを有する、シート状細胞培養物の破砕片を投与することを含む、前記方法。
［１１］末梢動脈疾患を処置するための方法であって、骨格筋芽細胞を含む細胞培養物と細胞外マトリクスとを含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
［１２］投与が、筋肉内への投与である、［１０］または［１１］に記載の方法。
　本発明の細胞培養物を投与することにより、血管形成を促進し、末梢動脈疾患を処置することができる。また、本発明の細胞培養物は、投与された部位において長く生着することができる。さらに本発明の細胞培養物は、例えば注射により対象の患部へ直接投与することが可能であるため、対象の患部が広範囲であっても、複数箇所へ分けて簡便に投与することができる。より詳細には、本発明の細胞培養物を患部へ投与することにより、例えば、中心に核のある筋線維を発生させたり、血流量を改善したりすることができる。
図１は、シート状細胞培養物の作製に用いた細胞のＦＡＣＳを用いた細胞純度の測定結果を示す。 図２Ａは、作製したシート状細胞培養物の写真である。 図２Ｂは、ヘマトキシリン・エオジン染色したシート状細胞培養物の断面の顕微鏡写真である。 図２Ｃは、免疫染色したシート状細胞培養物の断面の顕微鏡写真である。 図３に、シート状細胞培養物の懸濁液の顕微鏡写真を示す。図３Ａは、懸濁として吸引・排出のセットを５回繰り返した懸濁液の写真である。 図３Ｂは、図３Ａの懸濁液の拡大された顕微鏡写真である。 図３Ｃは、懸濁として吸引・排出のセットを１０回繰り返した懸濁液の拡大された顕微鏡写真である。
図４は、レーザードップラー灌流イメージング（ＬＤＰＩ）により測定した、マウス虚血モデル作製前の血流量を１００％とした第０、７、１４、２１、および２８日目における各群のマウスの血流量％の結果を示すグラフである。図中のClustered cellsは、破砕片投与群のマウスを、Single cellsは、シングルセル投与群のマウスを、Salineは、生理食塩水投与群のマウスを示す。また、図中＊は、生理食塩水投与群に対してダネット検定を行いＰ＜０．０５であったものを示す。 図５は、ＬＤＰＩにより測定した、第７、１４、２１および２８日目のそれぞれの群の代表的なマウスのイメージングの結果を示す。図中のClustered cellsは、破砕片投与群のマウスを、Single cellsは、シングルセル投与群のマウスを、Salineは、生理食塩水投与群のマウスを示す。 図６は、第３、５、７および２８日目における、破砕片投与群、シングルセル投与群、生理食塩水投与群のそれぞれのマウスから採取した組織におけるＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。図中のClustered cellsは、破砕片投与群のマウスを、Single cellsは、シングルセル投与群のマウスを、Salineは、生理食塩水投与群のマウスを示す。また、図中＊は、生理食塩水投与群に対してダネット検定を行いＰ＜０．０５であったもの、図中＋は、シングルセル投与群に対してダネット検定を行いＰ＜０．０５であったものを示す。図６ＡはＶＥＧＦについての、図６ＢはＨＧＦについての、図６ＣはＦＧＦについての、図６ＤはＡｎｇ－１についての、および図６ＥはＡｎｇ－２についての、図６ＦはＳＤＦ－１についてのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。 図６ＧはＰａｘ７についての、図６ＨはＭｙｏＤについてのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。 図７は、第３、５、７および２８日目における、破砕片投与群２、シングルセル投与群２、生理食塩水投与群２のそれぞれのマウスから採取した組織のヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真を示す。図中のClustered cellsは、破砕片投与群２のマウスを、Single cellsは、シングルセル投与群２のマウスを、Salineは、生理食塩水投与群２のマウスを示す。 図８Ａは、ヘマトキシリン・エオジン染色したそれぞれの組織における、中心に核がある筋線維（新生筋線維）の数をカウントした結果を示す。図８Ｂは、ヘマトキシリン・エオジン染色したそれぞれの組織における、中心に核がある筋線維（新生筋線維）の数と辺縁に核のある成熟した筋線維の数との比率を算出した結果を示す。図中のClustered cellsは、破砕片投与群２のマウスを、Single cellsは、シングルセル投与群２のマウスを、Salineは、生理食塩水投与群２のマウスを示す。また、図中＊は、生理食塩水投与群２に対してダネット検定を行いＰ＜０．０５であったもの、図中＋は、シングルセル投与群２に対してダネット検定を行いＰ＜０．０５であったものを示す。図８Ｃは、第３日目における、破砕片投与群２、シングルセル投与群２、生理食塩水投与群２のそれぞれのマウスから採取した組織中のembryonic MHC陽性である細胞数をカウントした結果を示す。MHCは骨格筋のマーカーであり、このマーカーが陽性で細胞は筋肉の細胞であることを表している。 図９は、第７日目における、破砕片投与群２およびシングルセル投与群２のそれぞれのマウスから採取した組織の凍結標本の顕微鏡写真を示す。図９（Ａ）は、破砕片投与群２のマウスから採取した標本の写真を、図９（Ｂ）は、シングルセル投与群２のマウスから採取した標本の写真を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の一側面は、下肢の疾患を処置するための１００～５００μｍの大きさを有する細胞培養物であって、該細胞培養物の外表面に細胞外マトリクスを有する、前記細胞培養物に関する。
　本発明において、「細胞培養物」は、細胞培養ステップを経て得られる組成物を指す。本発明の細胞培養物は、細胞培養物を構成する細胞により産生された細胞外マトリクスを介して、少なくとも一部の細胞が細胞同士接合している。本発明において、細胞培養物は、細胞外マトリクスを、細胞培養物の内部における細胞同士の間のみでなく、細胞培養物の外表面にも有する。一態様において、本発明の細胞培養物は、細胞外マトリクスの層を細胞培養物の外表面全体に有している。別の態様において、本発明の細胞培養物はシート状の形態をしており、ここで、シート状の形態とは、第１の面とそれとほぼ平行である第２の面を有する形態を指し、細胞培養物はその１つの面に細胞外マトリクスの層を有している。さらに別の態様において、本発明の細胞培養物は、スフェロイドを形成しており、スフェロイドが基材と接していた部分、例えば略球状であるスフェロイドの外表面部分の約半分において、細胞外マトリクスの層を有している。
　本発明において、細胞培養物を構成する細胞により産生された細胞外マトリクスは、種々の条件によるが、例えば、細胞の播種後、２４時間以上、例えば、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、培養することにより生じる。
　細胞外マトリクスは、細胞培養物が投与部位に接着することに寄与し、細胞培養物を投与する際に、投与部位における細胞培養物の生着率を向上させることができる。また細胞外マトリクスは細胞由来成分であるため、本発明の細胞培養物と共に投与に供することにおいてなんら問題はない。本発明の細胞培養物は、外表面に細胞外マトリクスを有していることが好ましいが、例えば、細胞培養物としてシングルセルを使用する場合など、細胞培養物が投与部位に接着するのに十分な細胞外マトリクスを有していない場合には、必要な量の細胞外マトリクスと組み合わせて、投与してもよい。例えば、７～１０×１０５個の細胞から作製されるシート状細胞培養物は、投与部位に接着するのに十分な細胞外マトリクスを有しており、それに相当する量の細胞外マトリクスを、細胞培養物と組み合わせて投与してもよい。ここで、シングルセルとは、互いに接着しておらず、単一の状態で存在する細胞を指し、これには元々接着していた複数の細胞を単一の細胞に分離された細胞および単一の細胞の状態で調製された細胞を含む。また本明細書において、シングルセルは、シングルセルに近い形態である細胞を含む。ここで、シングルセルに近い形態とは、少なくとも一部の細胞が少数の細胞同士で接着しているが、シングルセルと同様の挙動を示す形態を指す。シングルセルに近い形態の細胞は、細胞同士が接着している状態の細胞を、１～３０％、好ましくは１～２０％、より好ましくは１～１０％含む。
　本発明の細胞培養物に含まれる細胞は、細胞外マトリクスを産生し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。本発明の細胞培養物に含まれる細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。ここで、ｉＰＳ細胞は、遺伝子を導入することにより誘導された、分化万能性および自己複製能を有する細胞である。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
　別の態様において、本発明の細胞培養物に含まれる細胞は、血管新生を促進できる細胞、例えば、血管新生を促進する因子、例えば、ＶＥＧＦなどのサイトカインを分泌できる細胞が特に好ましい。
　細胞培養物を構成する細胞は、細胞培養物による処置に供する任意の生物に由来することができ、かかる生物は、これらに限定されるものではないが、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどを含む。また、細胞培養物を構成する細胞は、１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を構成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６０％以上、好ましくは、７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
　細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞である。
　本発明において、細胞培養物は、対象の組織内、好ましくは、下肢の疾患を有している対象の病変部位へ投与される。一態様において、細胞培養物は、末梢動脈疾患の患者において、血流量が悪化している病変部位、例えば、下肢の大腿内転筋群へ投与される。一態様において、細胞培養物を、病変部位に投与することにより、例えば投与７日後に、健常状態と比較して、例えば３５％、４０％、４５％まで血流量を改善することができる。一態様において、細胞培養物を、病変部位に投与することにより、対照の生理食塩水と比較して、例えば、血流量を約１．５倍、約２倍、約２．５倍改善することができる。好ましくは、細胞培養物は、注射により組織内へ投与される。したがって、本発明の細胞培養物は、投与に用いる注射針の内部を通り、かつ投与後に細胞培養物が微小血管へ入り込まない程度の大きさを有する。このような大きさとして、例えば、平均直径が３０μｍ～１０００μｍ、好ましくは１００μｍ～５００μｍの細胞培養物が挙げられる。ここで、１００μｍ～５００μｍの細胞培養物とは、例えば、顕微鏡下などで細胞培養物を平面的に観察した際の、観察された形状が多角形である場合における、任意の角を結ぶあらゆる線分が１００μｍ～５００μｍの長さである細胞培養物、または観察された形状が略円形である場合における、長径および短径が各々１００μｍ～５００μｍである細胞培養物を指す。一態様において、このような大きさの細胞培養物は、約１０2～１０６個の細胞を有するシート状細胞培養物、シート状細胞培養物の破砕片、スフェロイドなどが挙げられる。
　本発明において、「下肢の疾患」は、下肢に障害を有するあらゆる疾患を含む。かかる疾患の例として、これらに限定されないが、末梢動脈疾患、下肢静脈瘤、深部静脈血栓症などが挙げられる。好ましくは、本発明における下肢の疾患は、下肢において血管が狭窄または閉塞し、その下肢の血流量が悪化している疾患、例えば、末梢動脈疾患である。本発明において、末梢動脈疾患は、これらに限定されるものではないが、下肢閉塞性動脈硬化症、バージャー病、膠原病などを含み、特に重症化した下肢閉塞性動脈硬化症を重症下肢虚血と称する。
　本発明において「処置する」とは、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を行うことを包含するものとする。例えば、「処置する」とは、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止をすることなどを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を行うことを包含する。
　特定の理論に拘束されることはないが、本発明の細胞培養物の末梢動脈疾患への作用は、投与された本発明の細胞培養物から持続的に分泌されるＶＥＧＦなどのサイトカインが、虚血部位の細胞に直接的および／または間接的に作用し、血管新生を促進することによるものと考えられる。また、本発明の細胞培養物は細胞外マトリクスを含んでいるため、細胞培養物の虚血部位における生着率が高くなり、虚血部位の細胞に効率的に作用すると考えられる。このように、本発明の細胞培養物は、虚血部位における生着率が高く、虚血部位の細胞に作用して血管形成を促進するので、早期に筋新生を生じさせることができると考えられる。例えば、マウスにおいては、虚血モデルの筋肉の回復が起こるのは２ケ月は必要であるとされているが（Mohiuddin M et.al, Scientific Reports volume 9, Article number: 9551 (2019)参照）、本発明の細胞培養物を用いることより、例えば、３日で筋線維を生じさせ、１カ月で筋新生を終了させることができる。
　本発明の細胞培養物を虚血部位に投与し、虚血部位の細胞に作用することにより、中心に核のある筋線維（新生筋線維）を生じさせることができ、かかる筋線維の発生は、例えば、ヘマトキシリン・エオジン染色したそれぞれの組織における、辺縁に核のある成熟した筋線維の数、および、中心に核がある筋線維（新生筋線維）の数をカウントすることによって、組織中のembryonic MHC陽性である細胞数をカウントすることによって、あるいは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２およびＳＤＦ－１などの血管新生関連因子、Ｐａｘ７、ＭｙｏＤなどの筋分化制御因子の遺伝子発現を解析することによって確認することができる。一態様において、本発明の細胞培養物を虚血部位に投与することにより、例えば、２日以内、３日以内、４日以内に中心に核のある筋線維を生じさせることができ、上述のとおり、筋肉の治癒を確認することができる。
　一態様において、細胞培養物は骨格筋由来の細胞を含む。本発明において、骨格筋由来の細胞とは、衛星細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋細胞、骨格筋管および骨格筋線維を指す。好ましくは、骨格筋由来の細胞とは、骨格筋芽細胞である。かかる態様において本発明の細胞培養物を構成する細胞は、骨格筋由来の細胞を、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上含み、好ましくは６０％以上含む。
　骨格筋芽細胞は当該技術分野においてよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７－８９４４２号公報記載の方法など）により調製することもできるし、例えば、ロンザジャパン株式会社のカタログ番号：CC-2580、コスモ・バイオ株式会社の商品コード3520など、商業的に入手することもできる。骨格筋芽細胞は、これらに限定されるものではないが、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。一態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。一態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性およびデスミン陽性である。
　横紋筋組織から骨格筋芽細胞を調製する場合、調製した細胞集団には線維芽細胞が含まれる。本発明に係る細胞培養物を製造する際に、横紋筋組織から調製した骨格筋芽細胞を含む細胞集団を用いる場合、当該細胞集団には一定量の線維芽細胞が含まれることになる。線維芽細胞は当該技術分野においてよく知られており、ＴＥ－７（例えば、Rosendaal et al., J Cell Sci. 1994; 107(Pt1): 29-37、Goodpaster et al. J Histochem Cytochem. 2008; 56(4): 347-358など参照）などのマーカーにより同定することができる。
　一態様において、本発明の細胞培養物を構成する細胞は、横紋筋組織から調製された骨格筋芽細胞を含む。したがって本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団には、骨格筋芽細胞および線維芽細胞が含まれ得る。一態様において、本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団は、ＣＤ５６陽性率が５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり得、好ましくは６０％以上である。
　本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団は、線維芽細胞を含み得るが、線維芽細胞の含有率が高すぎる場合、骨格筋芽細胞の含有率が低下するため、好ましくない。したがって一態様において、本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団は、ＴＥ－７陽性率が５０％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下であり得、好ましくは４０％以下である。
　本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団は、骨格筋芽細胞および線維芽細胞以外の細胞も含み得るが、かかる細胞は少ないほど好ましい。したがってＣＤ５６陽性率およびＴＥ－７陽性率の合計値は、高い方が好ましく、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上などであり得、好ましくは９０％以上である。
　本発明において、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物からは、サイトカインが分泌される。
　本発明において、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物から分泌されるサイトカインは、これらに限定されるものではないが、例えば、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、エオタキシン、ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ｇ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）、ＭＩＰ－１ａ、ＰＤＧＦ－ｂｂ、ＭＩＰ－１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ－ａ、ＨＧＦ－１、ＳＤＦ－１、およびＶＥＧＦなどが挙げられる。
　一態様において、本発明の細胞培養物は、シート状細胞培養物の破砕片である。本発明において、「シート状細胞培養物の破砕片」とは、シート状細胞培養物を破砕することにより、複数の破砕片へと分割したものを指す。破砕片の大きさは、これに限定されるものではないが、破砕片のうち大部分が、微小血管へ入らず、かつ注射針の内部を通る大きさであることが好ましい。かかる大きさは、例えば、シート形状の平面の対角線の長さの平均が３０μｍ～１０００μｍであり、好ましくは１００μｍ～５００μｍである。本発明において破砕は、シート状細胞培養物の破砕片を得られるものであれば、既知の任意の方法によって行うことができ、例えば、シリンジおよびニードルまたはピペットなどにより、シート状細胞培養物を含む液体を懸濁することによって行うことができる。
　本発明において「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリクスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）体、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。
　シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
　本発明において、シート状細胞培養物の厚みは特に限定されていない。シート状細胞培養物として単層のシートを用いる場合、その厚みは通常細胞１個分以上の厚みを有し、シート状細胞培養物のシートを形成する細胞の種類によっても厚みは異なるが、一態様において、本発明のシート状細胞培養物は、３０μｍ以上の厚みを有し、好ましい一態様において、５０μｍ以上の厚みを有する。本発明のシート状細胞物の値の範囲としては、例えば３０μｍ～２００μｍ、好ましくは５０μｍ～１５０μｍ、より好ましくは６０μｍ～１００μｍが挙げられる。シート状細胞培養物として積層したシートを用いる場合、前記単層シートの厚み×積層枚数を超えない厚みとなる。したがって、一態様として例えば単層シートを５枚重ねたシートを用いる場合、その厚みは１５０μｍ以上の厚みを有し、好ましい一態様において、２５０μｍ以上の厚みを有する。その場合におけるシート状細胞物の値の範囲としては、例えば１５０μｍ～１０００μｍ、好ましくは２５０μｍ～７５０μｍ、より好ましくは３００μｍ～５００μｍが挙げられる。
　本発明の別の側面は、基材上に細胞を播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、および形成されたシート状細胞培養物を破砕するステップを含むシート状細胞培養物の破砕片を作製するための方法に関する。
　本発明のシート状細胞培養物の破砕片の作製方法において、シート状細胞培養物は、当業者に既知の任意の方法（例えば、特許文献１、特開２０１０－０８１８２９、特開２０１１－１１０３６８など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、基材上に細胞を播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、形成されたシート状細胞培養物を基材から剥離するステップを含むが、これに限定されない。ここで、播種した細胞をシート化するステップにおいて、シート状細胞培養物の基材側の一面に細胞外マトリクスの層が形成されており、続く形成されたシート状細胞培養物を基材から剥離するステップにおいて、シート状細胞培養物を、その一面に細胞外マトリクスの層を有した状態で基材から剥離する。細胞を基材上に播種するステップの前に、細胞を凍結するステップおよび細胞を解凍するステップを行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄するステップを行ってもよい。これら各ステップは、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。シート状細胞培養物を製造するステップは、サブステップとして上記シート状細胞培養物の製造方法に係るステップの１または２以上を含んでもよい。ある一態様において、細胞を解凍するステップの後、細胞を基材上に播種するステップの前に細胞を増殖させるステップを含まない。
　本発明のシート状細胞培養物の破砕片の作製方法は、シート状細胞培養物の製造の後に形成されたシート状細胞培養物を破砕するステップをさらに含む。シート状細胞培養物を破砕するステップは、シート状細胞培養物を複数の細胞培養物に分離し、上記のシート状細胞培養物の破砕片を作製することができれば、既知の任意の手法で行うことができる。一態様において、シート状細胞培養物の破砕は、シリンジとニードルを用いて２～８回シート状細胞培養物の吸引と排出のセットを繰り返し、懸濁することであり、好ましくは４～６回吸引と排出のセットを繰り返し、懸濁することである。
　基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリクスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning（登録商標）TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。
　基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ－イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２－２１１８６５、特開２００３－３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、株式会社セルシードのＵｐＣｅｌｌ（登録商標）やＤＩＣ株式会社のＣｅｐａｌｌｅｔ（登録商標））、これらを本開示の製造方法に使用することができる。
　基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２～約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２～約５０ｃｍ２などであってよい。例えば、基材として直径１０ｃｍの円形の培養皿が挙げられる。この場合、面積は５６．７ｃｍ２となる。
　基材は血清でコート（被覆またはコーティング）されていてもよい。血清でコートされた基材を用いることにより、より高密度のシート状細胞培養物を形成することができる。「血清でコートされている」とは、基材の表面に血清成分が付着している状態を意味する。かかる状態は、限定されずに、例えば、基材を血清で処理することにより得ることができる。血清による処理は、血清を基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。
　血清としては、異種血清および／または同種血清を用いることができる。異種血清は、シート状細胞培養物を移植に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種他家血清を非自己血清と総称することもある。
　基材をコートするための血清は、市販されているか、または、所望の生物から採取した血液から定法により調製することができる。具体的には、例えば、採取した血液を室温で約２０分～約６０分程度放置して凝固させ、これを約１０００×ｇ～約１２００×ｇ程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。
　基材上でインキュベートする場合、血清は原液で用いても、希釈して用いてもよい。希釈は、任意の媒体、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７など）等で行うことができる。希釈濃度は、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０．５％～約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１％～約６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約５％～約４０％（ｖ／ｖ）である。
　インキュベート時間も、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約１時間～約７２時間、好ましくは約２時間～約４８時間、より好ましくは約２時間～約２４時間、さらに好ましくは約２時間～約１２時間である。インキュベート温度も、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０℃～約６０℃、好ましくは約４℃～約４５℃、より好ましくは室温～約４０℃である。
　インキュベート後に血清を廃棄してもよい。血清の廃棄手法としては、ピペットなどによる吸引や、デカンテーションなどの慣用の液体廃棄手法を用いることができる。本開示の好ましい態様においては、血清廃棄後に、基材を無血清洗浄液で洗浄してもよい。無血清洗浄液としては、血清を含まず、基材に付着した血清成分に悪影響を与えない液体媒体であれば特に限定されず、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７など）等で行うことができる。洗浄手法としては、慣用の基材洗浄手法、例えば、限定することなく、基材上に無血清洗浄液を加えて所定時間（例えば、約５秒～約６０秒間）撹拌後、廃棄する手法などを用いることができる。
　本開示において、基材を、成長因子でコートしてもよい。ここで、「成長因子」は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。成長因子による基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、例えば、約０．０００１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０００５μｇ／ｍＬ～約０．０５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ～約０．０１μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
　本開示において、基材を、ステロイド剤でコートしてもよい。ここで「ステロイド剤」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。ステロイド剤による基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、デキサメタゾンとして、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
　基材は、血清、成長因子およびステロイド剤のいずれか１つでコートしても、これらの任意の組合わせ、すなわち、血清と成長因子、血清とステロイド剤、血清と成長因子とステロイド剤、または、成長因子とステロイド剤の組合わせでコートしてもよい。複数の成分でコートする場合、これらの成分を混合して同時にコートしてもよいし、別々のステップでコートしてもよい。
　基材は、血清等でコートした後直ちに細胞を播種してもよいし、コートした後に保存しておき、その後細胞を播種することもできる。コートした基材は、例えば約４℃以下、好ましくは約－２０℃以下、より好ましくは約－８０℃以下に保つことにより長期間保存することができる。
　基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
　一態様において、播種は、約７．１×１０５個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．３×１０５個／ｃｍ２～約２．８×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２～約２．５×１０６個／ｃｍ２、約７．８×１０５個／ｃｍ２～約２．３×１０６個／ｃｍ２、約８．０×１０５個／ｃｍ２～約２．０×１０６個／ｃｍ２、約８．５×１０５個／ｃｍ２～約１．８×１０６個／ｃｍ２、約９．０×１０５個／ｃｍ２～約１．６×１０６個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約１．６×１０６個／ｃｍ２などの密度で行うことができる。
　本発明のさらに別の側面は、末梢動脈疾患を処置するための、骨格筋芽細胞を含む細胞培養物と細胞外マトリクスとを含む、医薬組成物に関する。
　本発明の医薬組成物は、本発明の細胞培養物に加えて、細胞外マトリクスなどの種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本発明の医薬組成物は、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。一態様において、本発明の医薬組成物は、下肢の疾患の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織や疾患は、本発明の細胞培養物について上記したとおりである。
　本発明の医薬組成物において、細胞培養物と細胞外マトリクスとは別々に調製され、同時に投与されてもよい。本発明の医薬組成物において、細胞培養物は、上記の細胞培養物を用いることができるが、投与部位に接着するのに十分な量の細胞外マトリクスと併せて用いられる限り、シングルセルを用いてもよい。ここで、シート状細胞培養物の破砕片を投与する場合には、シート状細胞培養物を作成する際の基材との接着面に、虚血部位に接着するのに十分な量の細胞マトリクスが形成されているので、別途、細胞外マトリクスを投与する必要はない。スフェロイドである細胞培養物を投与する場合には、同数の細胞から形成されるシート状細胞培養物に含まれる細胞外マトリクスの量に対して不足している量を投与すればよく、例えば、スフェロイド細胞培養物がシート状細胞培養物の半分の量の細胞外マトリクスを有している場合、残り半分に該当する量を投与すればよい。細胞外マトリクスは、市販されており（例えば、Advanced BioMatrix社／ＶｉｔｒｏＣｏｌ（商標）ヒト由来Ｉ型コラーゲンなど）、これらを本発明の医薬組成物に使用することができる。
　本発明の別の側面は、対象において末梢動脈疾患を処置する方法であって、本発明の細胞培養物または医薬組成物の有効量をそれ必要とする対象に投与するステップを含む方法に関する。本発明の処置方法の対象となる組織や疾患は、本発明の細胞培養物について上記したとおりである。また、本発明の処置方法においては、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本発明の細胞培養物または医薬組成物と併用することができる。
　本発明において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。
　また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本発明において、「有効量」とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、細胞培養物に含まれる細胞数、細胞培養物のサイズ、重量など）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。一態様において、末梢動脈疾患を有するマウス疾患モデルに対して、合計７～１０×１０５個の細胞を、１個当たり約１０２～１０６個の細胞を含む細胞培養物の形態で投与することができる。別の態様において、末梢動脈疾患を有するヒトに対して、合計７～１０×１０６個の細胞を、１個当たり約１０２～１０６個の細胞を含む細胞培養物の形態で投与することができる。
　本発明のさらに別の側面は、末梢動脈疾患を処置するための方法であって、骨格筋芽細胞を含み、細胞外マトリクスを有する、シート状細胞培養物の破砕片または骨格筋芽細胞を含む細胞培養物と細胞外マトリクスとを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
　本発明の処置方法は、本発明の製造方法に従って、本発明のシート状細胞培養物の破砕片を製造するステップをさらに含んでもよい。本発明の処置方法は、シート状細胞培養物の破砕片を製造するステップの前に、対象からシート状細胞培養物の破砕片を製造するための細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物の破砕片または医薬組成物等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物の破砕片または医薬組成物等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物の破砕片または医薬組成物等の投与を受ける対象とは異種の個体である。
　投与方法としては、典型的には組織への直接的な適用が挙げられ、好ましくは、投与対象の筋肉組織への直接的な適用である。本発明の細胞培養物および医薬組成物は、シート状細胞培養物の断片を用いる場合には、注射による投与が可能な種々の経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、局所、動脈内、門脈内、心室内、腹腔内等の経路から投与してもよい。一態様において、投与方法は、投与対象の筋肉内への注射である。注射は、１回の処置において、複数箇所に分けて行われてもよい。
　投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。例えば、細胞外マトリクスを外表面に有する細胞培養物を投与する場合、複数個所に分けて注射してもよく、同一箇所に複数回注射してもよい。シングルセルと細胞外マトリクスを投与する場合、シングルセルと、細胞外マトリクスを別々に分けて１回ずつまたは複数回ずつ注射してもよく、シングルセルと細胞外マトリクスを混合したものを、１回または複数回、同一箇所または複数個所に注射してもよい。
例１．マウス由来骨格筋芽細胞シートの破砕片の作製
（１）マウス由来骨格筋芽細胞シートの作製
　４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア株式会社）の下肢から骨格筋を採取し、コラゲナーゼおよびトリプシンを含む溶液で処理し、単一の細胞に分散させた。かかる細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２０％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１３１培地でコンフルエントになるまで培養し、細胞を回収した。
　回収した細胞を、ＦＡＣＳを用いて測定した。測定結果を図１に示す。回収した細胞のうち９５％以上が、骨格筋芽細胞であった。
　回収した細胞を、１２穴の温度応答性培養容器（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、１２穴マルチウェル、ＣＳ３００３、株式会社セルシード）に７～１０×１０５／ｃｍ２の濃度で播種し、２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で６時間以上培養し、シート化を行った。その後、温度を２０℃まで下げることで、シート状細胞培養物を温度応答性培養容器から剥離させた。
　剥離したシート状細胞培養物を、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により、細胞核をヘマトキシリンで青紫色に、その他構造物をエオジンで種々の濃さの紅色に染色し、その断面を顕微鏡（２０倍）で観察を行った。また、別の剥離したシート状細胞培養物を、免疫染色により、細胞核を青色に、デスミンを緑色に染色し、その断面を顕微鏡（２０倍）で観察を行った。
　図２Ａに、シート状細胞培養物の写真を、図２Ｂに、ヘマトキシリン・エオジン染色したシート状細胞培養物の断面の顕微鏡写真を、図２Ｃに、免疫染色したシート状細胞培養物の断面の顕微鏡写真を示す。
（２）破砕片の作製
　（１）において染色に供していないシート状細胞培養物について、温度応答性培養容器から培地等を除去し、０．３ｍＬの生理食塩水を添加した。添加後、１．０ｍＬシリンジ（テルモ社製）および２３Ｇニードル（テルモ社製）を用いてシート状細胞培養物ごと生理食塩水を吸引、排出することを繰り返し、シート状細胞培養物を破砕し、生理食塩水に懸濁させた。懸濁液は、吸引・排出のセットを５回繰り返したものと、１０回繰り返したものをそれぞれ用意した。
　図３に、それぞれの懸濁液の顕微鏡写真を示す。図３Ａは、吸引・排出のセットを５回繰り返した懸濁液の写真であり、図３Ｂは、その拡大された顕微鏡写真である。図３Ｃは、吸引・排出のセットを５回繰り返した懸濁液の拡大された顕微鏡写真である。
　吸引・排出のセットを５回繰り返した懸濁液においては、約３００～５００μｍの破砕片が確認された。しかし、１０回繰り返した懸濁液においては、ほぼすべての細胞がシングルセルに近い形態であった。
　例１で得られた破砕物はシート状細胞培養物が培養基材に接着していた面に細胞外マトリクス（ＥＣＭ）が多く存在する破砕物であると考えられた。
例２．マウス虚血モデルにおける、シート状細胞培養物の破砕片の投与
（１）マウス虚血モデルの作製
　投与試験開始の７日前に、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア株式会社）の右後肢の大腿動脈以遠で結紮および血管切除した。結紮および血管切除を行う前に、レーザードップラー灌流イメージング（ＬＤＰＩ）により、健常な状態でのマウスの血流量を測定した。
（２）移植
　（１）において作製したマウス虚血モデルを各群１０匹ずつになるようランダムに３つの群に分けた。第１の群のマウスに対して、例１にて作製した、吸引・排出のセットを５回繰り返した懸濁液を注入した（以降、破砕片投与群と称する）。対照として、第２の群のマウスに対して、シート状細胞培養物に用いた細胞と同じ由来の細胞７～１０×１０５個を、培養することなくシングルセルの状態で０．３ｍＬの生理食塩水に懸濁させたものを注入し（以降、シングルセル投与群と称する）、第３の群のマウスに対して、０．３ｍＬの生理食塩水のみを注入した（以降、生理食塩水投与群と称する）。いずれの群のマウスにおいても、注入は、マウス虚血モデルの虚血肢の血管を取り除いた部分の筋中に、２か所に分けて行われた。
（３）試験計画
　試験は、注入した日を第０日として試験開始後の日数を数え、第２８日目まで実施された。それぞれのマウスについて、第０、７、１４、２１および２８日目にＬＤＰＩにより、血流量を測定した。また、第１、３、５、７および２８日目に、遺伝子の発現について確認するために、投与した部位の組織を採取した。それぞれの群のマウスから採取した組織中の遺伝子の発現についてＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
（４）結果
　マウス虚血モデル作製前の血流量を１００％とした、第０、７、１４、２１および２８日目における各群のマウスの血流量％のＬＤＰＩによる結果を、図４に示す。また、第７、１４、２１および２８日目のそれぞれの群の代表的なマウスのＬＤＰＩによるイメージングの結果を図５に示す。図４、図５ともに、図中のClustered cellsは、破砕片投与群のマウスを、Single cellsは、シングルセル投与群のマウスを、Salineは、生理食塩水投与群のマウスを示す。また、図４中＊は、生理食塩水投与群に対してダネット検定を行いＰ＜０．０５であったものを示す。
　図４に示すように、各群ともに第０日目においては、マウス虚血モデル作製時の２０％未満にまで血流量が下がっていたが、第７、１４、２１および２８日目には、破砕片投与群のマウスにおいて、生理食塩水投与群のマウスおよびシングルセル投与群のマウスと比べて、血流量の有意な改善が見られた。
　図５に示すように、破砕片投与群のマウスは、第７、１４、２１および２８日目のいずれの測定においても、生理食塩水投与群およびシングルセル投与群と比べて、より血流量が改善しており、健常状態にある左肢に近い状態となっていることが確認された。
　図６に示すように、シングルセル投与群のマウスから採取した組織および生理食塩水投与群のマウスから採取した組織と比べて、破砕片投与群のマウスから採取した組織において極めて高いレベルでＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２、ＳＤＦ－１、Ｐａｘ７、およびＭｙｏＤが発現していることが確認された。
例３．投与細胞の生着確認
（１）試験計画
　４週齢のＧＦＰ導入Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本エスエルシー株式会社）の下肢から骨格筋を採取し、例１と同様にして（同じ条件で）、シート状細胞培養物ごと生理食塩水を吸引、排出することを繰り返し、シート状細胞培養物を破砕し、生理食塩水に懸濁させて懸濁液を作製した。次いで、例２（１）と同様にしてマウス虚血モデルを作製し、３つの群に分けた。第１の群のマウスに対して、作製した懸濁液を注入した（以降、破砕片投与群２と称する）。対照として、第２の群のマウスに対して、ＧＦＰ導入Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下肢から採取した骨格筋の細胞７～１０×１０５個を、培養することなくシングルセルの状態で０．３ｍＬの生理食塩水に懸濁させたものを注入し（以降、シングルセル投与群２と称する）、第３の群のマウスに対して、０．３ｍＬの生理食塩水のみを注入した（以降、生理食塩水投与群２と称する）。いずれの群のマウスにおいても、注入は、マウス虚血モデルの虚血肢の血管を取り除いた部分の筋中に、２か所に分けて行われた。
　注入した日を第０日として試験開始後の日数を数え、第１、３、５、７および２８日目にそれぞれの群のマウスを屠殺し、内転筋を採取した。それぞれのマウスの採取した内転筋から得た組織の一部については、ホルマリン溶液にて固定後にヘマトキシリン―エオジン染色を行い、別の一部については、パラホルムアルデヒド溶液にて固定後に凍結標本を作製した。ヘマトキシリン―エオジン染色したそれぞれの組織については、中心に核がある筋線維（新生筋線維）および辺縁に核のある成熟した筋線維の数をカウントした。凍結標本については、ＧＦＰのエリアを確認した。第３日目にそれぞれの群のマウスから採取した組織においてはさらに、embryonic MHC陽性である細胞の数をカウントした。
（２）結果
　第３、５、７および２８日目における、破砕片投与群２、シングルセル投与群２、生理食塩水投与群２のそれぞれのマウスから採取した組織のヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真を示す。図中のClustered cellsは、破砕片投与群２のマウスを、Single cellsは、シングルセル投与群２のマウスを、Salineは、生理食塩水投与群２のマウスを図７に示す。また、ヘマトキシリン・エオジン染色したそれぞれの組織における、中心に核がある筋線維（新生筋線維）の数をカウントした結果を図８Ａに、ヘマトキシリン・エオジン染色したそれぞれの組織における、中心に核がある筋線維（新生筋線維）の数と辺縁に核のある成熟した筋線維の数との比率を算出した結果を図８Ｂに示す。また、図中＊は、生理食塩水投与群２に対してダネット検定を行いＰ＜０．０５であったもの、図中＋は、シングルセル投与群２に対してダネット検定を行いＰ＜０．０５であったものを示す。第３日目における、破砕片投与群２、シングルセル投与群２、生理食塩水投与群２のそれぞれのマウスから採取した組織中のembryonic MHC陽性である細胞数をカウントした結果を図８Ｃに示す。
　図８Ａおよび図８Ｂに示すように、第２８日目に破砕片投与群２のマウスは、筋新生がほぼ終了しているのに対して、シングルセル投与群２および生理食塩水投与群２においては、筋新生が継続していることから、破砕片投与群２のマウスにおいては、早期に筋新生が起こっていることが確認された。図８Ｃに示すように、第３日目においてembryonic MHC陽性である細胞数が、シングルセル投与群２、生理食塩水投与群２のマウスから採取した組織中に比べて、破砕片投与群２のマウスから採取した組織中で著しく多く存在していることが確認された。
　第７日目における、破砕片投与群２、シングルセル投与群２それぞれのマウスから採取した組織の凍結標本の顕微鏡写真を図９に示す。
　図９に示すように、シングルセル投与群２のマウスから採取した組織の標本と比べて、破砕片投与群２のマウスから採取した組織の標本の方がＧＦＰのエリアが広いことが確認された。

Claims (12)

  1. 　下肢の疾患を処置するための１００～５００μｍの大きさを有する細胞培養物であって、該細胞培養物の外表面に細胞外マトリクスを有する、前記細胞培養物。
  2. 　血管新生を促進するための、請求項１に記載の細胞培養物。
  3. 　骨格筋芽細胞を含む、請求項１または２に記載の細胞培養物。
  4. 　細胞培養物がシート状細胞培養物の破砕片である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  5. 　下肢の疾患が末梢動脈疾患である、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  6. 　細胞外マトリクスを有する、シート状細胞培養物の破砕片。
  7. 　シート状細胞培養物の破砕片を作製するための方法であって、以下：
    基材上に細胞を播種するステップ、
    播種した細胞をシート化するステップ、および
    形成されたシート状細胞培養物を破砕するステップ、
    を含む、前記方法。
  8. 　シート状細胞培養物の破砕が、シリンジを用いて４～６回懸濁することである、請求項７に記載の方法。
  9. 　末梢動脈疾患を処置するための、骨格筋芽細胞を含む細胞培養物と細胞外マトリクスとを含む医薬組成物。
  10. 　末梢動脈疾患を処置するための方法であって、骨格筋芽細胞を含み、細胞外マトリクスを有する、シート状細胞培養物の破砕片を投与することを含む、前記方法。
  11. 　末梢動脈疾患を処置するための方法であって、骨格筋芽細胞を含む細胞培養物と細胞外マトリクスとを含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  12. 　投与が、筋肉内への投与である、請求項１０または１１に記載の方法。
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