WO2021075525A1 - 炎症性疾患を処置するための細胞培養物 - Google Patents

炎症性疾患を処置するための細胞培養物 Download PDF

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WO2021075525A1
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cells
sheet
cell
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文哉 大橋
匡記 松村
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テルモ株式会社
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    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention used a cell culture containing cells derived from skeletal muscle, a method for producing the cell culture, a kit for producing the cell culture, and the cell culture for treating an inflammatory disease. Regarding treatment methods for inflammatory diseases.
  • Non-Patent Document 1 fetal cardiomyocytes, skeletal myoblasts, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells, iPS cells, etc. for repair of myocardial tissue damaged by ischemic heart disease such as angina and myocardial infarction.
  • Patent Document 1 sheet-like cell cultures
  • Patent Document 2 sheet-like cell culture containing adipocytes
  • Inflammatory bowel disease is an intractable disease consisting mainly of Crohn's disease and ulcerative colitis, for which the cause of its onset is not clear.
  • Currently, as a method for treating these diseases administration of steroids, immunosuppressants, anti-TNF- ⁇ antibody preparations and the like is being carried out.
  • As a new therapeutic method for inflammatory bowel disease a method of administering mesenchymal stem cells having various actions such as tissue differentiation, angiogenesis, and regulation of immune function has been proposed.
  • a method of intravenously injecting or intralymphatic administration of mesenchymal stem cells or adipose stem cells to an animal model of enteritis or rheumatoid arthritis (Patent Documents 3 to 5), and using a culture supernatant of mesenchymal stem cells as a rat model of enteritis.
  • Known methods include intestinal injection or intravenous injection (Patent Documents 6 and 7), and a method of regulating peripheral immune response by gene-introduced mesenchymal stem cells (Patent Document 8).
  • the present invention used a cell culture containing cells derived from skeletal muscle, a method for producing the cell culture, a kit for producing the cell culture, and the cell culture for treating an inflammatory disease.
  • the purpose is to provide a method for treating inflammatory diseases.
  • mesenchymal stem cells suitable for the administration target in an amount that can be administered as a drug, and mesenchymal stem cells are intravenously arranged. Problems such as insufficient engraftment at a desired site when injected or intralymphatic administration remain.
  • the present inventors have found that the culture supernatant of a sheet containing cells derived from skeletal muscle contains a component useful for the treatment of inflammatory bowel disease such as myokine, and further research is conducted based on this finding. As a result of continuing, the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following.
  • [1] A cell culture containing cells derived from skeletal muscle for treating an inflammatory disease.
  • [2] The cell culture according to [1], wherein the cell culture is a sheet-like cell culture.
  • [3] The cell culture according to [1] or [2], which secretes myokine.
  • [4] The cell culture according to any one of [1] to [3], wherein the inflammatory disease is an inflammatory disease occurring in the lower gastrointestinal tract.
  • [5] The cell culture according to any one of [1] to [4], wherein the inflammatory disease is an inflammatory bowel disease.
  • [6] The cell culture according to any one of [1] to [5] for transplantation to the serosal side of the gastrointestinal tract.
  • [7] The method for producing a sheet-shaped cell culture according to any one of [2] to [6]. Seeding cells on a substrate, The method described above comprising sheeting the seeded cells and exfoliating the formed sheet cell culture from the substrate
  • the method for treating an inflammatory disease which comprises transplanting a cell culture containing cells derived from skeletal muscle. [10] The method according to [9], wherein the cell culture is a sheet-like cell culture. [11] The method according to [9] or [10], wherein the cell culture secretes myokine. [12] The method according to any one of [9] to [11], wherein the inflammatory disease is an inflammatory disease occurring in the lower gastrointestinal tract. [13] The method according to any one of [9] to [12], wherein the inflammatory disease is an inflammatory bowel disease. [14] The method according to any one of [9] to [13], wherein the transplantation of the cell culture is the transplantation to the serosa side of the gastrointestinal tract.
  • the healing of inflammatory diseases can be promoted by transplanting a cell culture containing cells derived from skeletal muscle.
  • FIG. 1 shows the amount of various cytokines contained in the culture supernatant of a sheet-like cell culture containing human skeletal myoblasts measured using the Bio-Plex TM multi-system.
  • FIG. 2 shows a plan for a transplantation study in a mouse colitis model. Group A refers to the follow-up group, and group B refers to the test group. Free drinking of 2% DSS (sodium dextran sulfate) was performed in both groups from the start date of the test to the 4th day. The thin arrow in the figure indicates the day when the sheet-shaped cell culture was transplanted, and the thick arrow indicates the day when the autopsy was performed.
  • DSS sodium dextran sulfate
  • FIG. 3 is a photograph of tissues collected from mice in the sheet-shaped cell culture transplantation group and mice in the sham surgery group by autopsy on the 31st day after the start of the test.
  • A is a photograph of the lower gastrointestinal tract taken from the mouse of the sheet-shaped cell culture transplantation group
  • B is a photograph of the gastrointestinal lining confirmed by cutting open the lower gastrointestinal tract.
  • C is a photograph of the lower gastrointestinal tract taken from the mice in the sham operation group
  • (D) is a photograph of the endometrium of the lower gastrointestinal tract confirmed by cutting the lower gastrointestinal tract.
  • FIG. 4 shows images of colon tissue of mice in the sheet-like cell culture transplantation group and mice in the sham surgery group obtained by autopsy on the 31st day after the start of the test.
  • FIG. 4A is an image of a cross section of the colon tissue of mice in the sheet-shaped cell culture transplantation group autopsied 31 days after the start of the test.
  • FIG. 4B is a magnified image of the portion surrounded by the broken line in FIG. 4A.
  • FIG. 4C is an image of a cross section of colon tissue of mice in the sham-operated group autopsied 31 days after the start of the test.
  • FIG. 4D is a magnified image of the portion surrounded by the broken line in FIG. 4C.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in body weight between the sheet-shaped cell culture transplantation group and the sham surgery group.
  • the squares indicate the sham surgery group, and the black circles indicate the sheet-shaped cell culture transplantation group.
  • the vertical axis shows the weight of the mouse, and the horizontal axis shows the number of days elapsed in the test. On the 11th day after the start of the test, transplantation of the sheet-shaped cell culture was carried out.
  • FIG. 6 is a graph showing the changes in body weight based on the body weight of each mouse on the 11th day after the start of the test in the sheet-shaped cell culture transplant group and the sham operation group.
  • the squares indicate the sham surgery group, and the black circles indicate the sheet-shaped cell culture transplantation group.
  • FIG. 7 is a graph showing inflammation scores in mice in the sheet-shaped cell culture transplantation group and the sham surgery group.
  • the vertical axis shows the value of inflammation score (DAI), and the horizontal item axis shows the date when the score was measured.
  • the squares indicate the sham surgery group, and the black circles indicate the sheet-shaped cell culture transplantation group.
  • an inflammatory disease is a disease characterized by inflammatory symptoms.
  • inflammatory diseases include, but are not limited to, systemic or local inflammatory diseases such as allergic or immune complex diseases, Crohn's disease, ulcerative, acute or ischemic colitis, intestinal Bechet's disease.
  • Gastrointestinal disorders such as diverticulitis or cholecystitis, skin-related disorders such as dermatitis, cardiovascular disorders such as endocarditis, myocarditis, asthma, tuberculosis, bronchial dilatation or chronic obstructive disease (COPD)
  • COPD chronic obstructive disease
  • Respiratory diseases such as, rheumatoid arthritis, myelitis, connective tissue-related diseases such as myelitis, urogenital diseases such as nephritis, nervous system-related diseases such as meningitis, encephalitis or polysclerosis, viruses , Diseases caused by infections such as fungi or microorganisms, autoimmune diseases such as thyroiditis, and cancer.
  • inflammatory disease refers specifically to those resulting from the abnormal release of inflammatory cytokines.
  • the inflammatory disease in the present invention refers to an inflammatory bowel disease.
  • cell culture refers to a composition obtained through a cell culture step.
  • the cell culture of the present invention is a sheet-like cell culture.
  • the "sheet-like cell culture” refers to cells connected to each other to form a sheet.
  • the cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the mediator is preferably derived from cells, particularly from the cells that make up the cell culture.
  • the cells are at least physically (mechanically) connected, but may be more functionally, for example, chemically or electrically connected.
  • the sheet-like cell culture may be composed of one cell layer (single layer) or two or more cell layers (laminated (multilayer) body, for example, two layers, three layers, etc. It may be 4 layers, 5 layers, 6 layers, etc.). Further, the sheet-shaped cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one cell without showing a clear layered structure of the cells. For example, in the vertical cross section of a sheet-shaped cell culture, cells may be present in a non-uniformly (for example, mosaic-like) arrangement without being uniformly aligned in the horizontal direction.
  • a non-uniformly for example, mosaic-like
  • the sheet-like cell culture preferably does not contain a scaffold (support). Scaffolds may be used in the art to attach cells to and / or inside the surface and maintain the physical integrity of sheet cell cultures, such as polyvinylidene difluoride. Although membranes made of PVDF) and the like are known, the sheet-shaped cell cultures of the present disclosure can maintain their physical integrity even in the absence of such scaffolds.
  • the sheet-shaped cell culture of the present disclosure preferably comprises only the cell-derived substances constituting the sheet-shaped cell culture, and does not contain any other substances.
  • the cell culture contains cells derived from skeletal muscle.
  • skeletal muscle-derived cells refer to satellite cells, skeletal myoblasts, skeletal muscle cells, skeletal myotubes, and skeletal muscle fibers.
  • the cell derived from skeletal muscle is skeletal myoblast.
  • the cells constituting the cell culture of the present invention are 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% of cells derived from skeletal muscle. It contains the above, preferably 60% or more.
  • Skeletal myoblasts are well known in the art, and can be prepared from skeletal muscle by any known method (for example, the method described in JP-A-2007-89442), for example, Lonza Japan. Catalog number of the corporation: CC-2580, product code 3520 of Cosmo Bio Co., Ltd., etc. can also be obtained commercially. Skeletal myoblasts are, but are not limited to, CD56, ⁇ 7 integrin, myosin heavy chain IIa, myosin heavy chain IIb, myosin heavy chain IId (IIx), MyoD, Myf5, Myf6, myogenin, desmin, PAX3. It can be identified by markers such as. In one embodiment, skeletal myoblasts are CD56 positive. In one embodiment, skeletal myoblasts are CD56 positive and desmin positive.
  • the prepared cell population includes fibroblasts.
  • the cell population contains a certain amount of fibroblasts.
  • Fibroblasts are well known in the art and are TE-7 (eg Rosendal et al., J Cell Sci. 1994; 107 (Pt1): 29-37, Goodpaster et al. J Histochem Cytochem. 2008; It can be identified by markers such as 56 (4): 347-358, etc.).
  • the cells constituting the cell culture of the present invention include skeletal myoblasts prepared from striated muscle tissue.
  • the cell population used in the production of the cell culture of the present invention may include skeletal myoblasts and fibroblasts.
  • the cell population used in the production of the cell culture of the present invention has a CD56 positive rate of 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more. , 90% or more, preferably 60% or more.
  • the cell population used in the production of the cell culture of the present invention may contain fibroblasts, but if the content of fibroblasts is too high, the content of skeletal myoblasts decreases, which is not preferable. Therefore, in one embodiment, the cell population used in the production of the cell culture of the present invention has a TE-7 positive rate of 50% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less. It can be 15% or less, 10% or less, preferably 40% or less.
  • the cell population used in the production of the cell culture of the present invention may include cells other than skeletal myoblasts and fibroblasts, but the smaller the number of such cells, the more preferable.
  • the total value of the CD56 positive rate and the TE-7 positive rate is preferably high, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99. % Or more, preferably 90% or more.
  • cytokines are secreted from cell cultures containing cells derived from skeletal muscle.
  • cytokines secreted from cell cultures containing cells derived from skeletal muscle are generally referred to as myokines, and are not limited to, for example, IL-1b and IL.
  • the thickness of the sheet-shaped cell culture is not particularly limited.
  • the thickness is usually one cell or more, and the thickness varies depending on the type of cells forming the sheet of the sheet-shaped cell culture.
  • the sheet-like cell culture of the present invention has a thickness of 30 ⁇ m or more, and in a preferred embodiment, it has a thickness of 50 ⁇ m or more.
  • the range of values for the sheet-like cell material of the present invention includes, for example, 30 ⁇ m to 200 ⁇ m, preferably 50 ⁇ m to 150 ⁇ m, and more preferably 60 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the thickness does not exceed the thickness of the single-layer sheet x the number of laminated sheets. Therefore, for example, when a sheet in which five single-layer sheets are stacked is used as one embodiment, the thickness thereof is 150 ⁇ m or more, and in a preferred embodiment, the thickness is 250 ⁇ m or more. In that case, the range of values of the sheet-like cell material is, for example, 150 ⁇ m to 1000 ⁇ m, preferably 250 ⁇ m to 750 ⁇ m, and more preferably 300 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the cells that make up the cell culture can be derived from any organism that is treated with the cell culture, such as, but not limited to, humans, primates, dogs, cats, pigs. , Horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, etc. Further, the cells constituting the cell culture may be only one type, but two or more types of cells can also be used. In a preferred embodiment of the present invention, when there are two or more types of cells constituting the cell culture, the content ratio (purity) of the most abundant cells is 60% or more, preferably 70% or more at the end of cell culture production. , More preferably 75% or more.
  • the cell may be a heterologous cell or an allogeneic cell.
  • heterologous cell means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the cell culture is used for transplantation.
  • cells derived from monkeys and pigs correspond to heterologous cells.
  • homoogeneous cell means a cell derived from an organism of the same species as the recipient.
  • the human cell corresponds to an allogeneic cell. Allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), ie, recipient-derived cells and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells).
  • Autologous cells are preferred in the present disclosure because they do not cause rejection when transplanted. However, it is also possible to utilize heterologous cells and allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection.
  • cells other than autologous cells that is, allogeneic non-self-derived cells and allogeneic non-self-derived cells may be collectively referred to as non-autologous cells.
  • the cell is an autologous cell or an allogeneic cell.
  • the cell is an autologous cell.
  • the cell is an allogeneic cell.
  • the sheet-like cell culture when the cell culture is a sheet-like cell culture, the sheet-like cell culture can be obtained by any method known to those skilled in the art (for example, Patent Document 1, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-081829, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-). (See 110368, etc.).
  • the method for producing a sheet-shaped cell culture typically includes a step of seeding cells on a substrate, a step of forming the seeded cells into a sheet, and a step of peeling the formed sheet-shaped cell culture from the substrate. Including, but not limited to. Prior to the step of seeding the cells on the substrate, a step of freezing the cells and a step of thawing the cells may be performed.
  • a step of washing the cells may be performed after the step of thawing the cells.
  • the production method of the present disclosure may include a step of producing a sheet-shaped cell culture, in which case the step of producing the sheet-shaped cell culture is a step relating to the above-mentioned method for producing a sheet-shaped cell culture as a sub-step. It may contain 1 or 2 or more of. In one embodiment, it does not include the step of growing the cells after the step of thawing the cells and before the step of seeding the cells on a substrate.
  • the cell culture of the present invention cells are joined to each other via an extracellular matrix produced by the cells constituting the cell culture.
  • the cell culture of the present invention comprises extracellular matrix.
  • the extracellular matrix produced by the cells constituting the cell culture depends on various conditions, for example, 24 hours or more after seeding of the cells, for example, 24 hours, 30 hours, 36 hours, 42 hours. , 48 hours, 54 hours, 60 hours, 66 hours, 72 hours by culturing.
  • the extracellular matrix contributes to the adhesion of the cell culture to the transplant site and can simplify the steps of adhering the cell culture to the transplant site, such as suturing, when the cell culture is transplanted. ..
  • the extracellular matrix is a cell-derived component, there is no problem in using it for transplantation together with the cell culture according to the present invention.
  • the base material is not particularly limited as long as the cells can form a cell culture on it, and includes, for example, a container of various materials, a solid or semi-solid surface in the container, and the like.
  • the container preferably has a structure / material that does not allow a liquid such as a culture solution to permeate.
  • Such materials include, without limitation, for example, polyethylene, polypropylene, Teflon®, polyethylene terephthalate, polymethylmethacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethyl.
  • Acrylamide, metals (eg, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass) and the like can be mentioned.
  • the container preferably has at least one flat surface.
  • Examples of such a container include, without limitation, a culture container having a bottom surface made of a base material capable of forming a cell culture and a liquid-impermeable side surface.
  • a culture vessel include, but are not limited to, a cell culture dish, a cell culture bottle, and the like.
  • the bottom surface of the container may be transparent or opaque. If the bottom surface of the container is transparent, cells can be observed and counted from the back side of the container.
  • the container may have a solid or semi-solid surface inside the container. Examples of the solid surface include plates and containers of various materials as described above, and examples of the semi-solid surface include gels and soft polymer matrices.
  • the base material may be produced using the above materials, or a commercially available material may be used.
  • Preferred substrates include, without limitation, for example, substrates with an adhesive surface suitable for the formation of sheet cell cultures.
  • a base material having a hydrophilic surface for example, a base material coated with a hydrophilic compound such as corona discharge-treated polystyrene, collagen gel or hydrophilic polymer, and further, collagen, vitronectin, laminin. , Vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan and other extracellular matrices, and base materials coated with cell adhesion factors such as cadoherin family, selectin family and integrin family on the surface.
  • a base material is commercially available (for example, Corning (registered trademark) TC-Treated Culture Dish, Corning, etc.).
  • the substrate may be transparent or opaque in whole or in part.
  • the surface of the base material may be coated with a material whose physical properties change in response to a stimulus, for example, temperature or light.
  • a material whose physical properties change in response to a stimulus, for example, temperature or light.
  • Such materials include, but are not limited to, for example, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, etc.
  • Known materials such as a copolymer with a body and a photoresponsive material such as N-isopropylacrylamide gel containing spirobenzopyran can be used (see, for example, JP-A-2-21186 and JP-A-2003-33177). ).
  • a predetermined stimulus By giving a predetermined stimulus to these materials, their physical characteristics, for example, hydrophilicity and hydrophobicity can be changed, and the exfoliation of the cell culture adhering on the material can be promoted.
  • Culture dishes coated with a temperature-responsive material are commercially available (eg, CellSeed, Inc.'s UpCell® and DIC Corporation's Petri dish®), which are used in the production methods of the present disclosure. can do.
  • the base material may have various shapes, but is preferably flat.
  • the area thereof is not particularly limited, but may be, for example, about 1 cm 2 to about 200 cm 2 , about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , about 3 cm 2 to about 50 cm 2 .
  • a circular culture dish having a diameter of 10 cm can be mentioned as a base material.
  • the area is 56.7 cm 2 .
  • the substrate may be coated (coated or coated) with serum. By using a serum-coated substrate, a higher density sheet-like cell culture can be formed.
  • Coated with serum means a state in which serum components are attached to the surface of the base material. Such a state can be obtained without limitation, for example, by treating the substrate with serum. Treatment with serum involves contacting the serum with the substrate and, if necessary, incubating for a predetermined period of time.
  • heterologous serum means serum derived from an organism of a different species from its recipient when the sheet cell culture is used for transplantation.
  • serum derived from bovine or horse for example, fetal bovine serum (FBS, FCS), calf serum (CS), horse serum (HS), etc. corresponds to heterologous serum.
  • homologous serum means serum derived from an organism of the same species as the recipient. For example, if the recipient is human, human serum corresponds to allogeneic serum.
  • Allogeneic sera include autologous sera (also referred to as autologous sera), that is, sera derived from the recipient and allogeneic sera derived from allogeneic individuals other than the recipient.
  • autologous sera also referred to as autologous sera
  • sera other than autologous serum that is, allogeneic serum and allogeneic serum may be collectively referred to as non-autologous serum.
  • Serum for coating the substrate can be commercially available or prepared by routine from blood collected from the desired organism. Specifically, for example, a method in which the collected blood is left at room temperature for about 20 minutes to about 60 minutes to coagulate, and this is centrifuged at about 1000 ⁇ g to about 1200 ⁇ g, and the supernatant is collected. And so on.
  • serum When incubating on a substrate, serum may be used as a stock solution or diluted. Dilution can be made in any medium, such as, but not limited to, water, saline, various buffers (eg, PBS, HBSS, etc.), various liquid media (eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, etc.). It can be performed in DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, etc.).
  • MCDB MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.
  • L15 SkBM, RITC80-7, etc.
  • the dilution concentration is not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, and is, for example, about 0.5% to about 100% (v / v), preferably about 1% to about 60% (v / v). v), more preferably about 5% to about 40% (v / v).
  • the incubation time is also not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, for example, about 1 hour to about 72 hours, preferably about 2 hours to about 48 hours, more preferably about 2 hours to about 24 hours. The time, more preferably about 2 hours to about 12 hours.
  • the incubation temperature is also not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, for example, at about 0 ° C. to about 60 ° C., preferably about 4 ° C. to about 45 ° C., more preferably room temperature to about 40 ° C. is there.
  • Serum may be discarded after incubation.
  • a serum disposal method suction with a pipette or the like or a conventional liquid disposal method such as decantation can be used.
  • the substrate may be washed with a serum-free wash after serum disposal.
  • the serum-free cleaning solution is not particularly limited as long as it is a liquid medium that does not contain serum and does not adversely affect the serum components adhering to the substrate.
  • various liquid media eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, etc.
  • the cleaning method include a conventional substrate cleaning method, for example, a method in which a serum-free cleaning solution is added onto the substrate, stirred for a predetermined time (for example, about 5 seconds to about 60 seconds), and then discarded without limitation. Can be used.
  • the substrate may be coated with a growth factor.
  • growth factor means any substance that promotes cell growth as compared to its absence, eg, epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblasts. Includes cell growth factor (FGF) and the like.
  • the dilution concentration during incubation is, for example, about 0.0001 ⁇ g / mL to about 1 ⁇ g / mL, preferably about 0.0005 ⁇ g / mL to about 0.05 ⁇ g. It is basically the same as serum except that it is / mL, more preferably about 0.001 ⁇ g / mL to about 0.01 ⁇ g / mL.
  • the base material may be coated with a steroid agent.
  • the "steroid agent” refers to a compound having a steroid nucleus that can adversely affect the living body such as adrenocortical insufficiency and Cushing's syndrome.
  • Such compounds include, but are not limited to, for example, cortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone and the like.
  • the dilution concentration at the time of incubation is, for example, about 0.1 ⁇ g / mL to about 100 ⁇ g / mL, preferably about 0.4 ⁇ g / mL to about as dexamethasone. It is basically the same as serum except that it is 40 ⁇ g / mL, more preferably about 1 ⁇ g / mL to about 10 ⁇ g / mL.
  • the substrate may be coated with any one of serum, growth factors and steroids and any combination of these, ie serum and growth factors, serum and steroids, serum and growth factors and steroids, or , May be coated with a combination of growth factors and steroids.
  • these components may be mixed and coated at the same time, or may be coated in separate steps.
  • the base material may be seeded with cells immediately after being coated with serum or the like, or may be stored after being coated and then seeded with cells.
  • the coated substrate can be stored for a long period of time, for example, by keeping it at about 4 ° C. or lower, preferably about ⁇ 20 ° C. or lower, more preferably about ⁇ 80 ° C. or lower.
  • the present invention is a cell culture for treating an inflammatory disease occurring in the lower gastrointestinal tract.
  • the lower gastrointestinal tract refers to the small intestine and the large intestine.
  • the small intestine includes the empty intestine and the circumflex
  • the large intestine includes the appendix, the cecum, the ascending colon, the transverse colon, the descending colon, the sigmoid colon, the upper rectum, the upper rectum, the lower rectum, and the anal canal.
  • Inflammatory diseases occurring in the lower part of the gastrointestinal tract include, but are not limited to, inflammation caused by malignant tumors such as small intestine cancer and colon cancer, infectious enterocolitis, diverticulitis, and inflammatory bowel disease.
  • the present invention is a cell culture for treating inflammatory bowel disease.
  • the inflammatory bowel disease refers to an inflammatory disease in the chronic or remission / relapsed intestinal tract, and specifically refers to ulcerative colitis, Crohn's disease, intestinal Behcet's disease, and the like.
  • the cell culture according to the present invention is transplanted to the serosal side of the gastrointestinal tract, that is, to the outside of the gastrointestinal tract.
  • the cell culture may be transplanted away from the inflamed site as long as the effects of the present invention are exhibited, but all or part of the cell culture corresponds to the inflamed site. It is preferable to transplant at the opposite positions across the muscle layer. In one aspect, it may be implanted on the serosal side of the gastrointestinal tract except for the location corresponding to the site of inflammation.
  • the cell culture comprises extracellular matrix.
  • the cell culture of the present invention is a sheet-like cell culture.
  • one cell culture When there are a plurality of inflamed sites, one cell culture may be transplanted, or a plurality of cell cultures may be transplanted depending on the number of inflamed sites. ..
  • the plurality of cell cultures When transplanting a plurality of cell cultures, the plurality of cell cultures may be independently transplanted away from the inflamed site as long as the effects of the present invention are exhibited, but all or one of them may be transplanted. It is preferable that the part is transplanted at the opposite position across the muscle layer corresponding to the site where the inflammation is occurring.
  • the form is not particularly limited, but the form of a sheet-like cell culture is preferable.
  • the cell culture according to the present invention secretes myokine.
  • the cell culture according to the present invention secretes myokine even in the form of a sheet-like cell culture.
  • Inflammatory diseases can also be treated by transplanting a sheet-like cell culture that secretes myokine into a subject having an inflammatory disease.
  • the action of the cell culture according to the present invention on inflammatory diseases is that the cells at the site where myokine secreted from the cell culture according to the present invention is inflamed.
  • the cell culture according to the present invention contains an extracellular matrix, the engraftment property of the cell culture to the transplant site is increased, and more myokine secreted from the cell culture is produced. By doing so, it is considered that it acts efficiently on the cells at the site of inflammation.
  • Another aspect of the invention treats inflammatory diseases, including seeding cells on a substrate, sheeting the seeded cells, and stripping the formed sheet cell culture from the substrate.
  • the present invention relates to a method for producing a sheet-like cell culture containing cells derived from skeletal muscle.
  • the sheet-like cell culture can be any known known, including seeding cells on the above substrate, sheeting the seeded cells, and stripping the formed sheet-like cell culture from the substrate. It can be manufactured by the method.
  • the sheet-shaped cell culture can be produced by any method known to those skilled in the art (see, for example, Patent Document 1, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-081829, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-110368, etc.). ..
  • the method for producing a sheet-shaped cell culture typically includes a step of seeding cells on a substrate, a step of forming the seeded cells into a sheet, and a step of peeling the formed sheet-shaped cell culture from the substrate. Including, but not limited to. Seeding of cells on a substrate can be performed by any known method and condition.
  • the seeding of cells on a base material may be carried out, for example, by injecting a cell suspension in which cells are suspended in a culture solution into a base material (culture container).
  • a cell suspension in which cells are suspended in a culture solution into a base material (culture container).
  • an instrument suitable for the injection operation of the cell suspension such as a dropper or a pipette, can be used.
  • the seeding is about 7.1 ⁇ 10 5 pcs / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 pcs / cm 2 , about 7.3 ⁇ 10 5 pcs / cm 2 to about 2.8 ⁇ 10 6 Pieces / cm 2 , about 7.5 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.5 x 10 6 pieces / cm 2 , about 7.8 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.3 x 10 6 pieces / cm cm 2 , about 8.0 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.0 x 10 6 pieces / cm 2 , about 8.5 x 10 5 pieces / cm 2 to about 1.8 x 10 6 pieces / cm 2 , Approximately 9.0 x 10 5 pcs / cm 2 to Approximately 1.6 x 10 6 pcs / cm 2 , Approximately 1.0 x 10 6 pcs / cm 2 to Approximately 1.6 x 10 6 pcs / cm 2 etc. It can be done with density
  • kits for producing a cell culture containing the mixture are not limited to these, and may further include, for example, a washing solution, a buffer solution, a tube, an instrument used for cell culture, a shipping container, instructions on how to use, and the like.
  • instruments used for cell culture include pipettes, cell strainers, and cell scrapers.
  • Examples of the instruction regarding the usage method include a usage manual, a medium on which information on the manufacturing method and the usage method is recorded, for example, a flexible disc, a CD, a DVD, a Blu-ray disc, a memory card, a USB memory, and the like.
  • Yet another aspect of the invention relates to a method for treating an inflammatory disease, comprising transplanting a cell culture containing cells derived from skeletal muscle.
  • the cell culture according to the present invention can be transplanted to or around an inflamed site in order to suppress inflammation in an inflammatory disease.
  • the cells constituting the cell culture according to the present invention are 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, or 90 of cells derived from skeletal muscle. % Or more, preferably 60% or more.
  • the cell culture is a sheet-like cell culture.
  • the treatment of an inflammatory disease is the treatment of an inflammatory disease occurring in the lower gastrointestinal tract.
  • the treatment of inflammatory disease is the treatment of inflammatory bowel disease.
  • the cell culture according to the invention is implanted on the serosal side, i.e. outside the gastrointestinal tract.
  • the cell culture may be transplanted away from the inflamed site as long as the effects of the present invention are exhibited, but all or part of the cell culture corresponds to the inflamed site. It is preferable to transplant at the opposite positions across the muscle layer. In one aspect, it may be implanted on the serosal side of the gastrointestinal tract except for the location corresponding to the site of inflammation.
  • the cell culture comprises extracellular matrix.
  • the cell culture of the present invention is a sheet-like cell culture.
  • one cell culture When there are a plurality of inflamed sites, one cell culture may be transplanted, or a plurality of cell cultures may be transplanted depending on the number of inflamed sites. ..
  • the plurality of cell cultures When transplanting a plurality of cell cultures, the plurality of cell cultures may be independently transplanted away from the inflamed site as long as the effects of the present invention are exhibited, but all or one of them may be transplanted. It is preferable that the part is transplanted at the opposite position across the muscle layer corresponding to the site where the inflammation is occurring.
  • the sheet-like cell culture when the cell culture according to the present invention is a sheet-like cell culture, the sheet-like cell culture has a support layer by a biodegradable gel such as fibrin gel at the time of transplantation. May be good.
  • the formation of the support layer is not limited to this, for example, a method of forming a fibrinogen layer by dropping a fibrinogen solution onto a sheet-like cell culture and then spraying the thrombin solution (Patent No. 6495603). See) and so on.
  • Example 1 Analysis of culture supernatant of sheet-shaped cell culture containing human skeletal myoblasts (1) Preparation of sheet-shaped cell culture Cryopreserved human skeletal myoblasts (derived from human skeletal muscle sample) are thawed at 37 ° C. , Washed twice with buffer containing 0.5% serum albumin. The 5 ⁇ 10 6 ⁇ 5 ⁇ 10 7 cells were suspended in 20% serum-containing medium, was inoculated into a flask, and cultured for 2-3 days. To UpCell® (3.5 cm dish or 24-well multi-well, CellSeed Co., Ltd.), add 20% serum-containing medium that covers the entire culture surface, and add 3 at 37 ° C. and 5% CO 2 environment. Processed for hours to 3 days.
  • UpCell® 3.5 cm dish or 24-well multi-well, CellSeed Co., Ltd.
  • Example 2 Transplantation test in mouse colitis model (1) Preparation of sheet-shaped cell culture Skeletal muscle was collected from the lower limbs of 18-week-old C57BL / 6 mice (Japan Charles River Co., Ltd.) and treated with a solution containing collagenase and trypsin. And dispersed in a single cell. Such cells were cultured under MCDB131 medium containing 20% FBS under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions until they became confluent, and the cells were collected. The collected cells were seeded in 1 ⁇ 10 6 cells in a 48-well temperature-responsive culture vessel (UpCell®), cultured in DMEM / F12 medium containing 20% FBS for 6 hours or more, and subjected to sheet culture. .. Then, by lowering the temperature to 20 ° C., the sheet-shaped cell culture was exfoliated from the temperature-responsive culture vessel and recovered.
  • UpCell® 48-well temperature-responsive culture vessel
  • mice The test was carried out according to the following method.
  • the group composition of mice and the plan of autopsy and transplantation time are shown in FIG.
  • To induce colitis 7-week-old C57BL / 6 mice (Japan Charles River Co., Ltd.) were orally administered 2% dextran sulfate sodium (DSS, MP Bio Japan Co., Ltd.) for 4 days with free drinking water. Mice were randomly divided into a follow-up group and a test group.
  • the follow-up group was autopsied on the 4th, 10th, 17th, and 31st days counting from the start of free drinking to examine the tissue condition (hereinafter, the number of days is counted in the same way as free drinking). Based on the start).
  • the test group was further divided into a sheet-shaped cell culture transplantation group and a sham surgery group.
  • the sheet-shaped cell culture transplantation group was opened on the 11th day under general anesthesia, and the sheet-shaped cell culture prepared in (1) was transplanted to the serosal side of the gastrointestinal tract where inflammation of the large intestine was occurring. Only open surgery was performed under general anesthesia without transplanting sheet-like cell cultures into the sham surgery group. Mice in the sheet cell culture transplant group and the sham operation group were necropsied on the 31st day to examine the tissue condition. In addition, the lower gastrointestinal tract was collected from the mice of both groups, and the length of the large intestine was measured.
  • colon tissue was collected from the lower gastrointestinal tract, and the colon tissue was stained with hematoxylin and eosin staining to obtain a tissue-stained image.
  • changes in body weight were observed on the 3rd, 9th, 16th, and 23rd days after the start of the test in the sheet-shaped cell culture transplantation group and the sham surgery group.
  • the properties of the stool and the degree of bloody stool were observed, and the inflammation score (DAI) was calculated according to Table 1 below. The total score is 12 points, and the higher the value, the more severe the degree of inflammation.
  • FIG. 3 (A) A photograph of the lower gastrointestinal tract collected from mice in the sheet-shaped cell culture transplantation group is shown in FIG. 3 (A), and a photograph of the intima of the gastrointestinal tract confirmed by cutting the lower gastrointestinal tract is shown in FIG. 3 (B).
  • 3 (C) shows a photograph of the lower gastrointestinal tract taken out from mice in the sham-operated group
  • FIG. 3 (D) shows a photograph of the intima of the gastrointestinal tract confirmed by cutting open the lower gastrointestinal tract.
  • the length of the large intestine of the mice in the sheet-shaped cell culture transplantation group was 73 mm
  • the length of the large intestine of the mice in the sham surgery group was 67 ⁇ 5 mm.
  • tissue-staining images obtained from the mice in the sheet-like cell culture transplantation group are shown in FIG. 4A.
  • the enlarged image of the broken line portion is shown in FIG. 4B.
  • a tissue-stained image obtained from the mice in the sham surgery group is shown in FIG. 4C, and an enlarged image of the broken line portion thereof is shown in FIG. 4D. Histopathology of tissues of mice in the follow-up group autopsied on days 4, 10, 17, and 31 and mice in the sheet-like cell culture transplant group and pseudo-transplant group autopsied on day 31.
  • the target evaluation is shown in Table 2 below.
  • Table 2 Histopathological evaluation of mouse tissue in each group Erosion, ulcer, lymphocyte infiltration and neutrophil infiltration were confirmed in the large intestine of the pseudo-transplanted mouse autopsy on the 31st day, but the large intestine of the sheet-shaped cell culture transplanted mouse autopsy on the 31st day. No abnormality was confirmed in.
  • the changes in body weight of the mice in the sheet-shaped cell culture group and the mice in the sham surgery group are shown in FIG. Further, FIG. 6 shows the changes in body weight based on the body weight of the mice in each group of the sheet-shaped cell culture transplantation group and the sham operation group after the 11th day after the start of the test.
  • mice in the sham surgery group The squares indicate the mice in the sham surgery group, and the black circles indicate the mice in the sheet-like cell culture transplantation group. After transplantation of the sheet-like cell culture, the mice in the sheet-like cell culture transplantation group showed a significant increase in body weight as compared with the mice in the sham-surgery group.
  • the inflammation score (DAI) for the sheet-shaped cell culture transplantation group and the sham surgery group is shown in FIG.
  • the squares indicate the sham surgery group, and the black circles indicate the sheet-shaped cell culture transplantation group.
  • the scores were also high on the 16th and 23rd days after the laparotomy.
  • the score on the 16th day after the laparotomy was 0, and was 0 on the 23rd day as well.

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Abstract

本発明は炎症性疾患を処置するための、細胞培養物、細胞培養物の製造方法、細胞培養物を製造するためのキット、および当該細胞培養物を用いた炎症性疾患の処置方法などの提供を目的とする。骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物の製造方法、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物を製造するためのキット、および当該細胞培養物を用いた炎症性疾患の処置方法等により、上記課題が解決された。

Description

炎症性疾患を処置するための細胞培養物
　本発明は炎症性疾患を処置するための、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物、当該細胞培養物の製造方法、当該細胞培養物を製造するためのキット、および当該細胞培養物を用いた炎症性疾患の処置方法等に関する。
　近年、損傷した組織などの修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの利用が試みられている（非特許文献１）。
　このような試みの一例として、細胞をシート状に成形したシート状細胞培養物が開発されており、その一部は臨床応用の段階に入っている。そのような応用の例としては、例えば、内視鏡的粘膜下層剥離術後穿孔等を予防するために、施術箇所の外側に貼付して使用されるシート状細胞培養物（特許文献１）や、分泌されるアディポネクチンにより心臓疾患の患者における心機能を改善する、脂肪細胞を含有するシート状細胞培養物（特許文献２）などがある。
　炎症性腸疾患は主にクローン病、潰瘍性大腸炎からなる、発症の原因が明確に判明していない難病であり、現在、わが国においては両疾患併せて２２万人を超える患者が存在するとされている。これらの疾患の治療方法としては、現在、ステロイド剤、免疫抑制剤、抗ＴＮＦ－α抗体製剤等の投与などが行われている。
　炎症性腸疾患の新たな治療法として、組織分化や血管新生、免疫機能の調節など様々な作用を有する間葉系幹細胞を投与する方法が提案されている。例えば、間葉系幹細胞または脂肪幹細胞を腸炎や慢性関節リウマチの動物モデルに静注またはリンパ系内投与する方法（特許文献３～５）、間葉系幹細胞の培養上清を腸炎のラットモデルに腸注または静注する方法（特許文献６および７）、遺伝子導入した間葉系幹細胞により末梢免疫反応を調節する方法（特許文献８）などが知られている。
特願２０１８－１４０９７７ 特許第５６６１０４８号公報 特開２０１７－３５０９４ 特願２００９－７３２１ 特許第６５１２７５９号公報 特開２０１７－１３７２６８ 特許第６１３２４５９号公報 特開２０１９－６７９０
Haraguchi et al., Stem Cells Trans1 Med. 2012 Feb;1(2):136-41
　本発明は炎症性疾患を処置するための、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物、当該細胞培養物の製造方法、当該細胞培養物を製造するためのキット、および当該細胞培養物を用いた炎症性疾患の処置方法などの提供を目的とする。
　間葉系幹細胞を用いた炎症性腸疾患の治療においては、投与対象に適合する間葉系幹細胞を薬剤として投与可能なレベルの量で培養することが困難であること、間葉系幹細胞を静脈注射またはリンパ系内投与をした際に、所望の部位における生着が不十分であること、などといった課題が残存している。
　本発明者らは、骨格筋由来の細胞を含むシートの培養上清に、マイオカイン等の炎症性腸疾患の治療に有益な成分が含まれていることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下に関する。
［１］炎症性疾患を処置するための、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物。
［２］細胞培養物が、シート状細胞培養物である、［１］に記載の細胞培養物。
［３］マイオカインを分泌する、［１］または［２］に記載の細胞培養物。
［４］炎症性疾患が、下部消化管において生じている炎症性疾患である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の細胞培養物。
［５］炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の細胞培養物。
［６］消化管の漿膜側に移植するための、［１］～［５］のいずれか１つに記載の細胞培養物。
［７］［２］～［６］のいずれか１つに記載のシート状細胞培養物を製造する方法であって、
基材上に細胞を播種すること、
播種した細胞をシート化すること、および
形成されたシート状細胞培養物を基材から剥離すること
を含む、前記方法。
［８］［１］～［６］のいずれか１つに記載の細胞培養物を製造するためのキットであって、細胞、ならびに該細胞を培養するための培地および基材を含む、前記キット。
［９］炎症性疾患を処置するための方法であって、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物を移植することを含む、前記方法。
［１０］細胞培養物が、シート状細胞培養物である、［９］に記載の方法。
［１１］細胞培養物がマイオカインを分泌する、［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］炎症性疾患が、下部消化管において生じている炎症性疾患である、［９］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、［９］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］細胞培養物の移植が、消化管の漿膜側への移植である、［９］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
　本発明によれば、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物を移植することにより、炎症性疾患の治癒を促進することができる。
図１は、Bio-Plex（商標）マルチシステムを用いて測定した、ヒト骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物の培養上清中に含まれる各種サイトカインの量を示す。 図２は、マウス大腸炎モデルにおける移植試験の計画を示す。Ａ群は経過観察群を、Ｂ群は試験群を指す。両群において試験開始日から４日目まで２％ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）の自由飲水が実施された。図中の細い矢印は、シート状細胞培養物の移植を実施した日を指し、太い矢印は、剖検した日を指す。 図３は、試験開始後３１日目の剖検により、シート状細胞培養物移植群のマウスと偽手術群のマウスからそれぞれ回収した組織の写真である。（Ａ）は、シート状細胞培養物移植群のマウスから取り出した下部消化管の写真であり、（Ｂ）は、その下部消化管を切り開いて確認した消化管内膜の写真である。（Ｃ）は、偽手術群のマウスから取り出した下部消化管の写真であり、（Ｄ）は、その下部消化管を切り開いて確認した消化管内膜の写真である。 図４は、試験開始後３１日目の剖検により得られた、シート状細胞培養物移植群のマウスと偽手術群のマウスの結腸組織の画像を示す。図４Ａは、試験開始後３１日目に剖検したシート状細胞培養物移植群のマウスの結腸組織の断面の画像である。 図４Ｂは、図４Ａにおいて破線で囲んだ部分の拡大像である。 図４Ｃは、試験開始後３１日目に剖検した偽手術群のマウスの結腸組織の断面の画像である。 図４Ｄは、図４Ｃにおいて破線で囲んだ部分の拡大像である。
図５は、シート状細胞培養物移植群と偽手術群の体重の変化を示したグラフである。四角が偽手術群を、黒丸がシート状細胞培養物移植群を示す。縦軸はマウスの体重を示し、横軸は試験の経過日数を示す。試験開始後１１日目においてシート状細胞培養物の移植が実施された。 図６は、シート状細胞培養物移植群と偽手術群の試験開始後１１日目の各々のマウスの体重を基準とした体重変化を示したグラフである。四角が偽手術群を、黒丸がシート状細胞培養物移植群を示す。縦軸は基準からの体重変化を示し、横軸は試験の経過日数を示す。 図７は、シート状細胞培養物移植群と偽手術群のマウスにおける炎症スコアを表したグラフである。縦軸は炎症スコア（ＤＡＩ）の値を示し、横の項目軸はスコアを測定した日を示す。四角が偽手術群を、黒丸がシート状細胞培養物移植群を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の一側面は、炎症性疾患を処置するための、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物に関する。
　本発明において、炎症性疾患とは、炎症の症状を特徴とする疾患である。炎症性疾患の例としては、以下に限定されるものではないが、アレルギーまたは免疫複合体疾患などの全身または局所の炎症疾患、クローン病、潰瘍性、急性または虚血性の大腸炎、腸管ベーチェット病、憩室炎または胆嚢炎などの胃腸管系疾患、皮膚炎などの皮膚関連疾患、心内膜炎、心筋炎などの心血管系疾患、喘息、結核、気管支拡張症または慢性閉鎖性疾患（ＣＯＰＤ）などの呼吸器系疾患、リウマチ性関節炎、骨髄炎、筋膜炎などの結合組織関連疾患、腎炎などの泌尿生殖系疾患、髄膜炎、脳炎または多発性硬化症などの神経系関連疾患、ウイルス、真菌または微生物などの感染による疾患、甲状腺炎などの自己免疫性疾患、およびがんなどが挙げられる。
　一態様において、炎症性疾患は、特に炎症性サイトカインの異常な放出に由来するものを指す。好ましくは、本発明における炎症性疾患は、炎症性腸疾患を指す。
　本発明において「細胞培養物」は、細胞培養ステップを経て得られる組成物を指す。一態様において、本発明の細胞培養物は、シート状細胞培養物である。本発明において「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）体、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。
　シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
　本発明において、細胞培養物は骨格筋由来の細胞を含む。本発明において、骨格筋由来の細胞とは、衛星細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋細胞、骨格筋管および骨格筋線維を指す。好ましくは、骨格筋由来の細胞とは、骨格筋芽細胞である。本発明の細胞培養物を構成する細胞は、骨格筋由来の細胞を、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上含み、好ましくは６０％以上含む。
　骨格筋芽細胞は当該技術分野においてよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７－８９４４２号公報記載の方法など）により調製することもできるし、例えば、ロンザジャパン株式会社のカタログ番号：CC-2580、コスモ・バイオ株式会社の商品コード3520など、商業的に入手することもできる。骨格筋芽細胞は、これらに限定されるものではないが、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。一態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。一態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性およびデスミン陽性である。
　横紋筋組織から骨格筋芽細胞を調製する場合、調製した細胞集団には線維芽細胞が含まれる。本発明に係る細胞培養物を製造する際に、横紋筋組織から調製した骨格筋芽細胞を含む細胞集団を用いる場合、当該細胞集団には一定量の線維芽細胞が含まれることになる。線維芽細胞は当該技術分野においてよく知られており、ＴＥ－７（例えば、Rosendaal et al., J Cell Sci. 1994; 107(Pt1): 29-37、Goodpaster et al. J Histochem Cytochem. 2008; 56(4): 347-358など参照）などのマーカーにより同定することができる。
　一態様において、本発明の細胞培養物を構成する細胞は、横紋筋組織から調製された骨格筋芽細胞を含む。したがって本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団には、骨格筋芽細胞および線維芽細胞が含まれ得る。一態様において、本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団は、ＣＤ５６陽性率が５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり得、好ましくは６０％以上である。
　本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団は、線維芽細胞を含み得るが、線維芽細胞の含有率が高すぎる場合、骨格筋芽細胞の含有率が低下するため、好ましくない。したがって一態様において、本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団は、ＴＥ－７陽性率が５０％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下であり得、好ましくは４０％以下である。
　本発明の細胞培養物の製造において用いられる細胞集団は、骨格筋芽細胞および線維芽細胞以外の細胞も含み得るが、かかる細胞は少ないほど好ましい。したがってＣＤ５６陽性率およびＴＥ－７陽性率の合計値は、高い方が好ましく、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上などであり得、好ましくは９０％以上である。
　本発明において、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物からは、サイトカインが分泌される。
　本発明において、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物から分泌されるサイトカインは、一般的にマイオカインと称されるものであり、これらに限定されるものではないが、例えば、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、エオタキシン、ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ｇ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）、ＭＩＰ－１ａ、ＰＤＧＦ－ｂｂ、ＭＩＰ－１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ－ａ、ＨＧＦ－１、ＳＤＦ－１、およびＶＥＧＦなどが挙げられる。
　本発明の細胞培養物がシート状細胞培養物である場合に、シート状細胞培養物の厚みは特に限定されていない。シート状細胞培養物として単層のシートを用いる場合、その厚みは通常細胞１個分以上の厚みを有し、シート状細胞培養物のシートを形成する細胞の種類によっても厚みは異なるが、一態様において、本発明のシート状細胞培養物は、３０μｍ以上の厚みを有し、好ましい一態様において、５０μｍ以上の厚みを有する。本発明のシート状細胞物の値の範囲としては、例えば３０μｍ～２００μｍ、好ましくは５０μｍ～１５０μｍ、より好ましくは６０μｍ～１００μｍが挙げられる。シート状細胞培養物として積層したシートを用いる場合、前記単層シートの厚み×積層枚数を超えない厚みとなる。したがって、一態様として例えば単層シートを５枚重ねたシートを用いる場合、その厚みは１５０μｍ以上の厚みを有し、好ましい一態様において、２５０μｍ以上の厚みを有する。その場合におけるシート状細胞物の値の範囲としては、例えば１５０μｍ～１０００μｍ、好ましくは２５０μｍ～７５０μｍ、より好ましくは３００μｍ～５００μｍが挙げられる。
　細胞培養物を構成する細胞は、細胞培養物による処置に供する任意の生物に由来することができ、かかる生物は、これらに限定されるものではないが、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどを含む。また、細胞培養物を構成する細胞は、１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を構成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６０％以上、好ましくは、７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
　細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞である。
　本発明において、細胞培養物がシート状細胞培養物である場合に、シート状細胞培養物は、当業者に既知の任意の方法（例えば、特許文献１、特開２０１０－０８１８２９、特開２０１１－１１０３６８など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、基材上に細胞を播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、形成されたシート状細胞培養物を基材から剥離するステップを含むが、これに限定されない。細胞を基材上に播種するステップの前に、細胞を凍結するステップおよび細胞を解凍するステップを行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄するステップを行ってもよい。これら各ステップは、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。本開示の製造方法は、シート状細胞培養物を製造するステップを含んでもよく、その場合、シート状細胞培養物を製造するステップは、サブステップとして上記シート状細胞培養物の製造方法に係るステップの１または２以上を含んでもよい。ある一態様において、細胞を解凍するステップの後、細胞を基材上に播種するステップの前に細胞を増殖させるステップを含まない。
　一態様において、本発明の細胞培養物は、細胞培養物を構成する細胞により産生された細胞外マトリックスを介して、細胞同士が接合している。一態様において、本発明の細胞培養物は、細胞外マトリックスを含む。
　本発明において、細胞培養物を構成する細胞により産生された細胞外マトリックスは、種々の条件によるが、例えば、細胞の播種後、２４時間以上、例えば、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、培養することにより生じる。
　細胞外マトリックスは、細胞培養物が移植部位に接着することに寄与し、細胞培養物を移植する際に、例えば縫合などの、移植部位に細胞培養物を接着するステップを簡略化することができる。また細胞外マトリックスは細胞由来成分であるため、本発明に係る細胞培養物と共に移植に供することにおいてなんら問題はない。
　基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning（登録商標）TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。
　基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ－イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２－２１１８６５、特開２００３－３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、例えば、株式会社セルシードのＵｐＣｅｌｌ（登録商標）やＤＩＣ株式会社のＣｅｐａｌｌｅｔ（登録商標））、これらを本開示の製造方法に使用することができる。
　基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２～約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２～約５０ｃｍ２などであってよい。例えば、基材として直径１０ｃｍの円形の培養皿が挙げられる。この場合、面積は５６．７ｃｍ２となる。
　基材は血清でコート（被覆またはコーティング）されていてもよい。血清でコートされた基材を用いることにより、より高密度のシート状細胞培養物を形成することができる。「血清でコートされている」とは、基材の表面に血清成分が付着している状態を意味する。かかる状態は、限定されずに、例えば、基材を血清で処理することにより得ることができる。血清による処理は、血清を基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。
　血清としては、異種血清および／または同種血清を用いることができる。異種血清は、シート状細胞培養物を移植に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種他家血清を非自己血清と総称することもある。
　基材をコートするための血清は、市販されているか、または、所望の生物から採取した血液から定法により調製することができる。具体的には、例えば、採取した血液を室温で約２０分～約６０分程度放置して凝固させ、これを約１０００×ｇ～約１２００×ｇ程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。
　基材上でインキュベートする場合、血清は原液で用いても、希釈して用いてもよい。希釈は、任意の媒体、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７など）等で行うことができる。希釈濃度は、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０．５％～約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１％～約６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約５％～約４０％（ｖ／ｖ）である。
　インキュベート時間も、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約１時間～約７２時間、好ましくは約２時間～約４８時間、より好ましくは約２時間～約２４時間、さらに好ましくは約２時間～約１２時間である。インキュベート温度も、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０℃～約６０℃、好ましくは約４℃～約４５℃、より好ましくは室温～約４０℃である。
　インキュベート後に血清を廃棄してもよい。血清の廃棄手法としては、ピペットなどによる吸引や、デカンテーションなどの慣用の液体廃棄手法を用いることができる。本開示の好ましい態様においては、血清廃棄後に、基材を無血清洗浄液で洗浄してもよい。無血清洗浄液としては、血清を含まず、基材に付着した血清成分に悪影響を与えない液体媒体であれば特に限定されず、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７など）等で行うことができる。洗浄手法としては、慣用の基材洗浄手法、例えば、限定することなく、基材上に無血清洗浄液を加えて所定時間（例えば、約５秒～約６０秒間）撹拌後、廃棄する手法などを用いることができる。
　本開示において、基材を、成長因子でコートしてもよい。ここで、「成長因子」は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。成長因子による基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、例えば、約０．０００１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０００５μｇ／ｍＬ～約０．０５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ～約０．０１μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
　本開示において、基材を、ステロイド剤でコートしてもよい。ここで「ステロイド剤」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。ステロイド剤による基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、デキサメタゾンとして、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
　基材は、血清、成長因子およびステロイド剤のいずれか１つでコートしても、これらの任意の組合わせ、すなわち、血清と成長因子、血清とステロイド剤、血清と成長因子とステロイド剤、または、成長因子とステロイド剤の組合わせでコートしてもよい。複数の成分でコートする場合、これらの成分を混合して同時にコートしてもよいし、別々のステップでコートしてもよい。
　基材は、血清等でコートした後直ちに細胞を播種してもよいし、コートした後に保存しておき、その後細胞を播種することもできる。コートした基材は、例えば約４℃以下、好ましくは約－２０℃以下、より好ましくは約－８０℃以下に保つことにより長期間保存することができる。
　一態様において、本発明は、下部消化管に生じた炎症性疾患を処置するための細胞培養物である。本発明において、下部消化管は、小腸および大腸のことを指す。ここで、小腸は空腸、回腸を含み、大腸は、虫垂、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸、直腸Ｓ上部、上部直腸、下部直腸、肛門管を含む。消化管下部に生じた炎症性疾患としては、これらに限定されないが、小腸がん、大腸がんなどの悪性腫瘍に起因する炎症、感染性腸炎、憩室炎および炎症性腸疾患などが挙げられる。
　一態様において、本発明は、炎症性腸疾患を処置するための細胞培養物である。本発明において、炎症性腸疾患とは、慢性または寛解・再燃性の腸管における炎症性疾患を指し、具体的には、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病などを指す。
　一態様において、本発明に係る細胞培養物は、消化管の漿膜側、すなわち、消化管の外側に移植される。細胞培養物は、本発明の効果を奏する限りにおいて、炎症が生じている部位から離れて移植してもよいが、細胞培養物の全部または一部が、炎症が生じている部位に対応する、筋層を挟んだ正反対の位置に移植することが好ましい。一態様において、炎症が生じている部位に対応する位置を除く消化管の漿膜側に移植されてもよい。一態様において、細胞培養物は、細胞外マトリックスを含む。本発明の一態様において、本発明の細胞培養物は、シート状細胞培養物である。
　炎症が生じている部位が複数箇所である場合、１つの細胞培養物を移植してもよいが、炎症が生じている部位の数に応じて、複数の細胞培養物をそれぞれ移植してもよい。複数の細胞培養物を移植する場合、複数の細胞培養物は、それぞれ独立して、本発明の効果を奏する限りにおいて、炎症が生じている部位から離れて移植してもよいが、全部または一部が、炎症が生じている部位に対応する、筋層を挟んだ正反対の位置に移植することが好ましい。
　本発明に係る細胞培養物を対象に移植するためには、形態は特に限定されないが、シート状細胞培養物の形態であることが好ましい。
　本発明に係る細胞培養物は、マイオカインを分泌する。本発明に係る細胞培養物が、シート状細胞培養物の形態であっても、マイオカインを分泌する。また、マイオカインを分泌するシート状細胞培養物を炎症性疾患を有する対象に移植することにより、炎症性疾患を処置することができる。
　特定の理論に拘束されることはないが、本発明に係る細胞培養物の炎症性疾患への作用は、本発明に係る細胞培養物から分泌されるマイオカインが、炎症を生じている部位の細胞に直接的および／または間接的に作用し、腸上皮細胞の増殖効果、抗炎症効果、および抗アポトーシス効果を奏することによるものと考えられる。また、本発明に係る細胞培養物が細胞外マトリックスを含んでいる場合には、細胞培養物の移植部位への生着性が高くなり、細胞培養物から分泌されるマイオカインは、より多く産生されることで、炎症を生じている部位の細胞に効率的に作用すると考えられる。
　本発明の別の側面は、基材上に細胞を播種すること、播種した細胞をシート化すること、形成されたシート状細胞培養物を基材から剥離することを含む、炎症性疾患を処置するための、骨格筋由来の細胞を含むシート状細胞培養物を製造する方法に関する。
　シート状細胞培養物は、上記の基材上に細胞を播種すること、播種した細胞をシート化すること、形成されたシート状細胞培養物を基材から剥離することを含む、既知の任意の方法で製造することができる。
　本発明において、シート状細胞培養物は、上述のとおり、当業者に既知の任意の方法（例えば、特許文献１、特開２０１０－０８１８２９、特開２０１１－１１０３６８など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、基材上に細胞を播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、形成されたシート状細胞培養物を基材から剥離するステップを含むが、これに限定されない。
　基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
　一態様において、播種は、約７．１×１０５個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．３×１０５個／ｃｍ２～約２．８×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２～約２．５×１０６個／ｃｍ２、約７．８×１０５個／ｃｍ２～約２．３×１０６個／ｃｍ２、約８．０×１０５個／ｃｍ２～約２．０×１０６個／ｃｍ２、約８．５×１０５個／ｃｍ２～約１．８×１０６個／ｃｍ２、約９．０×１０５個／ｃｍ２～約１．６×１０６個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約１．６×１０６個／ｃｍ２などの密度で行うことができる。
　本発明のまた別の側面は、細胞培養物を製造するための細胞、該細胞を培養するための培地および基材を含む、上記の炎症性疾患を処置するための、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物などを製造するためのキットに関する。
　本発明におけるキットは、これらに限定されるものではないが、例えば、洗浄液、緩衝液、チューブ、細胞培養に使用する器具、輸送容器、使用方法に関する指示などをさらに含んでもよい。
　細胞培養に使用する器具としては、例えば、ピペット、セルストレーナー、セルスクレーバーなどが挙げられる。使用方法に関する指示としては、例えば、使用説明書、製造方法や使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどが挙げられる。
　本発明のさらに別の側面は、炎症性疾患を処置するための方法であって、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物を移植することを含む方法に関する。一態様において、本発明に係る細胞培養物を、炎症性疾患における炎症を抑えるために、炎症が生じている部位またはその周辺に移植することができる。本発明に係る細胞培養物を構成する細胞は、骨格筋由来の細胞を、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上含み、好ましくは６０％以上含む。本発明の一態様において、細胞培養物は、シート状細胞培養物である。
　一態様において、炎症性疾患の処置は、下部消化管において生じている炎症性疾患の処置である。一態様において、炎症性疾患の処置は、炎症性腸疾患の処置である。
　一態様において、本発明に係る細胞培養物は、漿膜側、すなわち、消化管の外側に移植される。細胞培養物は、本発明の効果を奏する限りにおいて、炎症が生じている部位から離れて移植してもよいが、細胞培養物の全部または一部が、炎症が生じている部位に対応する、筋層を挟んだ正反対の位置に移植することが好ましい。一態様において、炎症が生じている部位に対応する位置を除く消化管の漿膜側に移植されてもよい。一態様において、細胞培養物は、細胞外マトリックスを含む。本発明の一態様において、本発明の細胞培養物は、シート状細胞培養物である。
　炎症が生じている部位が複数箇所である場合、１つの細胞培養物を移植してもよいが、炎症が生じている部位の数に応じて、複数の細胞培養物をそれぞれ移植してもよい。複数の細胞培養物を移植する場合、複数の細胞培養物は、それぞれ独立して、本発明の効果を奏する限りにおいて、炎症が生じている部位から離れて移植してもよいが、全部または一部が、炎症が生じている部位に対応する、筋層を挟んだ正反対の位置に移植することが好ましい。
　一態様において、本発明に係る細胞培養物がシート状細胞培養物である場合に、シート状細胞培養物は、移植の際に、フィブリンゲルなどの生体分解性ゲルによる支持層を有していてもよい。支持層の形成は、これに限定されるものではないが、例えばシート状細胞培養物上にフィブリノーゲン液を滴下し、その後トロンビン液を噴霧することによりフィブリンゲル層を形成する方法（特許６４９５６０３号公報参照）などが挙げられる。
例１．ヒト骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物の培養上清の分析
（１）シート状細胞培養物の作成
　凍結保存されたヒト骨格筋芽細胞（ヒト骨格筋試料由来）を３７℃で解凍し、０．５％血清アルブミンを含む緩衝液を用いて２回洗浄した。５×１０６～５×１０７個の細胞を２０％血清含有培地に懸濁し、フラスコに播種した後、２～３日間培養した。
　ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）（３．５ｃｍディッシュまたは２４穴マルチウェル、株式会社セルシード）に、培養表面が全て覆われる程度の２０％血清含有培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で３時間～３日間処理した。処理後、添加した培地は廃棄した。
　培養した細胞を回収し、２０％血清含有培地に懸濁し、処理済みＵｐＣｅｌｌ（登録商標）に２～２０×１０５個／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で約１日間、シート化培養を行った。
（２）分泌サイトカインのアッセイ
　Bio-Plex（商標）Assay Kits（BIO-RAD製)を用いて、製造元の指示に従い、（１）で作製したシート状細胞培養物の培養上清を、２７種類のサイトカインについて分析した。
（３）結果
　結果を図１に示す。ヒト骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物の培養上清中には、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＰ－１０などが分泌されていた。
例２．マウス大腸炎モデルにおける移植試験
（１）シート状細胞培養物の作製
　１８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールス・リバー株式会社）の下肢から骨格筋を採取し、コラゲナーゼおよびトリプシンを含む溶液で処理し、単一の細胞に分散させた。かかる細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２０％ＦＢＳ含有ＭＣＤＢ１３１培地でコンフルエントになるまで培養し、細胞を回収した。回収した細胞を、４８穴の温度応答性培養容器（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標））に１×１０６個播種し、２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で６時間以上培養し、シート化培養を行った。その後、温度を２０℃まで下げることで、シート状細胞培養物を温度応答性培養容器から剥離させ、回収した。
（２）試験方法
　試験を、以下の方法に従って実施した。マウスの群構成および剖検ならびに移植時期の計画を図２に示す。
　大腸炎の誘導のために、７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、２％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、株式会社エムピーバイオジャパン）を４日間自由飲水で経口投与した。マウスをランダムに経過観察群と、試験群に分けた。経過観察群については、自由飲水開始から数えて４日目、１０日目、１７日目および３１日目に剖検し、組織の状態を調べた（以下、日数の数え方はすべて同様に自由飲水開始を基準にする）。試験群については、さらにシート状細胞培養物移植群と偽手術群とに分けた。シート状細胞培養物移植群は、１１日目に全身麻酔下で開腹し、大腸の炎症が生じている消化管の漿膜側へ（１）で作製したシート状細胞培養物を移植した。偽手術群には、シート状細胞培養物を移植することなく、全身麻酔下で開腹手術のみ実施した。シート状細胞培養物移植群および偽手術群のマウスを３１日目に剖検し、組織の状態を調べた。また、両群のマウスから下部消化管を回収し、大腸の長さを測定した。さらに、下部消化管から結腸組織を回収し、結腸組織を、ヘマトキシリン・エオジン染色により染色し、組織染色像を得た。
　また、上記の組織学的実験に加えて、シート状細胞培養物の移植群ならびに偽手術群について、試験開始後３日目、９日目、１６日目および２３日目に、体重の変化、便の性状、および血便の程度を観察し、以下の表１に従って炎症スコア（ＤＡＩ）を算出した。合計１２点満点であり、数値が高いほど炎症の程度が重度であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）結果
　シート状細胞培養物移植群のマウスから回収した下部消化管の写真を図３（Ａ）に、その下部消化管を切り開いて確認した消化管内膜の写真を図３（Ｂ）に示し、偽手術群のマウスから取り出した下部消化管の写真を図３（Ｃ）に、その下部消化管を切り開いて確認した消化管内膜の写真を図３（Ｄ）に示す。シート状細胞培養物移植群のマウスの大腸の長さは、７３ｍｍであり、偽手術群のマウスの大腸の長さは、６７±５ｍｍであった。
　３１日目に剖検されたシート状細胞培養物移植群のマウスおよび偽手術群のマウスから得られた組織染色像のうち、シート状細胞培養物移植群のマウスから得た組織染色像を図４Ａに示し、その破線部分の拡大像を図４Ｂに示す。また偽手術群のマウスから得た組織染色像を図４Ｃに示し、その破線部分の拡大像を図４Ｄに示す。
　４日目、１０日目、１７日目および３１日目に剖検した経過観察群のマウス、ならびに３１日目に剖検したシート状細胞培養物移植群および偽移植群のマウスの組織の病理組織学的評価を以下の表２に示す。
表２．各群のマウスの組織の病理組織学的評価
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　３１日目に剖検した偽移植群のマウスの大腸において、びらん、潰瘍、リンパ球浸潤および好中球浸潤が確認されたが、３１日目に剖検したシート状細胞培養物移植群のマウスの大腸においては、異常は確認されなかった。
　シート状細胞培養群のマウスおよび偽手術群のマウスの体重変化について、図５に示す。さらに試験開始後１１日目以降の、シート状細胞培養物移植群と偽手術群の各群のマウスの試験開始後１１日目の体重を基準とした体重変化を図６に示す。四角が偽手術群のマウスを、黒丸がシート状細胞培養物移植群のマウスを示す。シート状細胞培養物移植群のマウスにおいて、シート状細胞培養物の移植後、偽手術群のマウスと比べて体重の著しい増加がみられた。
　シート状細胞培養物移植群および偽手術群についての炎症スコア（ＤＡＩ）を図７に示す。四角が偽手術群を、黒丸がシート状細胞培養物移植群を示す。偽手術群においては、開腹手術後である１６日目および２３日目においてもスコアは高い状態であった。これに対し、シート状細胞培養物移植群においては、驚くべきことに、開腹手術後である１６日目のスコアは０であり、２３日目においても、０であった。

Claims (14)

  1. 　炎症性疾患を処置するための、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物。
  2. 　細胞培養物が、シート状細胞培養物である、請求項１に記載の細胞培養物。
  3. 　マイオカインを分泌する、請求項１または２に記載の細胞培養物。
  4. 　炎症性疾患が、下部消化管において生じている炎症性疾患である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  5. 　炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  6. 　消化管の漿膜側に移植するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞培養物。
  7. 　請求項２～６のいずれか一項に記載のシート状細胞培養物を製造する方法であって、
    基材上に細胞を播種すること、
    播種した細胞をシート化すること、および
    形成されたシート状細胞培養物を基材から剥離すること
    を含む、前記方法。
  8. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞培養物を製造するためのキットであって、細胞、ならびに該細胞を培養するための培地および基材を含む、前記キット。
  9. 　炎症性疾患を処置するための方法であって、骨格筋由来の細胞を含む細胞培養物を移植することを含む、前記方法。
  10. 　細胞培養物が、シート状細胞培養物である、請求項９に記載の方法。
  11. 　細胞培養物がマイオカインを分泌する、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 　炎症性疾患が、下部消化管において生じている炎症性疾患である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　細胞培養物の移植が、消化管の漿膜側への移植である、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。
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