JP6952706B2 - エピトープタグを有する組換え抗体を使用する多重化免疫組織化学 - Google Patents

エピトープタグを有する組換え抗体を使用する多重化免疫組織化学 Download PDF

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Description

［関連出願との相互参照］
本出願は、２０１７年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／４６１６５１号の出願日の利益と２０１６年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４１８６６７号の出願日の利益と２０１６年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３０５４４０号の出願日の利益を主張し、それら出願の開示を、その全体について出典明示によりここに援用する。
免疫組織化学（ＩＨＣ）及びインサイツハイブリダイゼーション分析（ＩＳＨ）を含む細胞染色法は、組織学的診断及び組織形態学の研究における有用なツールである。ＩＨＣは、組織試料中に存在しうる目的の抗原を検出するために、特異的結合剤又は部分、例えば抗体を用いる。ＩＨＣは、特定の疾病状態又は病状を診断するなどの臨床及び診断用途に広く使用されている。例えば、特定のがん型は、被験体から得られた試料中の特定のマーカー分子の存在に基づいて診断することができる。ＩＨＣは、異なる組織におけるバイオマーカー分布及び局在性を理解するための基礎研究においてもまた広く使用されている。生物学的試料はまた銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、及び蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの、まとめてＩＳＨと呼ばれるインサイツハイブリダイゼーション技術を使用して調べることができる。ＩＳＨは組織中の核酸を検出する一方、ＩＨＣは組織中のタンパク質を検出する点で、ＩＳＨはＩＨＣとは区別される。
生物のゲノムによって発現される多数のタンパク質の特徴付け及び定量化は、プロテオミクスの中心である。多重免疫組織化学（ＭＩＨＣ）は、研究及び診断において幅広い用途を持つ、パラフィン包埋ホルマリン固定組織中の多変量タンパク質標的を検出し分析する主要な未達成の技術的ニーズを表すものである。多重免疫組織化学（ＭＩＨＣ）技術では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織における多変量タンパク質標的を検出し分析するニーズに対処しようとする試みがなされている。効果的なＭＩＨＣ技術は、研究及び診断において幅広い用途を有する。しかしながら、組織中の複数のタンパク質標的の同時及び定量的検出を可能にする効率的かつ再現可能な方法は、あるとしても、わずかでしかない。
エピトープタギング法は、遺伝子産物を既に存在する抗体に対して免疫反応性にするための組換えＤＮＡ法である（Jarvik及びTelmer, Annu. Rev. Genet. 32:601-618, 1998）。典型的には、そのプロセスは、ペプチドタグをコードするヌクレオチド配列を目的の遺伝子中に挿入し、適切な宿主中で遺伝子を発現させることを含む。ついで、タンパク質は、エピトープタグに特異的な抗体とのその相互作用により、検出しかつ／又は精製することができる。このアプローチにより、タグ化されたタンパク質のサイズ並びにその存在量、細胞の位置、翻訳後修飾及び他のタンパク質との相互作用を解明することができる。特に、ペプチドタグを認識する抗体は、タグ化タンパク質の精製及び／又は単離を容易にする。
本開示の一態様は、エピトープタグを発現する組換え抗体（ここでは「エピトープタグ抗体」と称される）である。本開示の別の態様は、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含む抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、スペーサーによって分離されたタンデムエピトープタグ反復を含む。幾つかの実施態様では、エプトープタグコンストラクトは、一般構造−[スペーサー]−[エピトープタグ]−を有し、これは一又は複数回（例えば、１〜１２回）反復されうる。幾つかの実施態様では、前記少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは、抗体の重鎖定常領域のＣ末端又は軽鎖定常領域のＣ末端に発現される。他の実施態様では、前記少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の双方に発現される。
幾つかの実施態様では、エピトープタグは、Ｖ５、ＨＡ、ＶＳＶ、ＡＵ１、ＡＵ５、ＯＬＬＡＳ、Ｅ、Ｅ２、ＫＴ３、ＡＵ１、及びＯＬＬＡＳからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、エピトープタグは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、及び配列番号：９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは２〜８のエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは５つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は４〜１０のエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数と、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数の比は、約２：１から約１：２の範囲である。幾つかの実施態様では、重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数は２〜６のエピトープタグの範囲であり、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数は０〜４のエピトープタグの範囲である。
幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトの少なくとも一つのスペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトの第一スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４の一つから選択され；エピトープタグコンストラクトの第二スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４の別のものから選択される。
幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は約５ｇ／ｍｏｌから約３５ｇ／ｍｏｌの範囲である。幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は、約５ｇ／ｍｏｌから約５０ｇ／ｍｏｌの範囲である。幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は、対応する天然抗体の分子量の３０％未満である。
幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＰＤＬ１、ＦｏｘＰ３、ＨＥＲ２、及びＥＧＦＲ２からなる群から選択される標的に特異的である。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、重鎖定常領域と軽鎖定常領域の末端にコンジュゲートされた二つのエピトープタグコンストラクトを含み、二つのエピトープタグコンストラクトの各々は同じ配列を含み、その配列は配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、及び配列番号：３２からなる群から選択される。
本開示の別の態様は、ここに記載されているもののようなエピトープタグ抗体とエピトープタグ抗体を検出するための検出試薬とを含むキットである。幾つかの実施態様では、検出試薬は、エピトープタグ抗体の発現されたエピトープタグに特異的な抗タグ抗体であり、抗タグ抗体は検出可能部分を含む。幾つかの実施態様では、検出可能部分はフルオロフォアである。幾つかの実施態様では、検出可能部分は酵素であり、酵素のための更なる発色基質が検出キット内に含められる。幾つかの実施態様では、キットは、少なくとも一つの未修飾抗体又は抗体コンジュゲートと、少なくとも一つの未修飾抗体又は抗体コンジュゲートを検出する更なる検出試薬とを更に含む。幾つかの実施態様では、キットは、少なくとも一つの核酸プローブと、少なくとも一つの核酸プローブを検出するためのまた更なる検出試薬とを更に含む。
本発明の別の態様は、試料（例えば、組織試料）中の標的を検出する方法であって、試料を（ここに開示されているものなどの）エピトープタグ抗体に接触させ、抗体の発現されたエピトープタグを使用して標的を検出することを含む方法である。幾つかの実施態様では、試料は二つ以上の異なるエピトープタグ抗体と接触させられ、各エピトープタグ抗体は異なる標的に特異的であり、各抗体は異なるエピトープタグを発現する。幾つかの実施態様では、試料は二つ以上の異なるエピトープタグ抗体と同時に接触させられる。幾つかの実施態様では、本方法は、異なるエピトープタグ抗体を検出するための検出試薬と試料を接触させることを更に含む。幾つかの実施態様では、検出試薬は、エピトープタグ抗体の異なる発現されたエピトープタグに特異的な抗タグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体の異なる発現されたエピトープタグに特異的な抗タグ抗体が同時に導入される。幾つかの実施態様では、抗タグ抗体の各々はフルオロフォアにコンジュゲートされている。幾つかの実施態様では、本方法は、試料を一又は複数の未修飾抗体又は抗体コンジュゲートと接触させることを更に含む。幾つかの実施態様では、前記一又は複数の未修飾抗体又は抗体コンジュゲートは、エピトープタグ抗体の導入前に試料に導入される。
本開示の別の態様は、組織試料を二つ以上のエピトープタグ抗体に同時に接触させる工程であって、各エピトープタグ抗体が異なるエピトープタグを含む工程と；（ｉｉ）組織試料を二つ以上の抗タグ抗体に同時に接触させる工程であって、各抗タグ抗体がエピトープタグ抗体の一つに特異的であり、各抗タグ抗体が異なる検出可能部分を含む工程を含む多重検出法である。幾つかの実施態様では、二つ以上のエピトープタグ抗体が混合物として適用され；二つ以上の抗タグ抗体が混合物として適用される。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、Ｖ５、ＨＡ、ＶＳＶ、ＡＵ１、ＡＵ５、ＯＬＬＡＳ、Ｅ、Ｅ２、ＫＴ３、ＡＵ１、及びＯＬＬＡＳからなる群から選択されるエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、及び配列番号：９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は４〜１０のエピトープタグを含む。
幾つかの実施態様では、抗タグ抗体は蛍光部分にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、蛍光部分は、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、及びテトラピロール誘導体から選択される蛍光部分からなる群から選択される。
幾つかの実施態様では、本方法は、組織試料を少なくとも一つの未修飾抗体と接触させることを更に含む。幾つかの実施態様では、組織試料を少なくとも一つの未修飾抗体と接触させる工程は、組織試料を二つ以上のエピトープタグ抗体と接触させる前に起こる。
本開示の別の態様は、単一組織試料中の複数の標的を検出する方法であって、（ｉ）組織試料を、第一の特異的結合体であって未修飾抗体、抗体コンジュゲート、又はエピトープタグ抗体からなる群から選択される第一の特異的結合体と接触させて第一標的を検出する工程；（ｉｉ）組織試料を第一検出試薬と接触させて第一の特異的結合体を検出する工程；（ｉｉｉ）試料を、第二の特異的結合体であってエピトープタグ抗体を含む第二の特異的結合体と接触させて第二標的を検出する工程；及び（ｉｖ）組織試料を、第二検出試薬であって検出可能部分にコンジュゲートされた抗タグ抗体を含む第二検出試薬と接触させて第二の特異的結合体を検出する工程を含む方法である。
幾つかの実施態様では、方法は、試料を、第三の特異的結合体であって未修飾抗体、抗体コンジュゲート、又はエピトープタグ抗体からなる群から選択される第三の特異的結合体と接触させて第三標的を検出する工程と；組織試料を第三検出試薬と接触させて第三の特異的結合体を検出する工程とを含む。幾つかの実施態様では、第三の特異的結合体はエピトープタグ抗体であり、第二及び第三の特異的結合体は同時に導入される。
幾つかの実施態様では、第一及び第三の特異的結合体は未修飾抗体又は抗体コンジュゲートであり、第一及び第三の特異的結合体は同時に導入される。幾つかの実施態様では、第一及び第三検出試薬の導入は、第二の特異的結合体の導入前に行われる。幾つかの実施態様では、第一及び第三の特異的結合体は未修飾抗体又は抗体コンジュゲートであり、第一及び第三の特異的結合体は逐次的に導入される。
幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、Ｖ５、ＨＡ、ＶＳＶ、ＡＵ１、ＡＵ５、ＯＬＬＡＳ、Ｅ、Ｅ２、ＫＴ３、ＡＵ１、及びＯＬＬＡＳからなる群から選択されるエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、及び配列番号：９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は４〜１０のエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、抗タグ抗体は蛍光部分にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、蛍光部分は、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、及びテトラピロール誘導体から選択される蛍光部分からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、第一、第二、又は第三の特異的結合体の少なくとも一つは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＰＤＬ１、ＦｏｘＰ３、ＨＥＲ２、及びＥＧＦＲ２からなる群から選択される標的に特異的である。
本開示の別の態様は、スペーサーによって分離されたタンデムリピートエピトープタグを含むエピトープタグコンストラクトであって、２〜６のエピトープタグを含むエピトープタグコンストラクトである。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、及び配列番号：９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、及び配列番号：９からなる群から選択される配列の少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトのエピトープタグを分離するスペーサーの少なくとも一つは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトのエピトープタグを分離するスペーサーの少なくとも一つは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は約５ｇ／ｍｏｌから約３５ｇ／ｍｏｌの範囲である。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は約５ｇ／ｍｏｌから約２５ｇ／ｍｏｌの範囲である。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２０のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２２のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２８のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：３０のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：３２のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１６のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１８のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２０のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２２のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２４のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２６のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２８のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：３０のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：３２のものと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：１５の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：１５のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１５のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：１５のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：１７の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：１７のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１７のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：１７のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：１９の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：１９のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１９のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：１９のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：２１の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：２１のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２１のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：２１のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：２３の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：２３のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２３のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：２３のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：２５の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：２５のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２５のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：２５のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：２７の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：２７のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：７のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：２７のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：２９の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：２９のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２９のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：２９のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、（ｉ）配列番号：３１の核酸配列、（ｉｉ）配列番号：３１のものと少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：３１のものと少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、及び（ｉｖ）配列番号：３１のものと少なくとも９７％の同一性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むエピトープタグ遺伝子である。
本開示の別の態様は、二つ以上の抗体を含むパネルであり、抗体の少なくとも一つはエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、パネルは、ＦｏｘＰ３に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ２０に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ６８に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＦｏｘＰ３に対して特異的なエピトープタグ抗体、ｐａｎ−ＣＫに対して特異的なエピトープタグ抗体、ＰＤＬ１に対して特異的なエピトープタグ抗体、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるエピトープタグ抗体を含む。本開示の別の態様は、ＦｏｘＰ３に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ２０に対して特異的なエピトープタグ抗体、及びＣＤ６８に対して特異的なエピトープタグ抗体を含むパネルである。幾つかの実施態様では、パネルは更なる特異的結合体を更に含む。本開示の別の態様は、ＦｏｘＰ３に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ８に対して特異的なエピトープタグ抗体、及びＣＤ６８に対して特異的なエピトープタグ抗体を含むパネルである。幾つかの実施態様では、パネルは更なる特異的結合体を更に含む。本開示の別の態様は、ＦｏｘＰ３に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ８に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ６８に対して特異的なエピトープタグ抗体、及びｐａｎ−ＣＫに特異的な未修飾抗体を含むパネルである。幾つかの実施態様では、パネルは更なる特異的結合体を更に含む。本開示の別の態様は、ＦｏｘＰ３に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ２０に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ６８に対して特異的なエピトープタグ抗体、及びｐａｎ−ＣＫに対して特異的な未修飾抗体を含むパネルである。幾つかの実施態様では、パネルは更なる特異的結合体を更に含む。本開示の別の態様は、ＣＤ２０に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ６８に対して特異的なエピトープタグ抗体、ｐａｎ−ＣＫに対して特異的な未修飾抗体、及びＰＤＬ１に対して特異的な未修飾抗体を含むパネルである。本開示の別の態様は、ＣＤ２０に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ６８に対して特異的なエピトープタグ抗体、ｐａｎ−ＣＫに対して特異的な未修飾抗体、及びＣＤ３に対して特異的な未修飾抗体を含むパネルである。幾つかの実施態様では、パネルは更なる特異的結合体を更に含む。本開示の別の態様は、ＦｏｘＰ３に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ８に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ６８に対して特異的なエピトープタグ抗体、ＣＤ３に対して特異的なエピトープタグ抗体、及びＣＤ２０に対して特異的なエピトープタグ抗体を含むパネルである。幾つかの実施態様では、パネルは更なる特異的結合体を更に含む。
本開示の別の態様は、上記パネル（アッセイ）の何れかを含むキットであって、パネル（アッセイ）のエピトープタグ抗体を検出するための検出試薬を更に含んでいてもよいキットである。
本開示の別の態様は、抗体と少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトとを含むエピトープタグ抗体であり、エピトープタグコンストラクトが、交互のスペーサーとエピトープタグを含み、一般構造−[スペーサー]ａ−[エピトープタグ]ｂ−を有し、ここで、ａ及びｂがそれぞれ１〜１０の範囲の整数であり、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの連続する−[エピトープタグ]−間の距離が８〜１８ｎｍである。一実施態様では、各エピトープタグは偶数のエピトープを有する。ほんの一例として、距離は輪郭の長さ、すなわちペプチド骨格の直線長さによって測定することができる。別の単なる例として、距離は、例えば三次構造のエピトープタグのような、エピトープタグ間の直線長さでありうる。幾つかの実施態様では、距離は１２ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、距離は１０ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、距離は９ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、距離は、エピトープタグ間で抗タグ抗体の二価結合を促進するように最適化される。幾つかの実施態様では、距離は、隣接するエピトープタグ間の二価結合を促進する。他の実施態様では、距離は、非隣接エピトープタグ間の二価結合を促進する。幾つかの実施態様では、抗タグ抗体の第一重鎖の一部はエピトープタグコンストラクトの第一エピトープタグに結合し、同じ抗タグ抗体の第二重鎖の一部はエピトープタグコンストラクトの第二の隣接エピトープタグに結合する。幾つかの実施態様では、抗タグ抗体の第一重鎖の一部はエピトープタグコンストラクトの第一エピトープタグに結合し、同じ抗タグ抗体の第二重鎖の一部はエピトープタグコンストラクトの第二の非隣接エピトープタグに結合する。幾つかの実施態様では、近接しているエピトープ間の距離は、約１２０度から約２２０度、又は約１２０度から約２００度、又は約１４０度から約２００度のエルボー角を有する抗タグ抗体の両アームによってエピトープが到達できるようなものである。幾つかの実施態様では、非近接エピトープ間の距離は、約１２０度から約２２０度、又は約１２０度から約２００度、又は約１４０度から約２００度のエルボー角を有する抗タグ抗体の両アームによってエピトープが到達できるようなものである。
本開示の別の態様は、抗体と少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトとを含むエピトープタグ抗体であり、エピトープタグコンストラクトが、交互のスペーサーとエピトープタグを含み、一般構造−[スペーサー]ａ−[エピトープタグ]ｂ−を有し、ここで、ａ及びｂがそれぞれ１〜１０の範囲の整数であり、−[スペーサー]−が、８〜１８ｎｍの長さであるサイズ（全原子長と結合長の総計）を有する。幾つかの実施態様では、サイズは１２ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、−[スペーサー]−は、エピトープタグ間での抗タグ抗体の二価結合を促進するサイズとされる。幾つかの実施態様では、任意の二つの隣接するエピトープタグは、抗タグ抗体の抗原結合部位間の距離を近似する距離だけ互いに離れて配されている。幾つかの実施態様では、任意の二つの非隣接エピトープタグは、抗タグ抗体の抗原結合部位間の距離を近似する距離だけ互いに離れて配されている。幾つかの実施態様では、第一抗原結合部位は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの第一エピトープタグに結合し、第二抗原結合部位は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの第二の隣接エピトープタグに結合する。幾つかの実施態様では、第一抗原結合部位は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの第一エピトープタグに結合し、第二抗原結合部位は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの第二の非隣接エピトープタグに結合する。幾つかの実施態様では、近接エピトープ間のスペーサー長は、近接エピトープが、約１２０度から約２２０度、又は約１２０度から約２００度、又は約１４０度から約２００度のエルボー角を有する抗タグ抗体の両アームによって到達可能であるようなものである。幾つかの実施態様では、エピトープが、約１２０度から約２２０度、又は約１２０度から約２００度、又は約１４０度から約２００度のエルボー角を有する抗タグ抗体の両アームによって到達可能である配置に非近接エピトープを位置させるスペーサー長が選択される。
本開示の別の態様は、ここに記載されたエピトープタグ抗体と；エピトープタグ抗体が組織試料に結合したときに各エピトープタグ抗体に近接して色素を沈着させるための検出試薬セットとを含むシステムであり、検出試薬セットはエピトープタグ抗体のエピトープタグに特異的な抗タグ特異的検出剤を含む。幾つかの実施態様では、抗タグ特異的検出剤は色素にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、検出試薬セットは、第一酵素と第一の酵素に近接して組織試料上に色素を沈着させる第一酵素と反応性の基質とを更に含む。幾つかの実施態様では、抗タグ特異的結合剤は酵素にコンジュゲートされる。
幾つかの実施態様では、（ｉ）抗タグ特異的結合剤はハプテンにコンジュゲートされ、（ｉｉ）第一酵素はハプテンと反応性の抗体にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、抗タグ特異的結合剤は抗タグ抗体であり、第一酵素は抗タグ抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、抗タグ特異的結合剤は第一の特異的結合対の第一メンバーにコンジュゲートされ、第一酵素は第一の特異的結合対の第二メンバーにコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、第一の特異的結合対の第一メンバーはビオチンであり、第一の特異的結合対の第二メンバーはビオチン結合タンパク質である。幾つかの実施態様では、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、アビジン誘導体（例えば、ニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、第一の特異的結合対の第一メンバーはハプテンであり、第一の特異的結合対の第二メンバーは抗ハプテン抗体である。幾つかの実施態様では、第一の抗タグ特異的結合剤は西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素にコンジュゲートされ；第一酵素は、第一の特異的結合対の第一メンバーにコンジュゲートされ；検出試薬セットはシグナル伝達コンジュゲートを更に含み、シグナル伝達コンジュゲートは第二酵素と反応性のチラミドを含み、チラミドが第一の特異的結合対の第二メンバーにコンジュゲートされている。幾つかの実施態様では、第一の特異的結合対の第一メンバーはビオチン結合タンパク質であり；第一の特異的結合対の第二メンバーはビオチンである。幾つかの実施態様では、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、アビジン誘導体（例えば、ニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、第一の特異的結合対の第一メンバーはハプテンであり、第一の特異的結合対の第二メンバーは抗ハプテン抗体である。幾つかの実施態様では、第一の抗タグ特異的結合剤は第二酵素にコンジュゲートされ；第一酵素は、第一の特異的結合対の第一メンバーにコンジュゲートされ；検出試薬セットはシグナル伝達コンジュゲートを更に含み、シグナル伝達コンジュゲートは第二酵素と反応性のキノンメチドを含み、キノンメチドが第一の特異的結合対の第二メンバーにコンジュゲートされている。幾つかの実施態様では、第一の特異的結合対の第一メンバーはビオチン結合タンパク質であり；第一の特異的結合対の第二メンバーはビオチンである。幾つかの実施態様では、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、アビジン誘導体（例えば、ニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される。
幾つかの実施態様では、第一の特異的結合対の第一メンバーはハプテンであり、第一の特異的結合対の第二メンバーは抗ハプテン抗体である。
幾つかの実施態様では、上記システムは、複数のエピトープタグ抗体（上とここに記載）を含み、複数のエピトープタグ抗体の各々は異なるバイオマーカーに特異的であり、検出試薬セットは複数のエピトープタグ抗体の少なくとも一つに近接して第一色素を、また複数のエピトープタグ抗体の少なくとも別のものに近接して少なくとも第二色素を沈着させるための手段を含む。幾つかの実施態様では、システムは自動スライド染色装置を更に備える。幾つかの実施態様では、システムはスライドスキャナーを更に備える。幾つかの実施態様では、システムは、画像解析システムを更に備える。幾つかの実施態様では、システムは、検査室情報システム（ＬＩＳ）を更に備える。幾つかの実施態様では、ＬＩＳは、試料の一又は複数の組織切片に対して実施された処理工程及び／又は試料の一又は複数の組織切片に対して実施されるべき処理工程を格納するデータベースを含む。幾つかの実施態様では、ＬＩＳは、組織試料の一又は複数の切片上にエピトープタグ抗体又は複数のエピトープタグ抗体と検出試薬とを沈着させるように自動スライド染色装置に指示をする指示セットを更に含む。
本出願人は、本開示に係るエピトープタグ抗体が、同種一次抗体が多重アッセイにおいて使用される場合にしばしば観察される交差反応性を回避することを発見した。その結果、複数のエピトープタグ一次抗体を、多重アッセイにおいて、単一の試薬として一緒にプールすることができる。更に、本出願人は、本開示のエピトープタグ抗体が、化学的に修飾された抗体、例えばハプテンに化学的にコンジュゲートされた抗体よりも安定であり、一貫して製造することができることを見出した。加えて、本出願人は、エピトープタグ抗体が、シグナル増幅法、例えばチラミドシグナル増幅を使用する検出と比較して、タンパク質発現レベルの直接の定量的相関を可能にする線形シグナル検出カスケードを提供することを見出した。而して、本出願人は、複数のエピトープタグ抗体を、単独で又は未修飾抗体、抗体コンジュゲート又は他の特異的結合体と共に用いるＭＩＨＣアッセイが、組織試料中の複数の標的の検出を効果的に可能にし、ＭＩＨＣアッセイが５時間以内に完了し得、ＭＩＨＣはシグナル共局在化を可能にすると考える。
特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも一つの図面が含まれる。カラー図面を伴う本特許又は特許出願の公開物のコピーは、請求と必要な手数料の支払いに応じて、庁に提供される。
図１は３種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイを示す。
図２Ａ〜２Ｄは、３種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイによって染色された組織試料の画像である。 同上
図３は、３種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイを示す。
図４Ａ及び４Ｂは、３種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイによって染色された組織試料の画像である。
図５は、１種の未修飾抗体と３種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイを示す。
図６Ａ〜６Ｆは、１種の未修飾抗体と３種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイによって染色された組織試料の画像である。 同上 同上 同上 同上 同上
図７は、１種の未修飾抗体と３種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイを示す。
図８Ａ〜８Ｂは、１種の未修飾抗体と３種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイによって染色された組織試料の画像である。 同上
図９は、２種の未修飾抗体と２種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイを示す。
図１０Ａ〜１０Ｇは、２種の未修飾抗体と２種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイによって染色された組織試料の画像である。 同上 同上 同上 同上 同上
図１１は、２種の未修飾抗体と２種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイを示す。
図１２Ａ〜１２Ｄは、２種の未修飾抗体と２種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイによって染色された組織試料の画像である。 同上 同上
図１３は、５種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイを示す。
図１４Ａ〜１４Ｊは、５種の異なるエピトープタグ抗体を利用する多重ＩＨＣアッセイによって染色された組織試料の画像である。 同上 同上 同上 同上 同上
図１５Ａ、図１５Ｂ、及び図１５Ｃは、一又は複数のエピトープタグ抗体及び／又は一又は複数の未修飾抗体又は抗体コンジュゲートを利用する多重ＩＨＣアッセイを実施する様々な方法を示すフローチャートを提供する。 同上 同上
図１６Ａ〜１６Ｅは、それらの対応する天然抗体（未修飾抗体）と比較したエピトープタグ抗体に対応する吸光度データを提供する。 同上 同上 同上 同上
図１７Ａ〜１７Ｆは、対応する天然抗体（未修飾抗体）と比較したエピトープタグ抗体の比較染色性能を示す画像を提供する。 同上 同上 同上 同上 同上
図１８は、対応する天然抗体と比較した場合のエピトープタグ抗体の産生収量を示す。
図１９は、エピトープタグ抗体の安定性であって、加速安定性試験研究によって決定される安定性を示す；短い期間（例えば５〜１０日）の間に高温（すなわち、３７℃と４５℃）で収集されたデータに基づいて意図された保存条件（すなわち４℃）における試験抗体（希釈剤９０１０３中１ｕｇ／ｍｌ濃度）のリアルタイム安定性を予測するためにアレニウスモデルに従った。
図２０Ａ〜２０Ｆは、エピトープタグコンストラクトの構造と、エピトープタグコンストラクトを構成するエピトープタグとスペーサーとの間の空間的及び構造的関係を示す。 同上 同上 同上 同上 同上
図２１は、段階的アッセイ手順を示す。
図２２は、段階的アッセイ手順を示す。
図２３は、段階的アッセイ手順を示す。 同上 同上
図２４Ａは、重鎖と軽鎖の両方に４つのタグを有する抗体が、重鎖にのみ又は軽鎖にのみに４つのタグを有する同じ抗体よりもかなり遅い速度で解離することを示すＢＬＩアッセイからの動態データを提供する。
図２４Ｂは、重鎖と軽鎖の両方に４つのタグを有する抗体の利点を示す結合活性効果の比較を提供する。
図２４Ｃは、ＨＥＲ２ Ｈ０ＫＸでのＭｓＡｎｔｉＶ５認識を示し、ここで、軽鎖タグは、重鎖タグと同様のＢＬＩ応答を示す；ＭｓＡｎｔｉＶ５は、Ｈ０Ｋ３のＧｔＡｎｔｉＲｂに対してより速いオン速度及び類似のＢＬＩ応答を示した；図は、ＢＬＩ応答がおよそ２つないし３つのＶ５タグで飽和したことを更に示している（組織染色結果と一致）。また、Ｖ５タグの負荷が高いほど、抗Ｖ５解離の減少が観察された。
図２５Ａは、ＤＬＳ／ＤＳＣ試験に使用された所定のエピトープタグ抗体の構造を示す。
図２５Ｂは、ＢＳＡが試料から定量的に除去されたことを示す（ＳＤＳページ）。
図２５Ｃは、ＤＬＳ測定データを提供する。
図２５Ｄ及び図２５Ｆは、様々なＤＬＳ温度勾配を示す。
図２５Ｆは、ＤＬＳ分析の結果を示す。
図２６は、幾つかの異なるエピトープタグ抗体とそれらの各タグなし抗体に対する動的光散乱データを示す。 同上 同上
図２７Ａ〜２７Ｃは、様々なエピトープタグ抗体とそれらの各タグなし抗体に対するＳＥＣデータを示す。 同上 同上
図２８Ａ〜２８Ｅは、様々なエピトープタグ抗体とそれらの各タグなし抗体に対するＤＳＣデータを示す。 同上 同上 同上 同上
図２９Ａ〜２９Ｅは、様々なエピトープタグ抗体とそれらの各タグなし抗体に対するＤＬＳデータを示す。 同上 同上 同上 同上
図３０は、アナライト分子の受容体分子への結合を測定するための基本的ＳＰＲ実験の概略図を提供する。
図３１Ａ〜３１Ｅは、単独で化学的にビオチン化されたペプチド性の２ｋＤａアナライトに対するウサギモノクローナル抗体の結合挙動の動態評価を示す。Ｍａｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿ｗｔ及びＭａｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿Ｈ１Ｌ２は、１：１の結合化学量論を示す。ｂｉ−１又はｂｉ−１４にビオチン位置を有するペプチドアナライト間で、観察される動態差はなかった（図３１Ａ）。 Ｍａｂ＜Ｅ＞ｒＲｂ−Ｊ２６＿ｗｔ及びＭａｂ＜Ｅ＞ｒＲｂ−Ｊ２６＿Ｈ２Ｌ５は、３桁のナノモル親和性及び１：２の結合化学量論ＭＲ＝２を示す（図３１Ｂ）。 Ｍａｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿ｗｔ及びＭａｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿Ｈ５Ｌは２〜３桁のナノモル親和性を示し、１：１の結合化学量論ＭＲ＝１を示す。位置ｂｉ−１にビオチンを有するペプチドは位置ｂｉ−１２にビオチン化を伴うものよりも高い親和性で認識された（図３１Ｃ）。 Ｍａｂ＜ＨＡ＞ｒＲｂ−Ｊ１５＿Ｈ２Ｌ２は、１：１の結合化学量論で３桁のナノモル範囲の親和性を示した。ビオチンが位置ｂｉ−１又は位置ｂｉ−９にあるペプチドアナライト間に動態差は観察されなかった（図３１Ｄ）。 Ｍａｂ＜ＶＳＶ−Ｇ＞ｒＲｂ−Ｊ１１０＿Ｈ５Ｌ２は、３桁のナノモル親和性及び１：２の結合化学量論を示す（図３１Ｅ）。
図３２Ａ〜３２Ｄは、各タグ抗体アナライトに対するウサギモノクローナル抗タグ抗体の結合挙動の動態評価を示す：ＣＤ６８ ＨＬｖｓｖ、ＣＤ６８ ＨｖｓｖＬｖｓｖ、ＣＤ６８ ＨｖｓｖＬ、ＣＤ６８ ＨＬ（図３２Ａ）； ＣＤ８ ＨＬ、ＣＤ８ Ｈｅ２Ｌ（図３２Ｂの上図）；ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ Ｈｅ２Ｌ、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨＬｅ２、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ Ｈｅ２Ｌｅ２、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨＬ（図３２Ｂの下図）。 ＣＤ２０ ＨＬ、ＣＤ２０ ＨｈａＬ、ＣＤ２０ ＨＬｈａ、ＣＤ２０ ＨｈａＬｈａ（図３２Ｃの上図）；ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨｈａＬ、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨＬｈａ、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨｈａＬｈａ、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨＬ（図３２Ｃの下図）。 ＦｏｘＰ３ ＨＬ、ＦｏｘＰ３ Ｈ５ｖ５Ｌ、ＦｏｘＰ３ ＨＬ５ｖ５、ＦｏｘＰ３ Ｈ５ｖ５Ｌ５ｖ５、ＦｏｘＰ３ Ｈ４ｖ５Ｌ、ＦｏｘＰ３ ＨＬ４ｖ５、ＦｏｘＰ３ Ｈ４ｖ５Ｌ４ｖ５（図３２Ｄ）。
（Ａ）組換えエピトープタグ抗体の概略図。（Ｂ）連続的に沈着された一次抗体及び抗種抗体コンジュゲートの連続的除去を伴わない、５重蛍光多重検出の検出戦略。酵素媒介性フルオロフォア沈着に加えて、更なるシグナル増幅構成は、（Ｃ）に記載されるようにハプテンコンジュゲート抗タグ抗体及びフルオロフォアコンジュゲート抗ハプテン抗体の使用を含む。 同上
図３３Ｂは、ＰＤ−Ｌ１（シアン）、ＣＤ３（金）、ＣＤ８（緑）、ＦｏｘＰ３（赤）、及びＣＤ６８（紫）に対するエピトープタグ抗体を用いてプローブされたＦＦＰＥ ＮＳＣＬＣ切片を提供する。マーカーは、図１に記載されているように、組織成分上へのフルオロフォアのフルオロフォアコンジュゲート抗タグ抗体及び抗体−酵素コンジュゲート媒介性沈着によって検出された。擬似呈色後に６つのキューブフィルターを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１を使用してスライドをスキャンし、Ｚｅｎソフトウェアで可視化した。色は、ＣＤ６８を除いて、色スペクトルのフルオロフォア発光波長に基づいて割り当てた。細胞核はＤＡＰＩ色素（青）で標識された。サーモン色の物は、複数チャンネルで自己蛍光を発する赤血球（ＲＢＣ）である。
図３３Ｃは、（Ａ）タグ抗ＣＤ８抗体及び（Ｂ）天然抗ＣＤ８抗体、（Ｃ）タグ抗ＦｏｘＰ３抗体及び（Ｄ）天然抗ＦｏｘＰ３抗体、及び（Ｅ）タグ抗ＣＤ６８抗体及び（Ｆ）天然抗ＣＤ６８抗体を用いてプローブされたＦＦＰＥ肺腫瘍切片を提供する。マーカーは、（Ａ、Ｃ、及びＥ）フルオロフォアコンジュゲート抗タグ抗体又は（Ｂ、Ｄ、及びＦ）ＶＥＮＴＡＮＡ ｕｌｔｒａＶｉｅｗユニバーサルＤＡＢ検出キットを使用して検出された。蛍光染色したスライドをＶＥＮＴＡＮＡ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＱＤ ＤＡＰＩで共染色した。
図３３Ｄは、（Ａ）タグ抗ＰＤ−Ｌ１（ＳＰ２６３）及び（Ｂ）天然抗ＰＤ−Ｌ１（ＳＰ２６３）抗体又は（Ｃ）タグ抗ＣＤ３抗体及び（Ｄ）天然抗ＣＤ３抗体を用いてプローブされたＦＦＰＥ肺腫瘍切片を提供する。マーカーは、（Ａ及びＣ）酵素コンジュゲート抗タグ抗体及びＱＭ−及びＴＳＡ−フルオロ沈着、（Ｂ）ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ ＤＡＢ ＩＨＣ、又は（Ｄ）ＶＥＮＴＡＮＡ ｕｌｔｒａＶｉｅｗユニバーサルＤＡＢ検出キットを使用して検出した。
図３３Ｅは、ＤＡＢと比較して５重蛍光アッセイを使用して染色された各マーカーのカバレッジを示す１０のＮＳＣＬＣ症例のボックスプロットを提供する。マーカーは、図３３Ａ〜３３Ｄに記載されるように検出された。スキャンされた蛍光及びＤＡＢ全スライド画像は、輝度調整後に更なる加工なしに、病理学者によって評価された。ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ８蛍光とＤＡＢ染色との間で不一致を示した少数の症例は、肺の広範な結合組織に関連した異常に高い自己蛍光を有していた。結合自己蛍光は、シグナルアンミキシング手順を使用してデジタル的に除去することができた。
図３４Ａは、０．５μＭの抗ＰＤ−Ｌ１−Ｅ２（Ｈ４Ｋ０）、０．５μＭの抗Ｅ２、及び０．５：１〜６：１の様々なモル比で０．５μＭの抗ＰＤ−Ｌ１−Ｅ２と混合された抗Ｅ２のサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
図３４Ｂは、０．５μＭの抗ＣＤ８−Ｅ２（Ｈ４Ｋ０）、０．５μＭの抗Ｅ２、及び０．５：１〜６：１の様々なモル比で０．５μＭの抗ＣＤ８−Ｅ２と混合された抗Ｅ２のサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
図３４Ｃは、０．５μＭの抗ＣＤ３−Ｅ（Ｈ４Ｋ０）、０．５μＭの抗Ｅ、及び０．５：１〜６：１の様々なモル比で０．５μＭの抗ＣＤ３−Ｅと混合された抗Ｅのサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
図３４Ｄは、０．５μＭの抗ＦｏｘＰ３−Ｖ５（Ｈ４Ｋ０）、０．５μＭの抗Ｖ５及び０．５：１〜６：１の様々なモル比で０．５μＭの抗ＦｏｘＰ３−Ｖ５と混合された抗Ｖ５のサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
図３４Ｅは、０．５μＭの抗ＣＤ６８−ＶＳＶ−Ｇ（Ｈ４Ｋ０）、０．５μＭの抗ＶＳＶ−Ｇ、及び０．５：１〜６：１の様々なモル比で０．５μＭの抗ＣＤ６８−ＶＳＶ−Ｇと混合された抗ＶＳＶ−Ｇのサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
図３４Ｆは、０．５μＭの抗ＣＤ８−ＡＵ５（Ｈ４Ｋ０）、０．５μＭの抗ＡＵ５、及び０．５：１〜６：１の様々なモル比で０．５μＭの抗ＣＤ８−ＡＵ５と混合された抗ＡＵ５のサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
図３４Ｇは、０．５μＭの抗ＦｏｘＰ３−Ｖ５（Ｈ５Ｋ０）、０．５μＭの抗Ｖ５、及び０．５：１〜８：１の様々なモル比で０．５μＭの抗ＦｏｘＰ３−Ｖ５と混合された抗Ｖ５のサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
図３５Ａは、エピトープタグ抗体の発現されたエピトープタグに対する抗タグ抗体の二価結合を示し、結合は隣接エピトープタグ間で起こる。
図３５Ｂは、エピトープタグ抗体の発現されたエピトープタグに対する抗タグ抗体の二価結合を示し、結合は非隣接エピトープタグ間で起こる。
一般に、本開示は、エピトープタグ抗体、並びに生物学的試料、例えば組織試料中の一又は複数の標的を検出するためにエピトープタグ抗体を用いる方法に関する。
ここで使用される場合、「a」、「an」及び「the」という単数形の用語は、文脈が明らかに他の定義を示すものでない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「or」という単語は、文脈が明らかに他の定義を示すものでない限り、「and」を含むことが意図される。
ここで使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する（having）」等の用語は交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（comprises）」、「含む（includes）」、「有する（has）」等は交換可能に使用され、同じ意味を有する。詳細には、前記用語の各々は、「含む（comprising）」の共通の米国特許法の定義と一致するように定義され、従って、「少なくとも次のもの」を意味するオープンな用語であると解釈され、また更なる特徴、限定、態様等々を排除するものではないと解釈される。従って、例えば、「コンポーネントａ、ｂ、及びｃを有する装置」は、装置が少なくともコンポーネントａ、ｂ及びｃを含むことを意味する。同様に、「工程ａ、ｂ、及びｃを含む方法」という語句は、方法が少なくとも工程ａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。更に、工程及びプロセスは、ここでは特定の順序で概説されうるが、当業者は、順序付け工程及びプロセスが変わりうることを認識するであろう。
ここで使用される場合、「親和性」という用語は、２つの分子の非ランダム相互作用を指す。「親和性」という用語は、相互作用の強さを指し、解離定数（ＫＤ）として定量的に表すことができる。２つの分子の一方又は両方がペプチド（例えば、抗体）であってもよい。結合親和性（すなわち、ＫＤ）は、標準的な技術を使用して決定することができる。例えば、親和性は、個々のエピトープと抗体分子との結合強度の尺度でありうる。
ここで使用される場合、「抗体」という用語は、例を挙げると、限定しないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、それらの組み合わせ、及び任意の脊椎動物（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ及びマウスなどの哺乳類）において免疫応答中に産生される同様の分子、並びに抗体断片（例えば、当該分野で知られているＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片及びＦａｂ断片）、他の分子への結合を実質的に排除するまで対象の分子（又は対象の非常に類似した分子の群）に特異的に結合する組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、及びトリアボディ（当該技術分野で知られている）、及びラクダ科抗体）を含む、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子を意味する。抗体は抗原のエピトープを特異的に認識して結合する少なくとも軽鎖又は重鎖の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを更に意味する。抗体は、可変重鎖（ＶＨ）領域及び可変軽鎖（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域をそれぞれが有する、重鎖と軽鎖から構成されうる。併せて、ＶＨ領域とＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原の結合に関与する。抗体という用語はまたインタクトな免疫グロブリンと、当該技術分野でよく知られているそれらのバリアント及び部分を含む。
ここで使用される場合、「抗原」とは、抗体分子又はＴ細胞受容体のような特異的な体液性又は細胞性免疫の産物が特異的に結合しうる化合物、組成物、又は物質を意味する。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖（例えばオリゴ糖）、脂質、及びホルモン、並びに高分子、例えば複合糖質（例えば、多糖類）、リン脂質、核酸及びタンパク質を含む任意のタイプの分子でありうる。
ここで使用される場合、「結合活性（アビディティー）」という用語は、二つ以上の分子の協同的及び相乗的結合を指す。「結合活性」は、二つ以上の分子集団間の複合体の全体的な安定性、すなわち相互作用の機能的結合強度を指す。
ここで使用される場合、「生物学的試料」又は「組織試料」は、限定されないが、単細胞生物、例えば細菌、酵母、原生動物、及びとりわけアメーバ、多細胞生物（健康な又は見かけ上健康なヒト被験体又はがんなどの診断又は研究される状態又は疾患に罹患したヒト患者由来の試料を含む植物又は動物など）を含む任意の生物から得られ、排泄され又は分泌された任意の固体又は流体試料でありうる。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、眼房水又は硝子体液、又は任意の体分泌物、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍又は任意の他の感染又は炎症部位から得られる流体）から得られた生物学的流体、又は関節（例えば、正常な関節又は疾患によって冒された関節）から得られた流体でありうる。生物学的試料はまた（腫瘍生検などの生検又は剖検検体を含む）任意の器官又は組織から得られた試料であり得、あるいは細胞（初代細胞又は培養細胞の何れも）又は任意の細胞、組織又は器官によって条件付けされた培地を含みうる。試料は、メラノーマ、腎細胞癌、及び非小細胞肺がん由来のものを含む腫瘍試料でありうる。幾つかの実施態様では、試料は、組織試料内のバイオマーカー（例えば、タンパク質又は核酸配列）を含む標的を検出することによって、がんについて分析される。開示された方法の記載された実施態様は、「正常」試料又は「対照」試料と称される異常、疾病、疾患等々を有さない試料にもまた適用されうる。例えば、複数の位置から組織試料を採取することによって被験体をがんについて検査することは有用であり得、これらの試料を対照として使用し、後の試料と比較して特定のがんがその原発点を越えて広がったか否かを判定することができる。
ここで使用される場合、「コンジュゲート」は、より大きなコンストラクト中に共有結合的に連結された二以上の分子（及び／又はナノ粒子などの物質）を指す。幾つかの実施態様では、コンジュゲートは、一又は複数の他の分子、例えば一又は複数の他の生体分子に共有結合的に連結された一又は複数の生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、糖、多糖、脂質、糖タンパク質、及びリポタンパク質）を含む。他の実施態様では、コンジュゲートは、一又は複数の検出可能な標識（例えば、フルオロフォア、発光団、蛍光ナノ粒子、ハプテン、酵素及びそれらの組み合わせ）に共有結合的に連結された一又は複数の特異的結合分子（例えば抗体）を含む。
ここで使用される場合、「検出プローブ」は、特定の標的（例えば、核酸配列、タンパク質等々）に結合する核酸プローブ又は一次抗体を含む。検出プローブは、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光又は蛍光剤、ハプテン（限定されないがＤＮＰを含む）、及び酵素などの直接検出用の標識を含みうる。あるいは、検出プローブは、標識又はタグを含んでいなくてもよく、間接的に（例えば、検出プローブに特異的な二次抗体を用いて）検出されうる。
ここで使用される場合、「ハプテン」は、抗体と特異的に結合することができるが、典型的には、担体分子との組合わせ以外では実質的に免疫原性であることができない小分子である。幾つかの実施態様では、ハプテンには、限定されないが、ピラゾール（例えば、ニトロピラゾール）；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン；トリテルペン；尿素（例えば、フェニル尿素）；チオ尿素（例えば、フェニルチオ尿素）；ロテノンとロテノン誘導体；オキサゾール（例えば、オキサゾールスルホンアミド）；チアゾール（例えば、チアゾールスルホンアミド）；クマリンとクマリン誘導体；及びシクロリグナンが含まれる。ハプテンの更なる非限定的な例には、チアゾール；ニトロアリール；ベンゾフラン；トリペルペン；及びシクロリグナンが含まれる。ハプテンの特定の例には、ジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びフルオレセイン、並びにそれらの任意の誘導体又はアナログが含まれる。他のハプテンは、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第８８４６３２０号；第８６１８２６５号；第７６９５９２９号；第８４８１２７０号；及び第９０１７９５４号に記載されている。ハプテン自体は、直接的な検出に適している場合があり、すなわち、ハプテンは検出のための適切なシグナルを発しうる。
ここで使用される場合、ここで使用される「流体力学的半径」という用語は、与えられた構造として等価の流体力学的特性を有する球の半径を示す。流体力学的半径は、ストークス・アインシュタイン方程式による拡散係数から導出される。
ここで使用される場合、「免疫組織化学」は、抗体のような特異的結合剤と抗原の相互作用を検出することによって、試料中の抗原の存在又は分布を決定する方法を指す。試料は、抗体−抗原結合を可能にする条件下で抗体と接触させる。抗体−抗原結合は、抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識（直接検出）によって又は一次抗体に特異的に結合する二次抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識（間接検出）によって検出することができる。
ここで使用される場合、「多重（マルチプレックス）」、「多重化（マルチプレックスト）」又は「多重化（マルチプレキシング）」は、試料中の複数の標的を同時発生的に、実質的に同時に、又は順次検出することを意味する。多重化は、個々に、また任意かつ全ての組み合わせで、複数の区別される核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）及びポリペプチド（例えば、タンパク質）を同定及び／又は定量することを含みうる。
ここで使用される場合、「一次抗体」という用語は、組織試料中の標的タンパク質抗原に特異的に結合する抗体を指す。一次抗体は、一般に免疫組織化学手順において使用される第一抗体である。それぞれここに記載されるエピトープタグ抗体、未修飾抗体、又は抗体コンジュゲートが一次抗体の例である。よって、一次抗体は、組織試料内の標的を検出するための「検出プローブ」となりうる。
ここで使用される場合、ここでの「二次抗体」という用語は、検出プローブ又はその一部（例えば、ハプテン又は一次抗体）に特異的に結合し、それにより検出プローブと存在するならばその後の試薬（例えば、標識、酵素等々）との間に架橋を形成する抗体を意味する。二次抗体を使用して、検出プローブ、例えば一次抗体を間接的に検出することができる。二次抗体の例には、それぞれここに記載される抗タグ抗体、抗種抗体、及び抗標識抗体が含まれる。
ここで使用される場合、「特異的結合体」という用語は、特異的結合対のメンバーを言う。特異的結合対は、それらが他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子対である（例えば、特異的結合対は、生物学的試料中の他の分子との結合対の二つのメンバーの何れかに対する結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ−１大きく、１０４Ｍ−１大きく又は１０５Ｍ−１大きい結合定数を有しうる）。特異的結合部分の特定の例は、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンのようなアビジン、及びプロテインＡ）を含む。特異的結合部分はまたそのような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（又はその一部）を含みうる。特異的結合体は、上記の一次抗体、又は核酸プローブを含む。
ここで使用される場合、「標的」とは、存在、位置及び／又は濃度が決定されるか又は決定されうる任意の分子を意味する。標的の例には、ここに開示されるもののような核酸配列及びタンパク質が含まれる。
［エピトープタグ抗体］
本開示の一態様は、一又は複数の分子的に操作されたエピトープタグを発現する組換え抗体（「エピトープタグ抗体」）である。一般に、エピトープタグ（短いアミノ酸配列、すなわち抗原性ペプチド配列）の発現は、エピトープタグ抗体が（例えば、ここに更に記載される抗タグ抗体を用いて）認識され及び／又は検出されることを可能にする。従って、ここに開示されるエピトープタグ抗体は、多重免疫組織化学アッセイを含む免疫組織化学アッセイでの使用に適しており、それにより、組織試料内の標的が検出されうるように一次抗体又は検出プローブとして使用されうる。
エピトープタグ抗体は、任意の天然抗体に由来しうる。従って、天然抗体又は未修飾抗体のように、エピトープタグ抗体は、特定の標的に対して特異性を示す。例えば、エピトープタグ抗体は、分化マーカーのクラスター（例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８）、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２に特異的な抗体に由来しうる。他の非限定的な標的、例えば、エピトープタグ抗体が検出目的のために開発されうるタンパク質標的が、ここに更に開示される。
一般に、エピトープタグ抗体は、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、エピトープタグコンストラクトは交互のスペーサーとエプトープタグを含む。ここで使用される場合、「エピトープタグコンストラクト」という用語は、交互のエプトープタグとスペーサー、例えばスペーサーにより分離されたタンデムリピートエプトープタグを含むアミノ酸配列を意味する（例えば、図２０Ａ参照）。
説明目的のみのために、本開示のエピトープタグ抗体は、次の構造を有しうる：
Ａｂ−([スペーサー]−[エピトープタグ])ｎ−[スペーサー]（ここで、ｎは１〜２０の範囲の整数であり、「Ａｂ」は抗体であり、「エピトープタグ」及び「スペーサー」はここで定義された通りであり、各「スペーサー」は同一でも異なっていてもよく、([スペーサー]−[エピトープタグ])はエピトープタグコンストラクトの一例を表す。
エピトープタグ抗体は、エピトープタグとスペーサーが重鎖定常領域の末端、軽鎖定常領域の末端、又は重鎖定常領域と軽鎖定常領域の両末端に取り込まれるように操作される。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、抗体の重鎖定常領域のＣ末端、抗体の軽鎖定常領域のＣ末端、又は抗体の重鎖及び軽鎖定常領域の両Ｃ末端に含まれる。
他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、抗体の重鎖定常領域のＣ末端のみに含まれる。他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、抗体の軽鎖定常領域のＣ末端のみに含まれる。幾つかの実施態様では、重鎖定常領域はここでは表記「Ｈ」によって特定される一方、軽鎖定常領域はここでは表記「Ｋ」で特定される。例えば、表記Ｈ４Ｋ４は、重鎖定常領域の末端に４つのエピトープタグを含み、軽鎖定常領域の末端に更なる４つのエピトープタグを含むエピトープタグ抗体を意味しうる。同様に、表記Ｈ４Ｋ０は、重鎖定常領域の末端に４つのエピトープタグを含み、軽鎖定常領域の末端にエピトープタグを含まないエピトープタグ抗体を意味しうる。
エピトープタグが抗体の機能を損なわない限り（すなわち、抗体が標的に結合する能力を妨げ、又は抗体が検出されることを妨げない限り）任意のタイプのエピトープタグを抗体に組み込むことができる。幾つかの実施態様では、エピトープタグとＩｇＧ上のその構成（タグ数、ＩｇＧ上のタグの位置）が、組み込まれている抗体の任意の三次構造の破壊を最小限に抑えるように選択中に考慮される。幾つかの実施態様では、エピトープタグは、ヒトタンパク質との交差反応性を有さないように選択される。幾つかの実施態様では、エピトープタグは約６から約２０の塩基を含むヌクレオチド配列を有する。他の実施態様では、エピトープタグは、約６から約１６の塩基を含むヌクレオチド配列を有する。エピトープタグの配列は、天然に生じる供給源に由来してもよく、又は合成であってもよい。
幾つかの実施態様では、エピトープタグは、ＶＳＶエピトープタグ（配列番号：１）、ＡＵ５エピトープタグ（配列番号：２）、Ｅエピトープタグ（配列番号：３）、Ｖ５エピトープタグ（配列番号：４）、ＨＡエピトープタグ（配列番号：５）、又はＥ２エピトープタグ（配列番号：６）から選択される。エピトープタグ抗体内に組み込まれうる他の適切なエピトープタグには、ＦＬＡＧ、ＡＵ１（配列番号：８）、ＯＬＬＡＳ（配列番号：９）、及びＫＴ３（配列番号：７）が含まれる。当然のことながら、これらの例示されたエピトープタグは、当業者に知られている手順に従って改変されうる。
エピトープタグ抗体（又はエピトープタグ抗体に組み込まれた任意のエピトープタグコンストラクト）は、一つのエピトープタグ又は複数のエピトープタグを含むか又は発現しうる。一般に、本開示のエピトープタグ抗体は、エピトープタグが抗体の機能を妨害しないか、又は低下させない限り、任意の数のエピトープタグを含みうる。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、少なくとも２つのエピトープタグを含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、少なくとも３つのエピトープタグを含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、少なくとも４つのエピトープタグを含む。更なる実施態様では、エピトープタグ抗体は、２〜２０のエピトープタグを含む。なお更なる実施態様では、エピトープタグ抗体は、２〜１２のエピトープタグを含む。なお更なる実施態様では、エピトープタグ抗体は、３〜９のエピトープタグを含む。特定の一実施態様では、エピトープタグ抗体は、４つのエピトープタグを含む。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は、５つのエピトープタグを含む。
幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトは２〜１０のエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトは２〜８のエピトープタグを含む。他の実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトは２〜５のエピトープタグを含む。更に他の実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトは４又は５のエピトープタグを含む。
幾つかの実施態様では、重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれた（又は「発現された」）エピトープタグの数は、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数より多い（すなわち、重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグコンストラクトを構成するエピトープタグの数は、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグコンストラクトを構成するエピトープタグの数より多い）。他の実施態様では、重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数は、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数より少ない（すなわち、重鎖定常領域のＣ末端にエピトープタグコンストラクトを構成するエピトープタグの数は、軽鎖定常領域のＣ末端のエピトープタグコンストラクトを構成するエピトープタグの数より少ない）。
幾つかの実施態様では、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数に対する重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数の比は、４：１〜約１：４の範囲である。他の実施態様では、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数に対する重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数の比は、２：１〜約１：２の範囲である。更に他の実施態様では、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数に対する重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数の比は、１．５：１〜約１：１．５の範囲である。更なる実施態様では、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数に対する重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数の比は約１：１である。
幾つかの実施態様では、２〜８のエピトープタグが重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれ、２〜８のエピトープタグが軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれている。幾つかの実施態様では、２〜８のエピトープタグが重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれ、０〜５のエピトープタグが軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれている。他の実施態様では、２〜６のエピトープタグが重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれ、０〜４のエピトープタグが軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれている。他の実施態様では、４又は５のエピトープタグが重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれ、２〜５のエピトープタグが軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれている。更に他の実施態様では、４又は５のエピトープタグが重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれ、０、１、又は２のエピトープタグが軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれている。更なる実施態様では、４又は５のエピトープタグが重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれ、軽鎖定常領域のＣ末端にはエピトープタグが組み込まれていない。他の実施態様では、少なくとも２のエピトープタグが軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれ、少なくとも１のエピトープタグが重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれている。他の実施態様では、少なくとも３のエピトープタグが軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれ、少なくとも１のエピトープタグが重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれている。
特定の一実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ１Ｋ０を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ２Ｋ０を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ３Ｋ０を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ４Ｋ０を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ５Ｋ０を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ０Ｋ１を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ０Ｋ２を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ０Ｋ３を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ０Ｋ４を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ０Ｋ４を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ２Ｋ２を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ３Ｋ３を有する。別の特定の実施態様では、エピトープタグ抗体は構成Ｈ４Ｋ４を有する。
ここに記載のように、エピトープタグはスペーサーによって互いに分離されている。幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトが各定常領域の末端に直接に結合するのではなくスペーサーに「結合」するように、重鎖及び／又は軽鎖定常領域の末端にスペーサーが提供される。幾つかの実施態様では、更なる配列（例えば、連結又は結合配列）が、重鎖及び／又は軽鎖定常領域の末端の間に提供され、スペーサーと（又はエピトープタグコンストラクトと）末端を架橋する。同様に、幾つかの実施態様では、少なくとも一つの更なるスペーサーが、エピトープタグコンストラクトの末端エピトープタグの後であるが、任意の停止コドン配列の前に提供される。図２０Ａ〜２０Ｆは、エピトープタグコンストラクトの構造と、エピトープタグ（四角い枠内に示されている）とスペーサー（エピートータグ間の配列）の間の空間的及び構造的関係とを更に示している。図２０Ａ〜２０Ｆは「エピトープタグ遺伝子」（ここで定義）内の制限部位と停止コドンの位置をまた示している。
スペーサー自体は、スペーサーのアミノ酸配列（又はその結果得られる三次構造）が抗体の任意のフォールディングタンパク質ドメインを妨害しないように選択される。幾つかの実施態様では、スペーサーは、約２０塩基から約６０塩基を有する核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、任意のスペーサーのサイズは、エピトープタグ抗体への複数の抗タグ抗体の結合を促進するためにスペーサーがエピトープタグを十分に分離するように選択される。
幾つかの実施態様では、スペーサーは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、又は配列番号：１５から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列を含むアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列に対して少なくとも７５％を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列を含むアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列に対して少なくとも８０％を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列を含むアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列に対して少なくとも８５％を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列を含むアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列に対して少なくとも９０％を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列を含むアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列に対して少なくとも９５％を有するアミノ酸配列を含む。
エピトープタグを分離するスペーサーは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、エピトープタグコンストラクトが５つのエピトープタグを含む場合、コンストラクトの５つのエピトープタグ間のスペーサーは同じでも異なっていてもよい。幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトのエピトープタグを分離するスペーサーは全て同じである。他の実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトのエピトープタグを分離するスペーサーは全て互いに異なっている。更に他の実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトのエピトープタグを分離するスペーサーの少なくとも幾つかは同じである。幾つかの実施態様では、任意のスペーサーの一部は別のスペーサーの一部と同じであっても異なっていてもよい。幾つかの実施態様では、任意のスペーサーの任意の配列の一部は、別のスペーサーの配列の一部と同じであってもよい。幾つかの実施態様では、スペーサーの幾つかの少なくとも一部は同じである。
幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、又は配列番号：１３、配列番号：１４の配列を含む少なくとも一つのスペーサーを含む（又はスペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列を含むアミノ酸配列を含む）。他の実施態様では、任意のエピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の一つの配列を含む少なくとも一つのスペーサー（又はスペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列を含むアミノ酸配列を含む）と；配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の別のものの配列を含む少なくとも第二のスペーサーを含む（又はスペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の配列を含むアミノ酸配列を含む）。
幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は、約５ｇ／ｍｏｌから約３５ｇ／ｍｏｌの範囲である。他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は、約５ｇ／ｍｏｌから約３０ｇ／ｍｏｌの範囲である。他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は、約１０ｇ／ｍｏｌから約３０ｇ／ｍｏｌの範囲である。他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は、約５ｇ／ｍｏｌから約２５ｇ／ｍｏｌの範囲である。他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は、約５ｇ／ｍｏｌから約２０ｇ／ｍｏｌの範囲である。他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量は、約７．５ｇ／ｍｏｌから約１５ｇ／ｍｏｌの範囲である。他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量の範囲は２０ｇ／ｍｏｌを超えない。他の実施態様では、エピトープタグコンストラクトの分子量の範囲は１５ｇ／ｍｏｌを超えない。
幾つかの実施態様では、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの連続する−[エピトープタグ]−間の距離は約８ｎｍから約１８ｎｍの範囲である。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの連続する−[エピトープタグ]−間の距離は１８ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの連続する−[エピトープタグ]−間の距離は１６ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの連続する−[エピトープタグ]−間の距離は１４ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの連続する−[エピトープタグ]−間の距離は１２ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの連続する−[エピトープタグ]−間の距離は１１ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの連続する−[エピトープタグ]−間の距離は１０ｎｍ未満である。幾つかの実施態様では、−[スペーサー]−は、隣接するエピトープタグ間の抗タグ抗体の二価結合を容易にするようなサイズとされている（図３５Ａを参照）。而して、幾つかの実施態様では、任意の二つの隣接するエピトープタグは、抗タグ抗体の抗原結合部位間の距離を近似する距離だけ互いに離間されている。幾つかの実施態様では、第一抗原結合部位は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの第一エピトープタグに結合し、第二抗原結合部位は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトの第二の隣接エピトープタグに結合する。
スペーシングが抗体の二価結合を容易にしうるが、当業者は、抗体、例えば抗タグ抗体がエピトープタグを「スキップ」し、非隣接エピトープタグに結合することもまた可能であることを理解するであろう（図３５Ｂ参照）。例えば、エピトープタグ抗体は、第一及び第二エピトープタグが互いに隣接している（しかし、もちろん、スペーサーによって分離される）第一、第二、及び第三エピトープタグを含みうる。この例では、抗タグ抗体の第一抗原結合部位が第一エピトープタグに結合し得、抗タグ抗体の第二抗原結合部位が第三エピトープタグに結合しうる。当業者であれば、スペーサーの柔軟性と長さの組合せが、約１２０度から約２２０度のエルボー角を有する抗タグ抗体の両アームによって到達されうる近接又は非近接エピトープの空間配置を形成しうることをまた理解するであろう。幾つかの実施態様では、エルボー角は約１２０度から約２００度の範囲である。幾つかの実施態様では、エルボー角は約１４０度から約２００度の範囲である。
幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は約５ｇ／ｍｏｌから約８０ｇ／ｍｏｌである。他の実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は約５ｇ／ｍｏｌから約５０ｇ／ｍｏｌである。更に他の実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は約１０ｇ／ｍｏｌから約４０ｇ／ｍｏｌである。更なる実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は約１５ｇ／ｍｏｌから約３０ｇ／ｍｏｌである。
また更なる実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は、天然抗体の分子量（すなわち、同じ特異性及び／又は機能的特性を有する対応する未修飾抗体の分子量）の４０％未満である。また更なる実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は、天然抗体の分子量の３０％未満である。また更なる実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の全てのエピトープタグコンストラクトの総分子量は、天然抗体の分子量の２５％未満である。
［エピトープタグコンストラクト及びエピトープタグ抗体の操作］
本開示のエピトープタグ抗体は、当業者に知られている方法に従って作製されうる。一般に、スペーサーで分離されたタンデムリピートエピトープタグを含む「エピトープ遺伝子」が合成され、配列が検証される。幾つかの実施態様では、エピトープ遺伝子は、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、又は配列番号：３１の任意の核酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープ遺伝子は、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、又は配列番号：３１の何れかに少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープ遺伝子は、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、又は配列番号：３１の何れかに少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。更なる実施態様では、エピトープ遺伝子は、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、又は配列番号：３１の何れかに少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む。また更なる実施態様では、エピトープ遺伝子は、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、又は配列番号：３１の何れかに少なくとも約９７％の同一性を有する核酸配列を含む。
エピトープ遺伝子合成後、エピトープ遺伝子は、（例えば、配列を保存しベクターによって遺伝子を増やすために）中規模のＤＮＡ調製を使用して適切なベクター（例えばｐＵＣ５７−Ｋａｎ）中にクローニングされる。ついで、エピトープ遺伝子は、Ｃ末端の制限部位（例えば５’Ｎｏｔ１及び３’Ｓｆｉｌ）によって対象の抗体の重鎖定常領域のＣ末端又は軽鎖定常領域のＣ末端にクローニングされ、抗体発現ベクターの多重クローニング部位（ＭＣＳ）中に挿入される。最終の重鎖定常領域−エピトープタグコンストラクト又は最終の軽鎖定常領域−エピトープタグコンストラクトを作製するために、最大規模のＤＮＡ調製が使用される。ついで、ＤＮＡコンストラクト（重鎖定常領域−エピトープタグコンストラクト又は最終の軽鎖定常領域−エピトープタグコンストラクト）を、当業者に知られているような常套的な抗体発現及び産生プロセスによってＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトする。
別法では、抗体発現ベクターは、抗体発現及び産生において現在使用されているもの、すなわち天然の未修飾抗体を産生するために使用される抗体発現ベクターから選択される。エピトープ遺伝子が合成され、ベクター、例えばｐＵＣ５７中に挿入された後、エピトープ遺伝子が、正しい読み枠で抗体遺伝子の下流の抗体発現ベクター中に（例えばＮｏｔ１及びＳｆｉ１部位を介して）クローニングされる。このようにして、エピトープベクターのライブラリーが既存の抗体発現ベクターを使用して構築されうる。次に、対象の抗体のＩｇＧ Ｈ及びＫ鎖遺伝子配列が、制限部位（例えば、Ｎｈｅ１及びＮｏｔ１）を介して抗体発現ベクターから抽出され、同じ制限部位（例えば、Ｎｈｅ１及びＮｏｔ１）を介してエピトープベクター中に挿入される。ＩｇＧ Ｈ又はＫ鎖配列は正しい読み枠でタグ配列の上流に位置させられる。培養系において、エピトープベクターは、ＩｇＧ Ｈ又はＫ鎖とタグをＩｇＧのＣ末端に発現する。
［特定のエピトープタグコンストラクト及びエピトープタグ抗体の例］
ここで提供されるのは、操作されて抗体の重鎖及び／又は軽鎖定常領域の末端に組み込まれうるエピトープタグコンストラクトの特定の例である。当業者であれば、多かれ少なかれエピトープタグを有するエピトープコンストラクトを、上述の手順に従って、また当業者に知られている他の方法に従って、エピトープタグ遺伝子を改変することによって産生することができることが分かるであろう。而して、次の例は非限定的な例である。
［４つのＶＳＶエピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、ＶＳＶエピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは４つのＶＳＶエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１のアミノ酸配列を有する４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：１６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：１６のアミノ酸配列を含む。他では軽鎖定常領域のＣ末端にある。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：１６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は例えば５つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［４つのＡＵ５エピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、ＡＵ５エピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは４つのＡＵ５エピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：２のアミノ酸配列を有する４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、軽鎖定常領域のＣ末端に配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は、例えば５つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［４つのＥエピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、Ｅエピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは４つのＥエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：３のアミノ酸配列を有する４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：２０のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２０のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、軽鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２０のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：２０のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は、例えば５つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［５つのＶ５エピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、Ｖ５エピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは５つのＶ５エピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：４のアミノ酸配列を有する５つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：２２のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２２のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、軽鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２２のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：２２のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は、例えば４つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［４つのＨＡエピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、ＨＡエピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは４つのＨＡエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：５のアミノ酸配列を有する４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２４のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、軽鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２４のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：２４のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は、例えば５つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［４つのＥ２エピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、Ｅ２エピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは４つのＥ２エピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：６のアミノ酸配列を有する４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：２６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２６のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、軽鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２６のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：２６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は、例えば５つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［４つのＫＴ３エピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、ＫＴ３エピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは４つのＫＴ３エピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：７のアミノ酸配列を有する４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２８のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、軽鎖定常領域のＣ末端に配列番号：２８のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：２８のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は、例えば５つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［４つのＡＵ１エピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、ＡＵ１エピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは４つのＡＵ１エピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：８のアミノ酸配列を有する４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：３２のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：３２のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、軽鎖定常領域のＣ末端に配列番号：３２のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：３２のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は、例えば５つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［４つのＯＬＬＡＳエピトープタグを有するエピトープコンストラクトを含むエピトープタグ抗体］
幾つかの実施態様は、ＯＬＬＡＳエピトープタグを発現するエピトープタグ抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトを含み、少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトは４つのＯＬＬＡＳエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：９のアミノ酸配列を有する４つのエピトープタグを含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグコンストラクトは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４のアミノ酸配列の少なくとも一つを含む少なくとも一つのスペーサーを有する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、配列番号：３０のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端に配列番号：３０のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、軽鎖定常領域のＣ末端に配列番号：３０のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様では、エピトープタグ抗体は、重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に配列番号：３０のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＨＥＲ２、ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、及びＥＧＦＲ２の少なくとも一つに特異的である。幾つかの実施態様では、この特定のエピトープ遺伝子は、例えば５つのエピトープタグを有するように改変されうる。
［特徴付け］
ここに開示されたエピトープタグ抗体、並びにその天然の未修飾対応物は、ＥＬＩＳＡとＩＨＣにおいて抗種二次抗体を用いて検出することができる。ＥＬＩＳＡ研究では、エピトープペプチドをプレート上にコーティングし、エピトープタグ一次抗体を適用し、それに西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体を続け、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を酵素の発色基質として使用した。ＩＨＣでは、エピトープタグ一次抗体をヒト扁桃組織に適用し、それに西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体を続け、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を酵素の発色基質として使用した。一次抗体（すなわち、エピトープタグ抗体と対応する天然の未修飾抗体）は、両方とも１μｇ／ｍＬの濃度で試験した（図１６Ａ〜１６Ｆ及び図１７Ａ〜１７Ｆを参照）。抗ＣＤ３エピトープタグ抗体のみ（図１７Ｄ参照）が理想的よりは劣るが奏功し、如何なる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、重鎖定常領域のＣ末端の４つのエピトープタグと軽鎖定常領域のＣ末端の付加的な４つのエピトープタグの存在が、抗体がなお染色アッセイで機能したものの、理想的に機能することを妨げた立体障害を導入したのかも知れないと推察される。
更に、図１８に示されるように、本出願人は、抗体のエピトープタギングが、対応する天然抗体の抗体産生の収量と比較して、抗体産生の収量に悪影響を及ぼさないことを実証した。加えて、エピトープタグ抗体は、加速安定性試験において、２４ヶ月間安定であることが示された（図１９に示す加速安定性試験において４℃の貯蔵に相当する）。より短い期間（例えば５〜１０日）の間、高温（すなわち、３７℃及び４５℃）で収集されたデータに基づいて、意図された保存条件（すなわち４℃）で、試験抗体（希釈剤９０１０３中１ｕｇ／ｍｌ濃度）のリアルタイム安定性を予測するためにアレニウスモデルに従った。
本出願人はまた抗タグ抗体と開示されたエピトープタグ抗体上に存在するタンデムタグとの間の結合動態を決定するために表面プラズモン共鳴を利用する試験を行った。実施例１２に記載したように、本出願人は、動態が、抗タグ抗体とエピトープタグ抗体上のタンデムタグとの間で結合活性が触媒されたことを発見した（図３１Ａ〜３１Ｅを参照）。ここに記載したように、「結合活性」は、二つ以上の分子集団（例えば、抗タグ抗体と各タグ）間の複合体の全体的な安定性、すなわち、２つの分子集団間の相互作用の機能的結合強度を意味する。ここでの「結合活性が触媒された」とは、エピトープタグ抗体における、タンデムタグ、おそらくは二つ以上のタグに対する抗タグ抗体の協調的及び相乗的結合を指す。例えば、本開示の組換え抗体、例えばＣＤ６８エピトープタグ抗体上のタンデムＶ５タグへの抗Ｖ５抗体の結合は、単一のＶ５タグに対して少なくとも２４０倍、結合活性が触媒されたことが見出された（図３１Ａ参照）。同様に、本開示の組換え抗体、例えばＣＤ２０エピトープタグ抗体上のタンデムＨＡタグへの抗ＨＡ抗体の結合は、単一のＨＡタグに対して少なくとも２０００倍、結合活性が触媒されたことが見出された（図３１Ｄ参照）。如何なる特定の理論にも束縛されることを望まないが、そのような動態は二次抗体の性能を有意に改善すると考えられる。加えて、本出願人は、抗タグ抗体とエピトープタグ抗体のタグとの間の結合速度が速く、解離速度が、機器の仕様から外れているか、又は研究された全てのタグ構成に対して正にドリフトしていたと考える（図３２Ａ〜３２Ｄを参照）。
本出願人はまた（ａ）（ｉ）溶液中のエピトープタグ抗体の流体力学的半径と（ｉｉ）温度誘発凝集とを決定する動的光散乱（ＤＬＳ）実験；（ｂ）ＩｇＧドメインの融解温度に対するエピトープタグの影響を決定する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）実験；及び（ｃ）試料の均一性を決定するＳＥＣ実験を行った。ＤＳＣ実験により、本出願人は、本開示の組換えエピトープタグ抗体が、単量体抗体に対して予想されるＤＳＣパターンと一致して、溶液中の単量体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）として生じることを発見した（図２８Ａ〜２８Ｅを参照）。このことから、本出願人は、エピトープタグ抗体のタグは、抗体の適切な折り畳みを全体として妨害しないと結論付けた。而して、エピトープタグ抗体は、それが由来する一次抗体と一致した適切な折り畳みを維持し、同時にタンデムタグに柔軟性を付与し、更にエピトープタグへの到達を可能にした。
ＤＬＳは、懸濁液中の小粒子、又は溶液中のポリマー、例えば生体分子のサイズ分布プロファイルを決定するために使用されうる技術である。本出願人によって行われたＤＬＳ実験は、エピトープタグ抗体の流体力学的半径が、抗タグ抗体への十分な到達性を可能にする、タグの比較的非構造的で非常に柔軟な性質を示唆していることを示した。本出願人は、７０℃より高い温度で、タグなし抗体がかなり大きな凝集体（すなわち、１０００ｎｍより大きい）を形成し、沈殿することを示した。その一方、本開示のエピトープタグ抗体は、約７ｎｍから約２５ｎｍの流体力学的半径を有する粒子を形成した。これらの粒子は、重鎖のみ又は軽鎖のみにタグを有するエピトープタグ抗体と比較して、重鎖と軽鎖の両方にタグを有するエピトープタグ抗体の場合にはより小さかった。注目すべきことに、本出願人は、ここに開示されたタグのタイプの各々を含む、エピトープタグ抗体に組み込まれた様々なタイプのエピトープタグの間に有意な差がないことを観察した（図２６と図２９Ａ〜２９Ｅも参照）。
ＤＬＳ及びＤＳＣデータはまた抗体の軽鎖内へのエピトープタグの取り込みがＦａｂ／ＣＨ２ドメインを少なくとも部分的に不安定化し、４ＫまでのＴａｇｇ値の減少をもたらしたことを示している。幾つかの例では、ＤＬＳデータは約１ＫのＴａｇｇの僅かな増加を示しＤＳＣ測定値はピーク１の転移温度の増加（０．１Ｋ以下）を示唆している（図２８Ａ〜２８Ｅを参照）。
上記のように、本出願人は、直角散乱（ＲＡＬＳ）による分子量測定に対応するデータを含むＳＥＣデータをさらに収集した（例えば、図２７Ａ、２７Ｂ、及び２７Ｃを参照）。このデータはまた試験したタグなし抗体と対応するエピトープタグ抗体の全てが単量体ＩｇＧとして溶液中に出現したことを示している。本出願人は、タグなし抗体が約１４０ｋＤａから約１５０ｋＤａの範囲の分子量を有していることを見出した。幾つかの実施態様では、重鎖タグのみ又は軽鎖タグのみを有するエピトープタグ抗体は、約１７０ｋＤａから約２１０ｋＤａの範囲の分子量を有していた。更に他の実施態様では、重鎖タグのみ又は軽鎖タグのみを有するエピトープタグ抗体は、約１８５ｋＤａから約２０５ｋＤａの範囲の分子量を有していた。他の実施態様では、重鎖タグ又は軽鎖タグのみを有するエピトープタグ抗体は、約１９０ｋＤａの分子量を有していた。幾つかの実施態様では、重鎖タグと軽鎖タグの両方を有するエピトープタグ抗体は、２１５ｋＤａから約２３５ｋＤａの範囲の分子量を有していた。幾つかの実施態様では、重鎖タグと軽鎖タグの両方を有するエピトープタグ抗体は、約２２０ｋＤａから約２３０ｋＤａの分子量を有していた。加えて、上記のＤＬＳデータのように、ＳＥＣデータは、エピトープタグ抗体が比較的構造不定で柔軟であることを示唆した。
まとめると、ＤＬＳ、ＤＳＣ、及びＳＥＣ実験の結果は、エピトープタグ抗体の柔軟性のあるタグが、例えば熱応力に曝された場合に、大きな凝集体の形成を減少させ又は防止することを示した。また、抗体中へのエピトープタグの包含は、抗体の適切な折り畳みをその全体として妨害しないと結論付けることができた。
而して、本出願人は、エピトープタグ抗体が安定であり、それらがその未修飾の天然対応物と比較して染色において有意な差異を示さないことを考えると、ＩＨＣアッセイ、特に多重ＩＨＣアッセイにおいて使用するのに適していることを示した。加えて、本出願人は、抗体の重鎖の上又は重鎖内へのエピトープの組み込みは、軽鎖上にタグを組み込む場合と比較して、熱安定性及び品質の観点から利点をもたらすことを実証した。ここに更に示されるように、エピトープタグ抗体は、他の天然抗体で観察される交差反応性を伴わずに一緒にプールすることができると考えられる。
［エピトープタグ抗体の検出］
幾つかの実施態様では、任意のエピトープタグ抗体は検出可能部分を含み得、よってエピトープタグ抗体は直接的に検出されうる（例えば、検出可能部分にコンジュゲートされる）。
他の実施態様では、任意のエピトープタグ抗体の検出、よって組織試料中の標的の検出を可能にするために、特定の試薬が利用される。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体の特定のエピトープタグに特異的な検出試薬が利用される。幾つかの実施態様では、検出試薬は、エピトープタグ抗体の発現されたエピトープタグに特異的な二次抗体を含む。すなわち、二次抗体は抗エピトープ又は抗タグ抗体である。各抗タグ抗体は、特異的エピトープタグ、例えばＶＳＶ、Ｖ５、ＨＡ等々の一つを検出するように設計される。
例えば、一又は複数のＶＳＶエピトープタグを発現するエピトープタグ抗体は、抗ＶＳＶ抗体、すなわち発現されたＶＳＶエピトープタグに特異的な抗タグ抗体によって検出することができる。同様に、一又は複数のＡＵ５エピトープタグを発現するエピトープタグ抗体は、抗ＡＵ５抗体、すなわち発現されたＡＵ５エピトープタグに特異的な抗タグ抗体によって検出することができる。
幾つかの実施態様では、抗タグ抗体を「検出可能部分」にコンジュゲートさせて、エピトープタグ抗体の検出を実現することができる。「検出可能部分」は、試料中のエピトープタグ抗体の存在（すなわち定性分析）及び／又は濃度（すなわち定量分析）を示す検出可能な（例えば、視覚的、電子的又は他の方法で）シグナルを生成しうる分子又は物質である。検出可能なシグナルは、光子（ラジオ周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数及び紫外周波数光子を含む）の吸収、放出及び／又は散乱を含む、任意の既知の又は未発見のメカニズムによって生成されうる。
幾つかの実施態様では、抗タグ抗体の検出可能部分は、発色性、蛍光性、燐光性及び発光性分子及び物質、（例えば、無色物質を有色物質に変換するか又はその逆によって、あるいは沈殿物を生成することによって又は試料濁度を増加させることによって）ある物質を別の物質に変換して検出可能な差異をもたらす触媒（例えば酵素）、更なる検出可能に標識された抗体コンジュゲートを使用して抗体−ハプテン結合相互作用を通して検出されうるハプテン、並びに常磁性及び磁性分子又は物質を含む。当然のことながら、検出可能部分はそれ自体を間接的に検出することもでき、例えば、検出可能部分がハプテンならば、当業者に知られているように、その検出可能部分に特異的な更に別の抗体が、検出可能部分の検出に利用されうる。
幾つかの実施態様では、抗タグ抗体は、ＤＡＢ；ＡＥＣ；ＣＮ；ＢＣＩＰ／ＮＢＴ；ファストレッド；ファストブルー；フクシン；ＮＢＴ；ＡＬＫ ＧＯＬＤ；カスケードブルー・アセチルアジド；ダポキシルスルホン酸（Dapoxylsulfonic acid）／カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４０５；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４０５スクシンイミジルエステル；カスケードイエロー・スクシンイミジルエステル；ピリジルオキサゾールスクシンイミジルエステル（ＰｙＭＰＯ）；パシフィックブルー・スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４１５；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹＱ−４２５；６−ＦＡＭホスホラミダイト；ルシファーイエロー；ヨードアセトアミド；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０スクシンイミジルエステル；ダブシル・スクシンイミジルエステル；ＮＢＤ塩化物／フッ化物；ＱＳＹ３５スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４８５ＸＬ；Ｃｙ２スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４９０；オレゴングリーン４８８カルボン酸スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４８０ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ５スクシンイミジルエステル； ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹＱ−５０５；オレゴングリーン５１４カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５１０ＸＬ；ＤＹ−４８１ＸＬ；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＪＯＥ）；ＤＹ−５２０ＸＬ；ＤＹ−５２１ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ Ｃ３スクシンイミジルエステル；エリスロシンイソチオシアナート；５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオロセインスクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２スクシンイミジルエステル；６−カルボキシ−２’，４，４’，５’７，７’−ヘキサクロロフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＨＥＸ）；ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５３０；ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹ−５５５；ＤＹＱ−１；ＤＹ−５５６；Ｃｙ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５４７；ＤＹ−５４９；ＤＹ−５５０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５４８；ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ローダミンレッド−Ｘスクシンイミジルエステル；ＱＳＹ７スクシンイミジルエステル； ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９ Ｃ３スクシンイミジルエステル；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５９０；ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５９１；ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘスクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５９４；カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル；ＤＹ−６０５；ＤＹ−６１０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６１５；ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０−Ｘスクシンイミジルエステル；エリオグラウシン（erioglaucine）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３５スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６３４；ＤＹ−６３０；ＤＹ−６３１；ＤＹ−６３２；ＤＹ−６３３；ＤＹＱ−２；ＤＹ６３６；ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５−Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹ−６３５；Ｃｙ５スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６４７；ＤＹ−６４８；ＤＹ−６５０；ＤＹ−６５４；ＤＹ−６５２；ＤＹ−６４９；ＤＹ−６５１；ＤＹＱ−６６０；ＤＹＱ−６６１；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０スクシンイミジルエステル；Ｃｙ５．５スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６７７；ＤＹ−６７５；ＤＹ−６７６；ＤＹ−６７８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６７９；ＤＹ−６８０；ＤＹ−６８２；ＤＹ−６８１；ＤＹＱ−３；ＤＹＱ−７００；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００スクシンイミジルエステル；ＤＹ−７０３；ＤＹ−７０１；ＤＹ−７０４；ＤＹ−７００；ＤＹ−７３０；ＤＹ−７３１；ＤＹ−７３２；ＤＹ−７３４；ＤＹ−７５０；Ｃｙ７スクシンイミジルエステル；ＤＹ−７４９；ＤＹＱ−４；及びＣｙ７．５スクシンイミジルエステルからなる群から選択される検出可能部分を含む。
フルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン（又はフルオレセイン誘導体及びアナログ）、ローダミン、レゾルフィン、発光団及びシアニンを含む数種の共通の化学クラスに属する。蛍光分子の更なる例は、Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR, TheroFisher Scientific, 11版に見出すことができる。他の実施態様では、フルオロフォアは、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、及びテトラピロール誘導体から選択される。他の実施態様では、蛍光部分は、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍから入手可能）、ＤＲＡＱ及びＣｙＴＲＡＫプローブ（ＢｉｏＳｔａｔｕｓから入手可能）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（例えばＤｙＬｉｇｈｔ６４９）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）、Ａｔｔｏ及びＴｒａｃｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから入手可能）、Ａｂｂｅｒｉｏｒ Ｄｙｅｓ（Ａｂｂｅｒｉｏｒから入手可能）、ＤＹ及びＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ（Ｄｙｏｍｉｃｓから入手可能）、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ色素（Ｃｙａｎｄｙｅから入手可能）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（ＡｎａＳｐｅｃから入手可能）、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ及びＳｑｕａｒｅ Ｄｙｅｓ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓから入手可能）、Ｑｕａｓａｒ及びＣａｌ Ｆｌｕｏｒ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ Ｄｙｅｓ（ＡＰＣ，ＲＰＥＰｅｒＣＰ，Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅｓから入手可能）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｒｅｅｎｓｅａ，Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｆｌｏｇｅｎから入手可能）から選択される。
幾つかの実施態様では、 エピトープタグ抗体は、抗バイオマーカー抗体であり、バイオマーカーの検出は、試料に結合したときに抗バイオマーカー抗体に近接して検出可能部分を沈着させるように適合化された抗タグ特異的結合剤（例えば、抗タグ抗体）と試料を接触させることにより、促進される。幾つかの実施態様では、抗タグ抗体は検出可能部分に直接コンジュゲートされる（以下、「直接法」）。他の実施態様では、検出可能部分は、抗タグ特異的結合剤と間接的に関係付けられる（以下、「間接法」）。幾つかの実施態様では、検出試薬は、検出可能部分が抗バイオマーカー抗体／抗タグ特異的結合剤複合体を介してバイオマーカーに局在化する酵素反応を介して沈着される間接的方法に適している。そのような反応に適した酵素はよく知られており、酸化還元酵素、加水分解酵素、及びペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。明示的に含められる特定の酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、及びβ−ラクタマーゼである。酵素は、抗タグ抗体に直接コンジュゲートされ得、又は標識コンジュゲートを介して抗タグ抗体と間接的に関係付けられてもよい。ここで使用される場合、「標識コンジュゲート」は次を含む：
（ａ）特異的検出試薬；及び
（ｂ）特異的検出試薬にコンジュゲートされた酵素であって、適切な反応条件下で発色基質、シグナル伝達コンジュゲート、又は酵素反応性色素と反応して、その場での色素生成及び／又は組織試料上への色素の沈着を達成する酵素。
ここで使用される場合、「特異的検出試薬」という用語は、細胞試料の状況において標的化学構造に特異的に結合することができる任意の物質の組成物を意味するものとする。ここで使用される場合、「特異的結合」、「特異的に結合する」又は「に特異的な」という語句又は他の同様の反復は、標的と特異的検出試薬との間の測定可能で再現性のある相互作用を意味し、生物学的分子を含む分子の異種集団の存在下での標的の存在を決定するものである。例えば、標的に特異的に結合する抗体は、それが他の標的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこの標的に結合する抗体である。一実施態様では、特異的検出試薬の非関連標的への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、抗体の標的への結合の約１０％未満である。所定の実施態様では、標的に特異的に結合するバイオマーカー特異的試薬は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。別の実施態様では、特異的結合は排他的結合を含みうるが、それを必要とはしない。例示的な特異的検出試薬には、特定のヌクレオチド配列に特異的な核酸プローブ；抗体及びその抗原結合断片；及びＡＤＮＥＣＴＩＮ（第１０のＦＮ３フィブロネクチンに基づくスカフォールド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．）、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（スタフィロコッカス・アウレウス由来のプロテインＡのＺドメインに基づくスカフォールド；Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＡＶＩＭＥＲ（ドメインＡ／ＬＤＬ受容体に基づくスカフォールド；Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ｄＡｂ（ＶＨ又はＶＬ抗体ドメインに基づくスカフォールド；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＰＬＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＤＡＲＰｉｎ（Ａｎｋｙｒｉｎリピートタンパク質に基づくスカフォールド；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，ＣＨ）、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮ（リポカリンに基づくスカフォールド；Ｐｉｅｒｉｓ ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，ＤＥ）、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（ＶＨＨ（ラクダ科Ｉｇ）に基づくスカフォールド；Ａｂｌｙｎｘ Ｎ／Ｖ，Ｇｈｅｎｔ，ＢＥ）、ＴＲＡＮＳ−ＢＯＤＹ（トランスフェリンに基づくスカフォールド；Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＳＭＩＰ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、及びＴＥＴＲＡＮＥＣＴＩＮ（Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）に基づくスカフォールド，テトラネクチン；Ｂｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａ Ａ／Ｓ，Ａａｒｈｕｓ，ＤＫ）を含む、操作された特異的結合組成物が含まれる。そのような操作された特異的結合構造の説明は、その内容が出典明示により援用されるWurch等, Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, Current Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 9, pp. 502-509 (2008)に概説されている。非限定的な例では、標識用コンジュゲートの特異的検出試薬は、二次検出試薬（例えば、抗タグ抗体に結合された種特異的二次抗体、抗バイオマーカー抗体に特異的なエピトープタグ抗タグ抗体に結合した抗タグ抗体、ハプテンコンジュゲート抗タグ抗体に結合した抗ハプテン抗体、又はビオチン化抗タグ抗体抗体に結合したビオチン結合タンパク質）、又は他のそのような構成でありうる。このようにして試料結合抗バイオマーカー抗体に局在化した酵素は、ついで、検出可能部分を沈着させる多くのスキームにおいて使用されうる。
場合によっては、酵素は発色性化合物／基質と反応する。発色性化合物／基質の特定の非限定的な例には、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、リン酸ブロモクロロインドリル（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、又はテトラゾリウムバイオレットが含まれる。
幾つかの実施態様では、酵素は、金属組織学的検出スキームで使用されうる。金属組織学的検出法には、水溶性金属イオンと組み合わせたアルカリホスファターゼなどの酵素と酵素の酸化還元不活性基質の使用が含まれる。幾つかの実施態様では、基質は酵素によって酸化還元活性剤に変換され、酸化還元活性剤が金属イオンを還元し、検出可能な沈殿物を形成させる。（例えば、２００４年１２月２０日に出願された米国特許出願第１１／０１５６４６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照のこと；これらの各々は、出典明示によりその全体がここに援用される）。金属組織学的検出法には、また検出可能な沈殿物を形成するために水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共にオキシド−レダクターゼ酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を使用することが含まれる。（例えば、出典明示によりその全体がここに援用される米国特許第６６７０１１３号を参照のこと）。
幾つかの実施態様では、酵素作用は酵素と色素自体との間で起こり、反応は色素を非結合種から試料上に沈着した種に変換する。例えば、ＤＡＢとペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）の反応はＤＡＢを酸化させて沈殿させる。
更に他の実施態様では、検出可能部分は、酵素と反応して試料又は他の検出成分に結合することができる反応種を形成するように構成された潜在反応性部分を含むシグナル伝達コンジュゲートを介して沈着される。これらの反応種は、それらの生成の近くで、すなわち酵素の近くで試料と反応することができるが、酵素が沈着する部位から遠位の部位にシグナル伝達コンジュゲートが沈着しないように、非反応性種に速やかに転換する。潜在的反応性部分の例には、その各々の全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２０１５１２４７０３Ａ１号に記載されているもののようなキノンメチド（ＱＭ）アナログ、及び国際公開第２０１２００３４７６Ａ２号に記載されているもののようなチラミドコンジュゲートが含まれる。幾つかの例では、潜在的反応性部分は、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯパープル）、及びローダミン１１０（ローダミン）のような色素に直接コンジュゲートされる。他の例では、潜在的反応性部分が、特異的結合対の一方のメンバーにコンジュゲートされ、色素が特異的結合対の他方のメンバーに連結される。他の例では、潜在的反応性部分が特異的結合対の一方のメンバーに連結され、酵素が特異的結合対の他のメンバーに連結され、ここで、酵素は（ａ）発色基質と反応して色素の生成をなすか、又は（ｂ）色素と反応して色素（ＤＡＢなど）の沈着をもたらす。特異的結合対の例には次のものが含まれる：
（１）潜在的反応性部分に連結されたビオチン又はビオチン誘導体（例えばデスチオビオチン）と、色素又は発色基質と反応性であるかもしくは色素と反応性である酵素（例えば、色素がＤＡＢである場合、ビオチン結合タンパク質に連結されたペルオキシダーゼ）に連結されたビオチン結合体（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシル化されたアビジン（例えば、ニュートラアビジン）、又はそのビオチン結合部位にニトロ化チロシンを有するビオチン結合タンパク質（例えば、ＣＡＰＴＡＶＩＤＩＮ））；
（２）エピトープタグと関連する抗タグ抗体；及び
（２）潜在的反応性部分に連結されたハプテンと、色素又は発色基質と反応性であるかもしくは色素と反応性である酵素（例えば、色素がＤＡＢである場合、ビオチン結合タンパク質に連結されたペルオキシダーゼ）に連結された抗ハプテン抗体。
抗タグ抗体と検出試薬の組み合わせの非限定的な例を表１に記載する：
Figure 0006952706
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表１において使用される場合、「２°特異的検出試薬」は、抗タグ抗体に特異的に結合することができる任意の実体を指すものとする。よって、例えば、２°特異的検出試薬は、抗タグ抗体が由来する免疫グロブリンの種に特異的に結合する抗種抗体、及び抗タグ抗体にコンジュゲートしたハプテンと免疫反応性の抗ハプテン抗体、又は（抗タグ抗体がエピトープタグ抗体である場合）抗タグ抗体のエピトープタグと反応性の第二の抗タグ抗体でありうる。更に、表１の各例では、抗タグ抗体を、ＡＤＮＥＣＴＩＮ、ＡＦＦＩＢＯＤＹ、ＡＶＩＭＥＲ、ｄＡｂ、ＤＡＲＰｉｎ、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮ、ＮＡＮＯＢＯＤＹ；ＴＲＡＮＳ−ＢＯＤＹ、ＳＭＩＰ、又はＴＥＴＲＡＮＥＣＴＩＮのようなタグに特異的に結合することができる別の特異的検出剤で置き換えることができる。
［エピトープタグ抗体とエピトープタグ抗体を検出するための検出試薬とを含む検出キット］
幾つかの実施態様では、本開示のエピトープタグ抗体は、「検出キット」の一部として利用されうる。一般に、任意の検出キットは、一又は複数のエピトープタグ抗体とその一又は複数のエピトープタグ抗体を検出するための検出試薬とを含みうる。
検出キットは、エピトープタグ抗体が検出キットによって検出されうるように、エピトープタグ抗体を含む第一組成物と第一組成物に特異的な検出試薬を含む第二組成物とを含みうる。幾つかの実施態様では、検出キットは、（例えばバッファー中で混合されるような）複数のエピトープタグ抗体を含み、検出キットは、複数のエピトープタグ抗体のそれぞれに特異的な検出試薬もまた含む。
例として、キットは第一標的に特異的なエピトープタグ抗体であって第一エピトープタグ（例えばＶＳＶ）を有するエピトープタグ抗体と、第二エピトープタグ（例えばＨＡ）を有する第二標的に特異的なエピトープタグ抗体とを含み得、第一及び第二のエピトープタグは異なる。キットは、異なるエピトープタグ抗体の各々に特異的な検出試薬を更に含みうる。例えば、異なるエピトープタグ抗体のエピトープタグの各々に特異的な抗タグ抗体を含めてもよい。幾つかの実施態様では、抗タグ抗体は、蛍光性の検出可能部分（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ＩＲ色素）にコンジュゲートされうる。他の実施態様では、抗タグ抗体は酵素にコンジュゲートされ得、酵素のための発色基質をまた任意のキット内に含めることができる。
もちろん、任意のキットは、手作業又は自動標的検出のために必要に応じて、バッファー；対比染色剤；酵素不活性化組成物；脱パラフィン化溶液等々を含む他の薬剤を含みうる。検出キットはまた他の特異的結合体（例えば、ＩＳＨの核酸プローブ；未修飾（天然）抗体、及び抗体コンジュゲート）とその他の特異的結合体を検出する検出試薬とを含みうる。例えば、キットは、一又は複数のエピトープタグ抗体；一又は複数のエピトープタグ抗体を検出するための一又は複数の抗タグ抗体；少なくとも一つの未修飾抗体；及び少なくとも一つの未修飾抗体を検出するための検出試薬を含みうる。幾つかの実施態様では、例えばＭＩＨＣアッセイのようなアッセイにおいて使用するため、エピトープタグ抗体とキットの他の構成要素を使用するための説明書が提供される。
［エピトープタグ抗体及び検出試薬を用いて標的を検出する方法］
本開示はまたここに記載されるエピトープタグ抗体の何れかを使用して組織内の一又は複数の標的を検出する方法を提供する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体は、組織試料内の特定の標的（例えば、ＣＤ６８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２０等々）を検出するシンプレックスアッセイにおいて使用することができ、ここで、エピトープタグ抗体は、対象の標的に特異的であり、組織試料へのエピトープタグ抗体の適用時に、標的−エピトープタグ抗体複合体が形成される。エピトープタグ抗体の適用後、検出試薬（例えば、抗タグ抗体）が、標的−エピトープタグ抗体複合体が検出されうるように適用される。幾つかの実施態様では、検出試薬は、エピトープタグ抗体の特定の発現されたエピトープタグに特異的な抗タグ抗体を含み、抗タグ抗体は検出可能部分を含む。ついで、単一標的が視覚化されるか、又は別の方法で検出されうる。
本開示の幾つかの態様では、自動多重検出を含む多重検出方法が提供される。図１５Ａは、組織試料が複数のエピトープタグ抗体と同時に接触される（工程１００）標的の多重検出のための一方法を示すフローチャートを提供し、各エピトープタグ抗体は特定の標的に特異的であり、各エピトープタグ抗体は異なったエピトープタグ（異なる発現されたエピトープタグ）を含む。
幾つかの実施態様では、試料は２つのエピトープタグ抗体と接触させられ得、各エピトープタグ抗体は特定の標的に特異的であり、各エピトープタグ抗体は異なったエピトープタグを含む。他の実施態様では、試料は、３つのエピトープタグ抗体と接触させられ得、各エピトープタグ抗体は特定の標的に特異的であり、各エピトープタグ抗体は異なったエピトープタグを含む（例えば、実施例１及び２を参照）。更に他の実施態様では、試料は４つ以上のエピトープタグ抗体と接触させられ得、各エピトープタグ抗体は特定の標的に特異的であり、各エピトープタグ抗体は異なったエピトープタグを含む（例えば、実施例７を参照）。
エピトープタグ抗体は、特定のアッセイに必要とされるエピトープタグ抗体の各々を含む「プール」又は「カクテル」として組織試料に供給されうる。エピトープタグ抗体は、少なくとも交差反応性が染色性能を妨げる程度までには、互いに交差反応性を示さないので、エピトープタグ抗体のプール化は可能であると考えられる。各エピトープタグ抗体は、その各標的に結合し、検出可能な標的−エピトープタグ抗体複合体を形成する。幾つかの実施態様では、エピトープタグ抗体の適用後にブロッキング工程が実施される（例えば、ブロッキング工程及び／又は他の処理工程の組み入れを例示する実施例１、２、及び７を参照のこと）。
エピトープタグ抗体の同時適用（工程１００）に続いて、複数の抗タグ抗体が組織試料に同時に適用され（工程１１０）、ここで各抗タグ抗体は最初に適用された（工程１００）エピトープタグ抗体の一つに特異的であり、各抗タグ抗体が異なる検出可能部分を含む。幾つかの実施態様では、検出可能部分はフルオロフォアである。抗タグ抗体は、標的−エピトープタグ抗体複合体の検出に必要な抗タグ抗体の各々を含むプール又はカクテルとして組織試料に供給されうる。抗タグ抗体の適用後、幾つかの実施態様では、組織試料は対比染色で染色されうる。検出可能部分の各々からのシグナルは、視覚化されうるか、さもなければ検出されうる（例えば、同時に視覚化されるか又は検出される）。
本開示の一態様による多重アッセイの一例として、第一のエピトープタグを含み第一標的に特異的な（例えば、ＣＤ６８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２０等々の一つに特異的な）第一のエピトープタグ抗体が組織試料に導入される。幾つかの実施態様では、第一のエピトープタグ抗体は、検出可能な第一標的−エピトープタグ抗体複合体を形成する。同時に、第二のエピトープタグを含み第二標的（例えば、ＣＤ６８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２０等々の別のもの）に特異的な第二のエピトープタグ抗体が試料に導入されて第二標的−エピトープタグ抗体複合体を形成する。（「第ｎ」標的−検出プローブ複合体を形成する）他の標的に特異的で異なるエピトープタグを有する第三、第四、及び第ｎの更なるエピトープタグ抗体が、第一及び第二のエピトープタグ抗体抗体と同時に更に導入されうる。
エピトープタグ抗体が沈着された後、それらは、もちろん、その構成に応じて、直接的か間接的の何れかで検出されうる。幾つかの実施態様では、標的−エピトープタグ抗体複合体のそれぞれの検出を可能にするために抗タグ抗体が導入される。幾つかの実施態様では、抗タグ抗体は、エピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的であり、抗タグ抗体はそれぞれ検出可能部分にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、検出可能な試薬は、それぞれフルオロフォアにコンジュゲートした抗タグ抗体である。幾つかの実施態様では、第一、第二、及び第ｎの抗タグ抗体が同時に導入され、第一、第二、及び第ｎの検出試薬の各々が異なるエピトープタグ抗体に特異的であり、抗タグ抗体の各々はフルオロフォアにコンジュゲートされる。他の実施態様では、第一、第二、及び第ｎの抗タグ抗体が逐次的に導入され、第一、第二、及び第ｎの検出試薬の各々が異なるエピトープタグ抗体に特異的であり、抗タグ抗体の各々が酵素にコンジュゲートされる。
本開示による多重アッセイの更なる例として、第一標的（例えば、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、ＰＤ−Ｌ１、又は免疫細胞マーカー）に特異的な第一のエピトープタグ抗体を組織試料に導入し、第一のエピトープタグ抗体が第一のエピトープタグを発現する。幾つかの実施態様では、第一のエピトープタグ抗体は、検出可能な第一標的−エピトープタグ抗体コンジュゲート複合体を形成する。同時に又はその後に、第二標的（例えば、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、ＰＤ−Ｌ１の別のもの）に特異的な第二のエピトープタグ抗体を試料に導入して、第二標的−エピトープタグ抗体コンジュゲート複合体を形成し、第二のエピトープタグ抗体が第二のエピトープタグを発現する。それぞれ他の標的に特異的な第三、第四、及び第ｎの更なるエピトープタグ抗体（「ｎ」個の標的−エピトープタグ抗体コンジュゲート複合体を形成する）を、再び第一及び／又は第二のエピトープタグ抗体と逐次的に又は同時に、更に導入してもよく、第三、第四、及び第ｎのエピトープタグ抗体がそれぞれまた更に異なるエピトープタグを発現する。エピトープタグ抗体が沈着された後、それらは検出されうる。幾つかの実施態様では、標的の検出を可能にするために更なる検出試薬が導入され、その更なる検出試薬はここに記載のもの（例えば発色性検出試薬）を含む。幾つかの実施態様では、第一、第二及び第ｎの検出試薬が逐次的に導入され、第一、第二及び第ｎの検出試薬の各々は（ｉ）エピトープタグ抗体のエピトープタグの各々に特異的な二次抗体、つまり抗タグ抗体であって、酵素にコンジュゲートされている二次抗体と；（ｉｉ）発色基質であって；第一、第二及び第ｎの発色基質の各々が異なるものを含む。
幾つかの実施態様では、多重検出法は、（ｉ）生物学的試料を第一のエピトープタグ抗体と接触させて第一標的−エピトープタグ抗体コンジュゲート複合体を形成する工程；（ｉｉ）生物学的試料を、第一の標識用コンジュゲートであって第一の酵素を含む第一の標識用コンジュゲート（ここで第一の標識用コンジュゲートは第一のエピトープタグ抗体に特異的に結合し、標的を酵素で標識するように構成された抗タグ抗体である）と接触させる工程；（ｉｉｉ）生物学的試料を、第一の潜在的反応性部分及び第一の発色性部分を含む第一のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程（例えば、シグナル伝達コンジュゲートとその構成成分の記載に対してその開示が出典明示によりここに援用される米国特許出願第１３／８４９１６０号を参照のこと）；（ｉｖ）試料を第一の酵素不活性化組成物と接触させて、生物学的試料に含まれる第一の酵素を実質的に不活性化又は完全に不活性化させることなどにより、第一の酵素を不活性化する工程を含む。
第一の酵素の不活性化後（任意工程）、多重方法は、（ｖ）生物学的試料を第二のエピトープタグ抗体と接触させて、第二標的−エピトープタグ抗体コンジュゲート複合体を形成する工程；（ｖｉ）生物学的試料を、第二の標識用コンジュゲートであって第二の酵素を含む第二の標識用コンジュゲート（ここで第二の標識用コンジュゲートは第二のエピトープタグ抗体に特異的に結合し、標的を酵素で標識するように構成された抗タグ抗体である）と接触させる工程；（ｖｉｉ）生物学的試料を、第二の潜在的反応性部分及び第二の発色性部分を含む第二のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程；（ｖｉｉｉ）試料を第一の酵素不活性化組成物と接触させて、生物学的試料に含まれる第一の酵素を実質的に不活性化又は完全に不活性化させることなどにより、第二の第二酵素を不活性化する工程を更に含む。
第二の酵素の不活性化後、前記方法を、他の標的の検出を達成するために、更なるエピトープタグ抗体が更なる検出試薬と共に導入されうるように繰り返すことができる。エピトープタグ抗体（及び他の検出プローブ）及びそれぞれの検出試薬又はキットの全ての導入後、前記方法は、第一、第二、及び第ｎの発色性部分から（手作業又は自動化方法を介して）試料を対比染色し及び／又はシグナルを検出する工程を更に含み、第一、第二及び第ｎの発色性部分の各々がそれぞれ異なる。あるいは、エピトープタグ抗体の各々は、同時又は逐次的に加えることができるが、任意の標識用コンジュゲートが添加される前である。別の例として、任意の検出試薬の導入前に、最初に三つのエピトープタグ抗体が逐次的に適用され得、ついで検出試薬の各々が逐次的に加えられる。
複数の標的が逐次的に検出され、検出が酵素の使用を用いる多重アッセイの場合、連続する検出工程間で任意の試薬又は内因性酵素を不活性化させることが望ましい。結果として、何れか一つの検出工程に存在する酵素は、後の検出工程における酵素と干渉しないと考えられる。これはひいては多重アッセイで使用される異なる検出可能部分の視覚化及び検出を改善すると考えられる。当該技術分野で知られている任意の酵素不活性化組成物をこの目的のために使用することができる。幾つかの実施態様では、酵素不活性化組成物を適用して、各検出工程後に試薬又は内因性酵素を不活性化する。例示的な酵素不活性化組成物は、同時係属中の米国特許出願第６２／１５９２９７号に開示されており、その開示は、その全体が出典明示によりここに援用される。
幾つかの実施態様では、変性工程が、第一の検出試薬セットにおいて使用される酵素が第二の基質に作用するのを防止する。幾つかの実施態様では、変性剤は、第一の検出試薬セット中の酵素を変性させる物質である。幾つかの実施態様では、変性剤は、例えばホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、又はその誘導体である。アルキル置換アミドの例には、Ｎ−プロピルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−イソブチルホルムアミド、及びＮ，Ｎ−ジプロピルホルムアミドが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様では、変性剤はバッファー中に提供される。例えば、ホルムアミドが、２０ｍＭの硫酸デキストラン（５０〜５７％％ホルムアミド（ＵｌｔｒａＰｕｒｅホルムアミドストック）、２×ＳＳＣ（０．３Ｍのクエン酸塩及び３ＭのＮａＣｌを含む２０×ＳＳＣストック）、２．５ｍＭのＥＤＴＡ（０．５ＭのＥＤＴＡストック）、５ｍＭのトリス，ｐＨ７．４（１ｍＭのトリス，ｐＨ７．４ストック）、０．０５％のＢｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルを含む１０％ストック），ｐＨ７．４を含むハイブリダイゼーションバッファー中に提供されうる。幾つかの実施態様では、第一標的プローブ検出酵素、例えばアルカリホスファターゼを変性させるのに十分な時間及び条件下で、試料を変性剤で処理する。幾つかの実施態様では、試料は約３７℃で約１５から約３０分間、好ましくは約２０から２４分間、変性剤で処理される。幾つかの実施態様では、試料は、第二の核酸プローブの標的へのハイブリダイゼーションを維持しながら標的酵素を変性させるのに十分な時間及び条件下で変性剤で処理される。
酵素にコンジュゲートされた抗タグ抗体を用いる実施態様では、シグナル伝達コンジュゲート又は発色基質を生物学的試料と共に導入するのに適した条件が使用され、典型的には、過酸化物（例えば、過酸化水素）を含み、酵素がその所望の機能を遂行するのを可能にするか又は容易にするのに適した塩濃度及びｐＨを有する反応バッファー又は溶液を提供することを含む。一般に、前記方法のこの工程は、約３５℃から約４０℃の範囲の温度で実施されるが、当業者は、選択された酵素及びシグナル伝達コンジュゲートに適した適当な温度範囲を選択することができるであろう。例えば、これらの条件は、酵素と過酸化物が反応して、シグナル伝達コンジュゲートの潜在的反応性部分上でのラジカル形成を促進することを可能にすると考えられる。潜在的な反応性部分、従ってシグナル伝達コンジュゲート全体は、生物学的試料上、特に固定化酵素コンジュゲートに近接する一又は複数のチロシン残基、酵素コンジュゲートの酵素部分のチロシン残基、及び／又は酵素コンジュゲートの抗体部分のチロシン残基に共有結合的に沈着するであろう。ついで、生物学的試料を光で照らし、標的は、シグナル伝達コンジュゲートの発色性部分によって引き起こされる光の吸光によって検出されうる。
［他の特異的結合体と併せてエピトープタグ抗体を用いた検出法］
本開示の幾つかの態様では、エピトープタグ抗体は、組織試料中の標的の多重検出を達成するために他の特異的結合体と併用される。当業者ならば、上記の方法及び手順の何れかを、エピトープタグ抗体と他の特異的結合体の両方を用いる任意のアッセイに適切に適合させることができることが分かるであろう。
幾つかの実施態様では、特異的結合体には、インサイツハイブリダイゼーションのための核酸、ＩＨＣのための未修飾抗体、及び／又はＩＨＣのための抗体コンジュゲートが含まれる。ここで使用される場合、「未修飾抗体（unmodified antibody）」又は「未修飾抗体（unmodified antibodies）」という用語は、エピトープタグを含まない抗体又は任意の他の部分にコンジュゲートしていない抗体を指す。本質的に、「未修飾抗体」は、ＩＨＣアッセイにおいて伝統的に使用される天然抗体であり、特定の標的に特異的で（例えば、抗ＣＤ３抗体）、例えば抗種二次抗体を用いて検出されうる。例として、ウサギ抗ＣＤ３抗体は、ヤギ抗ウサギ抗体で検出することができる。
「抗体コンジュゲート」は、その用語がここで使用される場合、（直接的又は間接的に）一又は複数の標識にコンジュゲートした抗体を意味し、ここで、抗体コンジュゲートは特定の標的に特異的であり、標識は、例えば、二次抗体（抗標識抗体）を用いて、（直接的又は間接的に）検出することができる。例えば、抗体コンジュゲートは、例えば高分子リンカー及び／又はスペーサーを通して、ハプテンに結合されてもよく、ハプテンによる抗体コンジュゲートは間接的に検出されうる。代替的な例として、抗体コンジュゲートは、例えば高分子リンカー及び／又はスペーサーを通して、フルオロフォアに結合され得、抗体コンジュゲートは直接的に検出されうる。抗体コンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１４／０１４７９０６号及び米国特許第８６５８３８９号；第８６８６１２２号；第８６１８２６５号；第８８４６３２０号；及び第８４４５１９１号に更に記載されている。
図１５Ｂ及び１５Ｃは、組織試料を一又は複数の未修飾一次抗体及び／又は抗体コンジュゲートに（同時に又は逐次的に）接触させ（第一段階、２２０）、次に続いて一又は複数のエピトープタグ抗体に（同時に又は逐次的に）接触させる（第二段階、２５０）、標的の多重検出のための一方法を示す。二段階多重アッセイは更にここの実施例３、４、５、及び６に例示される。当業者であれば、エピトープタグ抗体が最初に組織試料に適用され、続いて未修飾抗体及び／又は抗体コンジュゲートが適用されるように、第一段階２２０と第二段階２５０を逆にしてもよいことが分かるであろう。当業者であれば、多重アッセイが（任意の順序で）ＩＳＨ及びＩＨＣ工程又は段階の両方を含むように、未修飾抗体及び／又は抗体コンジュゲートの代わりに適切な核酸プローブを使用できることもまた分かるであろう。
幾つかの実施態様では、例えば第１５図に示されるように、第一の未修飾一次抗体又は抗体コンジュゲートが組織試料に適用され得、第一標的−一次抗体複合体を形成する（工程２００）。次に、未修飾一次抗体又は抗体コンジュゲートに特異的な第一の検出試薬が組織試料に適用されて、第一標的−一次抗体複合体が検出される（工程２１０）。図１５Ｂ中の点線２０５は、未修飾一次抗体及び／又は抗体コンジュゲートによる組織試料内の複数の異なる標的の逐次的な多重検出をもたらすために、第一段階２２０の工程２００及び２１０を一又は複数回繰り返してもよいことを示している。例えば、第二の未修飾一次抗体又は抗体コンジュゲートが組織試料に適用されて、第二標的−一次抗体複合体が形成され得（２００）、続いて第二の未修飾一次抗体又は抗体コンジュゲートに特異的な第二の検出試薬が適用されて、第二標的−一次抗体複合体が検出される（２１０）。
図１５Ｃは、図１５Ｂに提示されたものと同様の２段階方法を使用する標的の多重検出のための代替方法を表す。図１５Ｃに示す方法では、未修飾抗体及び／又は抗体コンジュゲートの各々が、工程２６０において組織試料に同時に導入される。次に、試料は、未修飾抗体及び／又は抗体コンジュゲートの検出を達成するために、工程２７０において検出試薬（例えば、抗種抗体又は抗標識抗体）と接触させられる。別の実施態様では、未修飾一次抗体又は抗体コンジュゲートの全てが逐次的に適用され得（工程２６０）、これにそれぞれの抗種抗体の逐次的適用が続く（工程２７０）。
当業者であれば、検出試薬が、利用される未修飾抗体に特異的な抗種抗体を含みうることが分かるであろう。あるいは、検出試薬が、抗体コンジュゲートにコンジュゲートした標識（例えば、ハプテン）に特異的な抗標識抗体を含んでいてもよい。当業者であれば、抗種又は抗標識抗体が検出可能部分を含んでもよく、検出可能部分が酵素である実施態様では、更なる発色基質を第一及び第二の検出試薬と共に供給してもよいことも分かるであろう。
多重アッセイの第一段階２２０に続いて（図１５Ｂ又は図１５Ｃ）、第二段階２５０が実施され、そこで、組織試料が複数のエピトープタグ抗体と同時に接触させられ（工程２３０）、ここで、各エピトープタグ抗体は特定の標的に特異的であり、各エピトープタグ抗体は異なるエピトープタグを含む。エピトープタグ抗体は、特定のアッセイに必要とされるエピトープタグ抗体の各々を含む「プール」又は「カクテル」として組織試料に供給されうる。各エピトープタグ抗体は、特定の標的と検出可能な標的−エピトープタグ抗体複合体を形成する。エピトープタグ抗体（一次抗体）の同時適用（工程２３０）後、抗タグ抗体（二次抗体）が組織試料に同時に適用され（工程２４０）、ここで、各抗タグ抗体は適用されるエピトープタグ抗体の一つに特異的であり、各抗タグ抗体が異なる検出可能部分を含む。抗タグ抗体は、標的−エピトープタグ抗体複合体の検出に必要な抗タグ抗体の各々を含む「プール」又は「カクテル」として組織試料に供給されうる。
抗タグ抗体の適用後、幾つかの実施態様では、組織試料は対比染色で染色されうる（例えば、何れのワークフローにも組み込んでもよい更なる処理工程を提供する実施例３〜６を参照）。（例えば、抗種、抗標識、及び／又は抗タグ抗体由来の）検出可能部分の各々からのシグナルは、視覚化されうるか、又はそうでなければ検出されうる（例えば、同時に可視化又は検出される）。
（ｉ）未修飾抗体及び／又は抗体コンジュゲート、及び（ｉｉ）本開示に係るエピトープタグ抗体の両方を含む多重アッセイの例として、ハプテン標識を含む第一抗体コンジュゲート（例えば、ハプテンに間接的にコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体）が組織試料に導入されて、標的−抗体コンジュゲート複合体が形成される。同時に、未修飾抗体（例えば、ウサギ抗ＰＤＬ１抗体）が組織試料に導入されて、標的−未修飾抗体複合体が形成される。次に、形成された標的−抗体コンジュゲート複合体（例えば、抗ハプテン抗体）と形成された標的−未修飾抗体複合体（例えば、ヤギ抗ウサギ抗体）を検出するために検出試薬が導入され（同時に又は連続的に）、ここで、検出試薬の各々が異なるフルオロフォアにコンジュゲートされる。
多重アッセイの第二段階では、第一エピトープタグを含み、第一標的に特異的な（例えば、ＣＤ６８に特異的な）第一のエピトープタグ抗体が組織試料に導入される。幾つかの実施態様では、第一エピトープタグ抗体が検出可能な第一標的−エピトープタグ抗体複合体を形成する。同時に、第二エピトープタグを含み、第二標的に特異的な（例えば、ＦｏｘＰ３に特異的な）第二のエピトープタグ抗体が試料に導入されて、第二標的−エピトープタグ抗体複合体が形成される。異なるエピトープタグを有し（「第ｎ」の標的−エピトープタグ抗体複合体を形成する）他の標的に特異的な第三、第四、及び第五の更なるエピトープタグ抗体が、第一及び第二エピトープタグ抗体抗体と同時に更に導入されうる。
エピトープタグ抗体が沈着された後、それらは、もちろん、その構成に応じて、直接的か間接的の何れかで検出されうる。幾つかの実施態様では、標的−エピトープタグ抗体複合体のそれぞれの検出を可能にするために抗タグ抗体が導入される。幾つかの実施態様では、第一、第二、及び第ｎの検出試薬が同時に導入され、第一、第二、及び第ｎの検出試薬の各々が異なるエピトープタグ抗体に特異的である。幾つかの実施態様では、第一、第二、及び第ｎの検出試薬が逐次的に導入され、第一、第二、及び第ｎの検出試薬の各々が異なるエピトープタグ抗体に特異的である。幾つかの実施態様では、検出試薬は、エピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的である抗タグ抗体であり、抗タグ抗体はそれぞれ検出可能部分、例えばフルオロフォア又は酵素にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、検出可能な試薬はそれぞれフルオロフォアにコンジュゲートされた抗タグ抗体である。他の実施態様では、検出可能な試薬はそれぞれ酵素にコンジュゲートされた抗タグ抗体である。更に他の実施態様では、検出可能な試薬は、フルオロフォアにコンジュゲートされた抗タグ抗体と酵素にコンジュゲートされた抗タグ抗体の組合せである。抗タグ抗体が酵素にコンジュゲートされている実施態様では、（ここで先に記載されているように）検出を行うために酵素に対する基質が提供される。
幾つかの実施態様では、多重検出法は、（ｉ）生物学的試料を、未修飾抗体を含む第一の検出用プローブと接触させて第一標的−抗体コンジュゲート複合体を形成する工程；（ｉｉ）生物学的試料を、第一の標識用コンジュゲートであって第一の酵素を含む第一の標識用コンジュゲート（ここで第一の標識用コンジュゲートは第一の未修飾抗体に特異的に結合し、標的を酵素で標識するように構成された抗種抗体である）と接触させる工程；（ｉｉｉ）生物学的試料を、第一の潜在的反応性部分及び第一の発色性部分を含む第一のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程；（ｉｖ）試料を第一の酵素不活性化組成物と接触させて、生物学的試料に含まれる第一の酵素を実質的に不活性化又は完全に不活性化させることなどにより、第一の酵素を不活性化する工程を含む。あるいは、未修飾抗体を含む第一の検出プローブは、フルオロフォアに結合した抗種抗体で検出することができる。
第一の酵素の不活性化後（任意工程）、多重方法は、（ｖ）生物学的試料を、エピトープタグ抗体を含む第二の検出プローブと接触させて、第二標的−抗体コンジュゲート複合体を形成する工程；（ｖｉ）生物学的試料を、第二の標識用コンジュゲートであって第二の酵素を含む第二の標識用コンジュゲート（ここで第二の標識用コンジュゲートはエピトープタグ抗体を含む第二の検出プローブに特異的に結合し、標的を酵素で標識するように構成された抗タグ抗体である）と接触させる工程；（ｖｉｉ）生物学的試料を、第二の潜在的反応性部分及び第二の発色性部分を含む第二のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程；（ｖｉｉｉ）試料を第一の酵素不活性化組成物と接触させて、生物学的試料に含まれる第一の酵素を実質的に不活性化又は完全に不活性化させることなどにより、第二の第二酵素を不活性化する工程を更に含む。
第二の酵素の不活性化後、前記方法を、他の標的の検出を達成するために、更なる検出プローブ（未修飾抗体、抗体コンジュゲート、又はエピトープタグ抗体）が更なる検出試薬と共に導入されうるように繰り返すことができる。例えば、異なるエピトープタグを発現するエピトープタグ抗体を含む第三の検出プローブが導入され、例えばフルオロフォア又は酵素の一つにコンジュゲートした抗タグ抗体を用いて、検出されうる。検出プローブ及びそれぞれの検出試薬又はキットの全ての導入後、前記方法は、第一、第二、及び第ｎの発色性部分から（手作業又は自動化方法を介して）試料を対比染色し及び／又はシグナルを検出する工程を更に含み、第一、第二、及び第ｎの発色性部分の各々がそれぞれ異なる。
［自動化］
多重アッセイ及び方法は半自動化又は自動化されうる。例えば、染色プロセスは、自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置のような組織化学的染色プラットフォーム上で実施されうる。自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置は、典型的には、少なくとも、染色プロトコルで使用される様々な試薬のリザーバ、スライド上に試薬を分配するためにリザーバと流体連通される試薬分配ユニット、使用済み試薬及び他の廃棄物をスライドから除去するための廃棄物除去システム、及び試薬分配ユニットと廃棄物除去システムの動作を調整する制御システムを備える。染色工程の実施に加えて、多くの自動スライド染色装置は、スライドベーキング（試料をスライドに付着させるため）、脱ワックス（脱パラフィンとも称される）、抗原回復、対比染色、脱水及び清澄化、及び封入処理（カバースリッピング）を含む、染色に付随する工程を実施することもまたできる（又は、そのような補助的工程を実施する別個のシステムと適合性がある）。その全体が出典明示によりここに援用されるPrichard, Overview of Automated Immunohistochemistry, Arch Pathol Lab Med., Vol. 138, pp. 1578-1582 (2014)は、ｉｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）、ＷＡＶＥ（Ｃｅｌｅｒｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳ及びＤＡＫＯ ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ ＬＩＮＫ４８（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ、及びＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）自動スライド染色装置を含む、自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置とその様々な特徴の数種の特定の例を記載している。加えて、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社は、その各々の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第５６５０３２７号、第５６５４２００号、第６２９６８０９号、第６３５２８６１号、第６８２７９０１号及び第６９４３０２９号、及び米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号を含む、自動分析を実施するためのシステム及び方法を開示している多くの米国特許の譲受人である。市販の染色ユニットは、典型的には、次の原理のうちの一つで動作する：（１）スライドを水平に配置し、組織試料を含むスライドの表面上に液たまりとして試薬を分配する開放された個々のスライド染色（例えば、ＤＡＫＯ ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ Ｌｉｎｋ４８（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｉｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）染色装置で実施）；（２）試薬を、試料上に沈着した不活性の流体層で覆うか、又は該層を通して分配する液体オーバーレイ技術（例えば、ＶＥＮＴＡＮＡ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ染色装置で実施）；（３）スライド表面を別の表面（別のスライドであるか又はカバープレートでもよい）に近接して配置して狭い間隙をつくり、その間隙を通して毛細管力が液体試薬を吸い上げ試料と接触させるキャピラリー間隙染色（例えば、ＤＡＫＯ ＴＥＣＨＭＡＴＥ、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ、及びＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳ染色装置によって使用される染色原理）。（例えばＤＡＫＯ ＴＥＣＨＭＡＴＥ及びＬｅｉｃａ ＢＯＮＤでは）キャピラリー間隙染色の幾らかの繰り返しは、間隙内の流体を混合しない。動的間隙染色と呼ばれるキャピラリー間隙染色の他の変形態様では、毛細管力がスライドに試料を適用するために使用され、ついで平行表面を互いに平行移動させてインキュベーション中に試薬を攪拌して試薬混合を行う（例えば、ＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳスライド染色装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実施される染色原理）。平行移動間隙染色では、平行移動可能なヘッドがスライド上に配置される。ヘッド下面は、スライドの平行移動中にスライド上の液体から液体メニスカスが形成されるのを可能にする十分小さい第一間隙だけスライドから離間している。スライド幅よりも小さい側方寸法を有する混合延長部が、平行移動可能なヘッドの下面から延びて、混合延長部とスライドとの間の第一間隙よりも小さい第二間隙を画定する。ヘッドの平行移動中、混合延長部の側面寸法は、スライド上の液体中に第二間隙から第一間隙までほぼ延びる方向に横方向の動きを生み出すのに十分である。国際公開第２０１１−１３９９７８Ａ１号を参照のこと。最近、インクジェット技術を使用して試薬をスライド上に沈着させることが提案されている。国際公開第２０１６−１７０００８Ａ１号を参照のこと。この染色技術のリストは網羅的であることを意図しておらず、バイオマーカー染色を実施するための任意の完全又は半自動システムを、組織化学的染色プラットフォーム中に組み込むことができる。
形態学的に染色された試料がまた望ましい場合、自動Ｈ＆Ｅ染色プラットフォームを使用することができる。Ｈ＆Ｅ染色を実施するための自動システムは、典型的には、バッチ染色（「浸漬ダンク（dip'n dunk）」とも呼ばれる）又は個別スライド染色の二種の染色原理の一つで機能する。バッチ染色装置は、多くのスライドが同時に浸漬される試薬槽又は浴を一般に使用する。一方、個別スライド染色装置は、各スライドに直接試薬を適用し、２つのスライドが同じ試薬アリコートを共有することはない。市販のＨ＆Ｅ染色装置の例には、ＲｏｃｈｅのＶＥＮＴＡＮＡ ＳＹＭＰＨＯＮＹ（個別スライド染色装置）及びＶＥＮＴＡＮＡ ＨＥ６００（個別スライド染色装置）シリーズのＨ＆Ｅ染色装置；Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＤａｋｏ ＣｏｖｅｒＳｔａｉｎｅｒ（バッチ染色装置）；Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎｕｓｓｌｏｃｈ ＧｍｂＨのＬｅｉｃａ ＳＴ４０２０小型リニアステイナー（バッチ染色装置）、Ｌｅｉｃａ ＳＴ５０２０ Ｍｕｌｔｉｓｔａｉｎｅｒ（バッチ染色装置）、Ｌｅｉｃａ ＳＴ５０１０ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ＸＬシリーズ（バッチ式染色装置）Ｈ＆Ｅ染色装置が含まれる。
検体の染色後、染色された試料は顕微鏡で手作業で分析され得、及び／又は染色された試料のデジタル画像が保存及び／又はデジタル解析のために収集されうる。デジタル画像は、染色されたスライドを２０倍、４０倍、又は他の倍率でスキャンできるスライドスキャナーのようなスキャニングプラットフォームを介してキャプチャーされ、高解像度の全スライドデジタル画像が作製されうる。基本的なレベルでは、典型的なスライドスキャナーは、少なくとも、（１）対物レンズを有する顕微鏡、（２）（ハロゲン、発光ダイオード、白色光、及び／又は色素に依存するマルチスペクトル光源のような）光源、（３）ガラススライドを移動させるか又はスライドの周りに光学素子を移動させるか又は双方のロボット、（４）画像キャプチャー用の一又は複数のデジタルカメラ、（５）ロボットを制御し、デジタルスライドを操作し、管理し、及び見るコンピューターと関連ソフトウェアを含む。
スライド上の多くの異なるＸＹ位置（場合によっては複数のＺ面）のデジタルデータが、カメラの電荷結合素子（ＣＣＤ）によってキャプチャーされ、画像が互いに結合されて全スキャン面の合成画像が形成される。これを達成するための一般的な方法は次のものを含む：
（１）スライドステージ又は光学素子を非常に小さい増分で移動させて、隣接する正方形が僅かに重なる正方形の画像フレームをキャプチャーする、タイルベースのスキャニング。キャプチャーされた正方形は次に自動的に互いにマッチされて合成画像が構築される；及び
（２）スライドステージが取得中に単一軸において移動し多数の合成画像「ストリップ」をキャプチャーするラインベースのスキャニング。画像ストリップは次に互いにマッチされて、より大きな合成画像を形成することができる。
様々なスキャナー（蛍光及び明視野の両方）の詳細な概要は、その内容の全体が出典明示によりここに援用されるFarahani等, Whole slide imaging in pathology: advantages, limitations, and emerging perspectives, Pathology and Laboratory Medicine Int’l, Vol. 7, p. 23-33 (June 2015)に見出すことができる。市販のスライドスキャナーの例としては、３ＤＨｉｓｔｅｃｈ ＰＡＮＮＯＲＡＭＩＣ ＳＣＡＮ ＩＩ；ＤｉｇｉＰａｔｈ ＰＡＴＨＳＣＯＰＥ；Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＮＡＮＯＺＯＯＭＥＲ ＲＳ、ＨＴ、及びＸＲ；Ｈｕｒｏｎ ＴＩＳＳＵＥＳＣＯＰＥ ４０００、４０００ＸＴ、及びＨＳ；Ｌｅｉｃａ ＳＣＡＮＳＣＯＰＥ ＡＴ、ＡＴ２、ＣＳ、ＦＬ、及びＳＣＮ４００；Ｍｉｋｒｏｓｃａｎ Ｄ２；Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０−ＳＬ；Ｏｍｎｙｘ ＶＬ４、及びＶＬ１２０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＭＩＮＡ；Ｐｈｉｌｉｐｓ ＵＬＴＲＡ−ＦＡＳＴ ＳＣＡＮＮＥＲ；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＶＩＳＩＯＮＴＥＫ；Ｕｎｉｃ ＰＲＥＣＩＣＥ ５００、及びＰＲＥＣＩＣＥ ６００ｘ；ＶＥＮＴＡＮＡ ＩＳＣＡＮ ＣＯＲＥＯ及びＩＳＣＡＮ ＨＴ；及びＺｅｉｓｓ ＡＸＩＯ ＳＣＡＮ．Ｚ１が挙げられる。他の例示的なシステム及び特徴は、例えば、その内容の全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２０１１１−０４９６０８号又はＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡＳＳＥＴＴＥＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥと題された２０１１年９月９日出願の米国特許出願第６１／５３３１１４号に見出すことができる。
場合によっては、画像は画像解析システム上で解析されうる。画像解析システムは、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレット、スマートフォン、サーバー、アプリケーション特有のコンピューティングデバイス、又はここに記載の技術及び動作を実施することができる任意の他のタイプの電子デバイスなどの一又は複数のコンピューティングデバイスを含みうる。幾つかの実施態様では、画像解析システムは単一のデバイスとして実行されうる。他の実施態様では、画像解析システムは、ここで検討される様々な機能を一緒に達成する二つ以上のデバイスの組み合わせとして実行されうる。例えば、画像解析システムは、一又は複数のサーバーコンピュータと、一又は複数のローカルエリアネットワーク及び／又はインターネットなどの広域ネットワークを介して互いに通信可能に連結された一又は複数のクライアントコンピュータを含みうる。画像解析システムは、典型的には、少なくともメモリ、プロセッサ、及びディスプレイを含む。メモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、電気的消去可能プログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＥＰＲＯＭ）のようなリードオンリーメモリ、フラッシュメモリ、ハードドライブ、半導体ドライブ、光ディスク等々の任意のタイプの揮発性又は不揮発性メモリの任意の組み合わせを含みうる。メモリは、単一の装置に含めることができ、また二つ以上の装置に分配することもできることは理解される。プロセッサは、任意のタイプの一又は複数のプロセッサ、例えば中央処理装置（ＣＰＵ）、グラフィックス処理装置（ＧＰＵ）、専用の信号又は画像プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、テンソル処理装置（ＴＰＵ）等々を含みうる。プロセッサは、単一の装置に含めることができ、また二つ以上の装置に分配することもできることは理解される。ディスプレイは、ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＯＬＥＤ、ＴＦＴ、プラズマ等々の任意の適切な技術を使用して実装されうる。幾つかの実装では、ディスプレイはタッチセンサー式ディスプレイ（タッチスクリーン）でありうる。画像解析システムはまた典型的にはプロセッサに実装可能な一連の命令を含むメモリ上に記憶されたソフトウェアシステムを含み、命令は、物体認知、染色強度定量化等々の様々な画像解析タスクを含む。ここに開示されるようなモジュールの実装に有用な例示的な市販のソフトウェアパッケージには、ＶＥＮＴＡＮＡ ＶＩＲＴＵＯＳＯ；Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ ＴＩＳＳＵＥ ＳＴＵＤＩＯ、ＤＥＶＥＬＯＰＥＲ ＸＤ、及びＩＭＡＧＥ ＭＩＮＥＲ；及びＶｉｓｏｐｈａｒｍ ＢＩＯＴＯＰＩＸ、ＯＮＣＯＴＯＰＩＸ、及びＳＴＥＲＥＯＴＯＰＩＸソフトウェアパッケージが含まれる。
自動プロセスは検査室情報システム（ＬＩＳ）も含みうる。ＬＩＳ１３０は、典型的には、試料及びスライド及び試料から得られた画像について実施されたプロセスを記録し追跡すること、試料、スライド、及び／又は画像について特定のプロセスを実施し、及び試料及び又はスライドに適用される特定の試薬に関する情報（例えば、ロット番号、有効期限、分配された容量等々）を追跡するように免疫コンテクストスコアリングシステムの異なった構成要素に指示をすることから選択される一又は複数の機能を実施する。ＬＩＳは、通常、試料についての情報を含むデータベース；試料、スライド、及び／又は画像ファイルに関連するラベル（例えば、バーコード（１次元バーコード及び２次元バーコードを含む）、無線識別（ＲＦＩＤ）タグ、試料に貼り付けられた英数字コード等々）；及び試料又はスライド上のラベルを読み取り、及び／又はＬＩＳと免疫状況スコアリングシステムの他の構成要素との間のスライドに関する情報を通信する通信装置を少なくとも備える。従って、例えば、通信装置は、試料処理ステーション、自動組織化学的染色装置、Ｈ＆Ｅ染色プラットフォーム、及びスキャニングプラットフォームの各々に配置されうる。試料が最初に切片に加工されると、試料に関する情報（例えば、患者ＩＤ、試料タイプ、切片について実施されるプロセス）が通信装置に入力され得、試料から生成された各切片に対してラベルが作成される。後続の各ステーションでは、（バーコード又はＲＦＩＤタグをスキャンすることによって、又は英数字コードを手作業で入力することによって）ラベルが通信装置に入力され、ステーションがデータベースと電子的に通信して、例えばステーション又はステーションオペレータに、切片に関する特定のプロセスを実施し、及び／又は切片について実施されているプロセスを記録するように指示する。スキャニングプラットフォームでは、画像が画像解析システムに送られるときに、実施されるべき画像処理工程がＬＩＳのデータベースから画像解析システムに送られ得、及び／又は画像解析システムによって画像について実施された画像加工工程がＬＩＳのデータベースによって記録されるように、スキャニングプラットフォームが、画像が得られる切片又は試料に戻って相関するコンピュータ可読ラベル又はコードで各デジタル画像をまたエンコードしてもよい。本方法及びシステムに有用な市販のＬＩＳシステムには、例えば、ＶＥＮＴＡＮＡ Ｖａｎｔａｇｅ Ｗｏｒｋｆｌｏｗシステム（Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。
［対比染色］
対比染色は、一又は複数の標的を検出する薬剤で既に染色された後に試料を、それらの構造が顕微鏡下でより容易に視覚化できるように、後処理する方法である。例えば、対比染色が、免疫組織化学的色素をより明瞭にするために封入処理（カバースリッピング）前に任意に使用される。一次染色と色が異なる対比染色が選択されるべきである。ヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルー、及びヌクレアファストレッドなどの多数の対比染色が周知である。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）は、使用されうる蛍光色素である。また、対比染色は、それらが結合する構造とまたそれらが明視野又は蛍光分析に適しているかどうかによって分類することができ、例えば、ヘマトキシリン（青から紫に染色）、メチレンブルー（青に染色）、トルイジンブルー（核は濃い青に多糖類はピンクから赤に染色）、ヌクレアファストレッド（ケルネクトロート色素とも呼ばれ、赤に染色）、及びメチルグリーン（緑に染色）を含む明視野核対比染色；エオシン（ピンクに染色）などの非核明視野染色；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青に染色）、ヨウ化プロピジウム（赤に染色）、ヘキスト染色（青に染色）、核グリーンＤＣＳ１（緑に染色）、核イエロー（ヘキストＳ７６９１２１，中性ｐＨ下で黄に染色し、酸性ｐＨ下で青に染色）、ＤＲＡＱ５（赤に染色）、ＤＲＡＱ７（赤に染色）を含む蛍光核染色；フルオロフォア標識ファロイジンのような蛍光非核染色（糸状アクチンで染色、色はコンジュゲートしたフルオロフォアに依存）である。
幾つかの例では、一種を超える色素を一緒に混合して対比染色剤を作製することができる。これは、色素を選ぶ柔軟性と能力をもたらす。例えば、特定の性状を有するが異なる所望の性状を持っていない第一色素を混合物に対して選択することができる。不足している所望の性状を示す第二色素を混合物に加えることができる。例えば、トルイジンブルー、ＤＡＰＩ、及びポンタミンスカイブルーを一緒に混合して対比染色剤を形成することができる。
［イメージング］
開示された実施態様の所定の態様、又は全ては、コンピュータ解析及び／又は画像解析システムによって自動化され、容易にされうる。幾つかの用途では、正確な色彩又は蛍光比が測定される。幾つかの実施態様では、光学顕微鏡が画像解析に利用される。所定の開示された実施態様は、デジタル画像の取得を含む。これは、デジタルカメラを顕微鏡に連結することによって行うことができる。染色された試料から得られたデジタル画像は、画像解析ソフトウェアを使用して解析される。色彩又は蛍光は幾つかの異なる方法で測定することができる。例えば、色彩は、赤、青、緑の色値として；色相、彩度、及び輝度の値として；及び／又はスペクトルイメージングカメラを使用して特定の波長又は波長範囲を測定することによって、測定することができる。試料はまた定性的及び半定量的に評価することができる。定性的評価には、染色強度の評価、陽性染色細胞及び染色に関与する細胞内コンパートメントの同定、並びに試料全体又はスライドクオリティの評価が含まれる。別個の評価が試験試料に対して実施され、この解析は、試料が異常状態を表すかどうかを決定するために既知の平均値と比較することを含みうる。
［試料と標的］
試料は、生物学的成分を含み、一般には一又は複数の対象の標的分子を含む疑いがある。標的分子は細胞の表面にあり得、細胞は懸濁液中にあるか又は組織切片中にありうる。標的分子はまた細胞内にあり得、細胞溶解又はプローブによる細胞穿通の際に検出されうる。当業者であれば、試料中の標的分子を検出する方法は、試料のタイプ及び使用されるプローブに依存して変わることが分かるであろう。試料を収集し調製する方法は、当該技術分野において知られている。
例えば組織又は他の生物学的試料のような、ここに開示された方法の実施態様において組成物と共に使用される試料は、当業者に知られた任意の方法を使用して調製することができる。試料は、常套的なスクリーニングのために被験者から、あるいは遺伝子異常、感染、又は腫瘍などの疾患を有すると疑われる被験者から得ることができる。開示された方法の記載された実施態様は、「正常」試料と呼ばれる遺伝子異常、疾病、疾患等々を有していない試料にもまた適用することができる。このような正常な試料は、とりわけ、他の試料との比較のための対照として有用である。試料は多くの異なる目的のために分析することができる。例えば、試料は科学的研究において又は疑わしい疾患の診断のために、あるいは治療の成功、生存の予後指標等々として使用することができる。
試料は、プローブ又はレポーター分子が特異的に結合することができる複数の標的を含みうる。標的は核酸配列又はタンパク質でありうる。幾つかの例では、標的は、例えばウイルスゲノム由来のような、ウイルス、細菌、又は細胞内寄生体などの病原体に由来するタンパク質又は核酸分子である。例えば、標的タンパク質は、疾患に関連する（例えば、相関する、因果関係に関与する等々）標的核酸配列から産生されうる。
当業者であれば、次の標的の何れかに特異的なエピトープタグ抗体を開発することができることを理解するであろう：
特定の非限定的な例では、標的タンパク質は、新生物（例えば、がん）に関連する標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。新生物細胞、特にがん細胞、例えばＢ細胞及びＴ細胞白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、神経学的がん等々において、多数の染色体異常（転座及び他の再構成、増幅又は欠失を含む）が同定されている。従って、幾つかの例では、標的分子の少なくとも一部が、試料中の細胞の少なくともサブセットにおいて増幅され又は欠失された核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。
他の実施態様では、悪性細胞において欠損（喪失）している腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生された標的タンパク質である。例えば、染色体９ｐ２１上に位置するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、及びＤ９Ｓ１７５２を含む）がある種の膀胱がんにおいて欠失される。１番染色体の短腕の遠位領域（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、及びＳＨＧＣ−１３２２を包含する）及び１９番染色体の動原体周囲領域（例えば、１９ｐ１３−１９ｑ１３）（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、及びＧＬＴＳＣＲ１を包含する）を含む染色体欠失は、中枢神経系のある種の固形腫瘍の特徴的な分子的特徴である。
腫瘍性形質転換及び／又は増殖と相関する多数の他の細胞遺伝学的異常が当業者に知られている。腫瘍性形質転換と相関があり、開示された方法において有用である、核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される標的タンパク質には、また、ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９−５５２４２５２５）、Ｃ−ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８−１２８８２２８５６）、Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８−１９８６９０４９）、ＲＢＩ（１３ｑ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２−４７９５４０２３）、ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１７、補体、ヌクレオチド７５１２４６４−７５３１６４２））、Ｎ−ＭＹＣ（２ｐ２４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００２、補体、ヌクレオチド１５１８３５２３１−１５１８５４６２０）、ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１２、補体、ヌクレオチド５６１９６６３８−５６２００５６７）、ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４−３１１１０６０１）、ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１３、補体、ヌクレオチド４００２７８１７−４０１３８７３４）、並びに、例えば：ＡＬＫ（２ｐ２３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００２、補体、ヌクレオチド２９２６９１４４−２９９９７９３６）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４．６９１７８４２３）、ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１８、補体、ヌクレオチド５８９４１５５９−５９１３７５９３）、ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００３、補体、ヌクレオチド１８８９２１８５９−１８８９４６１６９）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（１ｐ３２−ｐ３１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００１、補体、ヌクレオチド５９０１９０５１−５９０２２３７３）、ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１−ｑ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１７、補体、ヌクレオチド３５７９８３２１−３５８２７６９５）、ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００２１、補体、ヌクレオチド４１７５８３５１−４１８０１９４８）、ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００２１、補体、ヌクレオチド３８６７５６７１−３８９５５４８８）；ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００７、補体、ヌクレオチド１３８９７３７９−１３９９５２８９）、ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１−２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１−ｑ２４．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９−１２８１８７５２１）、ＰＡＸ３（２ｑ３５−ｑ３７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００２、補体、ヌクレオチド２２２７７２８５１−２２２８７１９４４）、ＰＡＸ７（１ｐ３６．２−ｐ３６．１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７−１８９３５２１９）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５−８９７１６３８２）、ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１−ｑ１３．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１９、補体、ヌクレオチド４５４３１５５６−４５４８３０３６）、ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００１、補体、ヌクレオチド４０１３３６８５−４０１４０２７４）、ＲＥＬ（２ｐ１３−ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６−６１００３６８２）及びＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３−ｑ３５；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００５、補体、ヌクレオチド１４９４１３０５１−１４９４７３１２８）が含まれる。
［実施例］
ここに提示された非限定的な実施例はそれぞれ、少なくとも一つのエピトープタグ抗体の使用を組み入れる。本出願人は、次の実施例において証明されるように、ここに開示されるエピトープタグ抗体は多重ＩＨＣ検定を含むＩＨＣアッセイにおける使用に適していると考える。本出願人は次の実施例にもまた示されるように、未修飾抗体又は抗体コンジュゲートと併用して使用されうるとまた考える。当然のことながら、ここに詳述されるように、エピトープタグ抗体は、他の検出可能な特異的結合体と共に使用され得、ＩＨＣとＩＳＨを組み合わせたアッセイにおいて利用されうる。
次の実施態様及び上記した実施態様では、未結合抗体を除去するなどの一又は複数の洗浄工程を実施することができる。幾つかの実施態様では、過剰の試薬等を除去するために染色手順の各工程間で洗浄工程が実施されうる。もちろん、当業者であれば、任意の洗浄工程に関連するプロセス及び手順を理解しており、任意の試薬、未結合抗体等々を除去するプロセス及び手順に適用することができるであろう。
実施例１：３重免疫組織化学アッセイ
実施例１は、３種の異なるエピトープタグ抗体を組織試料に同時に適用した多重免疫組織化学アッセイを提供する（図１参照）。第一エピトープタグ抗体は、ＣＤ６８に特異的であり（抗ＣＤ６８）、ＶＳＶエピトープタグ（４つのＶＳＶエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第二エピトープタグ抗体は、ＦｏｘＰ３に特異的であり（抗ＦｏｘＰ３）、Ｖ５エピトープタグ（５つのＶ５エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第三エピトープタグ抗体は、ＣＤ２０に特異的であり（抗ＣＤ２０）、ＨＡエピトープタグ（４つのＨ５エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。エピトープタグ抗体は、希釈剤９００３９中の各エピトープタグ抗体を２μｇ／ｍＬ含む「カクテル」として適用した。
３種のエピトープタグ抗体の同時適用後、３種の抗タグ抗体を組織試料に同時に供給したが（図１参照）、ここで各抗タグ抗体がエピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的であった。第一抗ＶＳＶ抗体をＡｌｅｘａ５３２とコンジュゲートさせ（「オレンジ色」シグナルを生成）；第二抗Ｖ５抗体をＤｙＬｉｇｈｔ６４９とコンジュゲートさせ（「緑色」シグナルを生成）；そして第三抗ＨＡ抗体をＡｌｅｘａ５９４とコンジュゲートさせた（「紫色」シグナルを生成）。抗タグ抗体は、希釈剤９００４０中に５μｇ／ｍＬの各抗タグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
次の工程を、３重ＩＨＣアッセイについて行った（表２参照）：
Figure 0006952706
完全なプロトコルの概要を以下の表３に提供する：
Figure 0006952706
図２Ａ〜２Ｄは、上記の３重ＩＨＣアッセイで染色された組織試料を示す。図２Ａは、抗タグ抗体にコンジュゲートしたフルオロフォアの各々からのシグナルを明確に示し、よって、標的−エピトープタグ抗体複合体のそれぞれの位置、すなわちＣＤ６８−エピトープタグ抗体複合体（オレンジ色シグナル）、ＣＤ２０−エピトープタグ抗体複合体（緑色シグナル）、及びＦｏｘｐ３−エピトープタグ抗体複合体（紫色シグナル）の位置を明らかにしている。ＤＡＰＩ対比染色から生成されたシグナルは、図２Ａ〜２Ｄのそれぞれに青色で現れている。図２Ｂは、検出されたＣＤ６８−エピトープタグ抗体複合体に対応するシグナルのみを示す。図２Ｃは、検出されたＦｏｘｐ３−エピトープタグ抗体複合体に対応するシグナルのみを示す。図２Ｄは、検出されたＣＤ２０−エピトープタグ抗体複合体に対応するシグナルのみを示す。図２Ａ〜２Ｄは、本開示のエピトープタグ抗体が、（１）それぞれＣＤ６８、ＣＤ２０、及びＦｏｘＰ３に結合することができたこと；（２）適切な抗タグ抗体によって検出することができたこと；及び（３）互いに干渉することなく、同時に組織試料に（例えば、抗体カクテルとして）適用することができたことを示している。よって、本開示のエピトープタグ抗体は多重アッセイでの使用に適していた。加えて、本実施例の多重アッセイは、４時間以内で完了することができた。伝統的な多重アッセイと比較して、これは当該分野における進歩を表す。幾つかの実施態様では、このパネルは、血液系腫瘍及び固形腫瘍における免疫プロファイリングを助けるために使用されうる。
実施例２：３重免疫組織化学アッセイ
実施例２は、３種の異なるエピトープタグ抗体を同時に組織試料に適用した多重免疫組織化学アッセイを提供する（図３参照）。第一エピトープタグ抗体は、ＣＤ６８に特異的であり（抗ＣＤ６８）、ＶＳＶエピトープタグ（４つのＶＳＶエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第二エピトープタグ抗体は、ＦｏｘＰ３に特異的であり（抗ＦｏｘＰ３）、Ｖ５エピトープタグ（５つのＶ５エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第三エピトープタグ抗体は、ＣＤ８に特異的であり（抗ＣＤ８）、ＡＵ５エピトープタグ（４つのＡＵ５エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。エピトープタグ抗体は、希釈剤９００３９中に各エピトープタグ抗体を２μｇ／ｍＬ含む「カクテル」として適用した。
３種のエピトープタグ抗体の同時適用後、３種の抗タグ抗体を組織試料に同時に供給したが（図３参照）、ここで各抗タグ抗体がエピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的であった。第一抗ＶＳＶ抗体をＡｌｅｘａ５３２（ＪＨ）にコンジュゲートさせた（「オレンジ色」シグナルを生成）。第二抗Ｖ５抗体をＤｙＬｉｇｈｔ６４９にコンジュゲートさせた（「緑色」シグナルを生成）。第三抗ＡＵ５抗体をＡｌｅｘａ５９４（ＪＨ）にコンジュゲートさせた（「紫色」シグナルを生成）。抗タグ抗体は、希釈剤９００４０中に５μｇ／ｍＬの各抗タグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
次の工程を３重ＩＨＣアッセイのために行った（表４参照）：
Figure 0006952706
完全なプロトコルの概要をまた上記の表３に提供する：
図４Ａ〜４Ｄは、上記の３重ＩＨＣアッセイで染色された組織試料を示す。図４Ａ及び４Ｂは、抗タグ抗体にコンジュゲートしたフルオロフォアの各々からのシグナルを明確に示し、よって、標的−エピトープタグ抗体複合体のそれぞれの位置、すなわちＣＤ６８−エピトープタグ抗体複合体（オレンジ色シグナル）、ＣＤ８−エピトープタグ抗体複合体（緑色シグナル）、及びＦｏｘｐ３−エピトープタグ抗体複合体（紫色シグナル）の位置を明らかにしている。ＤＡＰＩ対比染色から生成されたシグナルは、図４Ａ及び４Ｂのそれぞれに青色で現れている。よって、図４Ａ及び４Ｂは、本開示のエピトープタグ抗体が、（１）それぞれＣＤ６８、ＣＤ８、及びＦｏｘＰ３に結合することができたこと；（２）適切な抗タグ抗体によって検出することができたこと；及び（３）互いに干渉することなく、同時に組織試料に（例えば、抗体カクテルとして）適用することができたことを示している。よって、本開示のエピトープタグ抗体は多重アッセイでの使用に適していた。加えて、本実施例の多重アッセイは、４時間以内で完了することができた。伝統的な多重アッセイと比較して、これは当該分野における進歩を表す。この免疫マーカーのパネルは、血液系腫瘍及び固形腫瘍における免疫プロファイリングを助ける。
実施例３：抗種抗体と抗タグ抗体を組み合わせて使用する４重免疫組織化学アッセイ
実施例３は、４種の異なるエピトープタグ抗体を２段階で組織試料に適用した多重免疫組織化学アッセイを提供する（図５参照）。最初に、未修飾抗体、すなわち抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体を組織試料と接触させた。抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体の適用後、標的−抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体複合体を検出するためにヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ４８８抗体を適用した（希釈剤９００４０中のヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ４８８（２μｇ／ｍＬ））。
ついで、３種のエピトープタグ抗体が組織試料に同時に供給される第二段階を実施した（図５参照）。この第二段階では、第一エピトープタグ抗体はＣＤ６８に特異的であり（抗ＣＤ６８）、ＶＳＶエピトープタグ（４つのＶＳＶエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第二エピトープタグ抗体はＦｏｘＰ３に特異的であり（抗ＦｏｘＰ３）、Ｖ５エピトープタグ（５つのＶ５エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第三エピトープタグ抗体は、ＣＤ８に特異的であり（抗ＣＤ８）、ＡＵ５エピトープタグ（４つのＡＵ５エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。エピトープタグ抗体は、希釈剤９００３９中に各エピトープタグ抗体を２μｇ／ｍＬ含む「カクテル」として適用した。
３種のエピトープタグ抗体の同時適用後、３種の抗タグ抗体を組織試料に同時に供給したが（図５参照）、ここで、各抗タグ抗体がエピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的であった。第一抗ＶＳＶ抗体をＡｌｅｘａ５３２（ＪＨ）とコンジュゲートさせ；第二抗Ｖ５抗体をＤｙＬｉｇｈｔ６４９とコンジュゲートさせ；第三抗ＡＵ５抗体をＡｌｅｘａ５９４（ＪＨ）とコンジュゲートさせた。抗タグ抗体は、希釈剤９００４０中に５μｇ／ｍＬの各抗タグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
４重ＩＨＣアッセイに対して次の工程を行った（表５参照）。
Figure 0006952706
完全なプロトコルの概要をまた表６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄに提供する。
図６Ａ〜６Ｆは、上記の４重ＩＨＣアッセイで染色された組織試料を示す。図６Ａは、抗種抗体又は抗タグ抗体の何れかにコンジュゲートしたフルオロフォアの各々からのシグナルを明確に示し、よって、標的−抗体複合体のそれぞれの位置、すなわちＰａｎ−ＣＫ−抗体複合体（「緑色」シグナル）、ＣＤ６８−エピトープタグ抗体複合体（「オレンジ色」シグナル）、ＣＤ８−エピトープタグ抗体複合体（「赤色」シグナル）、及びＦｏｘｐ３−エピトープタグ抗体複合体（「シアン色」シグナル）の位置を明らかにしている。ＤＡＰＩ対比染色から生成されたシグナルは、図６Ａ〜６Ｆのそれぞれに青色で現れている。図６Ｂは、ＤＡＰＩ対比染色に対応するシグナルのみを示す。図６Ｃは、検出されたＣＤ８−エピトープタグ抗体複合体に対応するシグナルのみを示す。図６Ｄは、検出されたＣＤ６８−エピトープタグ抗体複合体に対応するシグナルのみを示す。図６Ｅは、検出されたＦｏｘＰ３−エピトープタグ抗体複合体に対応するシグナルのみを示す。図６Ｆは、検出されたＰａｎ−ＣＫ染色に対応するシグナルのみを示す。図６Ａ〜６Ｅは、本開示のエピトープタグ抗体が、（１）それぞれＣＤ６８、ＣＤ８、及びＦｏｘＰ３に結合することができたこと；（２）適切な抗タグ抗体によって検出することができたこと；及び（３）互いに干渉することなく、同時に組織試料に（例えば、抗体カクテルとして）適用することができたことを示している。図６Ａはまたエピトープタグ抗体はマウス抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体のような未修飾抗体又は抗体コンジュゲートとアッセイにおいて組み合わせることができ、そのような組み合わせが抗種又は抗タグ抗体にコンジュゲートした全てのフルオロフォアの検出を可能にすることを示している。加えて、本実施例の多重アッセイは、４時間以内で完了することができた。伝統的な多重アッセイと比較して、これは当該分野における進歩を表す。このマーカーのパネルは、腫瘍領域内の上述の免疫細胞マーカー及び上皮細胞マーカーの発現と分布を示すのに有用な場合がある。
実施例４：抗種抗体と抗タグ抗体を併用する４重免疫組織化学アッセイ
実施例４は、４種の異なるエピトープタグ抗体を２段階で組織試料に適用した多重免疫組織化学アッセイ（図７参照）を提供する。最初に、未修飾抗体、すなわち抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体を組織試料と接触させた。抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体の適用後、標的−抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体複合体を検出するためにヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ４８８抗体を適用した（希釈剤９００４０中のヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ４８８（２μｇ／ｍＬ））。
ついで、３種のエピトープタグ抗体が組織試料に同時に供給される第二段階を行った（図７参照）。この第二段階では、第一エピトープタグ抗体はＣＤ６８に特異的であり（抗ＣＤ６８）、ＶＳＶエピトープタグ（４つのＶＳＶエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第二エピトープタグ抗体はＦｏｘＰ３に特異的であり（抗ＦｏｘＰ３）、Ｖ５エピトープタグ（５つのＶ５エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第三エピトープタグ抗体は、ＣＤ２０に特異的であり（抗ＣＤ２０）、ＨＡエピトープタグ（４つのＨＡエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。エピトープタグ抗体は、希釈剤９００３９中に各エピトープタグ抗体を２μｇ／ｍＬ含む「カクテル」として適用した。
３種のエピトープタグ抗体の同時適用後、３種の抗タグ抗体を組織試料に同時に供給したが（図７参照）、ここで、各抗タグ抗体がエピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的であった。第一抗ＶＳＶ抗体をＡｌｅｘａ５３２（ＪＨ）とコンジュゲートさせ；第二抗Ｖ５抗体をＤｙＬｉｇｈｔ６４９とコンジュゲートさせ；第三抗ＡＵ５抗体をクマリン（ＪＨ）とコンジュゲートさせた。抗タグ抗体は、希釈剤９００４０中に５μｇ／ｍＬの各抗タグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
４重ＩＨＣアッセイに対して次の工程を行った（表６Ａ参照）：
Figure 0006952706
完全なプロトコルの概要を表６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄに提供する。
Figure 0006952706
Figure 0006952706
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Figure 0006952706
Figure 0006952706
図８Ａ及び８Ｂは、上記の４重ＩＨＣアッセイで染色された組織試料を示す。図８Ａは４つの画像を提供し、各画像は、検出されたＰａｎ−ＣＫ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ６８、及びＣＤ２０に対応するシグナルを示す。図８Ｂは、シグナルの各々が検出されたＰａｎ−ＣＫ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ６８、及びＣＤ２０に対応する画像で、上で特定された抗体の４種全てが適用された組織試料に由来する画像を提供する。ここでもまた、図８Ａ及び８Ｂは、本開示のエピトープタグ抗体が、（１）それぞれＣＤ６８、ＣＤ２０、及びＦｏｘＰ３に結合することができたこと；（２）適切な抗タグ抗体によって検出することができたこと；及び（３）互いに干渉することなく、同時に組織試料に（例えば、抗体カクテルとして）適用することができたことを示している。図８Ｂはまたエピトープタグ抗体はマウス抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体のような未修飾抗体又は抗体コンジュゲートとアッセイにおいて組み合わせることができ、そのような組み合わせが抗種又は抗タグ抗体にコンジュゲートした全てのフルオロフォアの検出を可能にすることを示している。加えて、本実施例の多重アッセイは、４時間以内で完了することができた。伝統的な多重アッセイと比較して、これは当該分野における進歩を表す。このマーカーのパネルは、腫瘍領域に対する上述の免疫細胞マーカー及び上皮細胞マーカーの発現と分布を示すのに有用な場合がある。
実施例５：抗種抗体と抗タグ抗体を併用する４重免疫組織化学アッセイ
実施例５は、４種の異なるエピトープタグ抗体を２段階で組織試料に適用した多重免疫組織化学アッセイ（図９参照）を提供する。実施例３及び５と比較して、実施例５は、第１段階で２種の抗体を提供し、第２段階で別の２種のエピトープタグ抗体を提供する。
図９に示した第１段階に関して、第一の未修飾抗体、すなわち抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体を組織試料と接触させた。第一の未修飾抗体の適用と同時に又はその後に、第二の未修飾抗体、すなわち抗ＰＤＬ１（ＳＰ１４２）抗体を組織試料と接触させた。第一及び第二の未修飾抗体の適用後、ヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ４８８抗体を適用して標的−抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体複合体（希釈剤９００４０中のヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ４８８（２μｇ／ｍＬ））を検出し、ヤギ抗ウサギ−Ａｌｅｘａ５９４抗体を適用して標的−抗ＰＤＬ１（ＳＰ１４２）抗体複合体（ヤギ抗ウサギ−Ａｌｅｘａ５９４（２ｕｇ／ｍｌ））を検出した。
ついで、２種のエピトープタグ抗体が組織試料に同時に供給される第２段階を行った（図９参照）。この第２段階では、第一のエピトープタグ抗体はＣＤ２０に特異的であり（抗ＣＤ２０）、ＨＡエピトープタグ（４つのＨＡエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第二のエピトープタグ抗体は、ＣＤ６８に特異的であり（抗ＣＤ６８）、ＶＳＶエピトープタグ（４つのＶＳＶエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。エピトープタグ抗体は、希釈剤９００３９中に２μｇ／ｍＬの各エピトープタグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
２種のエピトープタグ抗体の同時適用後、２種の抗タグ抗体を組織試料に同時に供給したが（図９参照）、ここで、各抗タグ抗体がエピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的であった。第一の抗ＨＡ抗体をクマリンとコンジュゲートさせ；第二の抗ＶＳＶ抗体をＡｌｅｘａ５３２とコンジュゲートさせた。抗タグ抗体は、希釈剤９００４０中に５μｇ／ｍＬの各抗タグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
４重ＩＨＣアッセイのために次の工程を行った（表７参照）：
Figure 0006952706
完全なプロトコルの概要を表８に提供する：
Figure 0006952706
Figure 0006952706
図１０Ａ〜１０Ｇは、上記の４重ＩＨＣアッセイで染色された組織試料を示す。図１０Ａは、ＤＡＰＩ染色、ＰＤＬ１染色、ＣＤ２０染色、及びＣＤ６８染色をそれぞれ個別に示す画像を提供する。図１０Ｂは、ＤＡＰＩ染色、ＰＤＬ１染色、ＣＤ２０染色、ＣＤ６８染色、及びＰａｎ−ＣＫ染色に対応するシグナルを示す画像を提供する。図１０Ｃは、Ｐａｎ−ＣＫ染色及びＰＤＬ１染色のそれぞれを示す個々の画像；及びＰａｎ−ＣＫ染色及びＰＤＬ１染色に対応するシグナルを示す画像を提供する。図１０Ｃは、異なる種から産生された２種の未修飾抗体を組み合わせ、抗種抗体を使用して検出できることを示し、シグナルが腫瘍領域（Ｐａｎ−ＣＫ陽性腫瘍上皮細胞）及びＰＤＬ１発現腫瘍細胞（Ｐａｎ−ＣＫ及びＰＤＬ１の共局在化）又はＰＤＬ１発現免疫細胞を示すことを可能にする。図１０Ｄ及び１０Ｅは、それぞれ、既知の現象であるＰＤＬ１をマクロファージ（ＣＤ６８陽性）が発現するＣＤ６８及びＰＤＬ１共染色を示す画像を提供する。幾つかの実施態様では、この特定のアッセイは、腫瘍浸潤リンパ球を同定するために使用されうる。従って、図１０Ｄ及び１０Ｅは、未修飾抗体及びエピトープタグ抗体が、２つの適用段階にわたって首尾よく組み合わされ得、抗体の各々が抗種又は抗タグ抗体によって検出されうることを示す。図１０Ｄ及び１０Ｅはまた両ＰＤＬ１を発現しＣＤ６８マーカーを有する細胞膜の共局在化を示す。図１０Ｆ及び１０Ｇは、ＰＤＬ１、Ｐａｎ−ＣＫ、ＣＤ６８、及びＣＤ２０で染色した組織試料を示す。
再度、図１０Ａ〜１０Ｇは、本開示のエピトープタグ抗体が、（１）それぞれＣＤ２０及びＣＤ６８に結合することができたこと；（２）適切な抗タグ抗体によって検出することができたこと；及び（３）互いに干渉することなく、同時に組織試料に（例えば、抗体カクテルとして）適用することができたことを示している。図１０Ａ〜１０Ｇはまたエピトープタグ抗体はマウス抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体又はウサギ抗ＰＤＬ１（ＳＰ１４２）抗体のような２種の未修飾抗体又は抗体コンジュゲートとアッセイにおいて組み合わせることができ、そのような組み合わせが抗種又は抗タグ抗体にコンジュゲートした全てのフルオロフォアの検出を可能にすることを示している。加えて、本実施例の多重アッセイは、４時間以内で完了することができた。伝統的な多重アッセイと比較して、これは当該分野における進歩を表す。このマーカーのパネルは、抗ＰＤ−Ｌ１処置患者の腫瘍微小環境における腫瘍細胞及び浸潤免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現の同定を可能にする］。
実施例６：抗種抗体と抗タグ抗体を併用する４重免疫組織化学アッセイ
実施例６は、４種の異なるエピトープタグ抗体を２段階で組織試料に適用した多重免疫組織化学アッセイ（図１１参照）を提供する。実施例３及び５と比較して、実施例５は、第１段階で２種の抗体を提供し、第２段階で別の２種のエピトープタグ抗体を提供する。
図１１に示した第一段階に関して、第一の未修飾抗体、すなわち抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体を組織試料と接触させた。第一の未修飾抗体の適用と同時に又はその後に、第二の未修飾抗体、すなわち抗ＣＤ３（ＳＰ１６２）抗体を組織試料と接触させた。第一及び第二の未修飾抗体の適用後、ヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ４８８抗体を適用して標的−抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体複合体（希釈剤９００４０中のヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ４８８（２μｇ／ｍＬ））を検出し、ヤギ抗ウサギ−Ａｌｅｘａ５９４抗体を適用して標的−抗ＰＤＬ１（ＳＰ１４２）抗体複合体（ヤギ抗ウサギ−Ａｌｅｘａ５９４（２ｕｇ／ｍｌ））を検出した。
ついで、２種のエピトープタグ抗体が組織試料に同時に供給される第２段階を行った（図１１参照）。この第２段階では、第一のエピトープタグ抗体はＣＤ２０に特異的であり（抗ＣＤ２０）、ＨＡエピトープタグ（４つのＨＡエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第二のエピトープタグ抗体は、ＣＤ６８に特異的であり（抗ＣＤ６８）、ＶＳＶエピトープタグ（４つのＶＳＶエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。エピトープタグ抗体は、希釈剤９００３９中に２μｇ／ｍＬの各エピトープタグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
２種のエピトープタグ抗体の同時適用後、２種の抗タグ抗体を組織試料に同時に供給したが（図１１参照）、ここで、各抗タグ抗体がエピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的であった。第一の抗ＨＡ抗体をクマリンとコンジュゲートさせ；第二の抗ＶＳＶ抗体をＡｌｅｘａ５３２とコンジュゲートさせた。抗タグ抗体は、希釈剤９００４０中に５μｇ／ｍＬの各抗タグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
４重ＩＨＣアッセイのために次の工程を行った（表９参照）：
Figure 0006952706
完全なプロトコルの概要を表８に提供する：
図１２Ａ〜１２Ｄは、上記の４重ＩＨＣアッセイで染色された組織試料を示す。図１２Ａは、ＤＡＰＩ染色、ＣＤ３染色、ＰａｎＣＫ染色、及びＣＤ６８染色を示す画像を提供する。図１２Ｂは、２種の区別されるＢ細胞及びＴ細胞集団を表す、ＣＤ２０染色及びＣＤ３染色に対応するシグナルを示す画像を提供する。図１２Ｂは、未修飾抗体（抗ＣＤ３）及びエピトープタグ抗体（抗ＣＤ６８）が、二つの適用段階にわたって首尾よく組み合わされ得、抗体の各々がそれぞれ抗種又は抗タグ抗体によって検出されうることを示す。図１２Ｃ及び１２Ｄは、ＣＤ３、Ｐａｎ−ＣＫ、ＣＤ６８、及びＣＤ２０で染色された組織試料を示す。
図１２Ａ〜１２Ｄは、本開示のエピトープタグ抗体が、（１）それぞれＣＤ２０及びＣＤ６８に結合することができたこと；（２）適切な抗タグ抗体によって検出することができたこと；及び（３）互いに干渉することなく、同時に組織試料に（例えば、抗体カクテルとして）適用することができたことを示している。図１２Ａ〜１２Ｄはまたエピトープタグ抗体はマウス抗Ｐａｎ−ＣＫ抗体又はウサギ抗ＣＤ３（ＳＰ１６２）抗体のような２種の未修飾抗体又は抗体コンジュゲートとアッセイにおいて組み合わせることができ、そのような組み合わせが抗種又は抗タグ抗体にコンジュゲートした全てのフルオロフォアの検出を可能にすることを示している。加えて、本実施例の多重アッセイは、４時間以内で完了することができた。伝統的な多重アッセイと比較して、これは当該分野における進歩を表す。このマーカーのパネルは、免疫細胞マーカー及び腫瘍細胞マーカーを示し、腫瘍微小環境における免疫プロファイルを示すのに役立つ。
実施例７：５重免疫組織化学アッセイ
実施例７は、５つの異なるエピトープタグ抗体を同時に組織試料に適用した多重免疫組織化学アッセイを提供する（図１３参照）。第一エピトープタグ抗体はＣＤ３に特異的であり（抗ＣＤ３）、Ｅエピトープタグ（４つのＥエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第二エピトープタグ抗体はＣＤ８に特異的であり（抗ＣＤ８）、Ｅ２エピトープタグ（４つのＥ２エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第三エピトープタグ抗体はＣＤ２０に特異的であり（抗ＣＤ２０）、ＨＡエピトープタグ（４つのＨＡエピトータグを含む重鎖）を含んでいた。第四エピトープタグ抗体は、ＣＤ６８に特異的であり（抗ＣＤ６８）、ＶＳＶエピトープタグ（４つのＶＳＶエピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。第五エピトープタグ抗体は、ＦｏｘＰ３に特異的であり（抗ＦｏｘＰ３）、Ｖ５エピトープタグ（５つのＶ５エピトープタグを含む重鎖）を含んでいた。エピトープタグ抗体は、希釈剤９００３９中に各エピトープタグ抗体を２μｇ／ｍＬを含む「カクテル」として適用した。
３種のエピトープタグ抗体の同時適用後、５種の抗タグ抗体を組織試料に同時に供給したが（図１３参照）、ここで、各抗タグ抗体がエピトープタグ抗体の異なるエピトープタグに特異的であった。第一の抗Ｅ抗体をＡｌｅｘａ４８８とコンジュゲートさせ；第二の抗Ｅ２抗体をＡｌｅｘａ５９４とコンジュゲートさせ；第三の抗ＨＡ抗体をクマリンとコンジュゲートさせ；第四の抗ＶＳＶ抗体をＡｌｅｘａ５３２とコンジュゲートさせ；及び第五の抗Ｖ５抗体をＡｌｅｘａ６４７とコンジュゲートさせた。抗タグ抗体は、希釈剤９００４０中に５μｇ／ｍＬの各抗タグ抗体を含む「カクテル」として適用した。
３重ＩＨＣアッセイのために次の工程を行った（表１０）：
Figure 0006952706
完全なプロトコルの概要を表３に提供する。
図１４Ａは、ＤＡＰＩ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６８、及びＦｏｘＰ３染色に対応するシグナルを示す画像を提供する。図１４Ｂは、ＤＡＰＩ、ＣＤ３及びＣＤ８染色を示す画像を提供する。とりわけ、図１４Ｂは、ＣＤ３の白色シグナルとＣＤ８の赤色シグナルが重複して、重ね合わせされたマゼンタ色のシグナルを提供するように、ＣＤ３及びＣＤ８シグナルが（ＤＡＰＩ対比染色の存在下で）重ね合わされた位置を示す。同様に、図１４Ｃは、ＤＡＰＩ対比染色の非存在下で、ＣＤ３（緑色）及びＣＤ８（赤色）シグナルの重ね合わせを示す。
図１４Ｄは、重ね合わせが観察されないＤＡＰＩ、ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞マーカー）及びＦｏｘＰ３（制御性Ｔ細胞マーカー）染色を示す画像を提供する。図１４Ｅは、重ね合わせが観察されないＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞マーカー）及びＦｏｘＰ３（制御性Ｔ細胞マーカー）染色を示す画像を提供する。図１４Ｆは、重ね合わせが観察されるＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）及びＦｏｘＰ３（制御性Ｔ細胞マーカー）染色を示す画像を提供する。図１４Ｇは、ＣＤ６８及びＦｏｘＰ３染色を示す画像を提供し；図１４Ｈは、ＣＤ２０（Ｂ細胞マーカー）及びＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）染色を示す画像を提供する。図１４Ｉは、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、及びＣＤ８染色を示す画像を提供し、ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞マーカー）及びＦｏｘＰ３（制御性Ｔ細胞マーカー）がＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）に共局在化している。図１４Ｊは、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８、及びＣＤ６８染色を示す画像を提供する。これらの染色パターンは、免疫細胞の異なる集団とそれらの相互関係を示す。
図１４Ａ〜１４Ｉは、本開示の５種のエピトープタグ抗体が、（１）ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６８、及びＦｏｘＰ３に結合することができたこと；（２）適切な抗タグ抗体によって検出することができたこと；及び（３）互いに干渉することなく、同時に組織試料に（例えば、抗体カクテルとして）適用することができたことを示している。５重ＭＩＨＣアッセイは、４時間以内で完了することができた。このアッセイは、血液系腫瘍及び固形腫瘍における免疫プロファイリングに有用である。
実施例８：ＨＥＲ２＋４ｎ１細胞株モデル及び乳がん組織へのＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体−Ｖ５ペプチドコンジュゲートの評価
この実施例は、ＨＥＲ２＋４ｎ１細胞株モデル及びＨＥＲ２＋乳がん組織に対するＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体Ｖ５ペプチドコンジュゲートの可視化を実証する。扁桃組織切片を含むスライドを、自動染色装置［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ，Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，（ＶＭＳＩ）Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ］の標準プロトコルを使用して開発した。典型的な自動プロトコルは次の通りである：スライド上のパラフィン被覆組織を７５℃で４分間加熱し、容量を７５℃で調整したＥＺＰｒｅｐ（ＶＭＳＩ＃９５０−１０２）で１回処理した後、液体カバースリップ（ＬＣＳ，ＶＭＳＩ＃６５０−０１０）を適用した。スライドを７５℃で４分間インキュベートした後、スライドをリンスし、ＥＺＰｒｅｐ容量を調整し、続いてＬＣＳを用いて組織を脱パラフィンした（プロセスは３回反復−合計４サイクル）。スライドを３７℃に冷却し、４分間インキュベートした。スライドを細胞コンディショニング溶液（ＣＣＩ，ＶＭＳＩ＃９５０−１２４）で完全にリンスし、続いてＬＣＳを適用した。スライドを９５℃で８分間加熱した。ついで、スライドを１００℃に加熱し、８分間インキュベートした。スライドをＣＣＩでリンスし、続いてＬＣＳを適用し、１００℃で８分間インキュベートした。スライドの乾燥を防止するために、４分ごとに１６分間、ＣＣＩ及びＬＣＳを適用した。
スライドを３７℃に冷却し、反応バッファー（ＶＭＳＩ＃９５０−３００）で２回リンスし、１００μＬのＵＶインヒビター（ＶＭＳＩ ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ＤＡＢ検出キット＃７６０−５００の成分）をスライドに適用し、４分間インキュベートした。スライドを反応バッファーで１回リンスした後、カゼインを含むＶｅｎｔａｎａ抗体希釈剤（ＶＭＳＩ＃７６０−２１９）中のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−ＶＳペプチドコンジュゲート（１μｇ／ｍＬ）１００μＬを３７℃で１６分間適用した。スライドを反応バッファーで３回リンスしてから、Ｂ５ブロッカーを含むＶｅｎｔａｎａアビジン希釈剤（ＶＭＳＩ＃９００４０）中１μｇ／ｍＬのＰｉｅｒｃｅ ＭｓＡｎｔｉＶ５抗体（Ｃｌｏｎｅ ＥＩＯ／Ｖ４ＲＲ，Ｐｉｅｒｃｅ＃ＭＡＳ−１５２５３）１００μＬを添加した。ＭｓＡｎｔｉＶ５抗体を３７℃で８分間インキュベートした。スライドを反応バッファーで３回リンスした後、１００μＬのｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ＨＲＰユニバーサルマルチマー（ＶＭＳＩ ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ＤＡＢ検出キット＃７６０−５００の成分）を添加した。反応バッファーで３回リンスした後、ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ＤＡＢとｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ Ｈ２０ ２の両方をスライドに１００μＬ適用し、３７℃でＬＣＳと共に８分間インキュベートした。スライドを反応バッファー中で一回リンスした後、ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ Ｃｏｐｐｅｒ１００μＬをスライドに適用し、３７℃で４分間インキュベートした。ついで、スライドを反応バッファーで２回リンスした後、スライド上でＬＣＳと共に４分間インキュベートしたヘマトキシリンＩＩ（ＶＭＳＩ＃７５０−２０２１）で対比染色した。反応バッファーで２回リンスした後、ブルーイング試薬（ＶＭＳＩ＃７６０−２０３７）を適用し、対比染色が完了するまで４分間インキュベートした。スライドを機器から取り出し、洗剤洗浄で処理し、水でリンスし、アルコール削減及びキシレンで脱水した後、固体のカバースリップを手作業で適用した。以下に検討される結果は、２＋ＨＥＲ２＋乳がん組織の場合のＩＨＣ染色のものである。スライドを明視野顕微鏡で見た。表１１に示す結果は、ＤＡＢ ＩＨＣシグナル強度（例えば、染色の強度）の主観的スコアであり、２がＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）標準スライドについて観察された最も強いＤＡＢ強度であった。
Figure 0006952706
ＨＯＫ４ ＨＥＲ２−Ｖ５コンジュゲートは、２＋乳がん症例でのＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）標準対照と同等のＩＨＣ ＤＡＢ染色を提供した。Ｈ０Ｋ１からＨ０Ｋ３ ＨＥＲ２−Ｖ５コンジュゲートは、僅かに劣ったＩＨＣ染色を示した。Ｈ２Ｋ０からＨ５Ｋ０ ＨＥＲ２−Ｖ５コンジュゲートは、２＋乳がん症例でのＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）標準対照と同等であった。Ｈ１Ｋ０ ＨＥＲ２−Ｖ５コンジュゲートもまた僅かに劣ったＩＨＣ組織染色を示した。
実施例９：ＨＥＲ２＋４１１１細胞株モデル及び乳がん組織へのＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体−Ｖ５ペプチドコンジュゲートの評価
この実施例は、ＨＥＲ２＋４ｎ１細胞株モデル及びＨＥＲ２＋乳がん組織に対するＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体−Ｖ５ペプチドコンジュゲートの可視化を実証する。扁桃組織切片を含むスライドを、自動染色装置［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ，Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，（ＶＭＳＩ）Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ］の標準プロトコルを使用して開発した。典型的な自動プロトコルは次の通りである：スライド上のパラフィン被覆組織を７５℃で４分間加熱し、容量を７５℃で調整したＥＺＰｒｅｐ（ＶＭＳＩ＃９５０−１０２）で１回処理した後、液体カバースリップ（ＬＣＳ，ＶＭＳＩ＃６５０−０１０）を適用した。スライドを７５℃で４分間インキュベートした後、スライドをリンスし、ＥＺＰｒｅｐ容量を調整し、続いてＬＣＳを用いて組織を脱パラフィンした（プロセスは３回反復−合計４サイクル）。スライドを３７℃に冷却し、４分間インキュベートした。スライドを細胞コンディショニング溶液（ＣＣＩ，ＶＭＳＩ＃９５０−１２４）で完全にリンスし、続いてＬＣＳを適用した。スライドを９５℃で８分間加熱した。ついで、スライドを１００℃に加熱し、８分間インキュベートした。スライドをＣＣＩでリンスし、続いてＬＣＳを適用し、１００℃で８分間インキュベートした。スライドの乾燥を防止するために、４分ごとに１６分間、ＣＣＩ及びＬＣＳを適用した。
スライドを３７℃に冷却し、反応バッファー（ＶＭＳＩ＃９５０−３００）で２回リンスし、１００μＬのＵＶインヒビター（ＶＭＳＩ ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ＤＡＢ検出キット＃７６０−５００の成分）をスライドに適用し、４分間インキュベートした。スライドを反応バッファーで１回洗浄した後、カゼインを含むＶｅｎｔａｎａ抗体希釈剤（ＶＭＳＩ＃７６０−２１９）中のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−ＶＳペプチドコンジュゲート（１μｇ／ｍＬ）１００μＬを３７℃で１６分間適用した。スライドを反応バッファーで３回リンスしてから、Ｂ５ブロッカーを含むＶｅｎｔａｎａアビジン希釈剤（ＶＭＳＩ＃９００４０）中１μｇ／ｍＬのＰｉｅｒｃｅ ＭｓＡｎｔｉＶ５抗体（Ｃｌｏｎｅ ＥＩＯ／Ｖ４ＲＲ，Ｐｉｅｒｃｅ＃ＭＡＳ−１５２５３）１００μＬを添加した。ＭｓＡｎｔｉＶ５抗体を３７℃で８分間インキュベートした。スライドを反応バッファーで３回リンスした後、１００μＬのｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ＨＲＰユニバーサルマルチマー（ＶＭＳＩ ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ＤＡＢ検出キット＃７６０−５００の成分）を添加した。反応バッファーで３回リンスした後、ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ＤＡＢとｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ Ｈ２０ ２の両方をスライドに１００μＬ適用し、３７℃でＬＣＳと共に８分間、共インキュベートした。スライドを反応バッファーで一回リンスした後、ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ Ｃｏｐｐｅｒ１００μＬをスライドに適用し、３７℃で４分間インキュベートした。ついで、スライドを反応バッファーで２回リンスした後、スライド上でＬＣＳと共に４分間インキュベートしたヘマトキシリンＩＩ（ＶＭＳＩ＃７５０−２０２１）で対比染色した。反応バッファーで２回リンスした後、ブルーイング試薬（ＶＭＳＩ＃７６０−２０３７）を適用し、対比染色が完了するまで４分間インキュベートした。スライドを機器から取り出し、洗剤洗浄で処理し、水でリンスし、アルコール削減及びキシレンで脱水した後、固体のカバースリップを手作業で適用した。
以下に検討する結果は、２＋ＨＥＲ２＋乳がん組織の場合のＩＨＣ染色のものである。スライドを明視野顕微鏡で見た。表１２に示す結果は、ＤＡＢ ＩＨＣシグナル強度（例えば、染色の強度）の主観的スコアであり、２がＨＥＲ２／ｎｅｕ（４８５）標準スライドについて観察された最も強いＤＡＢ強度であった。
Figure 0006952706
Ｈ０Ｋ４ ＨＥＲ２−Ｖ５コンジュゲートは、２＋乳がん症例でのＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）標準対照と同等のＩＨＣ ＤＡＢ染色を提供した。Ｈ０Ｋ１からＨ０Ｋ３ ＨＥＲ２−Ｖ５コンジュゲートは、僅かに劣ったＩＨＣ染色を示した。Ｈ２Ｋ０からＨ５Ｋ０ ＨＥＲ２−Ｖ５コンジュゲートは、２＋乳がん症例でのＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）標準対照と同等であった。Ｈ１Ｋ０ ＨＥＲ２−Ｖ５コンジュゲートもまた僅かに劣ったＩＨＣ組織染色を示した。
実施例１０：ＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体−ＶＳペプチドコンジュゲートのＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）評価：ＨＥＲ２ペプチド抗原のコンジュゲート認識と抗ＶＳ抗体によるその後のコンジュゲート認識
全てのＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法実験を、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ黒色平底９６ウェルポリプロピレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ＃６５５２０９）中のＦｏｒｔｅＢｉｏアミン反応センサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ＃１８−５００１）を使用してＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ＢＵ機器で実施した。全てのＢＬＩアッセイは３７℃で実施した。
ＢＬＩ分析を次のように実施した：
ＦｏｒｔｅＢｉｏアミン反応性バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、０．１ＭＭＥＳ ｐＨ５．０［２−（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）］２００μＬ中で水和させた。バイオセンサーを、ｄｄｉ水中０．４ＭのＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）、０．１ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロスルホスクシンイミド）の２００μＬ混合物中での処理により５分間活性化した。ＢＳＡ−ＨＥＲ２ペプチド免疫原投入は、Ｏ．ＩＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０中２００μＬのＢＳＡ−ＨＥＲ２ペプチド免疫原（２５μｇ／ｍＬ）で２０分間センサーを処理することにより実施した。センサーを１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ＝８．５）で５分間クエンチした後、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態バッファー添加剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ＃１８−５０３２をＩＸに希釈）を含む１０ｍＭのリン酸（ｐＨ＝７．４）、１３４ｍＭのＮａＣｌ中で５分間平衡化した。ＨＥＲ２−Ｖ５抗体ペプチドコンジュゲート結合を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態バッファー添加剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ＃１８−５０３２をＩＸに希釈）を含む１０ｍＭのリン酸（ｐＨ＝７．４）、１３４ｍＭのＮａＣｌ中の３μｇ／ｍＬのコンジュゲート溶液でおよそ４５分間センサーを処理することによって実施した。ＨＥＲ２−Ｖ５抗体−ペプチド抗体コンジュゲートを、
ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態バッファー添加剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ＃１８−５０３２をＩＸに希釈）を含む１０ｍＭのリン酸（ｐＨ＝７．４）、１３４ｍＭのＮａＣｌ中で20分間センサーから解離させた。バイオセンサーのＭｓＡｎｔｉＶ５抗体認識を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態バッファー添加剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ＃１８−５０３２をＩＸに希釈）を含む１０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．４）、１３４ｍＭのＮａＣｌ中のＰｉｅｒｃｅ ＭｓＡｎｔｉＶ５抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｅｌ０／Ｖ４ＲＲ，Ｐｉｅｒｃｅ＃ＭＡＳ−１５２５３）の３μｇ／ｍＬ溶液でおよそ４５分間センサーを処理することにより実施した。ＨＥＲ２−Ｖ５抗体−ペプチド抗体コンジュゲートを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態バッファー添加剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ＃１８−５０３２をＩＸに希釈）を含む１０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．４）、１３４ｍＭのＮａＣｌ中でおよそ４５分間センサーから解離させた。
結果：
抗体−ペプチドコンジュゲート／抗原認識と続いて二次抗ペプチド抗体／抗体−ペプチドコンジュゲート認識に対するペプチド標識の影響を実証するためにＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法実験を実施した。ＢＬＩ研究は、抗体重鎖及び軽鎖のペプチド標識が、必要な抗原の抗体認識にほとんど影響しないことを実証した。更なる研究により、ペプチド標識の増加が、二次抗体認識の様式を親和性相互作用から結合活性相互作用へ変化させたことを示した。重鎖及び軽鎖の両方の標識の増加は、少なくとも幾らかのアッセイ層圧縮と結合活性の増加を引き起こしたが、二次抗体解離は大きく最小化された（図２４Ａ及び２４Ｂ参照）。
ＢＬＩ分析は、（１）全ての抗体認識工程に対する良好なシグナル／ノイズ；（２）反復データ点を用いた一貫したアッセイ応答を示し；（３）天然ＨＥＲ２（４Ｂ５）とＭｓＡｎｔｉＶ５に対して交差反応性は観察されなかった。
実施例１１：ＤＬＳ／ＤＳＣ試験
方法
ＤＬＳ：流体力学的半径、凝集体、温度誘発凝集
ＤＳＣ：ＩｇＧドメイン融解温度に対するＥ４タグの影響（表１３参照）：
Figure 0006952706
全ての試料は、０．１％のアジ化ナトリウム及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に入れた；Ｅ４タグをＨ及び／又はＫ鎖のＣ末端に融合させた（図２５Ａ参照）。Ｅ４タグの分子量は２０ｋＤａであった。
プロテインＡクロマトグラフィーによるＢＳＡの除去：
（１）プロテインＡクロマトグラフィー−カラム：ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（１ｍｌ）；バッファーＡ：５０ｍＭのＫＰ、１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．５；バッファーＢ：５０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ４．０
（２）５０ｍＭのＫＰ−Ｐｕｆｆｅｒ １５０ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．４に対して４℃で１６時間透析する
（３）Ｐａｌｌ Ｍａｃｒｏｓｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ １０ｋＤａで０．５ｍｇのタンパク質／ｍｌに濃縮する
収量（表１４参照）：
Figure 0006952706
図２５Ｂは、ＢＳＡが試料から定量的に除去されたことを示している（ＳＤＳページ）。
ＳＥＣクロマトグラフィー−ＳＥＣ（ＹＭＣ２００）と組み合わせた屈折率及び直角光散乱検出器から計算した分子量（表１５参照）：
Figure 0006952706
ＳＥＣクロマトグラフィーは、分子量が予想通りであることを示した。
ＤＬＳ測定−分析及び解釈（表１６Ａ及び１６Ｂ参照）：
Figure 0006952706
Figure 0006952706
測定の再現性は良好である；
Ｈ０Ｋ０は、ＩｇＧについて予想された通り１ｒＨ（５．４ｎｍ）を有し、少量の凝集物のみが検出可能であった；
Ｅ４タグのＣ末端融合がｒＨの有意な増加を引き起こしたが、これはＥ４タグの非構造的性質によって説明されうる；
Ｅ４タグを有する試料では、僅かにより多い凝集体が検出可能であった；そして
Ｈ４Ｋ０は、他のものより有意に多くの凝集体（約２％（ｗ／ｗ））を有し、ピーク１においてより高い多分散性を有し、オリゴマー（二量体から四量体）に高含有量を示している。
ＤＬＳ温度勾配（図２５Ｄ及び２５Ｅを参照）
２５℃から８０℃の温度範囲にわたって０．１Ｋ／分の勾配速度（約１０時間）で流体力学的半径（累積的フィット）が追跡される；天然ＩｇＧ（Ｈ０Ｋ０）は７０℃で非常に大きな（約１μｍ）凝集体を形成する；温度曲線は、Ｅ４タグがこの温度誘発凝集体の形成を低減させることを示唆している。
ＯｎｓｅｔＴｅｍｐを用いて凝集開始点を決定した。ＯｎｓｅｔＴｅｍｐは、タンパク質構造の安定性の指標である；Ｈ鎖のＣ末端へのＥ４タグの融合は、ＯｎｓｅｔＴｅｍｐに有意な影響を及ぼさない；Ｋ鎖のＣ末端へのＥ４タグの融合は、２ＫだけＯｎｓｅｔＴｅｍｐの減少を引き起こす；この効果は、Ｈ０Ｋ４及びＨ４Ｋ４で観察することができた。Ｋ４融合体はＩｇＧに対して不安定化効果を有していた。
ＤＳＣ分析（図２５Ｆ参照）−試料の量が限られているため、ＤＳＣ実験は単一の測定として非常に低い濃度で実施しなければならなかった；Ｋ鎖のＣ末端へのＥ４タグの融合は、Ｈ４Ｋ０と比較してＴｍの有意な減少を引き起こした；ＤＬＳ実験で示されたＩｇＧに対するＫ４融合の不安定化効果は、ＤＳＣによって確認することができた。
ＤＬＳ／ＤＳＣの概要
全ての実験を、５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、１５０ｍＭの塩化カリウムｐＨ７．４で実施した。バッファー、ｐＨ、塩濃度の影響の評価は、この研究の目的ではなかった。
Ｅ４タグの観察された影響：
分子量の増加は、１５４ｋＤａ（Ｈ０Ｋ０）から２０５ｋＤａ（Ｈ４Ｋ０及びＨ０Ｋ４）及び２５２ｋＤａ（Ｈ４Ｋ４）までＲＡＬＳによって決定した。
５．４ｎｍ（Ｈ０Ｋ０）から８ｎｍ（Ｈ４Ｋ０及びＨ０Ｋ４）及び９ｎｍ（Ｈ４Ｋ４）へのｒＨの増加
Ｈ鎖ではなくＫ鎖のＥ４タグが、ＤＬＳ ＯｎｓｅｔＴｅｍｐ測定及びＤＳＣによって示されるようにＩｇＧの安定性を低下させた。
Ｅ４タグは、高温で大きな凝集体を形成する傾向を低減させた。
実施例１２−動態及び結合／解離速度研究
表面プラズモン共鳴分光法の概要
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法は、リガンド結合相互作用の研究のための技術である。ＳＰＲは、比較的少量の材料を使用して、リガンド分子と相互作用する抗体のリアルタイム定量的結合親和性及び動態を測定することができる。常套的なＳＰＲ技術では、センサーチップ上に一方の結合成分を固定する必要があり、溶液中の他方の結合成分はセンサー表面上に流され；センサー表面での屈折率の小さな変化を測定する光学的方法を使用して結合相互作用が検出される。これは、金属薄膜における表面プラズモン生成現象と、溶液中に短距離（３００ｎｍまで）延びるエバネッセント波又は電磁膜を生成する表面−溶液界面での光の全反射照明を利用する。
図３０は、アナライト分子の受容体分子への結合を測定するための基本的なＳＰＲ実験の概略図である。例：Ａ．ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術に基づくＳＰＲ実験のための機器の設定。ＳＰＲは、光学的方法を使用してセンサー表面に近い屈折率を測定する；これは、溶液中に短距離（３００ｎｍまで）延びるエバネッセント波又は電磁場を生成する表面−溶液界面での光の全反射照明を利用する。表面は、水溶液が連続的に通過する小容量（１００ｎｌ未満）のフローセルの床を形成するガラス支持体上の金の薄膜である。受容体分子へのアナライト分子の結合を検出するために、受容体分子は通常センサー表面上に固定され、アナライト分子はフローセルを介して水溶液中に注入される。レーザ源からの偏光は、プリズムを通って、入射光の臨界角で表面プラズモンが生成される金膜の下面に向けられる。この光の吸収は、反射光の強度の低下として見られる。臨界角は、金表面の３００ｎｍ内の媒質の屈折率に依存し、分子が表面に結合するとき、例えばアナライト分子が固定された受容体分子に結合するとき、変化する。Ｂ．アナライト分子の受容体分子への結合の際の角度ａから角度ｂへの入射光の臨界角の変化。Ｃ．センサーグラムの形でのＳＰＲ実験の応答。固定された受容体分子とアナライト分子との間の相互作用が生じると、金膜の表面における屈折率が変化し、これがシグナル強度の増加として見られる。シグナルの増加を記述するには、共鳴又は応答単位（ＲＵ）が使用され、１ＲＵは１０−４度の臨界角シフトに等しい。実験開始時に、固定された受容体分子は全てアナライト分子に曝されておらず、ＲＵは開始臨界角ａに対応する。アナライト分子がフローセルに注入される；それらが固定された受容体分子に結合する場合、結合部位が占有される結合相が存在し、この曲線の形状を使用して結合速度（ｋｏｎ）を測定することができる。定常状態が達成されると（この例では全ての結合部位が占有されると）、ＲＵは変更された最終臨界角ｂに対応する。この最大ＲＵは、固定された受容体及びアナライト分子の濃度に関係し、よって、結合親和性（ＫＤ）を測定するために使用することができる。アナライト分子が連続流から除去されると、結合部位が空になる解離相があり、この曲線の形状を使用して解離速度（ｋｏｆｆ）を測定することができる。ついで、表面を再生して臨界角ａに戻し、実験を再び開始することができる。
［動態研究］
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、次の単独で化学的にビオチン化されたペプチド２ｋＤａアナライトに対するウサギモノクローナル抗体の結合挙動を動態的に評価した：Ｅ＿Ｔａｇ（１−１３）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−１］ａｍｉｄ、及びＥ＿Ｔａｇ（１−１３）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−１３］ａｍｉｄ；Ｅ２＿Ｔａｇ（１−１２）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−１］ａｍｉｄ、及びＥ２＿Ｔａｇ（１−１２）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−１２］ａｍｉｄ；Ｖ５＿Ｔａｇ（１−１４）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−１］ａｍｉｄ、及びＶ５＿Ｔａｇ（１−１４）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−１４］ａｍｉｄ；ＶＳＶ−Ｇ＿Ｔａｇ（１−１１）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−１１］ａｍｉｄ；ＨＡ＿Ｔａｇ（１−９）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−１］ａｍｉｄ、及びＨＡ＿Ｔａｇ（１−９）［Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）−９］ａｍｉｄ。
ウサギＩｇＧ（１５０ｋＤａ）モノクローナル抗体ｍＡｂ＜Ｅ＞ｒＲｂ−Ｊ２６＿ｗｔ−ＩｇＧ及びｍＡｂ＜Ｅ＞ｒＲｂ−Ｊ２６＿Ｈ２Ｌ５、ｍＡｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿ｗｔ−ＩｇＧ及びｍＡｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿Ｈ５Ｌ３、ｍＡｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿ｗｔ−ＩｇＧ及びｍＡｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿Ｈ１Ｌ２、ｍＡｂ＜ＨＡ＞ｒＲｂ−Ｊ１５＿Ｈ２Ｌ２、ｍＡｂ＜ＶＳＶ−Ｇ＞ｒＲｂ−Ｊ１１０＿Ｈ５Ｌ２、及びＲｂ−Ｎ−ＩｇＧ（ウサギ正常ＩｇＧ，Ｓｉｇｍａ）をその結合動態及び結合化学量論について調べた。ＣＭ５シリーズセンサーをシステムに取り付け、ＨＢＳ−ＥＴバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）中で製造者の説明書に従って規準化した。試料バッファーは、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン，Ｓｉｇｍａ＃８６５２４）を補充したシステムバッファーであった。システムは３７℃で作動した。１３０００ＲＵのＧＡＲｂＦｃγ（ヤギ抗ウサギＦｃγ），コード番号：１１１−００５−０４６，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈを、４つのフローセル全てについてＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用して製造者の説明書に従って固定化した。センサーを１Ｍのエタノールアミンを使用して不活性化した。アナライトに対する各抗体の結合活性を動態的に試験した。抗体を、１０μｌ／分で２分間の注入によって３０ｎＭの濃度で捕捉した。流量は６０μｌ／分に設定した。アナライトは、０ｎＭのバッファー対照、２２ｎＭ、６７ｎＭ、２００ｎＭの２回、６００ｎＭ及び１８００ｎＭの異なる濃度段階で３分間注入した。解離を５分間モニターした。各アナライトの注入後に、２０μｌ／分のＨＢＳ−ＥＴバッファーを１分２５秒間注入し、その後２０μｌ／分で１０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ１．５）を１分間注入し、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．７）を２０μｌ／分で１分間、２回注入して、抗体捕捉システムを完全に再生した。可能な場合、ＲＭＡＸローカルを用いたＬａｎｇｍｕｉｒフィットに従って動態シグネチャーを評価した。解離速度が明らかでない場合、定常状態アルゴリズムを製造者の評価ソフトウェアに従って適用した。
図３１Ａは、上述の方法によるＳＰＲ実験の結果を示す。特に、図３１Ａは、Ｍａｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿ｗｔとＭａｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿Ｈ１Ｌ２との間の動態の差異を示しており、ＭＲは約１．４であり、よって約１：１の結合化学量論を示している。ｂｉ−１位又はｂｉ−１４位でビオチンで標識されたペプチドアナライト間に観察可能な動態差はなかった。Ｊ５３ Ｈ１Ｌ２（重鎖上に一つのＶ５タグと軽鎖上に二つのＶ５タグ）は、Ｊ５３ｗｔよりも僅かに高い親和性を示した。
図３１Ｂは、上述の方法によるＳＰＲ実験の結果を示す。特に、図３１Ｂは、Ｍａｂ＜Ｅ＞ｒＲｂ−Ｊ２６＿ｗｔとＭａｂ＜Ｅ＞ｒＲｂ−Ｊ２６＿Ｈ２Ｌ５との間の動態の差異を示しており、ＭＲは約２までであると決定され、これは約１：２の結合化学量論を意味する。ここでは、決定可能なｋｄ複合体安定性は観察されなかったが、定常状態親和性は認められた。ｂｉ−１位にビオチンを含むＥエピトープタグは、通常のファストオン／ファストオフ動態を有し、ｂｉ−１３位にビオチンを含むＥエピトープタグは、解離相に非特異的結合を有し、これは抗体の弱い複合体安定性に起因すると考えられた。
図３１Ｃは、上述の方法によるＳＰＲ実験の結果を示す。特に、図３１Ｃは、Ｍａｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿ｗｔとＭａｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿Ｈ５Ｌとの間の動態の差異を示し、ＭＲは約１．４であり、よって約１：１の結合化学量論を示す。位置ｂｉ−１又は位置ｂｉ−１２にビオチンを有するペプチド間に観察可能な動態差は存在しなかった。
図３１Ｄは、上述の方法によるＳＰＲ実験の結果を示す。特に、図３１Ｄは、Ｍａｂ＜ＨＡ＞ｒＲｂ−Ｊ１５＿Ｈ２Ｌ２間の動態の差異を示し、ＭＲは約１．４であり、よって約１：１の結合化学量論を示している。位置ｂｉ−１又は位置ｂｉ−９にビオチンを有するペプチドアナライト間に観察可能な動態差はなかった。
図３１Ｅは、上述の方法によるＳＰＲ実験の結果を示す。特に、図３１Ｅは、Ｍａｂ＜ＶＳＶ−Ｇ＞ｒＲｂ−Ｊ１１０＿Ｈ５Ｌ２間の動態差を示し、ＭＲは約２までであり、よって約１：２の結合化学量論を示している。
［結合／解離速度研究］
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、次の各タグ抗体アナライトに対するウサギモノクローナル抗体の結合挙動を動態的に評価した：ＣＤ６８ ＨＬｖｓｖ、ＣＤ６８ ＨｖｓｖＬｖｓｖ、ＣＤ６８ ＨｖｓｖＬ、ＣＤ６８ ＨＬ；ＣＤ８ ＨＬ、ＣＤ８ Ｈｅ２Ｌ；ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ Ｈｅ２Ｌ、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨＬｅ２、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ Ｈｅ２Ｌｅ２、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨＬ；＿ＣＤ２０ ＨＬ、ＣＤ２０ ＨｈａＬ、ＣＤ２０ ＨＬｈａ、ＣＤ２０ ＨｈａＬｈａ；ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨｈａＬ、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨＬｈａ、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨｈａＬｈａ、ＰＤ−Ｌ１ ＳＰ６３ ＨＬ；ＦｏｘＰ３ ＨＬ、ＦｏｘＰ３ Ｈ５ｖ５Ｌ、ＦｏｘＰ３ ＨＬ５ｖ５、ＦｏｘＰ３ Ｈ５ｖ５Ｌ５ｖ５、ＦｏｘＰ３ Ｈ４ｖ５Ｌ、ＦｏｘＰ３ ＨＬ４ｖ５、ＦｏｘＰ３ Ｈ４ｖ５Ｌ４ｖ５。
ウサギＩｇＧ（１５０ｋＤａ）モノクローナル抗体ｍＡｂ＜Ｅ＞ｒＲｂ−Ｊ２６＿ｗｔ−ＩｇＧ及びｍＡｂ＜Ｅ＞ｒＲｂ−Ｊ２６＿Ｈ２Ｌ５、ｍＡｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿ｗｔ−ＩｇＧ及びｍＡｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿Ｈ５Ｌ３、ｍＡｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿ｗｔ−ＩｇＧ及びｍＡｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿Ｈ１Ｌ２、ｍＡｂ＜ＨＡ＞ｒＲｂ−Ｊ１５＿Ｈ２Ｌ２、ｍＡｂ＜ＶＳＶ−Ｇ＞ｒＲｂ−Ｊ１１０＿Ｈ５Ｌ２、及びＲｂ−Ｎ−ＩｇＧ（ウサギ正常ＩｇＧ，Ｓｉｇｍａ）をその結合動態及び結合化学量論について調べた。ＣＭ５シリーズセンサーをシステムに取り付け、ＨＢＳ−ＥＴバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）中で製造者の説明書に従って規準化した。試料バッファーは、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン，Ｓｉｇｍａ＃８６５２４）を補充したシステムバッファーであった。システムは３７℃で作動した。１３０００ＲＵのＧＡＲｂＦｃγ（ヤギ抗ウサギＦｃγ），コード番号：１１１−００５−０４６，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈを、４つのフローセル全てについてＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用して製造者の説明書に従って固定化した。センサーを１Ｍのエタノールアミンを使用して不活性化した。アナライトに対する各抗体の結合活性を動態的に試験した。抗体を、１０μｌ／分で２分間の注入によって約３０ｎＭの濃度で捕捉した。流量は６０μｌ／分に設定した。アナライトは、０ｎＭのバッファー対照、２２ｎＭ、６７ｎＭ、２００ｎＭの２回、６００ｎＭ及び１８００ｎＭの異なる濃度段階で３分間注入した。解離を５分間モニターした。各アナライトの注入後に、２０μｌ／分のＨＢＳ−ＥＴバッファーを１分２５秒間注入し、その後２０μｌ／分で１０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ１．５）を１分間注入し、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．７）を２０μｌ／分で１分間、２回注入して、抗体捕捉システムを完全に再生した。可能な場合、ＲＭＡＸローカルを用いたＬａｎｇｍｕｉｒフィットに従って動態シグネチャーを評価した。解離速度が明らかでない場合、定常状態アルゴリズムを製造者の評価ソフトウェアに従って適用した。
この研究によれば、本出願人は、エピトープタグ抗体に抗タグ抗体が全て特異的に結合することを見出した。図３２Ａ〜３２Ｄに示されるように、結合速度は速く、解離速度は機器の仕様の範囲外であったか、又は正のドリフトを呈していた。従って、ｋｄ（１／ｓ）を１Ｅ−０５ １／ｓに設定した。
上記の動態研究（例えば、図３１Ａ〜３１Ｅを参照）と比較すると、エピトープタグ抗体と抗タグ抗体との間の動態は結合活性が触媒されたことが明らかであった。エピトープタグ抗体は２つのエピトープを示し親和性を媒介した。従って、動態定量化は結合活性を与えるが親和性は与えないであろう。本出願人はまたアビディティー因子を、データを上記の動態研究と比較することによって計算できることを見出した。例えば、図３１Ａに示されるように、Ｍａｂ＜Ｖ５＞ｒＲｂ−Ｊ５３＿Ｈ１Ｌ２対ｂｉ−１４タグ（ｋｄ＝２．４Ｅ−０３ １／ｓ）は、結合活性が少なくとも２４０倍触媒された（２．４Ｅ−０３ １／ｓ／１Ｅ−０５ １／ｓ＝２４０）。同様に、図３１Ｃは、Ｍａｂ＜Ｅ２＞ｒＲｂ−Ｊ７８＿Ｈ５Ｌ３（ｋｄ＝２．０Ｅ−０２ １／ｓ）は、結合活性が少なくとも２０００倍触媒された（２．０Ｅ−０２ １／ｓ／１Ｅ−０５ １／ｓ＝２０００）ことを示している。
実施例１３−組換えエピトープタグ抗体とモノクローナル抗タグ抗体を使用する平行多重免疫組織化学検出法のための柔軟で多用途のツールボックス（図３３Ａ〜３３Ｅを参照）
［序］
臨床利用のための単一のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライド上での複数のバイオマーカーのコンテクスト検出は未だ満たされていない。現在の多重免疫組織化学（ＩＨＣ）手順は、抗体適用及びフルオロフォア付着の連続ラウンドに続いて抗体不活性化を伴う。我々は、一連のエピトープタグ抗体とフルオロフォア、ハプテン、又は酵素にコンジュゲートした抗エピトープ抗体を使用する自動化された大きく並列の多重ＩＨＣアプローチを開発し、免疫腫瘍学に関連するマーカーの５重蛍光及び二重明視野アッセイにより実現可能性を実証した。
［方法］
哺乳動物細胞における抗ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６８、ＦｏｘＰ３、及びＰＤＬ１抗体の産生のために、ペプチドエピトープタグに対応するＤＮＡ配列をウサギモノクローナル抗体ｃＤＮＡにインフレームで融合させた。組換えタギングは、化学ベースのタギングに付随する潜在的な抗体不活性化をバイパスする。エピトープタグ一次抗体は、タグなし天然抗体と同一のジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色強度及びパターンを生じた（データは示さず）。抗タグ又は抗ハプテン抗体へのフルオロフォア又はハプテンのコンジュゲーションは、ＮＨＳエステル前駆体を使用して実施した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を、ＮＨＳ−マレイミドリンカーを介して還元抗体にコンジュゲートさせた。抗エピトープ抗体の親和性を、バイオレイヤー干渉法を使用して評価した。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者由来の腫瘍試料を含むＦＦＰＥ組織切片の自動ＩＨＣを、ＶＥＮＴＡＮＡ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＵＬＴＲＡプラットフォームで実施した。
［結果］
５つのエピトープタグのそれぞれに対するウサギモノクローナル抗体の複数のクローンをコンジュゲートし、親和性、安定性、及び適切な染色強度及びパターンの保持についてスクリーニングした。各抗エピトープ抗体の少なくとも一つのクローンが機能要件を満たし、これらをエピトープタグ抗体カクテルと組み合わせてＦＦＰＥ肺切片を染色するために使用した。エピトープタグ抗体は、感度の順に３つの検出構成の一つを使用して検出した：１）フルオロコンジュゲート抗エピトープ抗体、２）ハプテンコンジュゲート抗タグ抗体とフルオロコンジュゲート抗ハプテン抗体、及び３）ＨＲＰ又はＡＰコンジュゲート抗エピトープ抗体を用いた組織検体へのチラミド又はキノンメチドフルオロの付着（図３３Ａ）。抗体の滴定及びアッセイの最適化は、検出構成との特定のバイオマーカーの対形成が、タグなし抗体及びＨＲＰコンジュゲート抗種抗体を使用するＤＡＢ染色によって生成されるものに匹敵する特異的蛍光パターン及び相対強度を生じさせるようにした（図３３Ｂ〜３３Ｅ）。酵素コンジュゲート抗タグ抗体及びＨＲＰ及びＡＰ活性化色素原を使用して２色の明視野染色を生成した（データは示さず）。
［結論］
我々は、一連のエピトープタグ抗体及びフルオロ−、ハプテン−、又は酵素−コンジュゲート抗タグ抗体を使用する自動並列多重ＩＨＣの実行可能性を実証した。本アプローチには次の利点がある：ワークフローの合理化−タグ抗体と抗タグ抗体プローブをカクテルとして適用すると、アッセイ時間を有意に短縮する。柔軟性と汎用性−ハプテン、エピトープタグ、フルオロフォア、及び酵素のライブラリーを、低含量マーカーと高含量マーカーを適切に検出するように適合させることができ（例えば、低含量マーカーを高感度の酵素媒介フルオロ沈着と対にする）、５重を超える増加した数のバイオーカーに適応できる。エピトープ保存−連続的に適用される抗体に基づくアプローチとは異なり、タグ抗体及び抗タグ抗体を使用することにより、抗体不活性化の複数のサイクルが組織の完全性に及ぼす有害な影響を回避する。
実施例１４−ペプチドエピトープタグ抗体と抗エピトープタグ抗体との間の結合化学量論の生化学分析
この研究は、タグ一次抗体に結合する抗タグ二次抗体の化学量論を決定するために開始された。この情報は、タグ一次抗体の検出にフルオロフォア又は酵素コンジュゲート抗タグ抗体を使用することによってもたらされるシグナル増幅の感度及び程度の理解に有用であった。抗タグ抗体を、０．５：１から８：１までモル比が増加する親水性スペーサーセグメントによって分離された４〜５個のタンデムペプチドエピトープタグを有する免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）のＣ末端がタグ化された抗体と共にインキュベートした。結合した複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して未結合抗体から分離した。ＩｇＨ当たり４タンデムペプチドエピトープタグを有する一次抗体では、１つのタグ抗体に対して６つの抗タグ抗体のモル比に達するまで、未結合の抗タグ抗体は観察されなかった。ＩｇＨ当たり５つのＶ５エピトープタグを有する抗ＦｏｘＰ３抗体では、１つのタグ抗体に対して８つの抗タグ抗体のモル比に達するまで、未結合の抗Ｖ５抗体は観察されなかった。データは、少なくとも４つの抗タグ免疫グロブリン（ＩｇＧ）がＩｇＨ当たり４つのペプチドエピトープタグ（全ＩｇＧ当たり８つのタグ）を持つ各ＩｇＧと安定して結合しうることを示した。抗タグ抗体が、遊離及び非タンデムタグペプチドよりもタグ抗体に対して有意に高い親和性を有することを示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の結果と併せて、本研究は、ここに開示されたタグ一次抗体に見出されるペプチドエピトープタグ及びスペーサーの特異的タンデム配置が、立体障害のない複数の抗タグ抗体の強力な二価結合を媒介する空間コンフォメーションを採用することができるという有力な証拠を提供した。
技術の感度を推進する生化学的基礎並びにその制限を理解するためには、タグ抗体がどのように抗タグ抗体と相互作用したかを特徴付けることが重要であった。以前のＳＰＲ実験では、抗タグ抗体と遊離ペプチドとの間の結合よりも、抗タグ抗体とタグ抗体との間のより強い結合が示され、抗タグ抗体とタグ抗体との間の結合活性媒介結合を示唆している。しかしながら、これらの研究は、各タグ抗体に結合することができる抗タグ抗体の数を明らかにしておらず、よって、タグ抗体に結合する抗タグ抗体の結合価に関して決定的な解答を提供するには不十分であった。図３２Ａ〜３２Ｄに示されるように、抗タグ抗体は迅速な結合動態でタグ抗体に結合し、解離は存在しないか又は機器で確実に測定するには余りに遅かった。そのような堅固な結合は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を遊離のタグ抗体又は遊離の抗タグ抗体からの安定なタグ及び抗タグ抗体複合体の分離に使用することを可能にした。この研究の目的は、ＳＥＣにおいて結合し遊離抗体として溶出する更なる抗タグ抗体がなくなるまで、何倍過剰の抗タグ抗体が安定な複合体においてタグ抗体と結合できるかを決定することであった。抗タグ抗体とタグ抗体の間の結合の化学量論が、結合価の問題に更に明確に取り組むことができると考えられた。加えて、この情報は、抗タグ抗体が検出試薬として提供しうるシグナル増幅の程度についての洞察をもたらした。
［材料］
ＰＢＳに溶解させた次のペプチドエピトープタグ抗体を、Ｓｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅで作製しプロテインＡ樹脂により精製した（表１７参照）。
Figure 0006952706
＊タグ構成中の文字は、Ｉｇ重鎖（Ｈ）又はκ軽鎖（Ｋ）を指し、文字の後の数字は重鎖又は軽鎖のＣ末端に融合されたタンデムタグリピートの数を指している。例えば、Ｈ４Ｋ０は、軽鎖上にタグを持たない重鎖上の４つのタンデムタグリピートを指す。
ＰＢＳに溶解した次の抗タグ抗体を、Ｓｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅで作製しプロテインＡ樹脂によって精製した（表１８参照）：
Figure 0006952706
機器−ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣ（アセットタグＸＸ，較正不要）；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬサイズ排除カラム；ハイブリダイゼーションオーブン（アセットタグＸＸ，較正不要）。
抗タグ抗体を、約０．７５Ｘ ＰＢＳ及び約０．２５Ｘ 反応バッファー（ＲＢ，Ｐ／Ｎ９５０−３００）中のタグ抗体と共に約３７℃で約３０分間インキュベートした後、試料を添加した。反応混合物の容量は約０．１ｍＬであり、試料全体を添加した。タグ抗体の濃度を約０．５μＭで一定に保つ一方、抗タグ抗体の濃度を約０．２５μＭから約４μＭまで変化させて、約０．５：１、約１：１、約２：１、約４：１、約６：１、そして必要な場合は約８：１のモル抗タグ対タグ抗体比を達成した。対照として、約０．７５Ｘ ＰＢＳ及び約０．２５Ｘ ＲＢ中で約０．５μＭの抗タグ又はタグ抗体を別々に調製し、約３７℃で約３０分間インキュベートし、添加した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムでの分画は周囲の室温で実施した。約２１０、約２３０、及び約２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を使用してタンパク質溶出をモニターした。
統計的分析−この研究の遂行には統計的分析は必要ないと考えられた。
ペプチドエピトープタグ抗体を様々なモル比で抗タグ抗体と共にインキュベートして、それらの間の結合の化学量論を決定した。一般に、抗タグ抗体に対するタグ抗体のモル比が０．５：１から６：１に増加するにつれて、ＳＥＣ溶出量が１３．５から１２ｍＬの益々大きくなる抗体複合体が観察された（図３４Ａ〜３４Ｇ）。４つのタンデムタグ及びスペーサーセグメントが各重鎖のＣ末端に融合された試験した全てのタグ及び抗タグ対（Ｖ５、Ｅ２、Ｅ、ＶＳＶ−Ｇ、及びＡＵ５）について、４：１以下の抗タグ：タグ抗体のモル比で遊離の抗タグ抗体は観察されなかった（図３４Ａ〜３４Ｆ）。遊離の抗タグ抗体は６：１のモル比でのみ見えるようになった（図３４Ａ〜３４Ｆ）。これらの結果は、安定な結合の最も高い化学量論は、ペプチドエピトープタグのアミノ酸配列にかかわらず、合計８つのペプチドタグ（重鎖当たり４つのタグ及びスペーサー）を含むタグ抗体当たり約４つの抗タグ抗体であったことを示す。抗タグ抗体とタグ抗体との間の相互作用が抗タグ抗体と遊離ペプチドタグとの間の相互作用よりも強いことを示すデータと併せて考えると（図３２Ａ〜３２Ｄ参照）、これらの結果は、各抗タグ抗体が２つのペプチドタグを結合することによって二価の様式でタグ抗体と相互作用しうることを示唆した。
６：１のモル比の抗ＶＳＶ−Ｇ対ＣＤ６８−ＶＳＶ−Ｇ及び抗ＡＵ５対ＣＤ８−ＡＵ５で、最も大きなタンパク質複合体に対応するピークの後ろに続く有意な量のより遅く溶出するピークが観察された（図３４Ｆ及び３４Ｇ）。これらのより遅く溶出するピークは、おそらく、タグ抗体当たり４つ未満の抗タグ抗体からなる複合体を表していた。これらのより小さい複合体がタグ抗体対抗タグ抗体の高い比率でのみ観察されたという事実は、タグ抗体と抗タグ抗体との間のより弱い一価相互作用を生じる限定された数のエピトープタグに対する抗タグ抗体間の競合と一致していた。
５つのタンデムタグ及びスペーサーを有するタグ抗体では、抗タグ抗体対タグ抗体のモル比が８：１に達するまで遊離の抗タグ抗体は観察されなかった（図３４Ｇ）。加えて、
複合体が一つの主ピーク（Ｅ、Ｅ２、及びＶ５タグについては図３４Ａ〜３４Ｄ）又は主ピークの後ろに続く幾つかの小ピーク（ＶＳＶ−Ｇ及びＡＵ５タグについては図３４Ｆ及び３４Ｇ）からなる抗タグ抗体とＩｇＨ当たり４つのタグを有するタグ抗体（Ｈ４Ｋ０）
との間の結合とは異なり、抗Ｖ５とＩｇＨ当たり５つのタグを有する抗ＦｏｘＰ３−Ｖ５（Ｈ５Ｋ０）との間の結合は、１１．７ｍＬで溶出した主要複合体よりも有意に大きい少なくとも２つの複合体を生じた（図３４Ｇ）。８．５ｍＬのピークは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムの空隙容量に対応するので、一種を超えるタンパク質複合体を表していると考えられる。これらの結果は、抗Ｖ５とＨ５Ｋ０タグ抗ＦｏｘＰ３−Ｖ５抗体との間の最も安定な複合体は、タグ抗体当たり５〜６個の抗タグ抗体からなっていたが、更に大きな複合体でさえも形成でき得たことを示唆している。この特定の抗体クローンのその同族タグに対する親和性が全ての抗タグ抗体の中で最も高いため、Ｖ５タグ抗体と抗Ｖ５抗体クローンＪ５３＿Ｈ１Ｌ２との間にのみ大きな複合体が形成されたことはありうる（図３１Ａ〜３１Ｅ参照）。Ｖ５タグに対するＪ５３＿Ｈ１Ｌ２の高親和性は、２つのＶ５タグ抗体の架橋又は安定な一価結合を媒介することができた。
この明細書において言及され、及び／又は出願データシートに列挙された全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物は、その全体が出典明示によりここに援用される。実施態様の態様は、必要に応じて様々な特許、出願及び刊行物の概念を用いて別の更なる実施態様を提供するために、変更することができる。
ここの開示は、特定の実施態様を参照して説明されたが、これらの実施態様は、本開示の原理及び応用の単なる例示であることを理解されたい。従って、例示的な実施態様に対して多くの変更がなされうることと、添付の特許請求の範囲によって定まる本開示の精神及び範囲から逸脱することなく他の構成が案出されうることが理解される。
［主題の開示の分野］
本開示は、エピトープタグを含む抗体を提供する。
［産業上の利用性の記述］
本開示は、医学及び診断の分野において産業上の利用性を有している。

Claims (21)

  1. 抗体と少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトとを含み、エピトープタグコンストラクトが交互のスペーサーと２〜８のエピトープタグとを含み、エピトープタグのそれぞれが、Ｖ５（配列番号：４）であるか、又は配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、エピトープタグ抗体。
  2. エピトープタグコンストラクトが、Ａｂ−（［スペーサー］−［エピトープタグ］） ｎ −［スペーサー］を有し、ここで、ｎは２〜８の範囲の整数であり、「Ａｂ」は抗体である、請求項１に記載のエピトープタグ抗体。
  3. 少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトが、抗体の重鎖定常領域のＣ末端又は軽鎖定常領域のＣ末端に発現される、請求項１又は２に記載のエピトープタグ抗体。
  4. 少なくとも一つのエピトープタグコンストラクトが、抗体の重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖定常領域のＣ末端の両方に発現される、請求項３に記載のエピトープタグ抗体。
  5. エピトープタグコンストラクトが４つのエピトープタグを含むか、又はエピトープタグコンストラクトが５つのエピトープタグを含む、請求項１に記載のエピトープタグ抗体。
  6. 重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数と軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数の比が、２：１〜１：２の範囲であるか、又は重鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数が２〜６のエピトープタグの範囲であり、軽鎖定常領域のＣ末端に組み込まれたエピトープタグの数が０〜４のエピトープタグの範囲である、請求項４に記載のエピトープタグ抗体。
  7. エピトープタグコンストラクトの少なくとも一つのスペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４からなる群から選択される、請求項１から６の何れか一項に記載のエピトープタグ抗体。
  8. エピトープタグコンストラクトの第一スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４の一つから選択され；エピトープタグコンストラクトの第二スペーサーを構成するアミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４の別のものから選択される、請求項１から４の何れか一項に記載のエピトープタグ抗体。
  9. エピトープタグ抗体が２つのエピトープタグコンストラクトを含み、各エピトープタグコンストラクトが抗体の重鎖の末端に発現され、各エピトープタグコンストラクトが４つのエピトープタグを含む、請求項１に記載のエピトープタグ抗体。
  10. エピトープタグ抗体がＰＤＬ１に特異的であるか、又はエピトープタグ抗体がＦｏｘＰ３に特異的であるか、又はエピトープタグ抗体がＨＥＲ２に特異的であるか、又はエピトープタグ抗体がＰａｎ−ＣＫに特異的であるか、又はエピトープタグ抗体が分化マーカーのクラスターに特異的である、請求項１に記載のエピトープタグ抗体。
  11. 請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体と、エピトープタグ抗体を検出するための検出試薬とを含むキットであって、検出試薬が、エピトープタグ抗体の発現されたエピトープタグに特異的な抗タグ抗体であり、抗タグ抗体が検出可能部分を含む、キット。
  12. 検出可能部分がフルオロフォアである、請求項１１に記載のキット。
  13. 検出可能部分が酵素であり、酵素の発色基質が検出キット内に含められる、請求項１１に記載のキット。
  14. 少なくとも一つの未修飾抗体又は抗体コンジュゲートと；少なくとも一つの未修飾抗体又は抗体コンジュゲートを検出する更なる検出試薬とを更に含む、請求項１１から１３の何れか一項に記載のキット。
  15. 試料中の標的を検出する方法であって、請求項１から１０の何れか一項に記載のエピトープタグ抗体に試料を接触させ、エピトープタグ抗体の発現されたエピトープタグを使用して標的を検出することを含む、方法。
  16. 試料が、請求項１から１０の何れか一項に記載の二つ以上の異なるエピトープタグ抗体と接触させられ、各エピトープタグ抗体が異なる標的に特異的であり、各エピトープタグ抗体が異なるエピトープタグを発現する、請求項１５に記載の方法。
  17. 試料が、二つ以上の異なるエピトープタグ抗体と同時に接触させられ、試料を異なるエピトープタグ抗体を検出するための検出試薬と接触させることを更に含み、検出試薬が、エピトープタグ抗体の異なる発現されたエピトープタグに特異的な抗タグ抗体である、請求項１６に記載の方法。
  18. エピトープタグ抗体の異なる発現されたエピトープタグに特異的な抗タグ抗体が同時に導入される、請求項１７に記載の方法。
  19. 抗タグ抗体の各々がフルオロフォアにコンジュゲートされている、請求項１８に記載の方法。
  20. 試料を一又は複数の未修飾抗体及び／又は抗体コンジュゲートと接触させることを更に含む、請求項１５から１９の何れか一項に記載の方法。
  21. 一又は複数の未修飾抗体及び／又は抗体コンジュゲートが、エピトープタグ抗体の導入前に試料に導入される、請求項２０に記載の方法。
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