KR102544802B1 - 아가로스 젤을 이용한 항체의 교차 반응 제거를 통한 다중 형광 신호 증폭 방법 - Google Patents

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Abstract

다양한 실시예들은 아가로스 젤을 이용한 항체의 교차 반응 제거를 통한 다중 형광 신호 증폭 방법을 제공할 수 있다. 다양한 실시예들에 따르면, 다중 형광 신호는 아가로스 젤을 이용하여, 상이한 타입들의 표적 단백질들의 각각에 대한 교차 반응이 제거된 상이한 항체들을 준비하고, 표적 단백질들의 각각에 결합된 상이한 1차 항체들에, 상이한 항체들의 조합에 따른 상이한 항체 쌍들을 각각 결합하여, 형광 신호들을 형성하는 것에 의해, 증폭되어 제조될 수 있다.

Description

아가로스 젤을 이용한 항체의 교차 반응 제거를 통한 다중 형광 신호 증폭 방법{METHOD OF FLUORESCENT SIGNAL AMPLIFICATION VIA SIMPLE REMOVE OF CROSS-REACTION USING NHS-ACTIVATED AGAROSE GEL}
다양한 실시예들은 아가로스 젤을 이용한 항체의 교차 반응 제거를 통한 다중 형광 신호 증폭 방법에 관한 것이다.
조직 내 바이오 마커들은 세포들의 복잡한 상태 및 신호체계를 나타내며, 다양한 질병을 규명하는 지표가 된다. 바이오 마커들의 시공간적 분석은 질병 조직의 분석 및 병태생리 규명을 가능하게 하여 치료기술 개발에 도움을 준다. 이렇게 바이오 이미징 기술은 기존의 동물 실험 및 화학적인 검출 반응으로는 한계가 있었던, 조직 내 수많은 단백질의 역할 및 분포를 효과적으로 시각화하여, 생체 내 시스템을 이해할 수 있는 혁신적인 방법으로 연구되고 있다. 또한 바이오 이미징 기술은 세포 및 조직 내 바이오 마커들을 측정하는 바이오 센서로 응용될 수 있다. 실시간으로 변화를 측정할 수 있는 이미징 기술을 통해, 세포 수준에서의 시공간적 분포 및 기능을 이해하고, 신호 전달 시스템을 분석하는 것이 가능하게 된 다. 또한 외부 변화에 의한 생체 반응을 시각적으로 분석하여, 의료 및 신약개발 시스템에서도 유용하게 사용될 수 있다. 바이오 이미징은 질병과 연관된 다양한 약물 반응을 시각적으로 확인할 수 있게 하며, 이를 통한 변화를 시공간적으로 제공해 줄 수 있다. 최근 활발하게 개발되고 있는 다양한 조직 투명화 기술과 더불어, 약물의 효능을 세포 수준에서부터 기관까지 포괄적으로 검증하여, 효과적인 약물을 설계할 수 있는 중추적인 시스템이 될 것이다. 바이오 이미징은 신약 개발 연구 및 임상 분야에서 약물 후보 물질을 결정하고, 치료 효과를 확인하는 중요한 도구로 주목받고 있으며, 그 활용도가 증가하고 있다.
최근 주목받고 있는 다양한 조직 투명화 기술은, 기존에는 2차원으로 제한되었던 바이오 이미징 연구를 3차원 대용량 조직 및 기관 연구로 확대했다. 이러한 조직 투명화 기법들은 조직의 손상을 최소화하고, 세부 구조 및 연결 네트워크를 파악할 수 있게 한다. 이를 통한 분자 수준에서의 세포 및 조직의 종합적인 매핑은 차세대 진단 및 분석 시스템을 크게 발전시킬 것이다.
이러한 장점에도 불구하고, 3차원 대용량 이미징은 높은 스캔 시간이 요구된다는 점에서 굉장히 제한적이다. 한 표본당 스캔 시간이 길어지게 되면, 낮은 이미지 처리량을 갖게 되고, 이는 많은 이미징 데이터가 있어야 하는 현대 의료 시스템에서 치명적인 단점이 될 수 있다. 하지만 이는 표본의 형광 신호의 증폭을 통해 해결될 수 있다. 표본 이미지 처리량은 형광 신호의 강도에 따라 달라지며, 표본의 형광 강도가 높을수록 동일한 형광 강도의 이미지를 얻기 위해 있는 노출 시간이 단축된다. 따라서 높은 이미지 처리량을 갖는 형광 신호 증폭 기술은 많은 이미지 데이터를 요구하는 차세대 바이오 이미징 분야의 핵심적인 요소가 될 것이다.
생체 내 바이오 마커를 측정하여 질병의 진단을 돕는 바이오 이미징 기술은 높은 정밀도를 요구한다. 또한 단일 마커의 이미징 보다, 서로 관여하는 다중 마커들을 동시에 이미징하여 전체적인 시공간적 분포와 관계를 알아내는 것은 바이오 이미징 기술에서 핵심이 되는 요소이다. 따라서 측정되는 신호를 증폭시켜 감도를 높이고, 다중 표지를 동시에 표지하는 기술은 초감도 바이오 이미징 및 센서를 위해 반드시 충족되어야 하는 요소들이다.
현재까지 높은 이미징 처리량을 얻기 위한 다양한 형광 신호 증폭 기술들이 개발되었다. 그러나 많은 기술이 낮은 신호 대 잡음 비, 제한된 다중 표지 이미징, 낮은 공간 분해능, 복잡성과 낮은 접근성 등 여러 제한점을 가지고 있다.
다양한 실시예들은, 아가로스 젤을 이용한 항체의 교차 반응 제거를 통한 다중 형광 신호 증폭 방법을 제공한다.
다양한 실시예들은 상이한 타입들의 표적 단백질들의 각각에 대해 증폭된 다수의 형광 신호들로 이루어지는 다중 형광 신호 증폭 방법을 제공한다.
다양한 실시예들에 따르면, 상기 다중 형광 신호 증폭 방법은, 각각에 대한 교차 반응이 제거된 상이한 항체들을 준비하는 단계, 및 상기 표적 단백질들의 각각에 결합된 상이한 1차 항체들에, 상기 상이한 항체들의 조합에 따른 상이한 항체 쌍들을 각각 결합하여, 상기 형광 신호들을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상기 상이한 항체들을 준비하는 단계는, 아가로스 젤을 이용하여, 상기 상이한 항체들의 각각에 대해, 다수의 직교적인 항체들과의 상기 교차 반응을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호가 증폭될 수 있다. 즉, 다양한 실시예들은, 이미 상용화되어 있는 항체와 형광 분자를 통해 간단하게 증폭된 형광 신호를 구현할 수 있다. 이는 일반적인 형광 현미경을 통해서, 추가적인 장비 없이 형광 신호 증폭 이미징을 가능하게 한다. 그리고, 다양한 실시예들은, 정제된 상보적인 항체 쌍들을 이용한 다중 표지 형광 신호 증폭이 가능하다. 또한, 병리학 조직의 이미징에서 조직 내부 바이오틴과 직교적으로 작용하기 때문에, 조직 내부 배경 신호를 증가시킬 수 있는 추가적인 문제를 제한할 수 있다.
도 1은 단일 형광 신호 증폭을 도시하는 도면이다.
도 2는 다양한 실시예들에 따른 다중 형광 신호 증폭을 도시하는 도면이다.
도 3은 일반적인 NHS기가 활성화된 아가로스 젤을 이용한 항체 정제 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 제1 실시예에 따른 NHS기가 활성화된 아가로스 젤을 이용한 항체 정제 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 제2 실시예에 따른 NHS기가 활성화된 아가로스 젤을 이용한 항체 정제 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 제3 실시예에 따른 NHS기가 활성화된 아가로스 젤을 이용한 항체 정제 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 7은 다양한 실시예들에 따른 다중 형광 신호 증폭 방법을 도시하는 도면이다.
도 8은 도 7의 상이한 2차 항체들의 각각을 준비하는 방법을 보다 상세하게 도시하는 도면이다.
도 9는 다양한 실시예들에 따른 다중 형광 신호의 신호 증폭률을 설명하기 위한 도면이다.
이하, 본 문서의 다양한 실시예들이 첨부된 도면을 참조하여 설명된다.
다양한 실시예들은, 직교적인 항체의 교차 반응 제거를 통한 다중 형광 신호 증폭, 즉 다중 FRACTAL(multiplexing FRACTAL; Fluorescent signal amplification via simple removal of cross-reaction using NHS-activated agarose gel) 기술을 제안한다. 다양한 실시예들에 따르면, 이미지 처리 장치는 증폭된 형광 신호를 통해 이미지를 처리한다. 다양한 실시예들은, NHS기가 활성화된 아가로스 젤 스핀 컬럼을 이용해 직교적인 항체 쌍들의 교차 반응을 제거한 후, 상보적인 항체의 반복적 라벨링을 통해 다수의 면역 형광 신호들을 증폭시키며, 이를 통해 다중 채널 이미징이 가능하다.
도 1은 단일 형광 신호(100) 증폭를 도시하는 도면이다.
도 1을 참조하면, 일반적인 단일 형광 신호(100)가 제공된다. 단일 형광 신호(100)는 형광 분자가 상보적인 항체의 반복적인 라벨링을 통한 형광 신호 증폭, 즉 FRACTAL 기술에 따라 증폭된 것이며, 직교적인 항체 쌍들의 교차 반응으로 인해 단일 표적 단백질(p)에 대한 증폭된 형광 신호를 나타낸다.
구체적으로, 단일 형광 신호(100)는 1차 항체(110) 및 2차 항체 쌍들(120)을 포함할 수 있다. 1차 항체(110)는 표적 단백질(p)에 결합될 수 있다. 2차 항체 쌍들(120)은 제1의 2차 항체(130)들 및 제2의 2차 항체(140)들로 이루어질 수 있다. 일 예로, 제1의 2차 항체(130)들 및 제2의 2차 항체(140)들 모두 형광 분자(131, 141)들로 표지되어 있을 수 있다. 여기서, 제1의 2차 항체(130)들의 형광 분자(131)들과 제2의 2차 항체(140)들의 형광 분자(141)들은 동일할 수 있다. 다른 예로, 도시되지는 않았으나, 제1의 2차 항체(130)들 만이 형광 분자(131)로 표지되어 있을 수 있다. 이 때, 2차 항체 쌍들(120) 내에서, 제2의 2차 항체(140)들은 제1의 2차 항체(130)들에 결합될 수 있다. 2차 항체 쌍들(120)은 1차 항체(110)로부터 적어도 하나의 계층들을 이루면서 결합될 수 있다. 예를 들면, 2차 항체 쌍들(120)은 1차 항체(110)로부터 복수의 계층들을 이루면서 주기적인 구조로 결합될 수 있다. 이러한 경우, 2차 항체 쌍들(120) 중 적어도 하나는 제1의 2차 항체(130)들을 통해, 1차 항체(110)에 결합될 수 있다. 그리고, 상위 계층의 2차 항체 쌍들(120)은 제1의 2차 항체(130)들을 통해 하위 계층의 2차 항체 쌍들(120)의 제2의 2차 항체(140)들에 결합될 수 있다.
도 2는 다양한 실시예들에 따른 다중 형광 신호(200) 증폭을 도시하는 도면이다.
도 2를 참조하면, 다양한 실시예들에 따른 다중 형광 신호(200)가 제공된다. 다중 형광 신호(200)는 직교적인 항체의 교차 반응 제거를 통한 다중 형광 신호 증폭, 즉 다중 FRACTAL 기술에 따라 증폭된 것이며, 상이한 타입들의 다수의 표적 단백질(p1, p2, p3)들의 각각에 대해 증폭된 다수의 형광 신호(201, 202, 203)들로 이루어진다. 이 때, 형광 신호(201, 202, 203)들의 각각은, 직교적인 항체 쌍들의 교차 반응으로 인해 표적 단백질(p1, p2, p3)의 각각에 대해 증폭되지만, 형광 신호(201, 202, 203)들 사이의 직교적인 항체 쌍들의 교차 반응은 제거된다.
구체적으로, 형광 신호(201, 202, 203)들의 각각은, 1차 항체(211, 212, 213) 및 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)을 포함할 수 있다. 1차 항체(211, 212, 213)는 해당 표적 단백질(p1, p2, p3)에 결합될 수 있다. 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)은 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 및 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들로 이루어질 수 있다. 일 실시예에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 및 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들 모두 형광 분자(231, 241, 251, 261, 271, 281)들로 표지되어 있을 수 있다. 여기서, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 형광 분자(231, 251, 271)들과 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 형광 분자(241, 261, 281)들은 동일할 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 도시되지는 않았으나, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들만이 형광 분자(231, 251, 271)들로 표지되어 있을 수 있다. 이 때, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223) 내에서, 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들은 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들에 결합될 수 있다. 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)은 1차 항체(211, 212, 213)로부터 적어도 하나의 계층들을 이루면서 결합될 수 있다. 예를 들면, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)은 1차 항체(211, 222, 223)로부터 복수의 계층들을 이루면서 주기적인 구조로 결합될 수 있다. 이러한 경우, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223) 중 적어도 하나는 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들을 통해, 1차 항체(211, 212, 213)에 결합될 수 있다. 그리고, 상위 계층의 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)은 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들을 통해 하위 계층의 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)의 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들에 결합될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 표적 단백질(p1, p2, p3)들의 각각에 대해, 1차 항체(211, 212, 213), 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들, 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들 및 형광 분자(231, 241, 251, 261, 271, 281)들이 상이하게 결정될 수 있다. 특히, 형광 신호(201, 202, 203)들 사이의 직교적인 항체 쌍들, 즉 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)의 교차 반응이 제거됨에 따라, 타입들 중 하나에 대한 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)은, 타입들 중 나머지에 대한 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)과 직교할 수 있다. 이를 통해, 상이한 타입들의 복수의 표적 단백질(p1, p2, p3)들에 대해, 형광 신호(201, 202, 203)들이 동시에 염색되며, 이로써, 다중 형광 신호(200)가 제조될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 호스트(host)는 1차 항체(211, 212, 213)들의 호스트와 상이하고, 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 호스트는 1차 항체(211, 212, 213)의 호스트와 동일할 수 있다. 그리고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 타겟(target)은 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 호스트와 동일하고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 호스트는 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 타겟과 동일할 수 있다. 이 때 형광 신호(201, 202, 203)들의 각각의 1차 항체(211, 212, 213), 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 및 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들을 위한 호스트 및 타겟은 염색되는 표적 단백질(p1, p2, p3)에 따라 결정될 수 있다.
예를 들면, 형광 신호(201, 202, 203)들의 각각의 1차 항체(211, 212, 213), 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 및 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들을 하기 [표 1]과 같이 상용화되어 있는, 다양한 동물들로부터 유래되는 호스트 및 타겟으로 결정될 수 있다. 하기 [표 1]에 따르면, 64 종류의 2차 항체들(230, 240, 250, 260, 270, 280)을 사용해 2차 항체 쌍(221, 222, 223)들이 조합될 수 있다. 일 예로, 1차 항체(211, 212, 213) 및 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 호스트는 토끼(rabbit)이고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 호스트는 당나귀(donkey)일 수 있다. 바꿔 말하면, 1차 항체(211, 212, 213)는 토끼 1차 항체이고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들은 당나귀 항-토끼 2차 항체들이고, 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들은 토끼 항-당나귀 2차 항체들일 수 있다. 다른 예로, 1차 항체(211, 212, 213) 및 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 호스트는 당나귀이고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 호스트는 토끼일 수 있다. 바꿔 말하면, 1차 항체(211, 212, 213)는 당나귀 1차 항체이고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들은 토끼 항-당나귀 2차 항체들이고, 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들은 당나귀 항-토끼 2차 항체들일 수 있다.
Figure 112021083565600-pat00001
다양한 실시예들에 따르면, 아가로스 젤을 이용하여, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)의 교차 반응이 제거될 수 있다. 구체적으로, 아가로스 젤 표면의 NHS기와 2차 항체 쌍들(221, 222, 223) 표면의 아민기 사이의 아마이드 결합을 통한 항체의 고정 후, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)의 정제 과정을 통해 교차 반응이 제거될 수 있다. 이 때, 타입들 중 하나에 대한 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)을 위한 단 한 번의 정제 과정을 통해, 타입들 중 나머지에 대한 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)의 교차 반응이 용이하게 제거될 수 있다. 예를 들면, 토끼 항-당나귀 항체들을 생쥐 항-쥐 항체들, 쥐 항-생쥐 항체들, 염소 항-닭 항체들, 및 닭 항-염소 항체들에 대해 정제할 수 있다.
한편, 전술된 설명에서, 1차 항체(211, 212, 213)에 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)이 결합되는 것으로, 설명되었으나, 이에 제한되지 않는다. 1차 항체(211, 212, 213)에는, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)이 아니더라도, 교차 반응이 제거된 직교적인 항체들로 구성되는 항체 쌍들이 결합될 수 있다. 바꿔 말하면, 1차 항체(211, 212, 213)에 결합되는 항체 쌍들이 반드시 2차 항체들(230, 240, 250, 260, 270, 280)로 구성될 필요는 없다. 예를 들어, 제 1의 항체에 단백질 분자를 연결해 그 분자를 타겟으로 하는 제 2의 항체로 구성될 수 있다. 이를 통해, 다중 형광 신호(200) 증폭을 위한 항체의 선택에 있어서의 제약이 감소될 것이다. 이는, 후술되는 설명에도 동일하게 적용될 것이다.
도 3은 일반적인 NHS기가 활성화된 아가로스 젤의 이용한 항체(300) 정제 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 3을 참조하면, 먼저, 310 단계에서, 정제하고자 하는 항체(300)들과 상보적인 항체(302)들이 1X PBS(phosphate buffer saline)와 함께, 아가로스 젤(308)에 넣어질 수 있다. 이 때, 아가로스 젤(308)의 표면의 NHS기와 상보적인 항체(302)들의 아민기가 반응해 아마이드 결합을 형성하며, 상보적인 항체(302)들이 아가로스 젤(308)에 연결될 수 있다. 이 후, 320 단계에서, 잔여의 NHS기를 제거하기 위해, 아가로스 젤(308)이 1M의 트리스아미노메테인 용액으로 처리될 수 있다. 다음으로, 330 단계에서, 정제하고자 하는 항체(300)들이 1X PBS와 함께 아가로스 젤(308)에 넣어지고, 이를 통해 상보적인 항체(302)들과 반응할 수 있다. 이 때, 정제하고자 하는 항체(300)들 중 친화력이 높은 항체(300a)들이 상보적인 항체(302)들과 결합될 수 있다. 다음으로, 340 단계에서, 원심 분리를 통해, 아가로스 젤(308)과 결합되지 않은 항체(300b)들이 제거될 수 있다. 또는, 340 단계에서, 용출 과정을 통해, 상보적인 항체(302)들에 결합되어 있는 항체(300a)들이 획득될 수 있다. 다음으로, 350 단계에서, 획득된 항체(300a)들이 형광 분자(301)들로 표지된 다음, 단백질 염색에 사용될 수 있다.
그러나, 도 3의 일반적인 방법은 두 가지의 큰 문제점들을 가질 수 있다. 첫 번째 문제점은, 상보적인 항체(302)들에 대해 친화력이 높은 항체(300a)들이 정제될 뿐, 정제된 항체(300a)들의 직교적인 항체에 대한 교차 반응이 제거되지는 않는다는 것이다. 두 번째 문제점은, 용출 과정에서의 불안정한 산도 조건으로 인해, 정제된 항체(300a)들에 대해 형광 분자(301)들의 표지가 제대로 이루어지지 않는다는 것이다. 이는, 형광 분자(301)들을 표지하는 과정에서의 최대 수득률은 산도 8.3에서 얻어지는 데 반해, 용출 과정에서 사용되는 사용되는 1M 글라이신 용액의 산도는 2.5 내지 3.0 정도이기 때문이다.
도 4는 제1 실시예에 따른 NHS기가 활성화된 아가로스 젤을 이용한 항체(400) 정제 방법을 설명하기 위한 도면이다. 여기서, 도 4는 일반적인 방법의 문제점들을 해결하는, 한 가지의 직교적인 항체(402)에 대한 정제 방법을 설명하기 위한 것이다.
도 4를 참조하면, 먼저, 410 단계에서, 상기의 첫 번째 문제점을 해결하기 위해 정제하고자 하는 항체(400)들과 직교적인 항체(402)들이 아가로스 젤(408)에 연결될 수 있다. 구체적으로, 직교적인 항체(402)들이 1X PBS와 함께, 아가로스 젤(408)에 넣어질 수 있다. 이 때, 아가로스 젤(408)의 표면의 NHS기와 직교적인 항체(402)들의 아민기가 반응해 아마이드 결합을 형성하며, 직교적인 항체(402)들이 아가로스 젤(408)에 연결될 수 있다. 이 후, 420단계에서, 잔여의 NHS기를 제거하기 위해, 아가로스 젤(408)이 1M의 트리스아미노메테인 용액으로 처리될 수 있다.
다음으로, 430 단계에서, 상기의 두 번째 문제점을 해결하기 위해, 정제하고자 하는 항체(400)들이 형광 분자(401)들로 미리 표지된 다음, 아가로스 젤(408)에 넣어질 수 있다. 구체적으로, 형광 분자(401)들로 표지된 항체(400)들이 1X PBS와 함께 아가로스 젤(408)에 넣어질 수 있다. 이를 통해, 430 단계에서, 정제하고자 하는 항체(400)들 중 일부와 직교적인 항체(402)들이 교차 반응을 통해 결합될 수 있다. 다음으로, 440 단계에서, 직교적인 항체(402)들에 결합되지 않은 항체(400)들, 즉 나머지의 항체(400)들이 획득될 수 있다. 이에 따라, 나머지의 항체(400)들에 대해, 직교적인 항체(402)들과의 교차 반응이 제거될 수 있다. 즉, 용출 과정 없이, 나머지의 항체(400)들은 직교적인 항체(402)들과 상이한 직교적인 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)로 구성되어, 두 가지의 형광 신호(201, 202, 203)들로 사용될 수 있다.
도 5는 제2 실시예에 따른 NHS기가 활성화된 아가로스 젤의 이용한 항체(500) 정제 방법을 설명하기 위한 도면이다. 여기서, 도 5는 두 가지의 직교적인 항체(502, 503)들에 대한 정제 방법을 설명하기 위한 것이다.
도 5를 참조하면, 먼저, 510 단계에서, 정제하고자 하는 항체(500)들과 각각 직교적인 두 가지의 직교적인 항체(502, 503)들이 아가로스 젤(508)에 연결될 수 있다. 구체적으로, 직교적인 항체(502, 503)들이 1X PBS와 함께, 아가로스 젤(508)에 넣어질 수 있다. 이 때, 아가로스 젤(508)의 표면의 NHS기와 직교적인 항체(502, 503)들의 아민기가 반응해 아마이드 결합을 형성하며, 직교적인 항체(502, 503)들이 아가로스 젤(508)에 연결될 수 있다. 이 후, 520 단계에서, 잔여의 NHS기를 제거하기 위해, 아가로스 젤(508)이 1M의 트리스아미노메테인 용액으로 처리될 수 있다.
다음으로, 530 단계에서, 정제하고자 하는 항체(500)들이 형광 분자(501)들로 미리 표지된 다음, 아가로스 젤(508)에 넣어질 수 있다. 구체적으로, 형광 분자(501)들로 표지된 항체(500)들이 1X PBS와 함께 아가로스 젤(508)에 넣어질 수 있다. 이를 통해, 530 단계에서, 정제하고자 하는 항체(500)들 중 일부와 직교적인 항체(502, 503)들이 교차 반응을 통해 결합될 수 있다. 다음으로, 540 단계에서, 직교적인 항체(502, 503)들에 결합되지 않은 항체(500)들, 즉 나머지의 항체(500)들이 획득될 수 있다. 이에 따라, 나머지의 항체(500)들에 대해, 두 가지의 직교적인 항체(502, 503)들과의 교차 반응이 동시에 제거될 수 있다. 즉, 용출 과정 없이, 나머지의 항체(500)들은 직교적인 항체(502, 503)들과 상이한 직교적인 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)로 구성되어, 세 가지의 형광 신호(201, 202, 203)들로 사용될 수 있다.
그러나, 도 5의 방법에 따라 획득된 항체(500)들로 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)을 구성하는 경우, 1차 항체(211, 212, 213)에 직접 결합되는 최하위의 첫 번째 계층과 그 상위의 두 번째 계층 사이에 교차 반응이 일어날 수 있다. 구체적으로, 두 번째 계층의 제1의 2차 항체(230, 250, 270)가 첫 번째 계층의 제2의 2차 항체(240, 260, 280)에 대해 교차 반응을 일으킬 수 있다.
도 6은 제3 실시예에 따른 NHS기가 활성화된 아가로스 젤의 이용한 항체(600) 정제 방법을 설명하기 위한 도면이다. 여기서, 도 6은 전술된 도 5의 정제 방법의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 모든 직교적인 항체들, 예컨대 네 가지의 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들에 대한 정제 방법을 설명하기 위한 것이다.
도 6을 참조하면, 먼저, 610 단계에서, 정제하고자 하는 항체(600)들과 각각 직교적인 모든 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 아가로스 젤(608)에 연결될 수 있다. 구체적으로, 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 1X PBS와 함께, 아가로스 젤(608)에 넣어질 수 있다. 이 때, 아가로스 젤(608)의 표면의 NHS기와 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들의 아민기가 반응해 아마이드 결합을 형성하며, 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 아가로스 젤(608)에 연결될 수 있다. 이 후, 620 단계에서, 잔여의 NHS기를 제거하기 위해, 아가로스 젤(608)이 1M의 트리스아미노메테인 용액으로 처리될 수 있다.
다음으로, 630 단계에서, 정제하고자 하는 항체(600)들이 형광 분자(601)들로 미리 표지된 다음, 아가로스 젤(608)에 넣어질 수 있다. 구체적으로, 형광 분자(601)들로 표지된 항체(600)들이 1X PBS와 함께 아가로스 젤(608)에 넣어질 수 있다. 이를 통해, 630 단계에서, 정제하고자 하는 항체(600)들 중 일부와 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 교차 반응을 통해 결합될 수 있다. 다음으로, 640 단계에서, 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들에 결합되지 않은 항체(600)들, 즉 나머지의 항체(600)들이 획득될 수 있다. 이에 따라, 나머지의 항체(600)들에 대해, 모든 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들과의 교차 반응이 동시에 제거될 수 있다. 즉, 나머지의 항체(600)들은 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들과 상이한 직교적인 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)로 구성되어, 여러 가지의 형광 신호(201, 202, 203)들로 사용될 수 있다. 이를 통해, 각 형광 신호(201, 202, 203)에서, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)의 각각에서의 교차 반응 및 계층들 간 교차 반응이 모두 제거될 수 있다.
이와 같이, 하나의 항체(600)가 모든 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들, 예컨대 네 개의 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들에 대해 정제될 수 있다. 예를 들면, 생쥐 항-쥐 항체가 염소 항-닭 항체, 닭 항-염소 항체, 당나귀 항-토끼 항체, 및 토끼 항-당나귀 항체에 대해 정제될 수 있다. 이러한 방식으로, 다수의 항체들이 각각 정제될 수 있으며, 항체들의 각각에 대해, 교차 반응이 제거될 수 있다. 이를 통해, 다수의 항체들의 조합에 의해, 다수의 직교적인 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)이 구성되어, 다수의 형광 신호(201, 202, 203)들이 구현될 수 있다. 예를 들면, 여섯 가지의 항체들이 각각 정제되어, 세 가지의 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)이 구성되며, 나아가 세 개의 형광 신호(201, 202, 203)들이 구현될 수 있다. 즉, n 개의 형광 신호(201, 202, 203)들로 이루어지는 다중 형광 신호(200)를 구현하기 위해, 2n-2 개의 항체들에 대한 정제가 한 번에 진행될 수 있다.
도 7은 다양한 실시예들에 따른 다중 형광 신호(200) 증폭 방법을 도시하는 도면이다.
도 7을 참조하면, 710 단계에서, 상이한 타입들의 표적 단백질(p1, p2, p3)들의 각각을 위해, 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들, 및 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들이 준비될 수 있다. 이 때, 염색하고자 하는 표적 단백질(p1, p2, p3)의 타입에 따라, 1차 항체(211, 212, 213) 및 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들이 상이하게 결정될 수 있다. 여기서, 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들은 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들과 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들로 구분되어, 준비될 수 있다. 제1 실시예들에 따르면, 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들은 모두 형광 분자(231, 241, 251, 261, 271, 281)들로 표지될 수 있다. 여기서, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 형광 분자(231, 251, 271)들과 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 형광 분자(241, 261, 281)들은 동일할 수 있다. 제2 실시예들에 따르면, 도시되지는 않았으나, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 만이 형광 분자(231, 251, 271)들로 표지될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 호스트(host)는 1차 항체(211, 212, 213)들의 호스트와 상이하고, 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 호스트는 1차 항체(211, 212, 213)의 호스트와 동일할 수 있다. 그리고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 타겟(target)은 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 호스트와 동일하고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 호스트는 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 타겟과 동일할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 각각에 대해, 아가로스 젤을 이용하여, 다수의 직교적인 항체들과의 교차 반응이 제거될 수 있다. 이 때, 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 각각이 정제되면서, 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 각각에 대해, 교차 반응이 제거될 수 있다. 예를 들면, 호스트와 타겟이 쥐(rat)와 생쥐(mouse) 및 그 반대인 항체들, 호스트와 타겟이 닭(chicken)과 염소(goat) 및 그 반대인 항체들, 및 호스트와 타겟이 토끼(rabbit)와 당나귀(donkey) 및 그 반대인 항체들은 서로에 대해 직교적일 수 있다. 이에 대해, 도 8을 참조하여, 보다 상세하게 후술될 것이다.
도 8은 도 7의 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 각각을 준비하는 방법을 보다 상세하게 도시하는 도면이다. 여기서, 도 8은 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들 중 하나를 준비하는 방법을 나타내며, 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 각각에 대해 동일한 방식으로 적용될 수 있다. 이로써, 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 모두가 준비될 것이다.
도 8을 참조하면, 811 단계에서, 정제하고자 하는 항체(600)들, 및 정제하고자 하는 항체(600)들에 각각 직교적인 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 준비될 수 있다. 이 때, 정제하고자 하는 항체(600)들은 형광 분자(601)들로 표지될 수 있다. 그리고, 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들은 정제하고자 하는 항체(600)들에 각각 직교적인 모든 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)을 포함할 수 있다.
다음으로, 813 단계에서, 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 아가로스 젤(608)에 동시에 투입될 수 있다. 구체적으로, 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 1X PBS와 함께, 아가로스 젤(608)에 넣어질 수 있다. 이 때, 아가로스 젤(608)의 표면의 NHS기와 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들의 아민기가 반응해 아마이드 결합을 형성하며, 이에 따라, 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 아가로스 젤(608)에 연결될 수 있다.
다음으로, 815 단계에서, 정제하고자 하는 항체(600)들이 아가로스 젤(608)에 투입될 수 있다. 이 때, 아가로스 젤(608)의 표면에서 잔여의 NHS기를 제거하기 위해, 아가로스 젤(608)이 1M의 트리스아미노메테인 용액으로 처리된 다음, 정제하고자 하는 항체(600)들이 아가로스 젤(608)에 투입될 수 있다. 이를 통해, 투입된 항체(600)들 중 일부가 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들에 교차 반응을 통해 결합될 수 있다.
다음으로, 817 단계에서, 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들에 결합되지 않은 항체(600)들, 즉 투입된 항체(600)들의 나머지가 획득될 수 있다. 이에 따라, 나머지의 항체(600)들이 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들, 예컨대 네 개의 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들에 대해 정제되면서, 모든 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들과의 교차 반응이 동시에 제거될 수 있다. 예를 들면, 생쥐 항-쥐 항체가 염소 항-닭 항체, 닭 항-염소 항체, 당나귀 항-토끼 항체, 및 토끼 항-당나귀 항체에 대해 정제될 수 있다. 이로써, 나머지의 항체(600)들이 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들 중 하나로 획득될 수 있다. 이러한 방식으로, 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들이 각각 정제되면서, 상이한 2차 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 각각에 대해, 교차 반응이 제거될 수 있다.
다시 도 7을 참조하면, 720 단계에서, 표적 단백질(p1, p2, p3)들의 각각에 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들이 개별적으로 결합될 수 있다. 다음으로, 730 단계 및 740 단계에서, 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 및 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들이 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들의 각각으로부터 하나의 계층을 이루면서 결합될 수 있다. 구체적으로, 730 단계에서, 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들의 각각에 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들이 개별적으로 결합될 수 있다. 다음으로, 740 단계에서, 결합된 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 각각에 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들이 개별적으로 결합될 수 있다.
이를 통해, 일 실시예에 따른 증폭된 다중 형광 신호(200)가 제조될 수 있다. 즉, 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 및 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들이 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들의 각각으로부터 하나의 계층을 이루면서 결합된 다수의 증폭된 형광 신호(201, 202, 203)들이 동시에 제조되며, 이로써, 증폭된 다중 형광 신호(200)가 제조될 수 있다.
추가적으로, 750 단계 및 740 단계를 반복하면서, 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 및 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들이 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들의 각각으로부터 복수의 계층들을 이루면서 결합될 수 있다. 구체적으로, 750 단계에서, 결합된 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 각각에 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들이 개별적으로 추가로 결합될 수 있다. 다음으로, 740 단계로 복귀하여, 740 단계에서, 결합된 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 각각에 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들이 개별적으로 결합될 수 있다.
이를 통해, 다른 실시예에 따른 증폭된 다중 형광 신호(200)가 제조될 수 있다. 즉, 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들 및 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들이 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들의 각각으로부터 복수의 계층들을 이루면서 결합된 다수의 증폭된 형광 신호(201, 202, 203)들이 동시에 제조되며, 이로써, 증폭된 다중 형광 신호(200)가 제조될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 증폭된 다중 형광 신호(200)는 높은 이미지 처리량을 달성할 수 있다. 즉, 증폭된 다중 형광 신호(200)의 이미지 처리량은 일반적인 형광 신호의 이미지 처리량 보다 현저하게 높을 수 있다. 이를 확인하기 위해, 다양한 실시예들을 초고해상도 이미징 기술인 팽창 현미경에 적용하였다. 이 때, 다중 형광 신호(200)는 팽창 후에도 증폭되어 있을 수 있다. 여기서, 팽창 전의 쥐 뇌 절편에 DAPI 염색을 적용했고, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)이 1차 항체(211, 212, 213)들로부터 6 개의 계층들을 이루도록 결합시켜, 다중 형광 신호(200)를 제조하였다. 그 결과, 팽창 후 단백질 구조체의 변형 없이, 다중 형광 신호(200)가 높은 신호 증폭률로 이미징되었다. 또한, 동일한 레이저 세기에서 같은 밝기에 도달하기 위해 필요한 레이저 노출 시간은 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)이 하나의 계층으로 이루어진 다중 형광 신호(200)에 비해, 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)이 여섯 개의 계층들로 이루어진 다중 형광 신호(200)에서, 5배 정도 감소될 수 있다. 이는, n번의 반복적인 염색을 통해 n배의 형광 신호 증폭이 가능하며, 이를 통해, 이미징 시간을 1/n 배로 감소시킬 수 있다는 것을 의미한다.
도 9는 다양한 실시예들에 따른 다중 형광 신호(200)의 신호 증폭률을 설명하기 위한 도면이다. 여기서, 도 9의 (a), (b) 및 (c)는 다중 형광 신호(200)의 형광 신호(201, 202, 203)들의 각각에 대한 신호 증폭률을 나타내는 막대 그래프들이며, 도 9의 (d)는 다중 형광 신호(200)의 형광 신호(201, 202, 203)들의 신호 증폭률을 비교하기 위한 선 그래프이다.
도 9를 참조하면, 다중 형광 신호(200)가 증폭될 수 있다. 이 때, 1차 항체(211, 212, 213)들의 각각에 대한 2차 항체 쌍들(221, 222, 223)의 계층 수, 즉 염색 횟수가 많을수록, 형광 신호(201, 202, 203)들의 각각의 신호 증폭률이 증가될 수 있다. 이에 따라, 다중 형광 신호(200)의 신호 증폭률도 현저하게 증가될 것이다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호가 증폭될 수 있다. 즉, 다양한 실시예들은, 이미 상용화되어 있는 항체와 형광 분자를 통해 간단하게 증폭된 형광 신호를 구현할 수 있다. 이는 일반적인 형광 현미경을 통해서, 추가적인 장비 없이 형광 신호 증폭 이미징을 가능하게 한다. 그리고, 다양한 실시예들은, 정제된 상보적인 항체 쌍들을 이용한 다중 표지 형광 신호 증폭이 가능하다. 또한, 병리학 조직의 이미징에서 조직 내부 바이오틴과 직교적으로 작용하기 때문에, 조직 내부 배경 신호를 증가시킬 수 있는 추가적인 문제를 제한할 수 있다.
본 기술은 특수화된 재료와 추가적인 처리 과정을 거쳐야 하는 신호 증폭 기술들과 차이를 보인다. 금 나노 입자를 이용한 신호 증폭의 경우, 형광 신호의 발생 및 증폭을 위해, 형광 물질과 소광제가 말단에 연결된 형광 RNA 탐지자 및 분해 효소를 사용해야 하며, 금 나노 입자에 DNA를 결합해야 하는 추가적인 처리 과정이 필요하다. 이는 표식에 직접 형광 신호 물질을 부착시키는 것이 아닌, 분해되며 억제된 형광을 발생시키는 방법으로, 형광이 부착된 항체의 복합체를 확장해, 표지에 고정된 신호를 증폭시키는 본 기술과는 차이가 있다. 본 기술은 isHCR, bDNA 등의 기술과 같이 복잡하고, 많이 상용화되지 않은, DNA 가닥들을 사용하지 않고 형광 신호를 증폭시킬 수 있는 기술이다.
본 기술은 다중 표지 이미징을 위해서 반복적인 활성화 및 비활성화 과정이 요구되는, 단일 화학의 특징을 갖는 티라미드 신호 증폭 면역 염색법과 차이를 보인다. 비활성화를 위한 열처리 과정을 반복하면 항원 결정기가 변성될 수 있고 이후의 염색 과정에서 항체의 결합력을 감소시킬 수 있다. 또한 이전에 침전된 티라미드는 이후의 염색 및 신호 증폭 단계에서 다른 표지에 대한 항체의 결합을 방해할 수 있다. 하지만 본 기술은 서로 직교적인 항체 쌍들을 이용하여, 별도의 활성화 및 비활성화 과정 없이 동시에 다중 이미징을 할 수 있다.
본 기술은 단일 화학의 특징을 갖는 아비딘-바이오틴 결합물 (Avidin-biotin complex) 및 스트렙트아비딘-바이오틴 결합물(Labeled streptavidin-biotin) 신호 증폭 방법과는 차이가 있다. 이 기술도 마찬가지로 다중 표지 신호 증폭 이미징은 제한되며, 다량의 바이오틴을 함유한 병리학 표본 이미징에서 높은 배경 신호를 나타내는 특징이 있다. 하지만 본 기술은 여러 종으로부터 유래된 2차 항체 쌍들을 통해 다중 표지 신호 증폭 이미징이 가능하며, 바이오틴 발현율이 높은 병리학 샘플에서도 효과적으로 사용될 수 있다.
본 기술은 면역 염색을 위해 각각의 항체별로 항체와 올리고뉴클레오티드 결합의 최적화 과정이 필요한 DNA 기반의 신호 증폭 기술과는 차이가 있다. 본 기술은 일반적인 면역 염색법에서 사용되는 형광 분자가 표지된 2차 항체를 이용하기 때문에, 별도의 최적화 과정이 필요하지 않는다. 이는 일반적인 생물 실험실에서도 유용하게 사용될 수 있다.
다양한 실시예들은 다음과 같이 다양한 분야들에 적용 및 응용될 수 있다. 이를 통해, 각 분야에서의 효과를 기대할 수 있다.
첫 번째 분야는, 높은 이미지 처리량을 갖는 대용량 바이오 이미징 기술 개발 분야이다. 최근 주목받고 있는 다양한 조직 투명화 기술은, 기존에는 2차원으로 제한되었던 바이오 이미징 연구를, 3차원 대용량 조직 및 기관 연구로 확대하고 있다. 이는 세포 및 조직의 세부 구조 및 종합적인 연결 네트워크를 파악할 수 있게 하여, 차세대 진단 및 분석 시스템을 크게 발전시킬 것이다. 이러한 장점에도 불구하고, 3차원 대용량 이미징은 높은 스캔 시간이 요구된다는 점에서 굉장히 제한적이다. 하지만 이는 표본의 형광 신호의 증폭을 통해 해결될 수 있다. 본 기술은 형광 증폭을 통해 높은 이미지 처리량을 갖는 대용량 바이오 이미징 기술 개발을 달성하게 할 것이다. 즉, 본 기술은 이미 상용화 되는 조직 투명화 장치에서 투명화 이후 면역 염색 과정을 본 기술로 대체시켜, 표본 자체의 형광강도를 증폭시키고, 전체 이미징 시간을 단축할 수 있는 높은 처리량을 갖는 장치로 제작될 수 있다.
두 번째 분야는, 기술디지털병리 및 인공지능 기반의 분석 시스템 개발 분야이다. 디지털병리는 차세대 진단시스템으로 기대되는 기술 중 하나로, 생체 조직을 이미징한 뒤, 디지털 파일로 저장하여 분석 및 진단을 가능하게 하는 시스템이다.　디지털병리 시스템은　최근 연구개발 되고 있는 빅데이터 및 인공지능 기반의 분석시스템과 함께, 기존 병리학 진단의 제한점들을 극복하려는 시도를 진행하고 있다. 본 기술은 디지털병리에 필요한 대용량 고효율 이미지를 제공할 것이다. 즉, 본 기술은 높은 이미지 처리량을 요구하는 현재의 병리학 및 진단 기술과 함께 사용될 수 있다. 최근 국내외 시장에서는 광학적으로 병리 슬라이드 전체를 스캔하여 정밀한 정보를 추출하여 디지털화하는 전체 슬라이드 이미징 및 디지털병리 기술을 활발하게 개발하고 있다. 본 기술은 디지털병리 기술에 적용되어, 동일한 시간 내에 많은 양의 이미지 데이터를 제공해 줄 것이다. 더 나아가 본 기술은 최근 개발된 CLARITY, MAP, 3DISCO, CUBIC, SHIELD와 같은 다양한 조직 투명화 기술과 함께 사용되어 3차원 대용량 이미지를 신속하게 제공할 것이다.
　세 번째 분야는, 초고감도 체외진단다지표검사 개발 분야이다. 생체 내 다양한 단백질 및 유전체는, 그 분포와 변화를 통해서 질병을 예측하고 진단할 수 있는 지표로 사용된다. 생체의 복잡한 시스템은 독립적인 지표들 각각의 역할뿐만 아니라, 그 지표들의 상호작용을 통해서 이루어지기 때문에 다중 바이오 마커들을 동시에 분석하는 다지표검사는 매우 중요하다. 본 기술은 초고감도 체외진단다지표검사를 제공할 것이다. 즉, 본 기술은 생채 내 낮은 비율로 발현하는 단백질 및 유전체의 형광 신호를 효과적으로 증폭시켜, 초고감도 체외진단다지표검사를 제공할 것이다. 여러 종류의 바이오 마커들의 형광신호를 동시에 증폭시킬 수 있기 때문에, 높은 감도의 다지표검사 시스템을 제공해 줄 것이며, 약물 및 치료 반응에 대한 효과적인 분석 시스템을 마련해 줄 것이다.
네 번째 분야는, 의료 및 신약개발 시스템 개발 분야이다. 치료반응에 대한 결과를 예측하고, 바이오 의약품의 효과를 스크리닝하는 임상 진단 분야는 차세대 신기술 및 신약개발 시스템을 위해 지속적인 연구가 이루어지고 있는 분야이다. 본 기술은 최적화된 질병 예측 및 예방 시스템을 제공하는 인공지능 기반의 첨단 기술 개발을 달성하게 할 것이다. 즉, 본 기술은 병리학적 데이터들과 첨단 기술의 복합적인 상호작용은 정밀한 인공지능 기반의 분석 시스템을 제공할 수 있다. 본 기술의 높은 이미지 처리 능력으로 제공된 많은 양의 데이터들은 인공지능 기반의 분석 시스템에 충분한 강화학습을 제공할 것이다. 이를 통해 발전된 기술은 새로운 데이터 내의 객체를 정확하게 인식하고 파악하여 합리적인 진단을 돕고, 예방할 수 있는 서비스를 제공할 것이다.
다양한 실시예들은 상이한 타입들의 표적 단백질(p1, p2, p3)들의 각각에 대해 증폭된 다수의 형광 신호(201, 202, 203)들로 이루어지는 다중 형광 신호(200) 증폭 방법을 제공한다.
다양한 실시예들에 따르면, 다중 형광 신호(200) 증폭 방법은, 각각에 대한 교차 반응이 제거된 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들을 준비하는 단계(710 단계), 및 표적 단백질(p1, p2, p3)들의 각각에 결합된 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들에, 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 조합에 따른 상이한 항체 쌍들(221, 222, 223)을 각각 결합하여, 형광 신호(201, 202, 203)들을 형성하는 단계(720 단계, 730 단계, 740 단계), 750 단계)를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들을 준비하는 단계(710 단계)는, 아가로스 젤을 이용하여, 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 각각에 대해, 다수의 직교적인 항체들과의 교차 반응을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들은, 형광 분자(231, 241, 251, 261, 271, 281)들로 각각 표지되어 있을 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 교차 반응을 제거하는 단계는, 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들의 각각을 정제하면서, 교차 반응을 제거하는 단계일 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 교차 반응을 제거하는 단계는, 정제하고자 하는 항체(600)들 및 정제하고자 하는 항체(600)들에 각각 직교적인 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들을 준비하는 단계(811 단계), 아가로스 젤(608)에 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들을 모두 투입하는 단계 - 상이한 직교적인 항체들이 아가로스 젤에 연결됨 -(813 단계), 아가로스 젤(608)에 정제하고자 하는 항체(600)들을 투입하는 단계 - 투입된 항체(600)들 중 일부가 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들에 교차 반응을 통해 결합됨 -(815 단계), 및 투입된 항체(600)들 중 나머지를 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들 중 하나로 획득하는 단계(817 단계)를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 정제하고자 하는 항체(600)들은, 형광 분자(601)들로 표지되어 있을 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들은, 정제하고자 하는 항체(600)들에 각각 직교적인 모든 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들을 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 아가로스 젤(608)에 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들을 모두 투입하는 단계(813 단계)에서, 아가로스 젤(608)의 표면의 NHS기와 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들의 표면의 아민기가 반응하여, 아마이드 결합이 형성됨에 따라, 상이한 직교적인 항체(602, 603, 604, 605)들이 아가로스 젤(608)에 연결될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 아가로스 젤(608)에 정제하고자 하는 항체(600)들을 투입하는 단계는, 아가로스 젤(608)의 표면에서 잔여의 NHS기를 제거한 후에, 아가로스 젤(608)에 정제하고자 하는 항체(600)들을 투입하는 단계일 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상이한 항체 쌍들(221, 222, 223)의 각각은, 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들 중 두 개로부터 각각 결정되는 적어도 하나의 제1의 2차 항체(230, 250, 270) 및 적어도 하나의 제2의 2차 항체(240, 260, 280)로 이루어질 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호(201, 202, 203)들을 형성하는 단계(720 단계, 730 단계, 740 단계)는, 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들의 각각에, 상이한 항체 쌍들(221, 222, 223)을 다수의 계층들로 결합하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호(201, 202, 203)들을 형성하는 단계(720 단계, 730 단계, 740 단계)는, 표적 단백질(p1, p2, p3)들의 각각에 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들을 개별적으로 결합하는 단계(720 단계), 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들의 각각에, 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들 중 일부로부터 각각 결정되는 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들을 개별적으로 결합하는 단계(730 단계), 및 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 각각에, 상이한 항체(230, 240, 250, 260, 270, 280)들 중 나머지로부터 각각 결정되는 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들을 개별적으로 결합하는 단계(740 단계)를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호(201, 202, 203)들을 형성하는 단계(720 단계, 730 단계, 740 단계)는, 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들의 각각에 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들을 개별적으로 추가하여 결합하는 단계(750 단계)를 더 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상이한 제2의 2차 항체(240, 260, 280)들을 개별적으로 결합하는 단계(740 단계), 또는 상이한 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들을 개별적으로 추가하여 결합하는 단계(750 단계) 중 적어도 하나는, 반복적으로 수행될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상이한 1차 항체(211, 212, 213)들, 상이한 항체 쌍들(221, 222, 223) 또는 형광 분자(231, 241, 251, 261, 271, 281)들은, 결합되는 표적 단백질(p1, p2, p3)의 타입에 따라, 조합될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)의 타겟은 제2의 2차 항체(240, 260, 280)의 호스트와 동일하고, 제1의 2차 항체(230, 250, 270)들의 호스트는 제2의 2차 항체(240, 260, 280)의 타겟과 동일할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 호스트와 타겟이 쥐(rat)와 생쥐(mouse) 및 그 반대인 항체들, 호스트와 타겟이 닭(chicken)과 염소(goat) 및 그 반대인 항체들, 및 호스트와 타겟이 토끼(rabbit)와 당나귀(donkey) 및 그 반대인 항체들은 서로에 대해 직교적일 수 있다.
다양한 실시예들은 전술된 다중 형광 신호(200) 증폭 방법에 따라 증폭된 다중 형광 신호를 통해 이미지를 처리하는 이미지 처리 장치를 제공한다.
본 문서의 다양한 실시예들 및 이에 사용된 용어들은 본 문서에 기재된 기술을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 해당 실시예의 다양한 변경, 균등물, 및/또는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 도면의 설명과 관련하여, 유사한 구성 요소에 대해서는 유사한 참조 부호가 사용될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함할 수 있다. 본 문서에서, "A 또는 B", "A 및/또는 B 중 적어도 하나", "A, B 또는 C" 또는 "A, B 및/또는 C 중 적어도 하나" 등의 표현은 함께 나열된 항목들의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다. "제1", "제2", "첫째" 또는 "둘째" 등의 표현들은 해당 구성 요소들을, 순서 또는 중요도에 상관없이 수식할 수 있고, 한 구성 요소를 다른 구성 요소와 구분하기 위해 사용될 뿐 해당 구성 요소들을 한정하지 않는다. 어떤(예: 제1) 구성 요소가 다른(예: 제2) 구성 요소에 "(기능적으로 또는 통신적으로) 연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 상기 어떤 구성 요소가 상기 다른 구성 요소에 직접적으로 연결되거나, 다른 구성 요소(예: 제3 구성 요소)를 통하여 연결될 수 있다.
본 문서에서 사용된 용어 "모듈"은 하드웨어, 소프트웨어 또는 펌웨어로 구성된 유닛을 포함하며, 예를 들면, 로직, 논리 블록, 부품, 또는 회로 등의 용어와 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 모듈은, 일체로 구성된 부품 또는 하나 또는 그 이상의 기능을 수행하는 최소 단위 또는 그 일부가 될 수 있다. 예를 들면, 모듈은 ASIC(application-specific integrated circuit)으로 구성될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 기술한 구성 요소들의 각각의 구성 요소(예: 모듈 또는 프로그램)는 단수 또는 복수의 개체를 포함할 수 있다. 다양한 실시예들에 따르면, 전술한 해당 구성 요소들 중 하나 이상의 구성 요소들 또는 단계들이 생략되거나, 또는 하나 이상의 다른 구성 요소들 또는 단계들이 추가될 수 있다. 대체적으로 또는 추가적으로, 복수의 구성 요소들(예: 모듈 또는 프로그램)은 하나의 구성 요소로 통합될 수 있다. 이런 경우, 통합된 구성 요소는 복수의 구성 요소들 각각의 구성 요소의 하나 이상의 기능들을 통합 이전에 복수의 구성 요소들 중 해당 구성 요소에 의해 수행되는 것과 동일 또는 유사하게 수행할 수 있다. 다양한 실시예들에 따르면, 모듈, 프로그램 또는 다른 구성 요소에 의해 수행되는 단계들은 순차적으로, 병렬적으로, 반복적으로, 또는 휴리스틱하게 실행되거나, 단계들 중 하나 이상이 다른 순서로 실행되거나, 생략되거나, 또는 하나 이상의 다른 단계들이 추가될 수 있다.

Claims (17)

  1. 상이한 타입들의 표적 단백질들의 각각에 대해 증폭된 다수의 형광 신호들로 이루어지는 다중 형광 신호 증폭 방법에 있어서,
    각각에 대한 교차 반응이 제거된 상이한 항체들을 준비하는 단계; 및
    상기 표적 단백질들의 각각에 결합된 상이한 1차 항체들에, 상기 상이한 항체들의 조합에 따라 서로로부터 구분되는 상이한 항체 쌍들을 각각 결합하여, 상기 형광 신호들을 형성하는 단계
    를 포함하고,
    상기 상이한 항체들을 준비하는 단계는,
    아가로스 젤을 이용하여, 상기 상이한 항체들의 각각에 대해, 상기 상이한 항체들과 상기 교차 반응을 일으키는 다수의 직교적인 항체들과의 상기 교차 반응을 제거하는 단계
    를 포함하는,
    방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 상이한 항체들은,
    형광 분자들로 각각 표지되어 있는,
    방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 교차 반응을 제거하는 단계는,
    상기 상이한 항체들의 각각을 정제하면서, 상기 교차 반응을 제거하는 단계인,
    방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 교차 반응을 제거하는 단계는,
    정제하고자 하는 항체들 및 상기 정제하고자 하는 항체들과 각각 교차 반응을 일으키는 상이한 직교적인 항체들을 준비하는 단계;
    상기 아가로스 젤에 상기 상이한 직교적인 항체들을 모두 투입하는 단계 - 상기 상이한 직교적인 항체들이 상기 아가로스 젤에 연결됨 -;
    상기 아가로스 젤에 상기 정제하고자 하는 항체들을 투입하는 단계 - 상기 투입된 항체들 중 일부가 상기 상이한 직교적인 항체들에 교차 반응을 통해 결합됨 -; 및
    상기 투입된 항체들 중 나머지를 상기 상이한 항체들 중 하나로 획득하는 단계
    를 포함하는,
    방법.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 정제하고자 하는 항체들은,
    형광 분자들로 표지되어 있는,
    방법.
  6. 제4 항에 있어서,
    상기 상이한 직교적인 항체들은,
    상기 정제하고자 하는 항체들과 각각 교차 반응을 일으키는 모든 직교적인 항체들을 포함하는,
    방법.
  7. 제4 항에 있어서,
    상기 아가로스 젤에 상기 상이한 직교적인 항체들을 모두 투입하는 단계에서,
    상기 아가로스 젤의 표면의 NHS기와 상기 상이한 직교적인 항체들의 표면의 아민기가 반응하여, 아마이드 결합이 형성됨에 따라, 상기 상이한 직교적인 항체들이 상기 아가로스 젤에 연결되는,
    방법.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 아가로스 젤에 상기 정제하고자 하는 항체들을 투입하는 단계는,
    상기 아가로스 젤의 표면에서 잔여의 NHS기를 제거한 후에, 상기 아가로스 젤에 상기 정제하고자 하는 항체들을 투입하는 단계인,
    방법.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 상이한 항체 쌍들의 각각은,
    상기 상이한 항체들 중 두 개로부터 각각 결정되는 적어도 하나의 제1의 2차 항체 및 적어도 하나의 제2의 2차 항체로 이루어지는,
    방법.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 형광 신호들을 형성하는 단계는,
    상기 상이한 1차 항체들의 각각에, 상기 상이한 항체 쌍들을 다수의 계층들로 결합하는 단계
    를 포함하는,
    방법.
  11. 제9 항에 있어서,
    상기 형광 신호들을 형성하는 단계는,
    상기 표적 단백질들의 각각에 상기 상이한 1차 항체들을 개별적으로 결합하는 단계;
    상기 상이한 1차 항체들의 각각에, 상기 상이한 항체들 중 일부로부터 각각 결정되는 상이한 제1의 2차 항체들을 개별적으로 결합하는 단계; 및
    상기 상이한 제1의 2차 항체들의 각각에, 상기 상이한 항체들 중 나머지로부터 각각 결정되는 상이한 제2의 2차 항체들을 개별적으로 결합하는 단계
    를 포함하는,
    방법.
  12. 제11 항에 있어서,
    상기 형광 신호들을 형성하는 단계는,
    상기 상이한 제2의 2차 항체들의 각각에 상기 상이한 제1의 2차 항체들을 개별적으로 추가하여 결합하는 단계
    를 더 포함하는,
    방법.
  13. 제12 항에 있어서,
    상기 상이한 제2의 2차 항체들을 개별적으로 결합하는 단계, 또는 상기 상이한 제1의 2차 항체들을 개별적으로 추가하여 결합하는 단계 중 적어도 하나는,
    반복적으로 수행되는,
    방법.
  14. 제2 항에 있어서,
    상기 상이한 1차 항체들, 상기 상이한 항체 쌍들 또는 상기 형광 분자들은,
    결합되는 표적 단백질의 타입에 따라, 조합되는,
    방법.
  15. 제9 항에 있어서,
    상기 제1의 2차 항체의 타겟은 상기 제2의 2차 항체의 호스트와 동일하고,
    상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 상기 제2의 2차 항체의 타겟과 동일한,
    방법.
  16. 제6 항에 있어서,
    호스트와 타겟이 쥐(rat)와 생쥐(mouse) 및 그 반대인 항체들,
    호스트와 타겟이 닭(chicken)과 염소(goat) 및 그 반대인 항체들, 및
    호스트와 타겟이 토끼(rabbit)와 당나귀(donkey) 및 그 반대인 항체들
    은 서로와 교차 반응을 일으키는,
    방법.
  17. 제1 항 내지 제16 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 증폭된 다중 형광 신호를 통해 이미지를 처리하는 이미지 처리 장치.
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Title
Jinyi Bai et al, RSC Chem Biol (2021.03.20.), vol 2, pp 906-916.
Yehlin Cho et al, Nanoscale (2020.11.13.), vol 12, issue 46, pp 23506-23513.

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