KR102475515B1 - 형광 분자가 표지된 상보적인 항체의 반복적인 라벨링을 통한 형광 신호 증폭 방법 - Google Patents

형광 분자가 표지된 상보적인 항체의 반복적인 라벨링을 통한 형광 신호 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

다양한 실시예들은 형광 분자가 표지된 상보적인 항체의 반복적인 라벨링을 통한 형광 신호 증폭 방법을 제공할 수 있다. 다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호 증폭 방법은, 각 표적 단백질에 대해, 1차 항체, 형광 분자들로 각각 표지된 제1의 2차 항체들, 및 제2의 2차 항체들을 준비하고, 표적 단백질에 1차 항체를 결합하고, 1차 항체에 적어도 하나의 제1의 2차 항체를 결합하고, 제1의 2차 항체에 적어도 하나의 제2의 2차 항체를 결합하도록 구성될 수 있다.

Description

형광 분자가 표지된 상보적인 항체의 반복적인 라벨링을 통한 형광 신호 증폭 방법{METHOD OF FLUORESCENT SIGNAL AMPLIFICATION VIA CYCLIC STAINING OF TARGET MOLECULES}
다양한 실시예들은 형광 분자가 표지된 상보적인 항체의 반복적인 라벨링을 통한 형광 신호 증폭 방법에 관한 것이다.
조직 내 바이오 마커들은 세포들의 복잡한 상태 및 신호체계를 나타내며, 다양한 질병을 규명하는 지표가 된다. 바이오 마커들의 시공간적 분석은 질병 조직의 분석 및 병태생리 규명을 가능하게 하여 치료기술 개발에 도움을 준다. 이렇게 바이오 이미징 기술은 기존의 동물 실험 및 화학적인 검출 반응으로는 한계가 있었던, 조직 내 수많은 단백질의 역할 및 분포를 효과적으로 시각화하여, 생체 내 시스템을 이해할 수 있는 혁신적인 방법으로 연구되고 있다. 또한 바이오 이미징 기술은 세포 및 조직 내 바이오 마커들을 측정하는 바이오 센서로 응용될 수 있다. 실시간으로 변화를 측정할 수 있는 이미징 기술을 통해, 세포 수준에서의 시공간적 분포 및 기능을 이해하고, 신호 전달 시스템을 분석하는 것이 가능하게 된 다. 또한 외부 변화에 의한 생체 반응을 시각적으로 분석하여, 의료 및 신약개발 시스템에서도 유용하게 사용될 수 있다. 바이오 이미징은 질병과 연관된 다양한 약물 반응을 시각적으로 확인할 수 있게 하며, 이를 통한 변화를 시공간적으로 제공해 줄 수 있다. 최근 활발하게 개발되고 있는 다양한 조직 투명화 기술과 더불어, 약물의 효능을 세포 수 준에서부터 기관까지 포괄적으로 검증하여, 효과적인 약물을 설계할 수 있는 중추적인 시스템이 될 것이다. 바이오 이미징은 신약 개발 연구 및 임상 분야에서 약물 후보 물질을 결정하고, 치료 효과를 확인하는 중요한 도구로 주목받고 있으며, 그 활용도가 증가하고 있다.
최근 주목받고 있는 다양한 조직 투명화 기술은, 기존에는 2차원으로 제한되었던 바이오 이미징 연구를 3차원 대용량 조직 및 기관 연구로 확대했다. 이러한 조직 투명화 기법들은 조직에 손상을 최소화하고, 세부 구조 및 연결 네트워크를 파악할 수 있게 한다. 이를 통한 분자 수준에서의 세포 및 조직의 종합적인 매핑은 차세대 진단 및 분석 시스템을 크게 발전시킬 것이다.
이러한 장점에도 불구하고, 3차원 대용량 이미징은 높은 스캔 시간이 요구된다는 점에서 굉장히 제한적이다. 한 표본당 스캔 시간이 길어지게 되면, 낮은 이미지 처리량을 갖게 되고, 이는 많은 이미징 데이터가 있어야 하는 현대 의료 시스템에서 치명적인 단점이 될 수 있다. 하지만 이는 표본의 형광 신호의 증폭을 통해 해결될 수 있다. 표본 이미지 처리량은 형광 신호의 강도에 따라 달라지며, 표본의 형광 강도가 높을수록 동일한 형광 강도의 이미지를 얻기 위해 있는 노출 시간이 단축된다. 따라서 높은 이미지 처리량을 갖는 형광 신호 증폭 기술은 많은 이미지 데이터를 요구하는 차세대 바이오 이미징 분야의 핵심적인 요소가 될 것이다.
생체 내 바이오 마커를 측정하여 질병의 진단을 돕는 바이오 이미징 기술은 높은 정밀도를 요구한다. 또한 단일 마커의 이미징 보다, 서로 관여하는 다중 마커들을 동시에 이미징하여 전체적인 시공간적 분포와 관계를 알아내는 것은 바이오 이미징 기술에서 핵심이 되는 요소이다. 따라서 측정되는 신호를 증폭시켜 감도를 높이고, 다중 표지를 동시에 표지하는 기술은 초감도 바이오 이미징 및 센서를 위해 반드시 충족되어야 하는 요소들이다.
현재까지 높은 이미징 처리량을 얻기 위한 다양한 형광 신호 증폭 기술들이 개발되었다. 그러나 많은 기술이 낮은 신호 대 잡음 비, 제한된 다중 표지 이미징, 낮은 공간 분해능, 복잡성과 낮은 접근성 등 여러 제한점을 가지고 있다.
다양한 실시예들은, 형광 분자가 표지된 상보적인 항체의 반복적인 라벨링을 통한 형광 신호 증폭 방법을 제공한다.
다양한 실시예들에 따른 형광 신호 증폭 방법은, 각 표적 단백질에 대해, 1차 항체, 형광 분자들로 각각 표지된 제1의 2차 항체들, 및 제2의 2차 항체들을 준비하는 단계, 상기 표적 단백질에 상기 1차 항체를 결합하는 단계, 상기 1차 항체에 적어도 하나의 제1의 2차 항체를 결합하는 단계, 및 상기 제1의 2차 항체에 적어도 하나의 제2의 2차 항체를 결합하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따른 형광 신호 증폭 방법은, 각 표적 단백질에 결합되는 1차 항체를 형성하는 단계, 및 상기 1차 항체에 대해, 형광 분자들로 각각 표지된 제1의 2차 항체들 및 상기 제1의 2차 항체들에 결합되는 제2의 2차 항체들로 이루어지는 2차 항체 쌍들을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 2차 항체 쌍들 중 적어도 하나는, 제1의 2차 항체를 통해 상기 1차 항체에 결합될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호가 증폭될 수 있다. 즉, 다양한 실시예들은, 이미 상용화되어 있는 항체와 형광 분자를 통해 간단하게 증폭된 형광 신호를 구현할 수 있다. 이는 일반적인 형광 현미경을 통해서, 추가적인 장비 없이 형광 신호 증폭 이미징을 가능하게 한다. 그리고, 다양한 실시예들은, 정제된 상보적인 항체 쌍들을 이용한 다중 표지 형광 신호 증폭이 가능하다. 또한, 병리학 조직의 이미징에서 조직 내부 비오틴과 직교적으로 작용하기 때문에, 조직 내부 배경 신호를 증가시킬 수 있는 추가적인 문제를 제한할 수 있다.
도 1은 일반적인 형광 신호를 도시하는 도면이다.
도 2는 제1 실시예들에 따른 형광 신호를 도시하는 도면이다.
도 3은 제2 실시예들에 따른 형광 신호를 도시하는 도면이다.
도 4는 다양한 실시예들에 따른 형광 신호 증폭 방법을 도시하는 도면이다.
도 5는 제1 실시예들에 따른 형광 신호 증폭 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 제2 실시예들에 따른 형광 신호 증폭 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 7, 도 8 및 도 9는 다양한 실시예들에 따른 형광 신호 증폭 방법의 응용을 설명하기 위한 도면들이다.
도 10은 다양한 실시예들에 따른 형광 신호의 신호 증폭률을 설명하기 위한 도면이다.
이하, 본 문서의 다양한 실시예들이 첨부된 도면을 참조하여 설명된다.
다양한 실시예들은, 상보적인 항체의 반복적인 라벨링을 통한 형광 신호 증폭(fluorescence signal amplification via repetitive labeling of target molecules; FRACTAL) 기술을 제안한다. 다양한 실시예들에 따르면, 이미지 처리 장치는 증폭된 형광 신호를 통해 이미지를 처리한다. 다양한 실시예들은, 형광 분자가 결합한 서로 다른 두 개의 2차 항체를 번갈아 사용함으로써, 면역 형광 신호를 증폭시키며, 이를 통해 제한된 이미지 처리량을 극복한다.
도 1은 일반적인 형광 신호(100)를 도시하는 도면이다.
도 1을 참조하면, 일반적인 형광 신호(100)는 증폭 없이 제공된다. 일 예로, 일반적인 형광 신호(100)는 직접법에 의해 표적 단백질(p)에 염색된다. 도 1의 (a)에 도시된 바와 같이, 일반적인 형광 신호(100)는 1차 항체(110)로 이루어지며, 1차 항체(110)가 형광 분자(111)로 표지되어 있다. 다른 예로, 일반적인 형광 신호(110)는 간접법에 의해 표적 단백질(p)에 염색된다. 도 1의 (b)에 도시된 바와 같이, 일반적인 형광 신호(100)는 1차 항체(110), 및 1차 항체(110)에 결합되는 2차 항체(120)들을 포함하며, 2차 항체(120)들이 형광 분자(121)들로 각각 표지되어 있다. 이러한 일반적인 형광 신호는 낮은 이미지 처리량을 갖는다.
도 2는 제1 실시예들에 따른 형광 신호(200)를 도시하는 도면이다.
도 2를 참조하면, 제1 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200)가 제공된다. 증폭된 형광 신호(200)는 1차 항체(210) 및 2차 항체 쌍들(220)을 포함할 수 있다. 1차 항체(210)는 표적 단백질(p)에 결합될 수 있다. 2차 항체 쌍들(220)은 제1의 2차 항체(230)들 및 제2의 2차 항체(240)들로 이루어질 수 있다. 제1 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230)들 및 제2의 2차 항체(240)들 모두 형광 분자(231, 241)들로 표지되어 있을 수 있다. 여기서, 제1의 2차 항체(230)들의 형광 분자(231)들과 제2의 2차 항체(240)들의 형광 분자(241)들은 동일할 수 있다. 이 때 2차 항체 쌍들(220) 내에서, 제2의 2차 항체(240)들은 제1의 2차 항체(230)들에 결합될 수 있다. 2차 항체 쌍들(220)은 1차 항체(210)로부터 적어도 하나의 계층들을 이루면서 결합될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 도 2의 (a)에 도시된 바와 같이, 2차 항체 쌍들(220)은 1차 항체(210)로부터 하나의 계층을 이루면서 결합될 수 있다. 이러한 경우, 2차 항체 쌍들(220)은 제1의 2차 항체(230)들을 통해, 1차 항체(210)에 결합될 수 있고, 제2의 2차 항체(240)들은 제1의 2차 항체(230)들에 결합될 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 도 2의 (b)에 도시된 바와 같이, 2차 항체 쌍들(220)은 1차 항체(210)로부터 복수의 계층들을 이루면서 주기적인 구조로 결합될 수 있다. 이러한 경우, 2차 항체 쌍들(220) 중 적어도 하나는 제1의 2차 항체(230)들을 통해, 1차 항체(210)에 결합될 수 있다. 그리고, 상위 계층의 2차 항체 쌍들(220)은 제1의 2차 항체(230)들을 통해 하위 계층의 2차 항체 쌍들(220)의 제2의 2차 항체(240)들에 결합될 수 있다.
도 3은 제2 실시예들에 따른 형광 신호(300)를 도시하는 도면이다.
도 3을 참조하면, 제2 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(300)가 제공된다. 증폭된 형광 신호(300)는 1차 항체(310) 및 2차 항체 쌍들(320)을 포함할 수 있다. 1차 항체(310)는 표적 단백질(p)에 결합될 수 있다. 2차 항체 쌍들(320)은 제1의 2차 항체(330)들 및 제2의 2차 항체(340)들로 이루어질 수 있다. 제2 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(330)들 만이 형광 분자(331)들로 표지되어 있을 수 있다. 이 때 2차 항체 쌍들(320) 내에서, 제2의 2차 항체(340)들은 제1의 2차 항체(330)들에 결합될 수 있다. 2차 항체 쌍들(320)은 1차 항체(310)로부터 적어도 하나의 계층들을 이루면서 결합될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 도 3의 (a)에 도시된 바와 같이, 2차 항체 쌍들(320)은 1차 항체(310)로부터 하나의 계층을 이루면서 결합될 수 있다. 이러한 경우, 2차 항체 쌍들(320)은 제1의 2차 항체(330)들을 통해, 1차 항체(310)에 결합될 수 있고, 제2의 2차 항체(340)들은 제1의 2차 항체(330)들에 결합될 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 도 3의 (b)에 도시된 바와 같이, 2차 항체 쌍들(320)은 1차 항체(310)로부터 복수의 계층들을 이루면서 주기적인 구조로 결합될 수 있다. 이러한 경우, 2차 항체 쌍들(320) 중 적어도 하나는 제1의 2차 항체(330)들을 통해, 1차 항체(310)에 결합될 수 있다. 그리고, 상위 계층의 2차 항체 쌍들(320)은 제1의 2차 항체(330)들을 통해 하위 계층의 2차 항체 쌍들(320)의 제2의 2차 항체(340)들에 결합될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트(host)는 1차 항체(210, 310)들의 호스트와 상이하고, 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 1차 항체(210, 310)의 호스트와 동일할 수 있다. 그리고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 타겟(target)은 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트와 동일하고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 제2의 2차 항체(240, 340)들의 타겟과 동일할 수 있다. 이 때 형광 신호(200, 300)의 1차 항체(210, 310), 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들을 위한 호스트 및 타겟은 형광 신호(200, 300)가 염색되는 표적 단백질(p)에 따라 결정될 수 있다.
예를 들면, 형광 신호(200, 300)의 1차 항체(210, 310), 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들을 하기 [표 1]과 같이 상용화되어 있는, 다양한 동물들로부터 유래되는 호스트 및 타겟으로 결정될 수 있다. 하기 [표 1]에 따르면, 64 종류의 2차 항체 쌍(220, 320)들이 조합될 수 있다. 일 예로, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 토끼(rabbit)이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 당나귀(donkey)일 수 있다. 바꿔 말하면, 1차 항체(210, 310)는 토끼 1차 항체이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들은 당나귀 항-토끼 2차 항체들이고, 제2의 2차 항체(240, 340)들은 토끼 항-당나귀 2차 항체들일 수 있다. 다른 예로, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 당나귀이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 토끼일 수 있다. 바꿔 말하면, 1차 항체(210, 310)는 당나귀 1차 항체이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들은 토끼 항-당나귀 2차 항체들이고, 제2의 2차 항체(240, 340)들은 당나귀 항-토끼 2차 항체들일 수 있다.
호스트 타겟 호스트 타겟 호스트 타겟
토끼(rabbit) 소(bovine) 염소 말 생쥐 쥐
닭(chicken) 사람 소
개(dog) 생쥐 원숭이
염소(goat) 토끼 기니피그
시리아 햄스터(Syrian hamster) 쥐 닭 생쥐
말(horse) 돼지(swine) 사람
사람(human) 햄스터 쥐
생쥐(mouse) 개 토끼
쥐(rat) 낙타 염소
양(sheep) 원숭이 알파카(alpaca) 사람
기니피그(guinea pig) 피그(pig) 생쥐
햄스터(hamster) 당나귀 닭 토끼
낙타(camelid) 염소 양 생쥐
당나귀(donkey) 기니피그 쥐
고양이(cat) 사람 염소
염소 소 토끼 토끼
고양이 쥐 소 염소
닭 양 사람
기니피그 생쥐 염소 생쥐
아르메니아 햄스터(armenian hamster) 사람 쥐 생쥐
시리아 햄스터 토끼 말 생쥐
도 4는 다양한 실시예들에 따른 형광 신호(200, 300) 증폭 방법을 도시하는 도면이다. 도 5는 제1 실시예들에 따른 형광 신호(200) 증폭 방법을 설명하기 위한 도면이고, 도 6은 제2 실시예들에 따른 형광 신호(300) 증폭 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 4를 참조하면, 410 단계에서, 1차 항체(210, 310), 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들이 준비될 수 있다. 이 때 염색하고자 하는 표적 단백질(p)에 대해, 1차 항체(210, 310), 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들이 준비될 수 있다. 제1 실시예들에 따르면, 도 5에 도시된 바와 같이, 제1의 2차 항체(230)들 및 제2의 2차 항체(240)들 모두 형광 분자(231, 241)들로 표지될 수 있다. 여기서, 제1의 2차 항체(230)들의 형광 분자(231)들과 제2의 2차 항체(240)들의 형광 분자(241)들은 동일할 수 있다. 제2 실시예들에 따르면, 도 6에 도시된 바와 같이, 제1의 2차 항체(330)들 만이 형광 분자(331)들로 표지될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트(host)는 1차 항체(210, 310)들의 호스트와 상이하고, 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 1차 항체(210, 310)의 호스트와 동일할 수 있다. 그리고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 타겟(target)은 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트와 동일하고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 제2의 2차 항체(240, 340)들의 타겟과 동일할 수 있다. 이 때 형광 신호(200, 300)의 1차 항체(210, 310), 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들을 위한 호스트 및 타겟은 형광 신호(200, 300)가 염색되는 표적 단백질(p)에 따라 결정될 수 있다.
420 단계에서, 표적 단백질(p)에 1차 항체(210, 310)가 결합될 수 있다. 도 5의 (a) 또는 도 6의 (a)에 도시된 바와 같이, 표적 단백질(p)에 1차 항체(210, 310)가 결합될 수 있다.
430 단계 및 440 단계에서, 제1의 2차 항체(230, 330) 및 제2의 2차 항체(240, 340)가 1차 항체(210, 310)로부터 하나의 계층을 이루면서 결합될 수 있다. 구체적으로, 430 단계에서, 1차 항체(210, 310)에 적어도 하나의 제1의 2차 항체(230, 330)가 결합될 수 있다. 도 5의 (b) 또는 도 6(b)에 도시된 바와 같이, 1차 항체(210, 310)에 적어도 하나의 제1의 2차 항체(230, 330)가 결합될 수 있다. 이 때 제1의 2차 항체(230, 330)들은 형광 분자(231, 331)들로 각각 표지되어 있을 수 있다. 다음으로, 440 단계에서, 결합된 제1의 2차 항체(230, 330)에 적어도 하나의 제2의 2차 항체(240, 340)가 결합될 수 있다. 도 5의 (c) 또는 도 6의 (c)에 도시된 바와 같이, 1차 항체(210, 310)에 결합된 제1의 2차 항체(230, 330)에 적어도 하나의 제2의 2차 항체(240, 340)가 결합될 수 있다. 제1 실시예들에 따르면, 제2의 2차 항체(240)들은 형광 분자(241)들로 각각 표지되어 있을 수 있다. 여기서, 제2의 2차 항체(240)들의 형광 분자(241)들은 제1의 2차 항체(230)들의 형광 분자(231)들과 동일할 수 있다. 제2 실시예들에 따르면, 제2의 2차 항체(340)들은 형광 분자들로 표지되어 있지 않을 수 있다.
이를 통해, 일 실시예에 따른 증폭된 형광 신호(200, 300)가 제조될 수 있다. 즉, 도 5의 (c) 또는 도 6의 (c)에 도시된 바와 같이, 제1의 2차 항체(230, 330) 및 제2의 2차 항체(240, 340)가 1차 항체(210, 310)로부터 하나의 계층을 이루면서 결합된, 증폭된 형광 신호(200, 300)가 제조될 수 있다.
추가적으로, 450 단계 및 440 단계를 반복하면서, 제1의 2차 항체(230, 330) 및 제2의 2차 항체(240, 340)가 1차 항체(210, 310)로부터 복수의 계층들을 이루면서 결합될 수 있다. 구체적으로, 450 단계에서, 결합된 제2의 2차 항체(240, 340)에 적어도 하나의 제1의 2차 항체(230, 330)가 결합될 수 있다. 도 5의 (d) 또는 도 6의 (d)에 도시된 바와 같이, 제1의 2차 항체(230, 330)에 결합된 제2의 2차 항체(240, 340)에 적어도 하나의 제1의 2차 항체(230, 330)가 추가적으로 결합될 수 있다. 마찬가지로, 제1의 2차 항체(230, 330)들은 형광 분자(231, 331)들로 각각 표지되어 있을 수 있다. 다음으로, 440 단계로 복귀하여, 440 단계에서, 결합된 제1의 2차 항체(230, 330)에 적어도 하나의 제2의 2차 항체(240, 340)가 결합될 수 있다. 도 5의 (e) 또는 도 6의 (e)에 도시된 바와 같이, 제2의 2차 항체(240, 340)에 결합된 제1의 2차 항체(230, 330)에 적어도 하나의 제2의 2차 항체(240, 340)가 추가적으로 결합될 수 있다. 제1 실시예들에 따르면, 제2의 2차 항체(240)들은 형광 분자(241)들로 각각 표지되어 있을 수 있다. 제2 실시예들에 따르면, 제2의 2차 항체(340)들은 형광 분자들로 표지되어 있지 않을 수 있다.
이를 통해, 다른 실시예에 따른 증폭된 형광 신호(200, 300)가 제조될 수 있다. 즉, 도 5의 (e) 또는 도 6의 (e)에 도시된 바와 같이, 제1의 2차 항체(230, 330) 및 제2의 2차 항체(240, 340)가 1차 항체(210, 310)로부터 복수의 계층들을 이루면서 결합된, 증폭된 형광 신호(200, 300)가 제조될 수 있다. 이 때 증폭된 형광 신호(200, 300)에서, 상위 계층의 제1의 2차 항체(230, 330)가 하위 계층의 제2의 2차 항체(240, 340)들에 결합될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 증폭된 형광 신호(200, 300)는 높은 이미지 처리량을 달성할 수 있다. 즉, 증폭된 형광 신호(200, 300)의 이미지 처리량은 일반적인 형광 신호(100)의 이미지 처리량 보다 현저하게 높을 수 있다. 이를 확인하기 위해, 2차 항체 쌍들(220)이 1차 항체(210)로부터 5 개의 계층들을 이루도록 결합시켜, 제1 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200)를 제조하였다. 해당 형광 신호(200)를 일반적인 형광 신호(100)와 비교한 결과, 해당 형광 신호(200)가 일반적인 형광 신호(100)에 비해, 약 9.32 배만큼 증폭되었다. 즉, 일반적인 형광 신호(100)를 이용할 때에 비해, 해당 형광 신호(200)를 이용할 때, 동일한 밝기를 얻는 데 필요한 이미징 시간이 9 배 이상 감소될 수 있다. 예를 들어, 실험용 쥐 뇌 절편(1 Х 1 Х 1 cm)을 이미징할 때, 일반적인 형광 신호(100)에 따른 이미징 시간과 해당 형광 신호(200)에 따른 이미징 시간이 비교되었다. 이 때 일반적인 형광 신호(100)로는, 100 ms 노출 시간, 10 배율, 4 μm의 z 축 스텝 사이즈 조건에서는 총 4시간의 이미징 시간이 필요하다. 하지만, 해당 형광 신호(200)로는, 동일한 밝기의 이미지를 얻기 위한 노출 시간을 10 ms로 줄일 수 있으며, 이는 뇌 절편에 대한 이미징 시간을 20~30분 정도로 단축할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 증폭된 형광 신호(200, 300)가 매우 간단한 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 특수한 화학 물질 없이도, 증폭된 형광 신호(200, 300)가 구현될 수 있다. 이 때 제1의 2차 항체(230, 330)들과 제2의 2차 항체(240, 340)이 연속적인 결합을 통해 균일한 계층들을 형성하고, 이를 통해 형광 신호(200, 300)가 증폭될 수 있다. 다양한 실시예들은 최신 고해상도 이미징 기술인 팽창 현미경 기술과도 잘 작동되며, 이는 높은 해상도와 처리량을 가진 획기적인 이미징 기술로 사용될 것이다.
제1 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230)들과 제2의 2차 항체(240)들은 모두 형광 분자(231, 241)들로 표지될 수 있다. 이 때 형광 분자(231, 241) 사이에 자기 소광(self-quenching) 효과가 발생될 수 있다. 한편, 제2 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(330)들은 형광 분자(331)들로 표지되나, 제2의 2차 항체(340)들이 형광 분자들로 표지되지 않을 수 있다. 이에 따라, 제2 실시예들에서, 자기 소광 효과가 감소될 수 있다. 자기 소광 효과가 감소됨에 따라, 제2 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(300)는 제1 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200) 보다 크게 증폭될 수 있다. 예컨대, 제1 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200)와 제2 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(300)가 동일한 수의 계층들로 각각 이루어지는 경우, 제2 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(300)는 제1 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200) 보다 약 1.5 배 크게 증폭될 수 있다. 뿐만 아니라, 제2 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(300)의 제조 비용은 제1 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200)의 제조 비용 보다 낮을 수 있다. 예컨대, 제1 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200)와 제2 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(300)가 동일한 수의 계층들로 각각 이루어지는 경우, 제1 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200)의 제조 비용은 제2 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(300)의 제조 비용 보다 약 4 배 높을 수 있다.
도 7, 도 8 및 도 9는 다양한 실시예들에 따른 증폭된 형광 신호(200, 300) 증폭 방법의 응용을 설명하기 위한 도면들이다.
도 7 및 도 8을 참조하면, 상이한 타입들의 복수의 표적 단백질(p)들에 대해, 증폭된 형광 신호(200, 300)들이 동시에 제조될 수 있다. 이는 단일 표적 단백질(p)마다 활성화 및 비활성화 과정을 반복해야 하는 복잡한 과정을 단순화시킬 수 있다. 표적 단백질(p)들의 각각에 대해, 1차 항체(210, 310), 제1의 2차 항체(230, 330)들, 제2의 2차 항체(240, 340)들 및 형광 분자(231, 241, 331)들이 상이하게 결정될 수 있다. 이 때 타입들 중 하나에 대한 2차 항체 쌍들(220, 320)은, 타입들 중 다른 하나에 대한 2차 항체 쌍들(220, 320)과 직교할 수 있다. 예를 들면, 도 7에 도시된 바와 같이, 제1 타입의 표적 단백질(p), 제2 타입의 표적 단백질(p) 및 제3 타입의 표적 단백질(p)에 대한 2차 항체 쌍들(220, 320)은 서로 직교할 수 있다. 이를 통해, 도 8에 도시된 바와 같이, 상이한 타입들의 복수의 표적 단백질(p)들에 대해, 형광 신호들이 동시에 염색될 수 있다. 이 때 증폭된 형광 신호(200, 300)들이 동시에 제조될 수 있다. 표적 단백질(p)이 라민 B1인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 쥐이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 생쥐일 수 있다. 표적 단백질(p)이 비멘틴인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 닭이고, 상기 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 염소일 수 있다. 표적 단백질이 튜블린인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 토끼이고, 상기 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 당나귀일 수 있다.
어떤 실시예들에서, 타입들 중 하나에 대한 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들은, 타입들 중 다른 하나에 대한 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들에 대해 정제되어 준비될 수 있다. 이를 통해, 타입들 중 하나에 대한 2차 항체 쌍들(220, 320)은, 타입들 중 다른 하나에 대한 2차 항체 쌍들(220, 320)과 직교할 수 있다. 예를 들면, 도 9의 (a)에 도시된 바와 같이, 정제되지 않은 토끼 항-당나귀 항체가 염소 항-닭 항체에 대해 정제되어, 정제된 토끼 항-당나귀 항체가 획득될 수 있다. 이러한 방식으로, 도 9의 (b), (c), (d) 및 (e)에 도시된 바와 같이, 튜블린을 위한 증폭된 형광 신호(200, 300)와 비맨틴을 위한 증폭된 형광 신호(200, 300)가 동시에 획득될 수 있다. 여기서, 도 9는, (b)로부터 (e)로 갈수록, 증폭된 형광 신호(200, 300)가 많은 수의 2차 항체 쌍들(220, 320)의 계층들을 갖도록 구현되는 경우를 나타낸다.
도 10은 다양한 실시예들에 따른 형광 신호(200, 300)의 신호 증폭률을 설명하기 위한 도면이다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호(200, 300)가 증폭될 수 있다. 추가적으로, 도 10의 (a)에 도시된 바와 같이, 제3 실시예들에 따른 형광 신호가, 제1 실시예들과 제2 실시예들이 혼합됨에 따라, 증폭될 수 있다. 이러한 경우, 제1의 2차 항체들 중 일부만이 형광 분자들로 표지되고, 제2의 2차 항체들 중 일부만이 형광 분자들로 표지될 수 있다. 다양한 실시예들에 따르면, 도 10의 (b) 및 (c)에 도시된 바와 같이, 2차 항체 쌍들(220)의 계층들의 수가 많을수록, 즉 염색 횟수가 많을수록, 형광 신호(200, 300)의 신호 증폭률이 증가될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호가 증폭될 수 있다. 즉, 다양한 실시예들은, 이미 상용화되어 있는 항체와 형광 분자를 통해 간단하게 증폭된 형광 신호를 구현할 수 있다. 이는 일반적인 형광 현미경을 통해서, 추가적인 장비 없이 형광 신호 증폭 이미징을 가능하게 한다. 그리고, 다양한 실시예들은, 정제된 상보적인 항체 쌍들을 이용한 다중 표지 형광 신호 증폭이 가능하다. 또한, 병리학 조직의 이미징에서 조직 내부 비오틴과 직교적으로 작용하기 때문에, 조직 내부 배경 신호를 증가시킬 수 있는 추가적인 문제를 제한할 수 있다.
본 기술은 특수화된 재료와 추가적인 처리 과정을 거쳐야 하는 신호 증폭 기술들과 차이를 보인다. 금 나노 입자를 이용한 신호 증폭의 경우, 형광 신호의 발생 및 증폭을 위해, 형광 물질과 소광제가 말단에 연결된 형광 RNA 탐지자 및 분해 효소를 사용해야 하며, 금 나노 입자에 DNA를 결합해야 하는 추가적인 처리 과정이 필요하다. 이는 표식에 직접 형광 신호 물질이 부착시키는 것이 아닌, 분해되며 억제된 형광을 발생시키는 방법으로, 형광이 부착된 항체의 복합체를 확장해, 표지에 고정된 신호를 증폭시키는 본 기술과는 차이가 있다. 본 기술은 isHCR, bDNA 등의 기술과 같이 복잡하고, 많이 상용화되지 않은, DNA 가닥들을 사용하지 않고 형광 신호를 증폭시킬 수 있는 기술이다.
본 기술은 다중 표지 이미징을 위해서 반복적인 활성화 및 비활성화 과정이 요구되는, 단일 화학의 특징을 갖는 티라미드 신호 증폭 면역 염색법과 차이를 보인다. 비 활성화를 위한 열처리 과정을 반복하면 항원 결정기가 변성될 수 있고 이후의 염색 과정에서 항체의 결합력을 감소시킬 수 있다. 또한 이전에 침전된 티라미드는 이후의 염색 및 신호 증폭 단계에서 다른 표지에 대한 항체의 결합을 방해할 수 있다. 하지만 본 기술은 서로 직교적인 항체 쌍들을 이용하여, 별도의 활성화 및 비활성화 과정 없이 동시에 다중 이미징을 할 수 있다.
본 기술은 단일 화학의 특징을 갖는 아비딘-바이오틴 결합물 (Avidin-biotin complex) 및 스트렙트아비딘-바이오틴 결합물(Labeled streptavidin-biotin) 신호 증 폭 방법과는 차이가 있다. 이 기술도 마찬가지로 다중 표지 신호 증폭 이미징은 제한되며, 다량의 바이오틴을 함유한 병리학 표본 이미징에서 높은 배경 신호를 나타내는 특징이 있다. 하지만 본 기술은 여러 종으로부터 유래된 2차 항체 쌍들을 통해 다중 표지 신호 증폭 이미징이 가능하며, 바이오틴 발현율이 높은 병리학 샘플에서도 효과적으로 사용될 수 있다.
본 기술은 면역 염색을 위해 각각의 항체별로 항체와 올리고뉴클레오티드 결합의 최적화 과정이 필요한 DNA 기반의 신호 증폭 기술과는 차이가 있다. 본 기술은 일반적인 면역 염색법에서 사용되는 형광 분자가 표지된 2차 항체를 이용하기 때문에, 별도의 최적화 과정이 필요하지 않는다. 이는 일반적인 생물 실험실에서도 유용하게 사용될 수 있다.
다양한 실시예들은 다음과 같이 다양한 분야들에 적용 및 응용될 수 있다. 이를 통해, 각 분야에서의 효과를 기대할 수 있다.
첫 번째 분야는, 높은 이미지 처리량을 갖는 대용량 바이오 이미징 기술 개발 분야이다. 최근 주목받고 있는 다양한 조직 투명화 기술은, 기존에는 2차원으로 제한되었던 바이오 이미징 연구를, 3차원 대용량 조직 및 기관 연구로 확대하고 있다. 이는 세포 및 조직의 세부 구조 및 종합적인 연결 네트워크를 파악할 수 있게 하여, 차세대 진단 및 분석 시스템을 크게 발전시킬 것이다. 이러한 장점에도 불구하고, 3차원 대용량 이미징은 높은 스캔 시간이 요구된다는 점에서 굉장히 제한적이다. 하지만 이는 표본의 형광 신호의 증폭을 통해 해결될 수 있다. 본 기술은 형광 증폭을 통해 높은 이미지 처리량을 갖는 대용량 바이오 이미징 기술 개발을 달성하게 할 것이다. 즉, 본 기술은 이미 상용화 되는 조직 투명화 장치에서 투명화 이후 면역 염색 과정을 본 기술로 대체시켜, 표본 자체의 형광강도를 증폭시키고, 전체 이미징 시간을 단축할 수 있는 높은 처리량을 갖는 장치로 제작될 수 있다.
두 번째 분야는, 기술디지털병리 및 인공지능 기반의 분석 시스템 개발 분야이다. 디지털병리는 차세대 진단시스템으로 기대되는 기술 중 하나로, 생체 조직을 이미징한 뒤, 디지털 파일로 저장하여 분석 및 진단을 가능하게 하는 시스템이다.　디지털병리 시스템은　최근 연구개발 되고 있는 빅데이터 및 인공지능 기반의 분석시스템과 함께, 기존 병리학 진단의 제한점들을 극복하려는 시도를 진행하고 있다. 본 기술은 디지털병리에 필요한 대용량 고효율 이미지를 제공할 것이다. 즉, 본 기술은 높은 이미지 처리량을 요구하는 현재의 병리학 및 진단 기술과 함께 사용될 수 있다. 최근 국내외 시장에서는 광학적으로 병리 슬라이드 전체를 스캔하여 정밀한 정보를 추출하여 디지털화하는 전체 슬라이드 이미징 및 디지털병리 기술을 활발하게 개발하고 있다. 본 기술은 디지털병리 기술에 적용되어, 동일한 시간 내에 많은 양의 이미지 데이터를 제공해 줄 것이다. 더 나아가 본 기술은 최근 개발된 CLARITY, MAP, 3DISCO, CUBIC, SHIELD와 같은 다양한 조직 투명화 기술과 함께 사용되어 3차원 대용량 이미지를 신속하게 제공할 것이다.
　세 번째 분야는, 초고감도 체외진단다지표검사 개발 분야이다. 생체 내 다양한 단백질 및 유전체는, 그 분포와 변화를 통해서 질병을 예측하고 진단할 수 있는 지표로 사용된다. 생체의 복잡한 시스템은 독립적인 지표들 각각의 역할뿐만 아니라, 그 지표들의 상호작용을 통해서 이루어지기 때문에 다중 바이오 마커들을 동시에 분석하는 다지표검사는 매우 중요하다. 본 기술은 초고감도 체외진단다지표검사를 제공할 것이다. 즉, 본 기술은 생채 내 낮은 비율로 발현하는 단백질 및 유전체의 형광 신호를 효과적으로 증폭시켜, 초고감도 체외진단다지표검사를 제공할 것이다. 여러 종류의 바이오 마커들의 형광신호를 동시에 증폭시킬 수 있기 때문에, 높은 감도의 다지표검사 시스템을 제공해 줄 것이며, 약물 및 치료 반응에 대한 효과적인 분석 시스템을 마련해 줄 것이다.
네 번째 분야는, 의료 및 신약개발 시스템 개발 분야이다. 치료반응에 대한 결과를 예측하고, 바이오 의약품의 효과를 스크리닝하는 임상 진단 분야는 차세대 신기술 및 신약개발 시스템을 위해 지속적인 연구가 이루어지고 있는 분야이다. 본 기술은 최적화된 질병 예측 및 예방 시스템을 제공하는 인공지능 기반의 첨단 기술 개발을 달성하게 할 것이다. 즉, 본 기술은 병리학적 데이터들과 첨단 기술의 복합적인 상호작용은 정밀한 인공지능 기반의 분석 시스템을 제공할 수 있다. 본 기술의 높은 이미지 처리 능력으로 제공된 많은 양의 데이터들은 인공지능 기반의 분석 시스템에 충분한 강화학습을 제공할 것이다. 이를 통해 발전된 기술은 새로운 데이터 내의 객체를 정확하게 인식하고 파악하여 합리적인 진단을 돕고, 예방할 수 있는 서비스를 제공할 것이다.
다양한 실시예들에 따른 형광 신호(200, 300) 증폭 방법은, 각 표적 단백질(p)에 대해, 1차 항체(210, 310), 형광 분자(231, 331)들로 각각 표지된 제1의 2차 항체(230, 330)들, 및 제2의 2차 항체(240, 340)들을 준비하는 단계(410 단계), 표적 단백질(p)에 1차 항체(210, 310)를 결합하는 단계(420 단계), 1차 항체(210, 310)에 적어도 하나의 제1의 2차 항체(230, 330)를 결합하는 단계(430 단계), 및 제1의 2차 항체(230, 330)에 적어도 하나의 제2의 2차 항체(240, 340)를 결합하는 단계(440) 단계)를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호(200, 300) 증폭 방법은, 제2의 2차 항체(240, 340)에 적어도 하나의 제1의 2차 항체(230, 330)를 결합하는 단계(450 단계)를 더 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 330)를 결합하는 단계(450 단계) 및 제2의 2차 항체(240, 340)를 결합하는 단계(440 단계)는, 반복적으로 수행될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제2의 2차 항체(240, 340)들은, 형광 분자(241, 341)들로 각각 표지될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 1차 항체(210, 310)의 호스트와 상이하고, 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 1차 항체(210, 310)의 호스트와 동일할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 타겟은 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트와 동일하고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 제2의 2차 항체(240, 340)들의 타겟과 동일할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호(200, 300) 증폭 방법은, 상이한 타입들의 복수의 표적 단백질(p)들에 대해, 동시에 수행될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 형광 신호(200, 300) 증폭 방법은, 1차 항체(210, 310), 형광 분자들, 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들은, 타입들의 각각에 대해, 상이할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 타입들 중 하나에 대한 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들은, 타입들 중 다른 하나에 대한 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들과 직교할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 타입들 중 하나에 대한 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들은, 타입들 중 다른 하나에 대한 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들에 대해 정제되어 준비될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 표적 단백질(p)이 라민 B1인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 쥐이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 생쥐일 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 표적 단백질(p)이 비멘틴인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 닭이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 염소일 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 표적 단백질(p)이 튜블린인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 토끼이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 당나귀일 수 있다.
다양한 실시예들에 따른 형광 신호(200, 300) 증폭 방법은, 각 표적 단백질(p)에 결합되는 1차 항체(210, 310)를 형성하는 단계, 및 1차 항체(210, 310)에 대해, 형광 분자(231, 331)들로 각각 표지된 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제1의 2차 항체(230, 330)들에 결합되는 제2의 2차 항체(240, 340)들로 이루어지는 2차 항체 쌍들(220, 320)을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 2차 항체 쌍들(220, 320) 중 적어도 하나는, 제1의 2차 항체(230, 330)를 통해 1차 항체(210, 310)에 결합될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 2차 항체 쌍들(220, 320)은, 1차 항체(210, 310)로부터 복수의 계층들을 이루면서 결합될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 상위 계층의 2차 항체 쌍은, 제1의 2차 항체(230, 330)를 통해 하위 계층의 2차 항체 쌍의 제2의 2차 항체(240, 340)에 결합될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제2의 2차 항체(240, 340)들은, 형광 분자(241, 341)들로 각각 표지될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 1차 항체(210, 310)의 호스트와 상이하고, 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 1차 항체(210, 310)의 호스트와 동일할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 타겟은 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트와 동일하고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 제2의 2차 항체(240, 340)들의 타겟과 동일할 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 1차 항체(210, 310), 형광 분자들, 제1의 2차 항체(230, 330)들 및 제2의 2차 항체(240, 340)들은, 표적 단백질(p)의 타입에 따라, 상이하게 결정될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 표적 단백질(p)이 라민 B1인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 쥐이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 생쥐일 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 표적 단백질(p)이 비멘틴인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 닭이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 염소일 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 표적 단백질(p)이 튜블린인 경우, 1차 항체(210, 310) 및 제2의 2차 항체(240, 340)들의 호스트는 토끼이고, 제1의 2차 항체(230, 330)들의 호스트는 당나귀일 수 있다.
본 문서의 다양한 실시예들 및 이에 사용된 용어들은 본 문서에 기재된 기술을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 해당 실시 예의 다양한 변경, 균등물, 및/또는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 도면의 설명과 관련하여, 유사한 구성 요소에 대해서는 유사한 참조 부호가 사용될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함할 수 있다. 본 문서에서, "A 또는 B", "A 및/또는 B 중 적어도 하나", "A, B 또는 C" 또는 "A, B 및/또는 C 중 적어도 하나" 등의 표현은 함께 나열된 항목들의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다. "제1", "제2", "첫째" 또는 "둘째" 등의 표현들은 해당 구성 요소들을, 순서 또는 중요도에 상관없이 수식할 수 있고, 한 구성 요소를 다른 구성 요소와 구분하기 위해 사용될 뿐 해당 구성 요소들을 한정하지 않는다. 어떤(예: 제1) 구성 요소가 다른(예: 제2) 구성 요소에 "(기능적으로 또는 통신적으로) 연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 상기 어떤 구성 요소가 상기 다른 구성 요소에 직접적으로 연결되거나, 다른 구성 요소(예: 제3 구성 요소)를 통하여 연결될 수 있다.
본 문서에서 사용된 용어 "모듈"은 하드웨어, 소프트웨어 또는 펌웨어로 구성된 유닛을 포함하며, 예를 들면, 로직, 논리 블록, 부품, 또는 회로 등의 용어와 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 모듈은, 일체로 구성된 부품 또는 하나 또는 그 이상의 기능을 수행하는 최소 단위 또는 그 일부가 될 수 있다. 예를 들면, 모듈은 ASIC(application-specific integrated circuit)으로 구성될 수 있다.
다양한 실시예들에 따르면, 기술한 구성 요소들의 각각의 구성 요소(예: 모듈 또는 프로그램)는 단수 또는 복수의 개체를 포함할 수 있다. 다양한 실시예들에 따르면, 전술한 해당 구성 요소들 중 하나 이상의 구성 요소들 또는 단계들이 생략되거나, 또는 하나 이상의 다른 구성 요소들 또는 단계들이 추가될 수 있다. 대체적으로 또는 추가적으로, 복수의 구성 요소들(예: 모듈 또는 프로그램)은 하나의 구성 요소로 통합될 수 있다. 이런 경우, 통합된 구성 요소는 복수의 구성 요소들 각각의 구성 요소의 하나 이상의 기능들을 통합 이전에 복수의 구성 요소들 중 해당 구성 요소에 의해 수행되는 것과 동일 또는 유사하게 수행할 수 있다. 다양한 실시예들에 따르면, 모듈, 프로그램 또는 다른 구성 요소에 의해 수행되는 단계들은 순차적으로, 병렬적으로, 반복적으로, 또는 휴리스틱하게 실행되거나, 단계들 중 하나 이상이 다른 순서로 실행되거나, 생략되거나, 또는 하나 이상의 다른 단계들이 추가될 수 있다.

Claims (19)

  1. 형광 신호 증폭 방법에 있어서,
    각 표적 단백질에 대해, 1차 항체, 형광 분자들로 각각 표지된 제1의 2차 항체들, 및 제2의 2차 항체들을 준비하는 단계;
    상기 표적 단백질에 상기 1차 항체를 결합하는 단계;
    상기 1차 항체에 상기 형광 분자들로 각각 표지된 상기 제1의 2차 항체들 중 적어도 하나를 결합하는 단계; 및
    상기 제1의 2차 항체들 중 적어도 하나에 상기 제2의 2차 항체들 중 적어도 하나를 결합하는 단계
    를 포함하고,
    상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 상기 1차 항체의 호스트와 상이하고,
    상기 제2의 2차 항체들의 호스트는 상기 1차 항체의 호스트와 동일하고,
    상기 제1의 2차 항체들의 타겟은 상기 제2의 2차 항체들의 호스트와 동일하고,
    상기 제1의 2차 항체들의 타겟은 상기 1차 항체의 호스트와 동일하고,
    상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 상기 제2의 2차 항체들의 타겟과 동일한,
    방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 제2의 2차 항체들 중 적어도 하나에 상기 제1의 2차 항체들 중 적어도 다른 하나를 결합하는 단계
    를 더 포함하는,
    방법.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 제1의 2차 항체들 중 적어도 다른 하나를 결합하는 단계 및 상기 제2의 2차 항체들 중 적어도 하나를 결합하는 단계는,
    반복적으로 수행되는,
    방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 제2의 2차 항체들은,
    상기 형광 분자들로 각각 표지된,
    방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1 항에 있어서,
    상이한 타입들의 복수의 표적 단백질들에 대해, 동시에 수행되고,
    상기 1차 항체, 상기 형광 분자들, 상기 제1의 2차 항체들 및 상기 제2의 2차 항체들은,
    상기 타입들의 각각에 대해, 상이한,
    방법.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 타입들 중 하나에 대한 제1의 2차 항체들 및 제2의 2차 항체들은,
    상기 타입들 중 다른 하나에 대한 제1의 2차 항체들 및 제2의 2차 항체들과 직교하는,
    방법.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 타입들 중 하나에 대한 제1의 2차 항체들 및 제2의 2차 항체들은,
    상기 타입들 중 다른 하나에 대한 제1의 2차 항체들 및 제2의 2차 항체들에 대해 정제되어 준비되는,
    방법.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 표적 단백질이 라민 B1인 경우, 상기 1차 항체 및 상기 제2의 2차 항체들의 호스트는 쥐(rat)이고, 상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 생쥐(mouse)이고,
    상기 표적 단백질이 비멘틴인 경우, 상기 1차 항체 및 상기 제2의 2차 항체들의 호스트는 닭(chicken)이고, 상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 염소(goat)이고,
    상기 표적 단백질이 튜블린인 경우, 상기 1차 항체 및 상기 제2의 2차 항체들의 호스트는 토끼(rabbit)이고, 상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 당나귀(donkey)인,
    방법.
  11. 제1 항 내지 제4 항 또는 제7 항 내지 제10 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 증폭된 형광 신호를 통해 이미지를 처리하는 이미지 처리 장치.
  12. 형광 신호 증폭 방법에 있어서,
    각 표적 단백질에 결합되는 1차 항체를 형성하는 단계; 및
    상기 1차 항체에 대해, 형광 분자들로 각각 표지된 제1의 2차 항체들 및 상기 제1의 2차 항체들에 결합되는 제2의 2차 항체들로 이루어지는 2차 항체 쌍들을 형성하는 단계
    를 포함하고,
    상기 2차 항체 쌍들은,
    상기 1차 항체로부터 복수의 계층들을 이루면서 결합되고,
    최하위 계층의 2차 항체 쌍은,
    제1의 2차 항체를 통해 상기 1차 항체에 결합되고,
    상위 계층의 2차 항체 쌍은,
    제1의 2차 항체를 통해 하위 계층의 2차 항체 쌍의 제2의 2차 항체에 결합되고,
    상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 상기 1차 항체의 호스트와 상이하고,
    상기 제2의 2차 항체들의 호스트는 상기 1차 항체의 호스트와 동일하고,
    상기 제1의 2차 항체들의 타겟은 상기 제2의 2차 항체들의 호스트와 동일하고,
    상기 제1의 2차 항체들의 타겟은 상기 1차 항체의 호스트와 동일하고,
    상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 상기 제2의 2차 항체들의 타겟과 동일한,
    방법.
  13. 삭제
  14. 제12 항에 있어서,
    상기 제2의 2차 항체들은,
    상기 형광 분자들로 각각 표지된,
    방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제12 항에 있어서,
    상기 1차 항체, 상기 형광 분자들, 상기 제1의 2차 항체들 및 상기 제2의 2차 항체들은,
    상기 표적 단백질의 타입에 따라, 상이하게 결정되는,
    방법.
  18. 제12 항에 있어서,
    상기 표적 단백질이 라민 B1인 경우, 상기 1차 항체 및 상기 제2의 2차 항체들의 호스트는 쥐(rat)이고, 상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 생쥐(mouse)이고,
    상기 표적 단백질이 비멘틴인 경우, 상기 1차 항체 및 상기 제2의 2차 항체들의 호스트는 닭(chicken)이고, 상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 염소(goat)이고,
    상기 표적 단백질이 튜블린인 경우, 상기 1차 항체 및 상기 제2의 2차 항체들의 호스트는 토끼(rabbit)이고, 상기 제1의 2차 항체들의 호스트는 당나귀(donkey)인,
    방법.
  19. 제12 항, 제14 항, 제17 항, 또는 제18 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 증폭된 형광 신호를 통해 이미지를 처리하는 이미지 처리 장치.

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