JP2002544531A - デジタル画像の変換 - Google Patents
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Abstract
Description
鏡のいずれの場合でも観察用の有機体組織試料およびその他材料の作製において
は、通常、試料に一連の化学処理を施し、最終的に試料を包埋した固形ブロック
を作製する。ブロック作成後、試料の薄い切片を(試料周囲の包埋剤とともに)
固形ブロックから切り出し、この切片をガラススライドまたは他の支持体に載せ
る。その後、包埋剤は必要があれば化学的に除去され、且つ組織切片は種々の有
色色素もしくは蛍光色素もしくは免疫組織化学的な染色法で染色され、または、
インサイチューハイブリダイゼーションを施され、観察に供される。
れている染色法はヘマトキシリンとエオシンによる染色法(H&E法)である。こ
の方法では、組織切片中の核酸およびその他いわゆる「好塩基性」の物質が青紫
に、蛋白質およびその他「好酸性」あるいは「エオシン好性」の物質がピンクに
染色される。この染色法は組織中の全構成要素を調べるための総合的なスクリー
ニング法として世界中で用いられており、このスクリーニング後、必要に応じて
微生物または神経突起など特定の組織構成要素に親和性を持つ特殊な染色法を用
いることによって、染色された組織切片上にそれらの形状が強調される。
ブロック(en bloc)染色法が導入されている。ブロックから切片を切り出し、
透過型顕微鏡で観察するか、またはブロック面鏡検法もしくは表面イメージング
鏡検法と呼ばれる方法によってブロックのカット面自体を画像化する。米国特許
第4,960,330号を含む後者の方法では、共役もしくは非共役の蛍光色素でエンブ
ロック染色した試料は、保存剤で引き続き浸透して包埋する。保存剤は、ブロッ
ク表面から数ミクロン以上の深さに由来する組織の画像を抑制するよう、不透明
度を高くしたもの、またはその他何らかの処理が施されたもので、広く用いられ
ているのはプラスチックポリマーである。これによって、従来のスライドグラス
上の組織切片に近い、薄い「バーチャル切片」が得られる。
学的組織およびその他の材料の検鏡像を高画質で得られる点で、標準的な明視野
鏡検法に対して利点を有している。スライドグラス作製の必要性がなくなること
により、組織病理学的工程の完全な自動化が可能となり、追加の切片を一枚作製
するごとに発生する費用を抑えることができ、その結果、各試料から得られる情
報量が大幅に増えることになる。
チャル切片は、黒色の背景に対して蛍光染色された試料が有色発光する暗視野画
像であり、この黒色の背景は、試料に浸透し、試料に包埋した不透明のポリマー
である。これとは対照的に、大多数の外科病理学的検査室およびその他医療関連
の顕微鏡診断施設で行われている検鏡を含む従来の光透過型検鏡法では、薄い組
織切片およびその他の検査材料は標準的な非蛍光性色素で染色され、白色光また
は白色光に近い光源からの光を通すため、得られる像は明視野像であり、背景は
組織像より暗くなることはなく、むしろ明るくなる。
ック表面から取得された暗視野像を、明視野検鏡法で得られる従来の像に変換お
よび表示することが好ましい。
視野像を生成する方法、および、得られた暗視野像をコンピュータのモニタ上で
観察するため明視野像に変換する方法から成る。その過程には、暗視野データを
明視野形式に変換するためにデジタル参照テーブル(digital lookup table)ま
たは他の計算機的手段を適用する段階、および変換した情報を表示する方法を含
む。好ましくは、画像取得方法はブロック面検鏡法により、画像変換方法はデジ
タルコンピュータによるものとする。
段階、(b)得られた蛍光染色試料から第一の画像を生成する段階、および(c)
デジタルプロセッサを用いて第一の画像を変換し、非蛍光色素で染色した試料の
像を模倣した第二の画像を生成する段階を含む画像生成法を特徴とする。
、第一の画像に参照テーブルを適用する。好ましい態様において、変更には、参
照テーブルの反転、または、非蛍光色素で染色した試料の色範囲に似せるための
、第一の画像もしくは第二の画像の色範囲の調整を含む。
は生物学的な試料が好ましい。
第一の色素で染色した試料の第一の画像と、第二の色素で染色した試料の第二の
画像とを生成する段階、および(c)デジタルプロセッサを用いて第一および第
二の画像を変換し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した試料の像を模倣し
た第三の画像をつくる段階を含む画像生成法を特徴とする。
第一の画像と、色素で染色した試料の第二の画像とを生成する段階、および(c
)デジタルプロセッサを用いて第一および第二の画像を変換し、ヘマトキシリン
およびエオシンで染色した試料の像を模倣した第三の画像を生成する段階を含む
画像生成法を特徴とする。
料中のひとつの色素から第一の画像を生成する段階、および、(c)デジタルプ
ロセッサを用いて第一の画像を変換し、一種類の非蛍光色素で染色した試料の像
を模倣した第二の画像を生成する段階を含む画像生成法を特徴とする。
階、(b)蛍光色素のサブセットで染色した試料の像を模倣した第一の画像を生
成する段階、および(c)デジタルプロセッサを用いて第一の画像を変換し、一
種類またはそれ以上の非蛍光色素で染色した試料の像を模倣した第二の画像を生
成する段階を含む画像生成法を特徴とする。
を用いて生成する。本発明で用いられる色素には、異染性色素(たとえばアクリ
ジンオレンジ)を含めることができる。
る。典型的な共役色素としては、蛍光結合抗体および蛍光DNAプローブがあるが
、これらに限定されることはない。
を目的に固体に変化させる一種類の液体あるいは一連の複数の液体で組織を処理
することを意味する。
且つその周囲を、硬化させて中に組織を含んだブロックを作製するためのある物
質(通常は浸透に用いたものと同じ物質)で満たすことを意味する。包埋物質は
、したがって、固い支持体となり、切り出しの作業を容易にする。
ックから切り出すことを意味する。
材料を処理することを意味する。
の光で励起されたときに自然に蛍光を発する色素)または共役色素(すなわち、
試料に結合し、直接的もしくは間接的に蛍光色素に付着する分子)を用いて行う
。共役色素の例としては次のものがあるが、これらに限定されることはない:す
なわち、(i)抗原に結合する一次抗体、および、蛍光色素を含み一次抗体に結
合する二次抗体、ならびに、(ii)共有結合した蛍光色素を有する分子。「標準
的な」または「明視野の」染色では、通常、非蛍光性の色素が用いられ、明るい
背景または白色の背景を持つ像が得られるのに対して、蛍光染色では背景が黒色
の像が得られる。同一の色素が、蛍光検鏡法と標準的な検鏡法のいずれにも有用
でありうることが知られている。
れらの化合物は、大多数の蛍光色素と同様に特定波長の光を吸収し、それより長
い、単一または複数の波長で発光する。異染性色素のスペクトル特性は標的分子
への近接度に大きく影響され、発光波長が変化する。したがって、これらの色素
は特定の種類の材料と結合した場合に色が変わる。場合によっては、異染性色素
は標的に結合したときにのみ発光し、それ以外の場合は不可視となることもある
。典型的な異染性色素のひとつはアクリジンオレンジである。他の異染性色素も
当業者に知られており、「コーンの生物学的染色法(Conn's Biological Stains
)」(Williams & Wilkens 9th Ed. 1977)(参照として本明細書に組み入れら
れる)に記載されている色素、および、モレキュラープローブス(Molecular Pr
obes)社(オレゴン州、ユージーン)より入手可能な色素を含むが、これらに限
定されることはない。後者の色素の大多数は公開されている米国特許の対象とな
っており、それはすべて参照として本明細書に組み入れられる。モレキュラープ
ローブス社の異染性色素は蛋白質の標識に適しており、ベンゾキサジアゾール誘
導体、ナフタレン誘導体、およびピレン誘導体の3つのカテゴリーに分類されて
いる。
効率的に生成し、明視野画像として最も有用かつ従来の形式で表示することが可
能となる。
求の範囲により理解されると思われる。
試料の像を取得し、且つその像を、一種類あるいはそれ以上の明視野用色素で染
色した試料の像を模倣した第二の画像に変換する方法を発見した。第一の画像を
第二の画像に変換する方法においては、第一の画像に対して参照テーブルを適用
することができる。
れる、変換値を集めたものを用いる。参照テーブルは色値の一対一変換を記述し
た色値関係のリストで構成され、且つ、通常、その画像システムの使用者が設定
した一定の基準に基づいて計算ができるものになっている。デジタル画像の変換
手段としては、各データ要素に数式を適用する変換関数などの一般的な方法が含
まれる。例としては、ある一定の値からすべてのデータ要素を減算することによ
って実現される画像の色反転変換がある。
基づいて算出した高次の結果にしたがって変更することもできる。たとえば、あ
る画像中の対象となる部分の各データ要素の値を合計し、その合計値を用いて、
その部分を表示する際の総合的な色を決定することができる。このような高いレ
ベルの計算を用いて模擬染色を決定するための方法は、本発明において「コンピ
ュータによる染色」と呼ぶ。
視野画像の各チャネル(たとえば、赤チャネル、緑チャネルなど)に適用される
。画像を暗視野画像から明視野画像に変換する手順において、ソースとなる暗視
野の各サンプル値(たとえば各ピクセル)は、明視野画像での対応値を確認する
ために参照テーブルを参照する際のインデックスとなる。各チャネルについて得
られた色は、結合され、明視野RGB画像がつくられる。色マッピングの方法は、
たとえば参照として本明細書に組み入れられるJ.C.ラス(J.C.Russ) (1995) 「
画像処理ハンドブック(The image processing handbook)」、第2版、CRC Pres
s, Ann Arbor, MIに説明されている。
とつの値を入力することによって作成される。たとえば、ソース(すなわち暗視
野画像)のレンジが0〜255(0が黒、および255が白)である場合、全256の値を
持つテーブルが作成される。テーブルの各値からは、以下のようにして対応する
色が得られる。 H = ターゲット色の色相 S = ターゲット色の彩度 B = ターゲット色の明度 * I/最大サンプル値(たとえば、8ビット=255
) ここで、Iは計算中の参照テーブル値のインデックスであり、且つその範囲は0か
ら最大サンプル値(たとえば255)である。算出されたHSBカラーはRGB色空間に
変換され、参照テーブルの位置Iに挿入される。
表したものとなる。テーブル中の色の範囲は、黒から明度を増しながら最後の値
までとなり、この最後の値は変更されないターゲット画像の色である。
て暗い赤から明るい赤になってゆき、最後の値は原色の赤になる。
加算して(たとえば、赤に赤、緑に緑、青に青)、あるRGBカラーを得る。値は
、最大サンプル値(たとえば8ビットなら255)を超えないように制限される。次
に、各RGB値に明度値を加算する。この値はもとの暗視野画像の「暗度」を取得
してそれを以下のように変換することによって得られる。 最大サンプル値−Maximum(ソースチャネル1、ソースチャネル2、・・・
)
暗度を新しいRGBカラーの各成分に加算して、その分だけ明度を増加させる。そ
の結果、非常に暗かったソースのサンプル値は非常に明るくなる。
ラーの参照テーブルは上述のように作成されるが、テーブル中の各値が対応する
色は次のようにして得られる。 H = ターゲット色の色相 S = ターゲット色の彩度 * I/最大サンプル値(たとえば、8ビット=255) B = ターゲット色の明度
される。
のとなる。テーブル中の色の範囲は、白から彩度を増しながら最後の値までとな
り、この最後の値は変更されないターゲット画像の色である。
て彩度の低い赤(ピンク)から彩度の高い赤になってゆき、最後の値は原色の赤
になる。
る。これらの色は以下のように混色される。
CMYは減法的な色空間である。各CMYカラーは加算される(たとえば、各ソースチ
ャネルからのシアン値が加算されて単一のシアン値が得られる、各ソースチャネ
ルからのマゼンタ値が加算されて単一のマゼンタ値が得られる、など)。本明細
書で説明しているように、値は許容される最大値(すなわち最大サンプル値)ま
でに制限するのが望ましい。合計を算出したあと、得られたCMYカラーをRGB色空
間に再変換する。
する場合には、黒からターゲット色へ(加法色空間の場合)、または白からター
ゲット色へ(減法色空間の場合)の増加は線形である。当業者には、非線形また
は非連続のものをも含めた他の参照テーブルもまた本発明に有用であることが理
解されるであろう。
た試料の像を計算機的手段により生成するひとつの方法は、種々の組織構造に特
異的に結合する複数の蛍光色素を混ぜた混合物か、または、試料に用いたときに
2色以上の色を呈する単一の蛍光色素(すなわち、異染性色素)で試料を染色す
ることである。本明細書で説明している画像変換法により、一種類またはそれ以
上の暗視野用色素で染色した試料の暗視野像を、一種類またはそれ以上の明視野
用色素で染色した試料の像を模倣した画像に変換することができる。
色し、このとき、色素のうちひとつは菌体に対して高い親和性を示すものとし、
もうひとつは組織の構成成分に対して高い親和性を示すものとする。これらの色
素で染色した試料の暗視野像では、菌体が組織から識別できる色で標識される。
(本明細書で説明しているような標準的な方法を用いて)明視野像に変換する際
、元の像の色特性の違いが、菌体を含んだ組織の明視野像に変換される。
像が、そのグレースケール明暗度に応じて異なる明視野色を割り当てることによ
って多色の明視野像に変換される。たとえば、使用した単色色素に対して菌体が
組織より高い親和性を示す場合、明暗度の違いを利用して、明るく染色された部
分(すなわち菌体)に対してある明視野色のセットを、薄く染色された部分(す
なわち組織)に対して別の色のセットを割り当てることができる。また、サイズ
など他の特徴的な特性も、明視野色を計算機的手段で割り当てるのに利用するこ
とができる。
そのうち一種類あるいは一組の色素である。フィルターキューブまたは励起法を
変えれば同じ試料の別の色素を画像化することができる。したがって、ひとつの
試料は、一度に画像化されるより多い種類の色素を含んでいてもよい。
フィルターキューブを用いて互いに区別することができる。または、スペクトル
分析もしくはその他の高次の分析を用いて、それぞれの色素を区別することもで
きる。組織を画像化するこうした方法は、レベンソン(Levenson, R.M.)および
ファーカス(Farkas, D.L.)(1997) Proc. SPIE, 2983: 123-135; レベンソン(
Levenson, R.M.)およびヤン(Young, D.A.)(1991): ダン(M.J. Dunn)(編),
「心胸郭外科、二次元電気泳動における国際会議要旨集(Proc. International
Meeting on Two-Dimensional Electrophoresis. Dept. of Cardiothoracic Surg
ery)」、国立心肺研究所(National Heart and Lung Inst.)(UK), London, UK
;ならびにレベンソン(Levenson, R.M.)、ブリンクマン(Brinckmann, U.G.)
、アンドロフィー(Androphy, E.)、シラー(Schiller, J.)、トゥレク(Ture
k, L.)、シン(Chin, M.)、ブロカー(Broker, T.R.)、コウ(Chow, L.T.)
、およびヤン(Young, D.A.)(1987):スティンバーグ(B.M. Steinberg)、ブラ
ンズマ(J.L. Brandsma)およびタイクマン(L.B. Taichman)(編)、「癌細胞V
、パピローマウィルス(Cancer Cells V. Papillomavimses)」Cold Spring Har
bor Press, New York, pp. 137-144に説明されており、これらはすべて参照とし
て本明細書に組み入れられる。
。
発する蛍光色が、結合した組織要素の化学組成によって変化する蛍光色素である
。たとえば、アクリジンオレンジで染色した場合に核酸は黄色に発光し、同時に
細胞質蛋白質は緑色に発光する。このように、アクリジンオレンジで染色した組
織および他の材料における組織要素の色の差異は、作製される特定の色が異なる
点とアクリジンオレンジが蛍光色素であるため明視野像ではなく暗視野像が得ら
れる点とを除けば、H&E染色法でみられる色の差異と同様になる。
に、明視野のH&E染色像の表示データを作製するアルゴリズムは以下のとおりで
ある。入力画像はカメラによってデジタル化され、黒、または赤と緑の値のみを
持つピクセルになる。出力ピクセルはRGB像を示し、ヘマトキシリンおよびエオ
シンで染色した明視野像として表示される。
4、など) Hr, Hg, Hb = ヘマトキシリン明視野色のRGBインデックス Er, Eg, Eb = エオシン明視野色のRGBインデックス Dr = Pmax - max(Sr, Sg) + (Sr/Pmax)*Hr + (Sg/Pmax)*Er Dg = Pmax - max(Sr, Sg) + (Sr/Pmax)/Hg + (Sg/Pmax)*Eg Db = Pmax - max(Sr, Sg) + (Sr/Pmax)/Hb + (Sg/Pmax)*Eb
染色した組織の像に適用することで、アクリジンオレンジ染色組織像からH&E染
色組織像を模倣した像への変換が可能になる。
ばらつきのために、各成分で染色される組織の色相および彩度には変動があるこ
とが理解されると思われる。したがって、アクリジンオレンジで染色された試料
の暗視野像を、H&E染色による明視野像を模倣したものに変換するには2つ以上
の参照テーブルを用いることもできる。付録Aに、アクリジンオレンジ染色試料
の暗視野像をH&E染色試料の明視野像に変換するのに適した、特定されたターゲ
ット染色の色の参照テーブルを生成するプログラムのコンピュータコードを(C
言語で)示す。
光色素の混合物をアクリジンオレンジの代わりに使用し、この混合物で得られる
暗視野像を標準的なH&E染色法の明視野像を模倣したものに変換するよう作成さ
れた参照テーブルまたは他の方法を用いることができる。蛍光色素混合の一例と
して、ヨウ化プロピジウム(核酸染色用)とエオシンY(蛋白質染色用)の組み
合わせがある。一例では、癌性組織の生検を、核酸に定量的に結合する黄色の蛍
光色素であり腫瘍細胞の核酸含有量を調べるフローサイトメトリー検査でDNAの
定量に広く用いられているヨウ化プロピジウムで処理する。同じ組織をエオシン
Yでも染色して、組織中の非核成分を緑色に染める。本発明にしたがって、この
組織試料から取得した暗視野像を、背景が白、組織中の核以外の部分がピンク、
核が青となる明視野像に変換する。または、それぞれの核の蛍光強度を定量的に
測定して核のDNA含有量を概算し、色参照テーブルもしくは他の方法によってそ
の蛍光強度と核の明視野中の色を関連づけ、それぞれの核がDNA含有量に応じて
異なる色で表示されるようにすることで、DNA含有量と関連した「コンピュータ
染色」を実現する。
複数の単色色素で染色した試料の像を模倣した多色像に変換する。一例としては
、菌体を含む組織試料に対して、青と白の色素であるFluorescence Brightener
28の使用がある。Fluorescence Brightener 28は菌体に強く結合して、感染した
生物の細胞など他の構造物よりも暗視野内で菌体をはるかに目立たせる。したが
って、256段階のグレーを表すピクセル(ピクセル値0が黒、およびピクセル値25
5が白)で構成された像において、菌体を表すピクセルは高いピクセル値を持つ
ことになる。
のピクセル値はXより小さくなる。色参照テーブルは、より明るく染色された菌
体(すなわち、値がXより大きいすべてのピクセル)を第一の明視野色、たとえ
ば暗い灰紫に変換し、組織中の残りの構造(すなわち、値がX〜0のすべてのピク
セル)を第二の明視野色、たとえば薄緑に変換するように作成する。同様に、黒
の背景(値が0のすべてのピクセル)を白に変換して、明視野像を作製する。こ
の色の組み合わせによって、外科病理学の検査室で組織切片中の菌体染色用に広
く採用されているグロコット・メテナミン銀染色に近い像が得られる。
者には、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の精神および範囲から逸脱す
ることなくその形式および詳細に様々な変更がなされうることが理解されるであ
ろう。当業者には、日常的な実験だけを用いても、本明細書中に具体的に説明さ
れた本発明の特定の実施例に対して多くの同等なものがあることが認識され、あ
るいは確かめられるであろう。そのような同等物は特許請求の範囲の範囲内に含
まれるものと意図される。
ことを含む、本発明の方法の略図である。
Claims (15)
- 【請求項1】 以下の段階を含む、画像生成方法: a)蛍光色素を用いて試料を染色する段階; b)得られた蛍光染色試料の第一の画像を生成する段階;および c)該第一の画像を、非蛍光色素で染色した該試料像を模倣した第二の画像に変
換するために、デジタルプロセッサを使用する段階。 - 【請求項2】 第一の画像がブロック面顕微鏡を用いて生成される、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項3】 第一の画像を第二の画像へと変換する段階が、該第一の画像
への参照テーブルの適用を含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 試料が少なくとも2種類の蛍光色素で染色される、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項5】 試料が生物学的試料である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項6】 以下の段階を含む、画像生成方法: a)第一および第二の蛍光色素を用いて試料を染色する段階; b)該第一の色素で染色された該試料の第一の画像と、該第二の色素で染色され
た該試料の第二の画像とを生成する段階;および c)該第一の画像および該第二の画像を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色
した該試料像を模倣した第三の画像に変換するために、デジタルプロセッサを使
用する段階。 - 【請求項7】 第一および第二の画像がブロック面顕微鏡を用いて生成され
る、請求項6に記載の方法。 - 【請求項8】 以下の段階を含む、画像生成方法: a)蛍光色素を用いて試料を染色する段階; b)該色素で染色された該試料の第一の画像と、該色素で染色された該試料の第
二の画像とを生成する段階;および c)該第一の画像および該第二の画像を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色
した該試料像を模倣した第三の画像へと変換するために、デジタルプロセッサを
使用する段階。 - 【請求項9】 第一および第二の画像がブロック面顕微鏡を用いて生成され
る、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 色素が異染性色素を含む、請求項8に記載の方法。
- 【請求項11】 異染性色素がアクリジンオレンジを含む、請求項10に記
載の方法。 - 【請求項12】 以下の段階を含む、画像生成方法: a)複数の蛍光色素を用いて試料を染色する段階; b)該試料中の該蛍光色素のうち一種類によって第一の画像を生成する段階;お
よび c)該第一の画像を、一種類の非蛍光色素で染色した該試料像を模倣した第二の
画像へと変換するために、デジタルプロセッサを使用する段階。 - 【請求項13】 第一の画像がブロック面顕微鏡を用いて生成される、請求
項12に記載の方法。 - 【請求項14】 以下の段階を含む、画像生成方法: a)重複する励起スペクトルおよび発光スペクトルを有する複数の蛍光色素を用
いて試料を染色する段階; b)該複数の蛍光色素のサブセットで染色した該試料に模倣した第一の画像を生
成する段階; c)該第一の画像を、少なくとも一種類の非蛍光色素で染色した該試料像を模倣
した第二の画像へと変換するために、デジタルプロセッサを使用する段階。 - 【請求項15】 第一の画像がブロック面顕微鏡を用いて生成される、請求
項14に記載の方法。
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