CN101874206B - 通过间接免疫荧光测定的终点效价确定方法及其评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过间接免疫荧光测定确定在人血清中抗细胞核和细胞质抗原抗体的终点效价确定方法。本发明进一步涉及通过间接免疫荧光测定确定人血清中抗细胞核和细胞质抗原抗体的体外诊断试剂盒,以及在所述方法框架内评估和确定终点效价的计算机程序。
Description
描述
本发明涉及通过间接免疫荧光测定确定在人血清中抗细胞核和细胞质抗原的抗体的终点效价确定方法。本发明进一步涉及通过间接免疫荧光测定确定人血清中抗细胞核和细胞质抗原抗体的体外诊断试剂盒,以及在所述方法框架内评估和确定终点效价的计算机程序。
发明背景
自身免疫疾病是由免疫系统对于机体自身组织过度反应所致疾病。免疫系统将机体自身组织错误地检测为待攻击的外来物质。由此产生严重的炎症反应,可导致受累器官的损害。T细胞负责检测外来物质。T细胞在胸腺中被训练以仅停靠在MHC分子上及耐受机体自身物质。在自身免疫疾病中,这些细胞表现为与其性质相反。代替防御进入体内的外来物质,它们攻击机体自身结构。生物体生命所必需的器官和组织被免疫系统识别为外来物质。免疫系统命令其全部力量对抗这些结构,包括细胞和体液防御反应,导致自身抗体产生。这些器官和组织因此随着时间的推移而丧失其功能。本发明因此涉及自身免疫疾病的诊断和及随后的治疗。
原则上,可以通过检测自身抗体谱(Profilen)对自身免疫疾病进行血清学鉴定。大多数这些抗体针对细胞核和细胞质抗原。抗核抗体(ANA)主要与风湿性疾病相关。一些ANA是疾病特异性的,并且用作诊断标记。这种抗体包括例如抗如下物质的抗体:
·系统性红斑狼疮(SLE)中的双链DNA(ds-DNA)和Sm抗原,
·硬皮病中的纤维蛋白、弥漫性硬皮病中的拓扑异构酶I(ScI-70)、CREST病中的着丝粒(ACA),
·多肌炎中的组氨酰-tRNA-合成酶(Jo-1)
·多肌炎与硬皮病之间重叠的PM-ScI。
在一些疾病中发现具有不同的流行性(unterschiedlicher)的ANA。这些包括:SLE、药物治疗引起的狼疮以及慢性营养毒性肝病中的抗组蛋白抗体;SLE和Sharp综合征(MCTD:混合结缔组织病)中的抗RNP抗体;以及SLE和综合征中的抗-SS-A(Ro)和抗-SS-B(La)抗体。抗-M2型抗线粒体抗体(AMA)与线粒体的α酮酸脱氢酶复合物的蛋白质反应,且是慢性胆汁郁积性肝病原发性胆汁性肝硬化(PBC)的特征性标记。
最早的ANA和AMA的检测方法是免疫荧光检测法(IFT),其中将冷冻的组织切片或者单细胞用作基质。在这种方法中,待检测的抗体的不同物种特异性是基本准则。对于一些人抗体,可以示出其只是与人或灵长类动物的组织反应,而其它自身抗体以物种非特异性方式与来自大鼠、小鼠、兔或者豚鼠的组织切片反应。各个抗原在其系统发生方面彼此不同。更多的物种非特异性抗原在进化过程中保持更强的保守性,因此在更不太相关的物种中发现。然而,当使用HEp-2细胞时,不是所有的动物细胞均适于检测特异性自身抗体这个缺点可以被忽略。
所谓的HEp-2细胞是指人喉上皮细胞系,其对于针对核抗原的大多数人自身抗体(ANA/ENA)呈现出高特异性(Hollingworth et al.,Clin.Diagn.Lab.Immunol.Vol.3,1996 374-377)。系统性风湿性炎症疾病如系统性红斑狼疮(SLE)及其变异、进行性系统性硬化症(PSS)、原发综合征、皮肌炎、Sharp综合征(混合结缔组织病-MCTD)或者类风湿性关节炎(RA)均特征在于出现许多针对细胞核和细胞质成分的自身抗体。尽管这些自身抗体的作用还未充分阐述,但是其可以用作除了活性参数之外的多种临床谱(clinical profile)的标记(Tan E.M.,Adv Immunol 1982,33:167-240;Tan E.M.,Adv Immunol.1989,44:93-151)。
目前自身抗体诊断中的一种合适方法是所谓的间接免疫荧光测定法。在HEp-2细胞上进行的免疫荧光测定是一种确定抗核抗体(ANA)的灵敏的筛选方法,其除了识别荧光参数之外,还提供了特异性潜在抗原和相关疾病的证据(Moore et al.,Cancer Res.1955,15:998-602;Weller et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1954,86:789-794)。在所述间接免疫荧光测定中,人上皮细胞系的HEp-2细胞用作基质,其对于大多数针对核抗原的人自身抗体(ANA/ENA)均具有高灵敏性。目前许多厂商可以提供HEp-2细胞(人上皮细胞)(例如INOVA Diagnostics,San Diego,USA;Kallestadt,Chaska,USA;Immuno Concepts,Sacramento,USA)。
定性和半定量确定ANA的间接ANA HEp-2免疫荧光测定如下所述进行:在第一个反应步骤中,稀释的患者样品和对照中的抗体与固定在玻片上的HEp-2细胞的抗原特异性反应。在室温保温30分钟之后,通过洗涤步骤除去未结合的成分。在第二个反应步骤中,结合的抗体与偶联于异硫氰酸荧光素(FITC)的抗人抗体(IgG和轻链特异性抗体)特异性反应。在室温保温30分钟后,通过进一步的洗涤步骤从所述与固相结合的免疫复合物中除去过量的缀合分子。在覆盖之后,将该玻片置于荧光显微镜下(激发波长490nm,发射波长520nm)手工读取。根据HEp-2细胞中所述抗原的组织学排列检测特异性荧光模式。
间接免疫荧光测定的最显著的问题之一是在HEp-2细胞上自身抗体诊断中荧光光学成像的评估。在目前自身抗体诊断中,一种使用HEp-2细胞的自动化方法呈现出如下特征:通过荧光显微镜和数码相机捕获图像的系统,其包含自动图像分析及确定荧光模式的描述特征,自动分类荧光模式以及在实验室数据系统上输出识别的模式。例如,具有相机和标准PC的荧光显微镜作为捕获单元。得自测量的荧光模式使得目前可以识别7种不同的基本模式(均质型、核仁型、细斑点型、粗斑点型、着丝粒型、周边型、多核点型)。
这种系统例如在DE 198 01 400 C1中描述。DE 198 01 400 C1描述了对HEp-2细胞模式进行自动识别、性质描述和解释的方法和系统。这种方法和相应的系统用以检测自身免疫疾病,从而解释在二维图像捕获和数字化中出现的HEp-2细胞,以及图像背景中切片的HEp-2细胞的分布,众多不连续图像类的分类,各个物体的像素总和,物体特征的确定,细胞模式对比及细胞模式的展示和/或存档以及指派的类别关系。DE 198 01 400 C1所述系统由记录设备和图像分割设备、图像类分类设备、特征鉴定设备以及细胞模式对比设备组成。所述装置依次包含和连接于数据处理计算机中。EP 1 733 333 B1描述了相似系统。
前述方法基于终点滴定原理,这是确定血清中抗体量的半定量方法。在这种方法中,使用恒定体积检测系列稀释的血清以及因此系列稀释的抗体。结果以其中免疫荧光模式仍可见的最高稀释倍数的倒数值表示。这种方法的问题是定性阳性检测结果单独不提供或者不允许有根据的诊断报告。表示终点效价的血清滴定的半定量确定仅可提供诊断性相关报告。
然而,必须说明的是临床诊断不是没有问题的。这是因为接近10%的普通人群可呈现出ANA。ANA的出现依赖于患者的年龄和性别,随着年龄的增加频率增加。上了年纪的人具有低效价而无临床症状的阳性结果因此可看做是正常结果。健康的年轻人因此通常是ANA阴性的。经历皮质类固醇治疗的SLE患者也可以是ANA阴性的。ANA也可以出现在具有结缔组织病的患者的亲属中,其随后也可发病。
目前根据美国亚特兰大疾病控制和预防中心(CDC)的如下建议(Lyerlaand Forrester:The Immunofluorescence (IF) test.In:Immunofluorescencemethods in virology,USDHHS,Georgia,1979,71-81),基于各个荧光物体的不同荧光强度对荧光模式的评估分类:
4+=最大荧光,亮黄-绿色
3+=略低的亮黄-绿色荧光
2+=清楚但暗黄色-绿色荧光
1+=非常微弱的受抑制的荧光
然而荧光的强度不反映抗体浓度。各种显微镜中的光镜(Optik)、滤光器和光源的不同可导致一个步骤以上的荧光强度不同。在这方面,产生所谓的“阴性”和“阳性”结果。当HEp-2细胞呈现荧光小于1+及不存在可确定模式时,该样品稀释液被评定为“ANA阴性”。当HEp-2细胞除了清晰可确定模式之外还呈现荧光为1+或之上时,该样品稀释液被评定为“ANA阳性”。
因此滴定终点的确定也依赖于荧光显微镜的类型和条件,除了观测者的主观判断之外还依赖于物镜的放大倍数。污染细菌的样品或者洗涤缓冲液可导致细胞基质的非特异性着色。
在半定量滴定中,其中存在1+荧光信号的最后稀释倍数作为结果。然后将这个滴定倍数作为血清终点效价。所述效价是是稀释倍数的倒数值。在由疾病控制和预防中心(CDC)推荐的四倍系列稀释中,滴定终点可以如下推断:
1∶40=3+
1∶160=2+
1∶640=+/-
1∶2560=-
因此推断的效价是1∶320。
作为这个评估的结果,认为40和80的效价是低阳性但临床不相关,认为160和320的效价是中等效价,其可以是临床相关的,而640或更高的效价被认为是高阳性且是临床相关的。然而,产生这种类型的系列稀释液以及进行各个检验耗时且成本较高,因此在实施中通常放弃四倍系列稀释,分析限于一或二倍稀释(例如1∶80和1∶320)。
例如,现有技术使用如下系统进行效价确定:所述应用系统除了使用电动X-Y样品工作台之外还含有待分析的制备物,电动荧光显微镜(Z-控制)具有可控相机以及具有相应软件和存取数据库的个人计算机。
第1天:用1∶80(+1∶320)稀释液进入筛选;由医学技术助理(MTA)目测终点效价;
第2天:1∶640、1∶1280稀释,及任选进一步稀释步骤直至在估计的终点效价基础上高或者低1。
如果终点效价不可确定,则需要进一步稀释直至荧光模式不再可见。
这种方法最主要的问题是制备物的荧光强度依赖于许多因素,例如应用的具体相机的灵敏性、染色方案、防脱色介质、激发光,激发光又依赖于光源龄以及应用的光学元件如物镜和滤光器组。
目前使用的方法的缺点可以概括如下:
·仍是由观测者纯主观方式进行荧光模式评估。
·荧光模式的强度有很大波动,因为模式依赖于许多技术参数,例如应用的具体相机的灵敏性,染色方案,防脱色介质,激发光,激发光又依赖于光源龄及光学分析中使用的光学元件。最后,每个观察者对荧光模式的强度和“亮度”的感知不同。因此不应忽略对“亮度评估”的主观影响。
·评估本身被限制于在实验室中可行的并且被认为是大多情况下必须的最小值。这意味着仅进行了不完整测量或稀释系列,然后滴定终点被外推,其根据各个用户的经验或多或少精确。因此这个终点可以位于实际终点效价之上或之下。“正确”结果经常是依赖于机会。
·通过表型特征主观评估荧光模式导致错误率增加,由此甚至导致待被评估图像的错误解释。在诊断实践中,这可以导致自身免疫疾病未被识别,或者假阳性结果被确定和评估。在诊断及临床实践中这可以导致治疗可能被省略或者不成熟治疗,这两种情况均代表对患者的不利情形。
发明详述
要解决的现有技术问题是通过间接荧光免疫测定在自身抗体诊断中提供客观及可再现的荧光模式评估。
除了各个从属权利要求之外,通过独立权利要求的特征解决这个问题。
根据本发明,提供了通过间接免疫荧光测定在人血清中抗细胞核和细胞质抗原抗体确定中的终点效价确定方法,所述方法包括多个步骤,其中患者血清内含有的自身抗体与固定于玻片上的HEp-2细胞、白细胞、绿蝇短膜虫(Crithidia luciliae)和/或组织切片的抗原反应及结合。发生结合的自身抗原的特异性荧光标记,除了使用评估系统中荧光强度经光学记录和评估荧光光学图像之外,随后对结合所述玻片的荧光标记的自身抗体进行荧光显微镜分析。所述评估系统在患者血清中含有的自身抗体与固定在玻片上的HEp-2细胞、白细胞、绿蝇短膜虫和/或组织切片的抗原结合之前通过具有限定效价的至少两个对照血清校准以产生稀释系列,其中还测量激发光的强度。相对于对照血清的效价设置记录的荧光光学图像的荧光强度,从而提供待检测的患者血清的终点效价。待检测的患者血清的终点效价从校准的系统的确定的参考函数中产生,其根据所述模式或模式组合可以是线性或者非线性的。
除了测量激发光的强度之外,本发明的终点效价确定方法特征在于校准阶段。此外,除了患者血清的最初效价之外,最大的有意义的曝光时间(最终曝光时间)以及相机的曝光时间是相关的。
本发明的基本特征是光学校准程序,其用于评估荧光模式。这通过测量荧光的激发光实现,本发明的玻片在其表面上呈现具有限定效价的多个对照血清,由此校准所述光学系统。为了进行校准,对每个限定的对照血清经过多个图像测量平均曝光时间,随后确定相机的终点(饱和点),其得自最大有意义的曝光时间,其相应于对照血清的终点效价的曝光时间。因此待研究的患者血清的终点效价得自最终曝光时间、患者血清的最初效价和相机的曝光时间,优选根据确定的校准函数,其在最简单的线性情况中可以根据如下等式计算:
此外,通过间接免疫荧光测定法确定人血清中抗细胞核和细胞质抗原抗体的体外诊断试剂盒也是本发明的主题,所述试剂盒包括至少:
a.用HEp-2细胞包被的具有施加对照血清和患者血清的多个施加部位的玻片,
b.具有不同的预定效价的对照血清,用以校准免疫荧光显微镜测量和评估系统的光学系统,
c.荧光标记的抗人抗体,用以特异性偶联与HEp-2细胞结合的抗体。
所述试剂盒中要应用的抗人抗体是抗人免疫球蛋白,且可以任选与异硫氰酸荧光素偶联。
本文所述的试剂盒适于进行本发明的方法,以在人血清中抗细胞核和细胞质抗原抗体确定中确定终点效价。所述试剂盒有利地还包括适于其应用的试剂、洗涤溶液及其它溶液。所述试剂盒除了任选提供参考数值表和校准信息之外,优选还提供在体外诊断中每个必需步骤的方案。所述试剂盒进一步含有组合该试剂盒内容物的信息。
本发明还提供了在HEp-2细胞上的免疫荧光测定作为确定抗核抗体(ANA)的灵敏筛选测定法,其通过荧光模式的识别可以报告潜在的抗原及相关的病症。所述试剂盒包含一系列试剂,用以通过自动化评估方式定性和半定量确定人血清中抗HEp-2细胞的细胞核和细胞质中抗原的抗体。
此外,本发明提供了计算机程序,其存储于含有计算机可读数据(程序代码)的计算机可读介质中,在计算机运行期间通过其命令计算机进行本发明的方法。通过计算机程序,可以电子控制和评估在自身抗体诊断中通过间接免疫荧光测定评估荧光光学图像确定人血清中细胞核和细胞质抗原抗体中终点效价确定方法。
本发明还包含这样的设备,其用于通过间接免疫荧光测定在确定人血清中抗细胞核和细胞质抗原的抗体中在自身抗体诊断中的终点效价确定,所述设备包括:
a.利用具有相机的荧光显微镜的图像捕获系统,
b.自动图像分析和确定患者血清的结合的自身抗体的捕获的荧光模式和荧光强度的系统,所述自身抗体与固定于玻片上的HEp-2细胞、白细胞、绿蝇短膜虫和组织切片的抗原反应及结合。
这个设备具有提供图像捕获及同时进行自动图像分析的优势。这样特别减少了现有技术关于数据分析不足的已知缺点。
本发明的方法和基于所述方法的试剂盒适于基于细胞的测定,其中荧光模式和潜在地效价被自动化读取。所述方法适于通过自动化评估定性和半定量确定人血清中抗HEp-2细胞的细胞核和细胞质中的抗原的抗体。除了HEp-2细胞之外,也优选白细胞、绿蝇短膜虫和组织切片。
荧光信号取决于变量,这是为什么加入防脱色试剂如2,3,5,6-四甲基-1,4-苯二胺(C10H16N2)是有利的。
本发明尤其是试剂盒和方法的基本要素是待检测的“细胞+缀合物”保持恒定。所述缀合物(=着色剂+抗体)通过防止着色剂褪色(防脱色)的物质保持稳定。优选使用2,3,5,6-四甲基-1,4-苯二胺(C10H16N2)。所述基本技术参数(荧光滤光器、相机、物镜)也是常量。因此仅曝光强度可波动,因此其在预测效价时进行测量(=测量激发光)。所述技术的单一变量因此是光源,这也解释了为什么要测量荧光的激发光,因为荧光激发和荧光发射彼此相关。抗体浓度(效价)因此得自血清图像的曝光时间。
除了快速且有效成本地获得血清的终点效价之外,本发明的优势因此是客观确定终点效价。可以将本发明的系统普遍应用于各个测量系统。此外,可以使用不同种类的制备物(该系统可普遍应用于不同制备物如细胞、单细胞或者组织切片)。此外,通过本发明可以节约技术和财政资源。
进一步的有利方面在所附权利要求书中描述。本发明通过实施例和附图得以更清晰地描述,但是本发明非限于本文揭示的实施例。图1-4证实不同的校准曲线。
实施例
通过附图和实施例试图更清晰地描述本发明,但是本发明非试图限于本文揭示的实施例。
I.准备及实施测量。应用如下方法:
1.使用一些对照血清校准荧光光学元件。
2.在室温将患者血清用吸量管滴在包被玻片的指定施加部位,在湿润保温室中在室温保温30分钟。
3.将该玻片用PBS溶液漂洗,以及在染色槽中在新鲜制备的PBS中洗涤2次,每次5分钟。
4.将该玻片用缀合溶液覆盖,在具有紫外光防护的湿润保温室中在室温保温30分钟。
5.重复步骤3。
6.将该玻片用盖玻片覆盖,不留气泡,在荧光显微镜下测量。
II.校准
图2示出用第一种校准血清1校准,由此获知终点(640)。在最简单情况中,测量的滴定出的血清的曝光时间的回归是直线(Y=mx+b),其中m是斜率,b是与Y轴的交点。更复杂的曲线可以根据下式计算:
由于已知校准血清的终点,因此应仅包括向上直至回归终点的测量点,因为超过此点仅组织的自身荧光被测量。
图3示出具有已知终点(640)的校准血清1(均质型)与也已知其终点(1280)的校准血清2(斑点型模式)的相关性。根据所述模式和特异性(线性斜率或者指数或者S形)可以产生不同校准血清的不同曲线形状。每个校准血清均具有不同的抗体特异性(均质模式,着丝粒模式,斑点模式等(见下文))。在测量期间确定所述模式,选择校准曲线以及将稀释效价引入校准曲线中计算血清终点效价点。
III.血清效价评估
使用1∶80最初效价进行HEp-2终点效价评估。
如下校准所述“校准玻片”(见实施例1,点1):将1∶640已知效价的第一种血清以8倍稀释度施加于玻片上的8个孔中,曝光并通过荧光显微镜测量。在不同曝光时间测量荧光强度。这样产生如下系列测量结果:
表1:玻片的校准
通过从孔1至5的值的回归确定所述函数的原形(见图1;Y-轴:光强度;X-轴:稀释倍数)。在这个实施例中,最大有意义曝光时间是5000ms,因为随后所述制备物开始出现自身荧光,从而导致误报结果。由于对玻片(校准玻片)描述的校准,因此这个实施例中校准系统的终点已知为5000ms。
然而,具有患者血清的玻片(患者玻片)可呈现不同的稀释倍数。在这种情况中,孔中血清的稀释倍数已知为1∶80。图像自动化曝光,由此免疫荧光信号被相机的传感器完全捕获(见Hiemann et al.Cytometry Part A 69A(2005))。测量500ms相机的平均曝光时间,这个时间通过平均所述孔的单一图像的曝光时间而获得。在实施中,需要回答的问题是:所述血清的预期终点效价是多高?
基于本发明的解决方案提供了这样的结果,即使用线性关系,感兴趣的终点效价可以根据校准系统的确定的参考函数计算。根据上述实施例,通过下式计算:
图4示出使用斑点模式进一步测量患者血清,其中未知终点。使用已知稀释效价80。测量的曝光时间为200ms。由此通过在校准函数中插入数值计算终点效价为~400。
下表2提供了根据本发明从第二个检测系列(线性校准函数)获得的测量结果。
表2
“血清”描述了以内部参考号码提供的血清。
“效价软件”描述了通过本发明的软件确定的效价,使用如上述从已知最初效价、使用的曝光时间和最终曝光时间中获得的比例量。
“效价人”描述了根据目前常用方法通过主观感知荧光强度确定的效价。
“偏差”描述了主观确定的效价步骤中的偏差。因此,+/-1效价步骤的偏差(见上述)不认为是有意义的而且实际上在所应用的技术中不起作用。
因此获得令人吃惊的结果,使用本发明的技术可以更精确地及无失误地确定终点效价。
除了检测原理之外,本发明的方法、基于所述方法的本发明的试剂盒在下文详细描述。
a.本发明的试剂盒含有至少如下内容物:
-用HEp-2细胞包被的具有施加部位的玻片,其任选用保护气体密封,
-洗涤缓冲液/样品稀释PBS缓冲液,pH 7.4±0.1,固体物质,
-与FITC偶联的包含抗人免疫球蛋白(IgG和轻链特异性抗体)的缀合物,
-磷酸盐缓冲的具有防脱色试剂的永久甘油溶液覆盖介质,
-盖玻片,
-阳性对照;具有抗体特异性的阳性人血清,
-阴性对照;阴性人血清,
-读取和评估荧光模式的测量系统。
此外,所述试剂盒中也可包含其它常用辅助设备,如用户自定义的微量加液器(10,100,1000μl),微量加液吸头,样品稀释管,测量圆筒或者量瓶,湿润保温室,洗涤瓶和/或染色槽。
b.稀释的患者样品或者对照血清中的抗体在第一个反应步骤中与固定于玻片的HEp2-细胞的抗原特异性反应。在室温保温30分钟后,通过洗涤步骤除去未结合的成分。结合的抗体在第二个反应步骤中与偶联于异硫氰酸荧光素(FITC)的抗人抗体(IgG和轻链特异性抗体)特异性反应。在室温保温30分钟后,通过进一步洗涤步骤从与固相结合的免疫复合物中分离出剩余的缀合物分子。根据HEp-2细胞中抗原的组织学排列可观测特异性荧光模式。在覆盖之后,在具有自动测量系统的荧光显微镜下读取该玻片(激发波长490nm,发射波长520nm)。
c.为了提取样品,使通过静脉穿刺取自患者的血液凝固,随后通过离心分离血清。在应用于所述测定中之前,将血清置于室温下,任选简单摇动以保证适当均质性。将进行本发明测定的患者样品以1∶80(v/v)比率用PBS缓冲液稀释。除了这个筛选稀释之外,在潜在混合型模式(EASI推荐)情况中可以应用1∶320稀释液以保证效价预测或者更好的评估。从1∶80(v/v)稀释倍数开始,将所述样品在PBS缓冲溶液中进一步4倍稀释,例如100μl样品稀释液+300μl PBS缓冲液。
d.如下所述进行本发明测定:
d.1.将测定试剂置于室温下(RT,20-25℃)。将玻片从其包装中取出,在马上使用之前标记以避免污染。
d.2.用吸液管吸取25μl对照物(25μl稀释的患者血清)。
d.3.将玻片在室温在湿润保温室中保温30分钟。
d.4.用PBS溶液漂洗将该玻片。
d.5.将该玻片在染色槽中用新鲜制备的PBS溶液洗涤2次,每次5分钟。
d.6.单独取出玻片,使PBS滴下,将1滴缀合物加入每个施加部位,由此所述施加部位被完全覆盖。
d.7.将该玻片在室温在湿润保温室中保温30分钟。使该玻片避免光直射。
d.8.重复步骤d.4和d.5。
d.9.单独取出玻片,使PBS滴下,将一小滴覆盖介质加于每个施加部位的边缘。然后将盖玻片小心置于该玻片上,由此所述覆盖介质形成无泡沫密闭层。
d.10.通过自动系统读取该玻片。应擦干净该玻片的下表面!
e.结果评估
本发明的自动化评估系统除了关于主要荧光模式和推荐终点效价(抗体浓度)之外,还报告了每个施加部位的结果(阳性或者阴性)。可以使用PC上存储的图像对照通过该系统评估为阳性的样品。
当1∶80稀释液中荧光强度小于软件预定阈值时,将样品评估为ANA阴性。当1∶80稀释液中荧光强度大于软件预定阈值时,将样品评估为ANA阳性。
本发明另一方面是对于ANA阳性结果,所述软件将荧光模式分为如下几类:均质型、斑点状型、核仁型、着丝粒型、核斑点型、有丝分裂型、胞质型。
根据HEp-2细胞的细胞核染色可以区分各种模式:
e.1.均质型:整个细胞核弥漫性染色,有或无核隐藏。该模式在一些样品中可以出现斑点状型,尤其在接近终点处。有丝分裂中细胞染色体区域呈现强阳性荧光。抗原:DNA,组蛋白。临床相关性:特异于SLE的高效价,对于类风湿性关节炎较低的效价;组蛋白抗体与药物诱导的狼疮极其相关。
e.2.周边型:细胞核外部区域均匀染色,内部区域出现微弱荧光;不是施加部位的所有细胞均需要示出这种外周染色,一些细胞可以呈现均质型模式。有丝分裂中细胞染色体区域示出强阳性荧光(然而在有丝分裂中阴性细胞染色体区域薄环形染色提示抗体是针对核膜的)。抗原:DNA,组蛋白。临床相关性:在SLE活动期高效价,对于其它结缔组织病呈现较低效价。
e.3.斑点状型:在整个细胞核出现荧光斑点,根据抗体类型可以是非常细至非常粗的斑点。有丝分裂中细胞染色体区域通常阴性反应。
a)Sm和nRNP:粗斑点,细胞核除外,有丝分裂中细胞的染色体区域是阴性的。临床相关性:Sm抗体是SLE的高特异性标记;高抗-nRNP效价是MCTD的特征,在SLE、RA、PSS中与其它ANA一起。
b)SS-A和SS-B:适当分布的小的均一斑点,有丝分裂中细胞染色体区域是阴性的。临床相关性:在原发综合征中非常常见,在SLE中不太常见;抗-SS-S在新生儿狼疮和先天性心脏传导阻滞中非常常见。
c)Scl-70:具有核荧光的细小密度斑点,有丝分裂中细胞染色体区域是阳性的。临床相关性:抗-Scl-70是PSS的有效标记。
d)PCNA:在30-60%细胞中可变的细小和粗大斑点,有丝分裂中的细胞可以是阳性或阴性的。临床相关性:在小部分SLE患者中出现抗-PCNA。
e.4.着丝粒型:在整个细胞核中不连续的斑点,数目相应于单一或多个染色体组。有丝分裂中细胞的荧光模式依据染色体分布:在中期赤道面配对点,在后期运动离开至中心体。由NSP-1(SP100)抗体导致相似模式(多核斑点),但是在这种情况中有丝分裂中的细胞染色体区域保持阴性。抗原:染色体的着丝粒蛋白。临床相关性:CREST综合征、罕见的弥漫性硬皮病和Raynaud’s现象的标记。
e.5.核仁型:与未染色的核浆清晰界定的细胞核内的核荧光。细胞核的荧光可以是均质或者斑点状(成块状)。通常伴随斑点状模式。抗原:PMScl、RNA聚合酶I、原纤蛋白。临床相关性:特异于PSS、多肌炎-皮肌炎重叠的高效价,对于SLE、综合征、Raynaud’s现象的低效价。
e.6.纺锤体:在经历有丝分裂时细胞中连接彼此中心体的细小线状网。抗原:有丝分裂中细胞的纺锤体。临床相关性:在许多资自身免疫疾病和其它疾病(RA、SLE、PBC、腕管综合征)中的罕见模式。
e.7.胞质型:细胞质中斑点状的或者线状荧光
a)核糖体RNP:在整个细胞质中的细小斑点荧光,通常伴随核仁型模式(建议在其它组织切片上证实)。临床相关性:一些SLE特有。
b)Jo-1(PL-7,PL-12):一般具有微弱荧光的细小斑点,主要在核周区域中。临床相关性:多肌炎、皮肌炎。
c)线粒体:线状排列的小的均一斑点,在接近细胞核的区域更密集(建议在其它组织切片上证实)。临床相关性:原发性胆汁性肝硬化(PBC)的标记。
d)细胞骨架:由于抗肌动蛋白及细胞骨架其它成分(波形蛋白,微管蛋白)抗体导致的细胞质的线状、蛛网状荧光,建议在其它组织切片上证实。临床相关性:在自身免疫性肝炎和传染性疾病中常见一些抗肌动蛋白。
除了关于主要荧光模式和推荐终点效价(抗体浓度)之外,所述自动评估系统报告每个施加部位的结果(阳性或阴性)。使用PC上保存的图像可以对照通过该系统评估为阳性的样品。
Claims (9)
1.校准在通过间接免疫荧光法测定人血清中抗细胞核和细胞质抗原的抗体中用于终点效价确定的设备的方法,所述间接免疫荧光法测定包括:
a.患者血清内含有的自身抗体与固定于玻片上的HEp-2细胞、白细胞、绿蝇短膜虫或组织切片的抗原反应并结合,
b.特异性荧光标记结合至所述抗原的自身抗体,
c.除了在评估系统中使用荧光强度光记录和评估荧光光学成像之外,还对结合在所述玻片上的荧光标记的自身抗体进行荧光显微镜分析,
其中所述设备包括:
d.用于通过具有相机的荧光显微镜捕获图像的系统,
e.用于自动化图像分析及确定患者血清的结合的自身抗体的捕获的荧光模式以及荧光强度的系统,所述自身抗体与固定于玻片上的HEp-2细胞、白细胞、绿蝇短膜虫或组织切片的抗原反应并与其结合,
其特征在于:
f.在进行所述方法步骤之前,所述评估系统用具有限定效价的至少两种对照血清通过产生和测量每种对照血清的系列稀释液、从而产生校准函数进行校准,并测量荧光激发光,及
g.相对于所述校准函数,放置所研究的患者血清的记录的荧光光学图像的荧光强度,其中所述荧光强度由测量的曝光时间表示,从而能够提供所研究的患者血清的终点效价。
2.权利要求1的方法,其中所述特异性荧光标记使用荧光标记的抗人抗体进行。
3.权利要求1或2的方法,其中加入防脱色试剂以稳定荧光信号。
4.权利要求3的方法,其中所述防脱色试剂是2,3,5,6-四甲基-1,4-苯二胺。
5.权利要求1的方法,其中通过间接免疫荧光法测定所研究的患者血清的终点效价得自最终曝光时间、患者血清的初始效价以及相机的曝光时间,其中
a.最终曝光时间是最大有意义曝光时间,其中从所述校准函数的饱和点确定所述最大有意义曝光时间,
b.相机的曝光时间是所研究的患者血清与固定于玻片上的抗原结合后的多个单一图像的测量的平均曝光时间,
其中所研究的患者血清的终点效价将根据确定的校准函数计算,在最简单的线性情况中其根据如下等式计算:
6.通过间接免疫荧光法测定确定人血清中抗细胞核和细胞质抗原的抗体的体外诊断试剂盒,所述试剂盒包括至少:
a.具有用HEp-2细胞包被的用于施加对照血清和患者血清的多个施加部位的玻片,
b.具有不同的预定效价以校准免疫荧光显微镜测量和评估系统的光学系统的至少两种对照血清,
c.荧光标记的抗人抗体,其中所述荧光标记的抗人抗体特异性偶联与HEp-2细胞结合的抗体。
7.权利要求6的试剂盒,其中校准玻片是所述试剂盒的组分,其在表面展示具有限定效价的多种对照血清。
8.权利要求6的试剂盒,其中所述抗人抗体是抗人免疫球蛋白。
9.权利要求8的试剂盒,其中所述抗人抗体与异硫氰酸荧光素偶联。
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