-
Gebiet der
Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Biotechnologie
und insbesondere der Diagnose menschlicher Erkrankungen. Die Aufgabe
dieser Erfindung ist eine schnelle und einfache Identifizierung
von anti-Antigen-Antikörpern,
assoziiert mit einer Zöliakie
(CD) in menschlichem Serum, Plasma oder Blutproben.
-
Stand der Technik
-
Die
Zöliakie
(CD) ist eine Enteropathie, die durch eine Intoleranz gegenüber Weizen,
Roggen, Gerste und Hafermehlproteine (Gluten) in genetisch prädisponierten
Individuen gekennzeichnet ist. Die intestinale Läsion wird immunologisch vermittelt,
wobei Gliadin ein Auslöser
von einer Reihe von Kaskaden ist, die zu einer Aktivierung des Immunsystems
und zur Erzeugung einer Abflachung der intestinalen Mucosa und einer
Krypten-Hyperplasie
führen
(Marsh, Correlative Aspects of Mucosal Pathology Across the Spectrum
of Gluten-sensitivity, in C.F.A., O'Farrelly de, Gastrointestinal Immunology
and Gluten-sensitive Disease, Dublin: Oak Tree Press, 1994: 145-157).
Die Prävalenz
von CD, einschließlich
der symptomatischen Form wie auch der stillen oder atypischen Form
wurde kürzlich
auf 1/160 geschätzt,
wenn die Analyse in der allgemeinen Population durchgeführt wird.
Eine Mortalität,
die mit einem höheren
Risiko für
Neoplasien verbunden ist, wie auch die Morbidität – einschließlich Fehlgeburten, Osteopönie, Osteoporose,
Autoimmunerkrankungen usw. – die
mit einer unbehandelten CD assoziiert sind, machen eine frühe Diagnose
notwendig, deren Vorteile nach Verwendung einer Gluten-freien Diät demonstriert
wurden. Um die Enteropathie zu bestätigen, wird eine Biopsie des Dünndarms
mit einer histopathologischen Studie, wie auch unterschiedliche
serologische Tests für
zelluläre Antigene
oder Nahrungsmittel, die in den letzten Jahren zum Screening von
Kandidaten zur Durchführung
der intestinalen Biopsie Anerkennung gefunden haben, notwendig.
-
Da
die Gewebstransglutaminase (t-TG) kürzlich als größtes Autoantigen
identifiziert wurde, das in Strukturen des Endomysiums vorliegt (Dieterich
W., Ehnis T., Bauer M. et al., Identification of Tissue Transglutaminase
as the Autoantigen of Celiac Disease. Nat. Med. 197; 3: 797-801;
WO 98/03872, Immunological Process for Detecting Antibodies Directed
Towards Tissue Transglutaminase (TTG), Use of TTG for Diagnostic Purposes
and Therapy Control, and Oral Pharmaceutical Agent Containing TTG,
Schuppan D., Dieterich W.), ist die t-TG-ELISA-Technik die allgemein
akzeptierte Technik zum Test bei der Diagnose von Zöliakie (CD)
bei einer Diagnose. Andere Autoren schlagen einen immunologischen
Assay vor, worin Antikörper
von CD-Patienten mit einem Antigen besser reagieren würden, das
durch t-TG gebildet wird, und einem Substrat davon (WO 01/29090,
IMMCO DIAGNOSTICS, Immunological Assay for Detection of Antibodies
in Celiac Disease).
-
Andererseits
wurde ein einstufiger immunchromatographischer Assay zum Nachweis
von IgA- und IgG-Typ-Antikörpern
gegen t-TG in menschlichem Plasma oder Serum offenbart (Sorell L.,
Garrote JA., Acevedo B., et al., One-step Immunochromatographic
Assay for Screening of Coeliac Disease, Lancet 2002; 359: 945-946).
Gemäß diesen
Autoren hat der anti-t-TG-immunchromatographische
Assay eine 100%ige Empfindlichkeit und Spezifität bei der Diagnose von CD,
d.h. ähnliche
Daten zu denjenigen, die durch eine Intestinalbiopsie erhalten werden,
die den Gold-Standardtest bei der Diagnose von CD bildet. Es muss
jedoch darauf hingewiesen werden, dass diese Arbeit mit einer kleinen
Gruppe von Patienten mit CD durchgeführt wurde (n=50), weshalb diese
Ergebnisse als übermäßig vielversprechend
betrachtet werden müssen.
Dieselben Autoren reichten ein Patent ein, das die theoretische
Verwendung von t-TG bei der Ausarbeitung eines immunchromatographischen
Assays für
die Diagnose von CD betraf, obwohl sie keine praktische Ausführungsform des
Assays noch spezifische Ergebnisse mit Proben von Patienten mit
CD angaben (
EP 1 164 375 ,
Assay for Antitransglutaminase Antibodies, Sorell LT., Aroya H.,
Acevedo BE., Cerro H.).
-
Antigliadin-Antikörper (AGA)
sind für
CD ebenfalls indikativ, obwohl die Spezifität der anti-AGA-ELISA-Assays,
die durchgeführt
werden, geringer ist als die bei anderen Assays, und es müssen getrennte
Assays für
die Identifizierung der IgA- und IgG-Antikörpern durchgeführt werden.
Kürzlich
wurde auch ein AGA-visueller Diagnoseassay vorgeschlagen (Garrote
JA., Sorell L., Alfonso P. et al., 1999, A Simple Visual Immunoassay
for the Screening of Coeliac Disease, Eur. J. Clin. Invest. 29;
697-699) wie auch ein Festphasenimmunassay für Antikörper, die für AGA spezifisch sind (ES 2141679).
Ein anderes Patent, das die Diagnose von CD betrifft, und zwar durch
Identifizierung von Antigliadin-Antikörpern, ist das Patent WO 00/25793
(Diagnosis of Coeliac Disease Using a Gliadin Epitope, Anderson
R., Hill A., Jewell D.), obwohl es ein zeitaufwändiges Verfahren ist, da die
T-Lymphozyten in vitro behandelt werden.
-
Bazzigaluppi
et al. (Bazzigaluppi E. et al., Journal of Autoimmunity, Band 12,
Nr. 1, Februar 1999, Seiten 51-56) offenbaren einen Radiobindungsassay
for IgG und IgA, die für
t-TG spezifisch sind; IgA und IgG für AGA wird aus kompetitiven
Gründen
mit immunenzymatischen Verfahren gemessen. ELISA-Verfahren zur Messung
von IgA für
AGA und IgA für
t-TG wurden ebenfalls beschrieben (Palacios E. et al., An. Esp.
Pediatr., Band 53, Nr. 6, Juli 2000, Seiten 542-546).
-
Aufgrund
des Vorstehenden macht es die Durchführung der ELISA- und Immunfluoreszenz-Techniken notwendig,
dass die Labors gut ausgerüstet
sind und die Arbeitskräfte
qualifiziert sind, was nicht unbedingt weitweit zur Verfügung steht,
wie auch eine Wiederholung der Techniken für eine einzelne biologische
Probe zur Identifizierung unterschiedlicher IgA, IgG oder IgM, obwohl
die Empfindlichkeit und Spezifität
der serologischen Marker, wie z.B. der anti-Gliadin-Antikörper (AGA),
anti-Endomysium-Antikörper
(EmA) und anti-Gewebstransglutaminase (t-TG)-Antikörper hoch
sein kann.
-
Daher
ergibt sich hier ein Interesse, ein neues ökonomischeres und leichter
durchzuführendes
Assayverfahren zu entwickeln, das bei der Diagnose von CD verwendet
werden kann, insbesondere bei Risiko-behafteten Populationen. Bis
jetzt wurden nur einige dieser Assays entwickelt, wobei ein Großteil davon
auf einer serologischen Reaktion auf Gliadin und schließlich auf
t-TG basiert, von denen bestimmt wurde, dass es die häufigsten
Antikörper
sind, die mit CD assoziiert sind. Das in diesem Patent offenbarte
Verfahren ist das erste visuelle Verfahren unter Verwendung von
rekombinantem menschlichem t-TG, und das erste visuelle Verfahren,
das einen Nachweis von IgA-Typ-Antikörpern gegen t-TG und AGA in
einem einzelnen Assay ermöglicht, d.h.
mit einem einzelnen immunchromatographischen Streifen.
-
Beschreibung
-
Kurzbeschreibung
-
Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein doppeltes immunchromatographisches
System zu bilden, das die Implementierung des früher offenbarten Prozesses ermöglicht und
gleichzeitig die notwendigen Elemente zur Bestimmung und Visualisierung
der immunchromatographischen (IC-) Reaktionen zwischen IgA-Antikörpern (Doppel-AGA/t-TG-Streifen)
und IgG-Antikörpern
oder IgM-Antikörpern
(anti-t-TG-IgA/IgG/IgM-Streifen), die für Zöliakie (CD)-Patienten charakteristisch
sind, mit mindestens zwei CD-immunreaktiven
induktiven Antigenen einschließt.
-
Eine
andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Identifizierung
von Antikörpern,
die bei Patienten mit einer Zöliakie
vorliegen durch ein Immunchromatographiesystem, wobei zusammen und
simultan die Gegenwart von Antikörpern – IgA, IgG
oder IgM, in jedem System separat – die für die Autoantigene spezifisch
sind, die für
CD, AGA und t-TG charakteristisch sind, in einer biologischen Probe
von Antikörpern
bewertet wird.
-
Schließlich wird
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung des
Immunchromatographie-Systems und Verfahrens der vorliegenden Erfindung
für die
Identifizierung von Antikörpern
gebildet, die bei Patienten mit Zöliakie vorliegen.
-
Detaillierte
Beschreibung
-
Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Tatsache, dass die Erfinder
beobachtet haben, dass die gemeinsame und simultane Identifizierung
von Antikörpern,
die bei Zöliakie-Patienten
vorliegen, durch ein Immunchromatographiesystem (immunchromatographische
Streifen) möglich
ist, mit besseren Empfindlichkeits- und Spezifitätswerten als denjenigen, die
getrennt durchgeführt
werden und ähnlich
zu denjenigen, die durch andere immunologische Techniken erhalten
werden, beispielsweise einen ELISA. So wurde es möglich, die Gegenwart
von Antikörpern
gegen unterschiedliche Autoantigene von CD, insbesondere AGA und
t-TG, in einem einzelnen immunchromatographischen Streifen und unter
denselben Reaktionsbedingungen zu bestimmen; und für diejenigen
Fälle,
wo die CD-Patienten kein IgA aufweisen, wurde ein anderer immunchromatographischer
Streifen, basierend auf demselben t-TG-Autoantigen wie vom vorherigen
Streifen entwickelt.
-
Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein doppeltes Immunchromatographiesystem
gebildet, das die Implementierung des früher beschriebenen Prozesses
erlaubt und eine simultane Einführung der
notwendigen Elemente für
die Bestimmung und Visualisierung der immunchromatographischen (IC-)
Reaktionen zwischen Antikörpern,
die für
Zöliakie-Patienten
charakteristisch sind, mit mindestens zwei CD-immunreaktiven induktiven
Antigenen beinhaltet. Spezifisch wird das Immunchromatographiesystem
für die
Diagnose der Zöliakie
beim Menschen durch die folgenden Elemente gebildet:
- I) einen immunchromatographischen Streifen, der die Identifizierung
von Antikörpern – vom IgA-Typ – spezifisch
für die
Autoantigene, die für
CD charakteristisch sind, AGA (Antigliadin) und t-TG (Gewebstransglutaminase)
in einer menschlichen biologischen Probe ermöglicht, umfassend:
a)
ein System zum Visualisieren der Reaktion, beispielsweise kolloidale
Teilchen oder gefärbte
Mikrosphären,
beschichtet mit einem anti-IgA monoklonalen Antikörper,
b)
AGA und t-TG-Antigene, immobilisiert auf demselben Streifen und
c)
ein Kontrollsystem für
die immunchromatographischen Reaktionsbedingungen, und
- II) einen immunchromatographischen Streifen, der die Identifizierung
von IgA/IgM/IgG-Antikörpern
gegen das Autoantigen t-TG in einer menschlichen biologischen Probe
ermöglicht,
umfassend:
a) ein System zum Visualisieren der Reaktion, beispielsweise
kolloidale Teilchen oder gefärbte
Mikrosphären,
beschichtet mit t-TG-Antigen,
b)
t-TG-Antigen, immobilisiert auf demselben Streifen und
c) ein
Kontrollsystem für
die immunchromatographischen Reaktionsbedingungen.
-
Wenn
die Bezeichnung "biologische
Probe" in der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, bezieht sich dies auf eine Serum-, Plasma-,
Speichel- oder Blut-artige biologische Probe von einem Patienten,
von dem vermutet wird, dass er eine Zöliakie hat.
-
Wie
in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "AGA" auf einen Proteinextrakt,
der von einem oder einer Mischung etlicher Getreide erhalten wird,
die zu der folgenden Gruppe gehören – Weizen,
Gerste, Roggen und Hafer – und
der Antikörper
bei Patienten mit CD induziert.
-
Wie
in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "t-TG" auf ein Transglutaminaseprotein
von tierischem oder menschlichem Ursprung, synthetisch oder rekombinant
und auch auf Fragmente des t-TG, die eine immunologische Reaktion
bei Patienten mit CD induzieren, ähnlich zu der die mit komplettem
t-TG erhalten wird.
-
Eine
bestimmte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Immunchromatographiesystem,
worin das AGA-Antigen von einer Getreidevarietät oder Mischung von Getreiden
erhalten wurde, wie beispielsweise der Triana-Weizenvarietät, und das
t-TG-Antigen ist ein rekombinantes menschliches t-TG (siehe Beispiel
1).
-
So
wird eine bestimmte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung durch einen doppelten lateralen Fluss-immunchromatographischen
Streifen als inerten Träger
gebildet, der die IC-Reaktionen zwischen IgA und AGA und IgA und
t-TG auf einem einzelnen Streifen, durchgeführt gemäß Beispiel 1 a) bestimmt und
darstellt und umfassend ein System zur Visualisierung der Reaktion
(beispielsweise kolloidale Teilchen oder gefärbte Mikrosphären, beschichtet
mit einem anti-menschlichen IgA-monoklonalen Antikörper), die
Immobilisierung der CD-Antigene, AGA und t-TG (in diesem Fall t-TG),
einen inerten Träger,
der den Fluss der Elemente ermöglicht,
die rekonstituiert werden, wenn Serum oder Plasma zugefügt werden,
und ein Kontrollsystem für die
immunchromatographischen Reaktionsbedingungen. Andererseits bildet
jeder andere doppelte IC-Streifen, der gemäß dem gegenwärtigen Stand
der Technik auf dem Gebiet immunchromatographischer Verfahren entwickelt
werden kann und dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, einen Teil
der Erfindung.
-
Eine
weitere bestimmte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird durch einem immunchromatographischen
Streifen (anti-t-TG-IgA/IgG/IgM-Streifen,
siehe Beispiel 1 b)) gebildet, der die Bestimmung von IgA- oder
IgG- oder IgM-Antikörpern
von Patienten mit Zöliakie
gegen das t-TG-Auto-Antigen,
das in dem vorher erwähnten
Doppel-AGA/t-TG-Streifen verwendet wird, ermöglicht.
-
Eine
andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Identifizierung
von Antikörpern,
die bei Patienten mit Zöliakie
vorliegen, durch ein Immunchromatographiesystem, das auf kombinierte und
simultane Weise die Gegenwart von Antikörpern-IgA, wie auch IgM oder
IgG, getrennt auf jedem immunchromatographischen Streifen – die spezifisch
für die
Autoantigene sind, die charakteristisch sind für CD, AGA und t-TG, in einer
biologischen Probe durch zwei unterschiedliche immunchromatographische
Streifen (Doppel-AGA/t-TG-Streifen und anti-t-TG-IgA/IgG/IgM-Streifen)
bewertet.
-
Eine
bestimmte Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein vorher
beschriebenes Verfahren gebildet, worin statt der simultanen Durchführung der
Bewertung der CD-spezifischen Antikörper durch die zwei immunchromatographischen
Streifen die Analyse der Antikörper
zunächst
durch den Doppel-AGA/t-TG-immunchromatographischen Streifen (Beispiel
1 a) und im Fall eines negativen Ergebnisses mit einer zweiten Bewertung
der Gegenwart von IgA-, IgG- und IgM-Typ-Antikörpern gegen t-TG durch ein
einzelnes Immunchromatographiesystem (Beispiel 1 b) durchgeführt wird.
-
Eine
andere bestimmte Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein
Verfahren gemäß diesem Patent
gebildet, worin die immunchromatographische Reaktion, die durchgeführt wird,
zwischen den CD-Autoantigenen auftritt, die auf dem immunchromatographischen
Streifen angeordnet sind, AGA und t-TG, und IgG- oder IgM-Antikörpern in
der biologischen Probe auf getrennte Weise. In diesen Fällen würden die
kolloidalen Teilchen oder gefärbten
Mikrosphären
des Doppelstreifens mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet werden, der
menschliches IgG bzw. IgM erkennt, und zwar für jeden der Streifen.
-
Schließlich wird
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung des
Immunchromatographiesystems gebildet, gebildet aus den immunchromatographischen
Streifen und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Identifizierung
von Antikörpern
(IgA, IgM oder IgG), die bei Patienten mit Zöliakie vorliegen.
-
Beschreibung der Zeichnungen
-
1 – Ergebnisse
der Doppel- und Einfach-immunchromatographischen Streifen bei der
Diagnose von CD. Diese Figur zeigt die Repräsentation von Banden, die sich
nach den immunchromatographischen Assays mit dem Doppelstreifen
(AGA/t-TG) und dem einfachen Streifen (IgA/IgG/IgM) zeigen. 1+,
t-TG-positiver Streifen
durch einen einfachen Streifen; 2+, t-TG-negativer Streifen durch
einen einfachen Streifen; 3+ und 3–, Vergleich eines einfachen
und Doppelstreifens bei einem Patienten mit einer IgA-Defizienz;
4–, t-TG/AGA-negativer
Streifen auf einem Doppelstreifen; 5+, AGA-positiver Streifen auf
einem Doppelstreifen; 6+, t-TG-positiver Streifen auf einem Doppelstreifen;
7+, AGA/t-TG-Streifen positiv auf einem Doppelstreifen.
-
Ausführungsbeispiele
-
Beispiel 1 – Ausarbeitung
der immunchromatographischen Streifen
-
Das
in der vorliegenden Erfindung entwickelte Verfahren basiert auf
lateralen Fluss-Immunchromatographiestreifen, erzeugt von der Firma
Operón
S.A. (Zaragoza, Spanien). Die beiden Streifenmodelle, die entwickelt
wurden, werden unten präsentiert:
a) AGA- und t-TG-IgA-Typ-Streifen und b) t-TG-IgA/IgG/IgM-Streifen.
Die Streifen bestehen aus etlichen Schichten, die mit allen notwendigen
Reagenzien für
jeden Typ versehen sind.
-
a) Doppel-AGA/t-TG-Streifen
-
Hier
handelt es sich um einen Dreibandentest (siehe 1).
Die menschlichen Serumproben von CD-Patienten oder von Kontrollfällen werden
in einer Pufferlösung,
die Rinderserumalbumin (BSA) und ein nicht-ionisches Detergens enthält, verdünnt, wobei
es möglich
ist, die Verdünnung
entweder in Eppendorf-Röhrchen
oder Mikrotiterplatten durchzuführen.
Der absorbierende Bereich des Streifens oder Eintauchsticks wird
in der 1:15-Verdünnung
des vorher erwähnten
gepufferten Serums eingeführt.
Wenn das Serum des Patienten die IgA-Typ-Antikörper gegen t-TG, Gliadine oder
beide aufweist, wenn sich die Flüssigkeit
aufgrund ihrer Kapillarität
nach oben bewegt (lateraler Fluss-Immunchromatographiestreifen),
rekonstituiert sie gefärbte
Mikrosphären,
die in diesem absorbierenden Bereich des Streifens lokalisiert sind
und in diesem Fall mit einem monoklonalen Antikörper gegen menschliches IgA
beschichtet sind. Sobald rekonstituiert, bewegt sich der Komplex,
gebildet durch die roten Mikrosphären, beschichtet mit einem
monoklonalen Antikörper
gegen menschliches IgA, die Antikörper (IgA-Typ) gegen t-TG oder
gegen Gliadine oder beide Antigene nach oben und reagiert getrennt
mit zwei unterschiedlichen Linien (die physikalisch getrennt sind),
enthaltend sowohl immobilisierte gereinigte Gliadine (in einer der
Linien) als auch rekombinantes menschliches t-TG (in der anderen
Linie), was nach der korrespondierenden immunologischen Reaktion
auf unterschiedlichen Niveaus zu ein oder zwei roten Banden führt, abhängig davon,
ob das Serum Antikörper
(IgA-Typ) gegen t-TG, gegen Gliadine (AGA) oder gegen beide Antigene
aufweist. Im Fall einer Immunreaktivität kann sich, abgesehen von einer
blau gefärbten
Kontrollbande, in diesem Beispiel eine rote Bande nach 5 bis 10
Minuten entwickeln, die t-TG oder AGA entspricht, oder beide Banden,
korrespondierend zu den IgA-Typ-Antikörpern gegen AGA und t-TG. Die
blau gefärbte
Kontrollbande erscheint am oberen Teil des Streifens und validiert
das Ergebnis des Tests, wobei die rote Bande der Gegenwart von IgA-Typ-Antikörpern gegen
Gliadin (AGA) im Mittelbereich entspricht, und die rote Bande, die
die Gegenwart von IgA-Typ-Antikörpern gegen
t-TG anzeigt, im unteren Bereich des Streifens auftritt.
-
Die
blau gefärbte
Bande ist eine interne Kontrolle des immunchromatographischen Streifen,
die anzeigt, das die für
die Antikörper-Antigen-Reaktion
und die darauf folgende Visualisierung notwendigen Bedingungen geeignet
sind.
-
Das
rekombinante menschliche t-TG (Rt-TG) wurde von Diarect (Freiburg,
Deutschland) erhalten und das gereinigte Gliadin aus einer Weizen-Varietät, der Triana-Varietät, isoliert,
und zwar von den Erfindern selbst an der Unidad de Gluten del Centro
Nacional de Biotechnologia. Diese Reinigung wurde durch Ethanolextraktion
durchgeführt,
gefolgt von einer Konzentration unter Verwendung von Ultrafiltration
und darauffolgendes Lyophilisieren des Extrakts. Der monoklonale
Antikörper
gegen menschliches IgA wurde bei Operón S.A. (Zaragoza, Spanien)
erzeugt.
-
Mit
dieser Art von Streifen wurden 248 Seren getestet, wobei 50 % davon
zu Patienten mit CD und die anderen 50 % zu Nicht-CD-Kontrollfällen korrespondierten,
und zwar auf dieselbe Weise wie bei den einzelnen Streifen.
-
b) Einfache anti-t-TG-IgA/IgG/IgM-Streifen
-
Hier
handelt es sich um einen Zweibandentest. Die Streifen oder Sticks
werden in Eppendorf-Röhrchen
oder in Mikrotiterplatten eingeführt,
die eine vorher hergestellte 1:20-Verdünnung von Serum von Patienten
enthielten, die untersucht werden sollten, und zwar mit einer Salz-Phosphat-Pufferlösung (PBS)
bei einer physiologischen Salzkonzentration und pH mit 1 % Rinderserumalbumin
(BSA). Wenn der Streifen in die verdünnte Probe platziert wird,
bewegt sich die Flüssigkeit
aufgrund der Kapillarkräfte
nach oben und rekonstituiert die rot gefärbten Mikrosphären, die
getrocknet und mit rekombinantem menschlichem t-TG (Rt-TG) beschichtet
sind, wenn die Probe Antikörper
gegen Gewebstransglutaminase (t-TG) enthält. Der durch die rot gefärbten Mikrosphären, das
rekombinante menschliche t-TG und die anti-t-TG-Antikörper, die
in der Patientenprobe vorliegen, gebildete Komplex bewegt sich nach
oben und erreicht einen Bereich, der eine rekombinante menschliche
t-TG-Linie enthält,
und führt
zu einer Immunreaktion, die zu einer roten Bande führt. Diese
rote Bande zeigt die Gegenwart von anti-t-TG-IgA-, IgG- oder IgM-Typ-Antikörpern in
einer analysierten Probe an. Andere getrocknete, blau gefärbte Mikrosphären, die
mit einem bestimmten Protein beschichtet sind, sind im absorbierenden
Bereich des Streifens als Systemkontrolle lokalisiert. Der rekonstituierte
Protein-beschichtete blau gefärbte
Mikrosphärenkomplex
bewegt sich auf dem Streifen nach oben bis er einen Bereich erreicht,
worin immobilisierte monoklonale Antikörper gegen das Protein vorliegen,
die immunologisch reagieren und zu einer blauen Bande führen. Wenn
das Serum nicht immunreaktiv ist, entwickelt sich nur eine blaue
Kontrollbande, während sich
im Fall einer Immunreaktivität
zusätzlich
zu der blauen Bande eine rote Bande nach 5 bis 10 Minuten entwickelt.
-
In
dem Fall, dass keine der beiden Banden auftritt, ist die Analyse
nicht gültig
und muss wiederholt werden, wobei ein neuer Streifen verwendet wird.
Es ist für
die Durchführung
des Assays keine zusätzliche Ausrüstung notwendig.
-
Beispiel 2 – Immunchromatographie
und ELISAs für
CD
-
Die
in den Tests mit den beiden Streifenarten, doppelt und einfach,
erhaltenen Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die
durch einen ELISA für
anti-t-TG- und AGA-Antikörper
erhalten wurden.
-
Im
Fall von Doppel-Diagnosestreifen wurde eine 92,7 und 83,2 %ige Empfindlichkeit
mit einer 96,2 und 96,7 %igen Spezifität für t-TG bzw. AGA gefunden, wenn
t-TG- und AGA-Ergebnisse getrennt analysiert wurden (Tabelle 1).
Diese Daten zeigten eine Konsistenz von 99,3 bzw. 99,2 %, verglichen
mit dem ELISA. Andererseits ist es notwendig darauf hinzuweisen,
dass die kombinierte Analyse der Ergebnisse auf demselben Doppelstreifen,
d.h. die Zahl von Fällen,
die positiv für
eines der beiden Antigene, AGA und t-TG getrennt, gescreent wurden,
oder beide, resultierend in einem positiven Ergebnis, eine höhere Empfindlichkeit
und Spezifität
ermöglichten
als die getrennt erhaltenen, nämlich
95,2 bzw. 96,2 %. Genauer gesagt wurde beobachtet, dass drei Patienten
mit CD mit positivem AGA auf dem Doppelstreifen t-TG-negativ waren,
15 Patienten mit CD mit positivem t-TG waren AGA negativ und 100
Patienten mit CD waren positiv für
AGA und t-TG. Anders ausgedrückt,
ermöglichte
die Ausführungsform
des Doppelstreifens die Identifizierung von drei Patienten mit CD,
von denen es möglich
gewesen wäre,
sie mit einer getrennten AGA- oder einer t-TG-Analyse zu identifizieren
(d.h. dies erhöht
die Empfindlichkeit von 92,7 auf 96,3 %).
-
In
den negativen CD-Fällen
gegen AGA/t-TG, erhalten mit dem Doppelstreifen, wurde die Gegenwart von
IgA/IgM/IgG-Antikörpern
gegen T-TG durch Durchführung
eines immunchromatographischen Assays mit einem Einzelstreifen analysiert,
wobei ein positiver Fall gegen t-TG beobachtet wurde, worin die
IgA-Defizienz bei diesem Patienten durch ein Nephelometrieverfahren
bestätigt
wurde. Einer der besonders bemerkenswerten Vorteile der kombinierten
Verwendung von sowohl Doppel- als auch Einfachstreifen ist es, dass
der Nachweis von Patienten mit selektiver IgA-Defizienz ermöglicht wird, die CD haben,
wenn die t-TG-Bande in dem Einfachstreifen positiv und im Doppelstreifen
negativ ist, während
die Empfindlichkeit, die durch beide Tests erhalten wird, ansteigt
(in unserem Fall von 95,2 % auf 96 %). Tabelle
1
- * Ein einzelner Doppelstreifen für zwei ELISA-Tests.
-
Wie
aus der Tabelle abgelesen werden kann, gibt es eine hohe Korrelation
zwischen den unterschiedlichen visuellen Assays und den jeweiligen
ELISA-Tests.
-
Die
in den präsentierten
immunchromatographischen Assays erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass
diese Verfahren für
die Diagnose von CD extrem effizient sind, was kombiniert mit ihrer
einfachen Durchführung, der
Tatsache, dass kein spezifisch qualifizierter Arbeiter benötigt wird,
der Tatsache, dass sie schnell durchzuführen sind (nicht mehr als 10
Minuten) und der Tatsache, dass sie keine komplexe technologische
Ausrüstung nötig machen,
die Verfahren zu einem sehr wertvollen Werkzeug für eine Überprüfung von
Populationen mit einem Risiko für
CD und zum Screening von Kandidaten zur Durchführung einer Dünndarmbiopsie
darstellen.
-
Ein
anderes wichtiges Merkmal ist dasjenige, dass diese Streifen eine
höhere
Empfindlichkeit und Spezifität
aufweisen, als die korrespondierenden T-TG- und AGA-ELISA-Tests
und für
das Testen und eine Diagnose von CD extrem effizient sind.
-
Der
Doppel-AGA/t-TG-Streifen bestimmt IgA-Typ-AGA und t-TG in einer
einzelnen Analyse und eliminiert so den Bedarf an einer Verwendung
von zwei parallelen t-TG- und AGA-ELISA-Tests.
-
Beide
Streifen sind signifikant weniger teuer als ELISA, einfacher zu
verarbeiten und zu interpretieren, und es wird angenommen, dass
diese Merkmale sie zu einem idealen Test für die Diagnose von CD in großen Populationen,
insbesondere in Entwicklungsländern,
machen.
