WO2013098441A1 - Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas - Google Patents

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WO2013098441A1
WO2013098441A1 PCT/ES2012/000331 ES2012000331W WO2013098441A1 WO 2013098441 A1 WO2013098441 A1 WO 2013098441A1 ES 2012000331 W ES2012000331 W ES 2012000331W WO 2013098441 A1 WO2013098441 A1 WO 2013098441A1
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gluten
seq
peptides
patients
feces
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PCT/ES2012/000331
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Carolina Sousa Martin
Ana Real Calderon
Isabel COMINO MONTILLA
Santiago VIVAS ALEGRE
Ángel CEBOLLA RAMIREZ
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Universidad De Sevilla
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention framed in the medical-clinical sector, complements the invention already protected above in which a procedure for monitoring gluten intake is shown by measuring the proteins / peptides of gluten in feces with antibodies against peptides Immunogenic resistant to gastrointestinal digestion.
  • the presence or absence of said immunogenic peptides is controlled by immunological assays based on antibodies reactive against immunogenic gluten peptides that are resistant to proteolysis.
  • Such tests may be quantitative ELISAs, or qualitative techniques such as rapid immunochromatographic tests, immunoblots, etc.
  • Gluten is a set of cereal storage proteins. Gluten proteins from wheat, barley, rye and probably oats are not tolerated by genetically predisposed individuals suffering from celiac disease (CD).
  • CD celiac disease
  • gluten is composed of a fraction soluble in ethanol (prolamines: ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ -gliadins); and another insoluble, glutenins (high and low molecular weight) (Wieser, 2007, Food Microbiol., 24: 115-119; Fasano, 2009, Sci Am., 301: 54-61).
  • Gliadins, as well as glutenins are unusually rich in proline residues ( ⁇ 15%) and glutamine ( ⁇ 35%).
  • gluten proteins are not completely digested (Erickson and Kim, 1990, Annu Rev Med., 41: 133- 139; Gray, 1991, New York: Oxford University, pp. 411-420; Ganapathy et al., 2006, Academic Press, pp. 1667-1692). Therefore, some of the gluten peptides generated during gastrointestinal digestion are highly resistant to digestion by gastric and pancreatic enzymes, so they persist in the intestine. These peptides are able to internalize in intestinal cells and, as a consequence, the glutamine residues they possess can be deaminated by tissue transglutaminase (tTG).
  • tTG tissue transglutaminase
  • Intestinal villi are destroyed due to the immunological reaction, producing a decrease in intestinal absorption that can lead to symptoms such as diarrhea, anemia, stunted growth, weight loss, bone disorders, neurological complications, cancer, etc. (Alaedini and Green, 2005, Ann Int Med., 142: 289-299; Catassi and Fasano, 2008, Curr Opin Gastroenterol., 24: 687-691; Tack et al., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7: 204- 213).
  • DSG gluten-free diet
  • markers have been proposed for diet monitoring, such as the permeability test (Duerksen et al., 2005) or fecal calprotectin (Ertekin et al., 2010, J Clin Gastroenterol., 44: 544-546. ) but its validity has not been proven. These methods can show that there are inflammatory processes, so that if the values of these markers are modified it can be as a result of infectious diseases, inflammatory bowel diseases or allergy processes, which means that they do not have to be a measure of direct consumption of gluten.
  • a more direct measure of gluten intake could provide critical information about the patient: the detection of non-compliance with the DSG before anatomical damage, the detection of inadvertent consumption, the evaluation of the accuracy of treatment adherence in the initial period after the diagnosis when patients are less familiar with diet, etc., providing easy and reliable confirmation of the results obtained. Therefore, a sensitive and reliable marker for monitoring and detecting gluten intake could be a useful tool for the correct compliance of the DSG and, probably, for an accurate diagnosis of refractory CD.
  • the monoclonal antibodies (moAbs) G12 and A1 obtained against the main immunogenic epitope of ⁇ -gliadin have proven to be very useful in the detection of toxic peptides in food samples, as well as in clinical research of enzymatic detoxification of gluten (Morón et al. ., 2008, Am J Clin Nutr., 87: 405-414; Morón et al., 2008, PloS ONE, 3: e2294; Ehren et al., 2009, PloS ONE, 4: e6313; Alvine Pharmaceuticals, Inc., Biomedal SL).
  • the sensitivity and specificity of monoclonal antibodies and their ability to recognize peptides resistant to gastrointestinal digestion could make them ideal for the monitoring of gluten immunotoxic peptides obtained after intestinal digestion in human samples.
  • the recognition epitopes of moAb G12, QP (Q / E) LP (Y / F), are present in the main peptides recently described in a high-yield screening performed with 2,700 peptides from prolamines of different cereals (Tye-Din and col., 2010, Sci Trans ⁇ Med., 2: 41ra51).
  • the undigested peptide fragments from the intake of gluten and not absorbed could be recovered from the feces, which would demonstrate the individual's gluten intake.
  • Figure 1 Determination of the elimination time of ingested gluten in healthy individuals undergoing gluten-free diet (DSG) for 7 days.
  • LC Limit of quantification. Each of the samples was analyzed in triplicate. Maximum, minimum and 25th and 75th percentiles are shown.
  • B Representative immunochromatographic example of the samples collected for one of the subjects during the study period. The blue stripe is a positive internal control that indicates that the device has worked correctly, and the pink stripe indicates the presence of gluten.
  • FIG. 1 Analysis of the levels of gluten excreted through the feces of a celiac patient undergoing gluten provocation for 6 days. Determination of toxic peptide levels (ng / g feces) by competitive ELISA G12. The results were expressed as the mean ⁇ SD of the data obtained in three independent experiments with three replicates each.
  • the gluten-free diet is the only effective treatment for celiac disease today. Therefore, compliance with the DSG in patients should be monitored to avoid direct and indirect cumulative damage, as well as to confirm that the persistence of any typical celiac symptoms is not due to a violation (voluntary or not) of the diet.
  • a violation voluntary or not
  • the present invention has as its object the application of immunological methods to monitor the fulfillment of the gluten-free diet by means of the detection in faeces of immunotoxic peptides resistant to gastrointestinal digestion.
  • the object of the invention is the application of antibody-based immunological techniques that recognize immunogenic gluten peptides that resist gastrointestinal digestion.
  • the invention employs immunological techniques that use antibodies that recognize gliadin 33-mer peptide. There would be a preferred way of detecting the peptides by rapid qualitative methods based on immunochromatographic strips or by quantitative and automated methods such as ELISA techniques.
  • the preferred method used in the invention should allow to detect ingested gluten equivalent to 50 mgs of wheat gluten per day, which is the maximum amount described for a gluten-free diet, or in its case a minimum of 20 ppms of equivalent gluten in feces. It is also the subject of the present patent kits or immunological analytical devices based on antibodies reactive to 33-mer of gliadin which are indicated for the detection of gluten peptides in feces.
  • Said procedure and analytical kits also have their object of the patent in their use to reveal the lack of adherence to the DSG, either due to the contamination of the food consumed or to an occasional voluntary / involuntary intake of gluten-containing foods.
  • the application of the detection of said immunotoxic peptides in feces for the control of clinical research on celiac disease including enzymatic therapies related to detoxification of gluten prolamines, immunotoxic peptide sequestrants, and Other alternative therapies.
  • the object of the present invention is a method for detecting or monitoring ingested gluten by detecting immunotoxic peptides in feces, characterized by the use of immunological methods with antibodies that recognize, preferably epitopes related to the 33-mer peptide of the gliadin and other peptide sequences resistant to gastrointestinal digestion.
  • the object of the present invention is the use of immunological techniques for said gluten monitoring, immunological methods such as indirect ELISA, competitive ELISA, sandwich ELISA, immunochromatographic strips, fluorescent immunomicroparticles, Western blot, biosensors based on electrochemical reactions catalyzed by enzymes coupled to the antibodies, by magnetic particles upholstered by antibodies, by resonance of surface plasmons, and other techniques in which the binding of an analyte to an antibody is detected.
  • immunological methods such as indirect ELISA, competitive ELISA, sandwich ELISA, immunochromatographic strips, fluorescent immunomicroparticles, Western blot, biosensors based on electrochemical reactions catalyzed by enzymes coupled to the antibodies, by magnetic particles upholstered by antibodies, by resonance of surface plasmons, and other techniques in which the binding of an analyte to an antibody is detected.
  • these methods are characterized in that they preferably employ one or more monoclonal antibodies capable of detecting epitopes contained or similar to the 33-mer peptide (SEQ ID No. 1), such as the following sequences: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8.
  • SEQ ID No. 1 the antibodies used by immunological techniques they would be G12 and A1 for their demonstrated relationship of their reactivity with the potential immunotoxicity of a sample.
  • the invention also contemplates the use of the R5 antibody that reacts with the epitope SQ ID No.
  • a preferred form of the invention would be the use of immunological methods based on the G12 monoclonal antibody conjugated to an enzyme that allows a quantitative assay using chromogenic, fluorogenic or luminescent substrates. This procedure could use a pattern of gliadin, hydrolyzed gliadin, complete 33-mer peptide or a part of its sequence of at least 6 amino acids (SEQ ID No. 2).
  • Another object of the invention is the particular use of immunochromatographic strips based on the anti-33-mer antibodies of gliadin, G12 and A1 that allow a semi-quantitative and rapid detection of gluten peptides / proteins contained in feces.
  • the invention proposes a measure of the gluten ingested by the individual through the diet. It is a useful procedure for the control of ingested gluten through the use of analytical methods in which a correlation between the amount of gluten ingested and the protein / peptide estimates of gluten in feces obtained through these procedures has been demonstrated.
  • the invention proposes an analytical instrument for monitoring compliance with the DSG, as well as to rule out the uncontrolled intake of gluten in patients suspected of suffering from the so-called refractory celiac disease.
  • the new therapeutic alternatives for the enzymatic detoxification of gluten and other alternative therapies can also be controlled in the feces of celiac patients undergoing clinical trials or a therapeutic prescription in the future, since the effectiveness of the therapy It could be determined by measuring the presence or absence of peptides in feces after 12-48 hours of the intake of some controlled amount of gluten along with therapies that eliminate immunotoxic peptides
  • the extraction of the peptides in the feces can be carried out directly with a hydroalcoholic solution of 40 to 60%.
  • a hydroalcoholic solution of 40 to 60%.
  • dispersing agents such as guanidinium chloride, arginine chloride, etc; or detergents such as polyvinylpyrrolidone, and reducing agents such as b-mercaptoethanol, DTT or TCEP.
  • the extracted gluten polypeptides are diluted in a buffered saline solution and then used to make the measurement with an ELISA, very competitive, or sandwich if you want to have an idea of the concentration of the reactive peptides.
  • the straight pattern could be made with standard pepsino-trypsin gliadin, to simulate gastric digestion.
  • Synthesized polypeptide that reacts with antibodies, preferably, 33-mer of gliadin or fragments thereof, could also be used directly with the option of putting some specific modifications that maintain reactivity against antibodies.
  • the following peptides could be used for the G12 antibodies: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, and SEQ ID No. 4.
  • the peptides SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 or SEQ ID No. 8 to make the straight pattern with a competitive ELISA.
  • an immunochromatographic strips using the G12 or A1 antibody or both could be used.
  • the procedure could be carried out with a kit containing the stool polypeptide extraction solution; a reference standard with gluten polypeptides hydrolyzed by pepsin and trypsin or synthesized; and the components of an ELISA with a multiwell plate and using the A1 and / or G12 antibodies to immobilize the wells and / or for the development of the assay, or immunochromatographic strips.
  • Example 1 Evaluation of the viability of monitoring the DSG by determination of gluten peptides / proteins through feces.
  • the following example is carried out with the objective of determining the time necessary to excrete the gluten consumed in different individuals during previous days and the ability of the G12 immunological methods in the detection of said gluten. Likewise, the feasibility and sensitivity of G12 immunological methods for detecting gluten microdoses in known quantities were studied.
  • the concentration of gluten peptides / proteins obtained by IC-strips was at least 100 times higher than its detection limit in all the cases analyzed.
  • the gluten content ranged from 201 to 29,076 ng 33EPs / g of feces while maintaining a normal diet in which gluten was included. Intra- and inter-individual variations found could be related to diet, the type of food with gluten consumed and the variability in fermentation degradation.
  • Example 3 Evaluation of the viability of DSG monitoring by determination of gluten peptides / proteins through feces using the R5 antibody
  • the present example demonstrates how other antibodies that have not been created directly by immunization against 33-mer but that recognize it, although with less specificity, can be used to assess DSG compliance in celiac patients.
  • Immunological methods based on the R5 antibody such as sandwich and competitive type ELISA, as well as immunochromatographic strips were used for this study. Following the instructions of the supplier, the capacity of AcMo R5 was determined, an antibody that recognizes the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 and SEQ ID No. 10 to detect gluten in previously tested fecal samples.

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Abstract

La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico, muestra un procedimiento para el control de la ingesta de gluten en sujetos sanos, pacientes celíacos activos, pacientes celíacos en remisión y pacientes con otras enfermedades gastrointestinales. Este procedimiento se basa en la detección de gluten en heces mediante técnicas cuantitativas ELISAs, o cualitativas como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc., en los que se usan anticuerpos frente a péptidos presentes en las proteínas del gluten. Dichos ensayos permitirán evaluar la capacidad de la flora microbiana para degradar el gluten ingerido en distintos tipos de pacientes, así como evaluar el diseño y control de terapias de inmunización y/o desensibilización basadas en la ingesta controlada de gluten.

Description

Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas
Objeto de la invención
La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico, complementa la invención ya protegida anteriormente en la que se muestra un procedimiento para la monitorización de la ingestión de gluten mediante la medida de las proteínas/péptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a péptidos inmunogénicos resistentes a digestión gastrointestinal. La presencia o ausencia de dichos péptidos inmunogénicos es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos inmunogénicos del gluten que son resistente a proteólisis. Dichos ensayos pueden ser técnicas cuantitativas ELISAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc. Estas medidas también se podrían aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para mejorar el diagnóstico en casos de síntomas refractarios o agudos de la enfermedad celíaca en casos donde supuestamente se está respetando una dieta sin gluten, o a la investigación clínica de la efectividad de las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas.
Estado de la técnica
El gluten es un conjunto de proteínas de almacenamiento de los cereales. Las proteínas del gluten procedentes del trigo, la cebada, el centeno y, probablemente la avena, no son toleradas por individuos predispuestos genéticamente que padecen la enfermedad celíaca (EC). En el trigo, el gluten está compuesto por una fracción soluble en etanol (prolaminas: α, β, γ y ω-gliadinas); y otra insoluble, gluteninas (de alto y bajo peso molecular) (Wieser, 2007, Food Microbiol., 24:115-119; Fasano, 2009, Sci Am., 301 :54-61). Las gliadinas, así como también las gluteninas, son inusualmente ricas en residuos de prolina (~15%) y glutamina (~35%). Como resultado, mientras que la mayoría de las proteínas de la dieta son digeridas mediante proteasas gastrointestinales a aminoácidos simples, dipéptidos o tripéptidos, las proteínas del gluten no son completamente digeridas (Erickson y Kim, 1990, Annu Rev Med., 41 :133-139; Gray, 1991 , New York:Oxford University, pp.411-420; Ganapathy y col., 2006, Academic Press, pp.1667-1692). Por lo tanto, algunos de los péptidos del gluten generados durante la digestión gastrointestinal son altamente resistentes a la digestión por parte de las enzimas gástricas y pancreáticas, por lo que persisten en el intestino. Estos péptidos son capaces de internalizarse en las células intestinales y, como consecuencia, los residuos de glutamina que poseen pueden ser desaminados por la transglutaminasa tisular (tTG). La predisposición genética de los individuos con EC hace que sean intolerantes a dichos péptidos debido a que su sistema inmunológico reacciona de manera patológica contra autoantígenos resultantes de la interacción - péptidos del gluten/tTG- (Korponay-Szabó y col., 2007, BMJ, 335:1244-1247; Bethune y Khosla, 2008, PloS Pathogens, 4:e34; Jabri y Sollid, 2009, Nat Rev Immunol., 9:858- 870). Los péptidos desaminados inducen una reacción inmunologica mediada por células T que ocasiona inflamación crónica del intestino delgado. Las vellosidades intestinales son destruidas debido a la reacción inmunologica, produciéndose disminución de la absorción intestinal que puede dar lugar a síntomas como diarrea, anemia, retraso en el crecimiento, pérdida de peso, desórdenes óseos, complicaciones neurológicas, cáncer, etc. (Alaedini y Green, 2005, Ann Int Med., 142:289-299; Catassi y Fasano, 2008, Curr Opin Gastroenterol., 24:687-691 ; Tack y col., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213).
Uno de los principales péptidos del gluten descritos hasta la fecha es el péptido 33-mer de la a2-gliadina (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Bethune y col.,
2009, Chem Biol., 16:868-881) que ha demostrado ser resistente a la digestión gastrointestinal, sustrato de la desaminación mediada por la tTG y altamente reactivo frente a las células T aisladas de pacientes celíacos. La identificación del péptido 33- mer, así como otros péptidos, contribuye a demostrar que los epítopos del gluten con elevada antigenicidad están localizados en regiones de las gliadinas ricas en residuos de prolina y glutamina (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Tye-Din y col.,
2010, Sci Transí Med., 2:41 ra51).
La única terapia existente a día de hoy para los pacientes celíacos es una rigurosa dieta sin gluten (DSG). El incumplimiento de la DSG se ha asociado con osteoporosis, lesiones histológicas con atrofia de las vellosidades intestinales, mal nutrición, distensión abdominal, diarreas, vómitos, perdida de peso, anemia por deficiencia de hierro, depresión e infertilidad, todo lo cual se mejora, en cierta medida, mediante la adhesión a la dieta libre de gluten. Estas observaciones nos dan una idea de la importancia de la adherencia a una DSG para reducir los síntomas, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida del paciente. Sin embargo, varios estudios basados en biopsias intestinales han sugerido que las transgresiones de la dieta son relativamente frecuentes, estando entre el 32,6% y el 55,4% en las poblaciones estudiadas (Ciacci y col., 2002, Digestión, 66:178-185; Silvester y Rashid, 2007, Can J Gastroenterol., 21 :557-564). La falta de adherencia a una dieta libre de gluten de manera estricta es la principal razón de enfermedad celíaca mal controlada en adultos (Leffler y col., 2009, Clin Gastroenterol Hepatol., 7:530-536; Jamma y col., 2010, Clin Gastroenterol Hepatol., 8:587-590).
Así mismo existe una parte de la población celíaca que no parece responder de manera positiva a la DSG y sufren síntomas de malabsorción persistente o recurrente y atrofia de las vellosidades intestinales. Esta población podría ser sospechosa de padecer EC refractaria, una enfermedad rara (aproximadamente el 5%-10% de los pacientes con EC) pero de gran importancia clínica al constituir una lesión pre- linfomatosa (EC Refractaria tipo 1) o linfomatosa (EC Refractaria tipo II con una elevada mortalidad del 50%) que aparece en los pacientes sin aparente respuesta positiva a la dieta libre de gluten (Al-Toma y col., 2007, Dig Dis Sci., 25:230-236; Freeman, 2009, Gut Liver, 3:237-246; Rubio-Tapia y Murray, 2010, Gut, 59:547-557). Aunque esta enfermedad refractaria fue descrita en pacientes con supuesta ausencia total de ingesta de gluten, la ingestión involuntaria y la hipersensibilidad a una pequeña cantidad de gluten también pueden desencadenar los síntomas propios de la patología, lo que contribuye a dificultar el diagnostico diferencial y la instauración temprana de tratamiento para la EC Refractaria (tratamiento similar al del Linfoma No Hodgkin). El estudio de los linfocitos intraepiteliales de la mucosa intestinal proporciona el diagnóstico de confirmación de la EC Refractaria pero su estudio, aun en fase experimental, se realiza en un número muy limitado de centros de referencia, y requiere la realización de una biopsia intestinal con recogida de múltiples muestras para estudio fluorocitometrico o genético (León, 2010, J Immunol Methods 5:177-186). Para realizar esa biopsia es necesario descartar que el paciente este consumiendo gluten de forma involuntaria.
La falta de un marcador preciso para el control del cumplimiento de la DSG es pues todavía una cuestión sin resolver de gran importancia clínica, y es especialmente difícil en el caso de leves transgresiones dietéticas (Fernández-Calle y col., 1993, Gut, 34:774-777). No hay manera de demostrar la ingesta de gluten y así evitar posibles secuelas nocivas, de hecho sólo se puede medir las consecuencias de las transgresiones dietéticas observando la inflamación de las mucosas y/o la atrofia vellositaria para lo cual se tendría que realizar biopsias intestinales y como consecuencia anestesiar al paciente con las posibles consecuencias que ello pueda tener. Por otro lado, el estudio histológico de la biopsia intestinal, aunque muy sensible al consumo de gluten (>80%), es muy poco especifico (<60% al existir múltiples afecciones intestinales que producen atrofia de vellosidades). En el polo opuesto de especificidad (>95%) y sensibilidad a las transgresiones dietéticas moderadas (<40%) se encuentra el control de la anti-tTG, que ha sido propuesto como un marcador para evaluar el estricto cumplimiento de la DSG, sin embargo la eficacia de dicho marcador para controlar la ingesta de gluten aún no está clara (Tack y col., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213) debido a la mencionada falta de sensibilidad frente al consumo de cantidades bajas u ocasionales de gluten. Otros marcadores han sido propuestos para el seguimiento de la dieta, como por ejemplo la prueba de permeabilidad (Duerksen et al., 2005) o la calprotectina fecal (Ertekin y col., 2010, J Clin Gastroenterol., 44:544-546.) pero su validez no ha sido demostrada. Estos métodos pueden mostrar que existen procesos inflamatorios, de tal manera que si los valores de estos marcadores se encuentran modificados puede ser como consecuencia de enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias intestinales o de procesos de alergia, lo que significa que no tienen por qué ser una medida del consumo directo de gluten. En definitiva a día de hoy, no existe un método eficaz para comprobar que el enfermo celíaco esté realizando una DSG o descartar la posibilidad de que los síntomas de la EC refractaria sean debidos a una intolerancia hipersensible a trazas de gluten asociada a una exposición involuntaria a los cereales tóxicos. Este hecho tiene consecuencias inmediatas en la elección terapéutica, puesto que descartar el consumo de gluten es el primer paso en el algoritmo diagnóstico y terapéutico de la EC Refractaria.
El cumplimiento de la dieta evaluado mediante entrevista ha sido sugerido como marcador de control de la EC por su bajo coste, su no invasividad, y su demostrada correlación con el daño intestinal. Sin embargo, la DSG supone numerosas restricciones para los pacientes debido a sus implicaciones sociales y económicas. Además, una dieta libre de gluten es difícil de mantener debido a la ubicuidad del gluten en los alimentos, a la desinformación educativa, a las variaciones en el etiquetado de los alimentos y a la posible contaminación cruzada de éstos (Bethune y col., 2009, Chem Biol., 16:868-881 ; Selimoglu y Karabiter, 2010, J Clin Gastroenterol., 44:4-8). Por otra parte, ciertos estilos de vida y algunos sectores de la población dificultan, en cierta medida, el cumplimiento de la DSG. Además no existe una alternativa a las entrevistas a los pacientes para conocer cuánto de fiables son los resultados obtenidos de estos estudios clínicos.
Una medida más directa sobre la ingestión de gluten podría proporcionar información crítica sobre el paciente: la detección del incumplimiento de la DSG antes del daño anatómico, la detección del consumo inadvertido, la evaluación de la exactitud de la adherencia al tratamiento en el periodo inicial tras el diagnóstico cuando los pacientes están menos familiarizados con la dieta, etc., proporcionando una confirmación fácil y fiable de los resultados obtenidos. Por tanto, un marcador sensible y fiable para monitorizar y detectar la ingesta de gluten podría ser una herramienta útil para el correcto cumplimiento de la DSG y, probablemente, para un diagnóstico preciso de la EC refractaria.
Los anticuerpos monoclonales (moAbs) G12 y A1 obtenidos frente al principal epítopo inmunogénico de la α-gliadina han demostrado ser muy útiles en la detección de péptidos tóxicos en muestras de alimentos, así como en investigación clínica de desintoxicación enzimática del gluten (Morón y col., 2008, Am J Clin Nutr., 87:405-414; Morón y col., 2008, PloS ONE, 3:e2294; Ehren y col., 2009, PloS ONE, 4:e6313; Alvine Pharmaceuticals, Inc., Biomedal S.L.). La sensibilidad y especificidad de los anticuerpos monoclonales y su capacidad para reconocer péptidos resistentes a la digestión gastrointestinal los podrían hacer ideales para la monitorizacion de péptidos inmunotóxicos del gluten obtenidos tras digestión intestinal en muestras humanas. Los epítopos de reconocimiento del moAb G12, QP(Q/E)LP(Y/F), están presentes en los principales péptidos descritos recientemente en un rastreo de alto rendimiento realizado con 2.700 péptidos procedentes de prolaminas de diferentes cereales (Tye- Din y col., 2010, Sci Transí Med., 2:41ra51). Los fragmentos peptídicos no digeridos procedentes de la ingesta de gluten y no absorbidos, podrían ser recuperados de las heces, lo que demostraría la ingesta de gluten del individuo.
En esta patente, hemos evaluado la viabilidad de la monitorizacion de gluten intacto y digerido en las heces mediante la detección de epítopos relacionados con el péptido 33-mer, que podría ser aplicada en estudios clínicos y de seguimiento de la dieta, así como también, en el diagnóstico de la EC refractaria.
Descripción de las figuras
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, con carácter ilustrativo y no limitativo, las figuras siguientes:
Figura 1. Determinación del tiempo de eliminación del gluten ingerido en individuos sanos sometidos a dieta sin gluten (DSG) durante 7 días. A. ELISA competitivo para la determinación de la concentración de 33EPs (ng/g) en heces (n=4). LC: Límite de cuantificación. Cada una de las muestras fue analizada por triplicado. Se muestra máximo, mínimo y percentiles 25 y 75. B. Ejemplo inmunocromatográfico representativo de las muestras recogidas para uno de los sujetos durante el periodo de estudio. La franja azul es un control interno positivo que indica que el dispositivo ha funcionado correctamente, y la franja rosa indica la presencia de gluten.
Figura 2. Análisis de los niveles de gluten excretado a través de las heces de un paciente celíaco sometido a provocación con gluten durante 6 días. Determinación de los niveles de péptido tóxico (ng/g heces) mediante ELISA competitivo G12. Los resultados fueron expresados como la media ± DE de los datos obtenidos en tres experimentos independientes con tres replicas cada uno.
Descripción de la invención
La dieta sin gluten es el único tratamiento efectivo a día de hoy para la enfermedad celíaca. Por ello, el cumplimiento de la DSG en los pacientes debe ser monitorizado para evitar daños acumulativos directos e indirectos, así como también, para confirmar que la persistencia de cualquier síntoma típico de la celíaca no se debe a una infracción(voluntaria o no) de la dieta. Sin embargo, actualmente no se dispone de métodos para controlar el cumplimiento de la dieta en pacientes con enfermedad celíaca.
La presente invención tiene como objeto la aplicación de métodos inmunológicos para monitorizar el cumplimiento de la dieta libre de gluten mediante la detección en heces de péptidos inmunotóxicos resistentes a digestión gastrointestinal. Es objeto de la invención la aplicación de técnicas inmunológicas basadas en anticuerpos que reconocen péptidos inmunogénicos del gluten que resisten la digestión gastrointestinal. Preferentemente, la invención emplea técnicas inmunológicas que usan anticuerpos que reconocen el péptido 33-mer de la gliadina. Se tendría una forma preferente de realizarse la detección de los péptidos mediante métodos cualitativos rápidos basado en tiras inmunocromatográficas o bien por métodos cuantitativos y automatizables como las técnicas de ELISA. El método preferente usado en la invención debe permitir detectar gluten ingerido equivalente a 50 mgs de gluten de trigo por día, que es la cantidad máxima descrita para una dieta sin gluten, o en su caso un mínimo de 20 ppms de gluten equivalente en heces. Es objeto también de la presente patente kits o dispositivos analíticos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente al 33-mer de gliadina que estén indicados para la detección de los péptidos del gluten en heces.
Dicho procedimiento y kits analíticos tienen también su objeto de la patente en su uso para revelar la falta de adherencia a la DSG, ya sea debido a la contaminación de los alimentos consumidos o a una ingesta voluntaria/involuntaria ocasional de alimentos que contienen gluten. Además, es objeto de la presente invención la aplicación de la detección de dichos péptidos inmunotóxicos en heces para el control de la investigación clínica sobre la enfermedad celíaca, incluidas las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas del gluten, secuestrantes de péptidos inmunotóxicos, y otras terapias alternativas.
El objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para detección o monitorización del gluten ingerido mediante detección de péptidos inmunotóxicos en las heces, caracterizado por el uso de métodos inmunológicos con anticuerpos que reconocen, preferentemente a epítopos relacionados con el péptido 33-mer de la gliadina y otras secuencias peptídicas resistentes a las digestión gastrointestinal.
Es objeto de la presente invención el uso de técnicas inmunológicas para dicha monitorización de gluten, métodos inmunológicos tales como ELISA indirecto, ELISA competitivo, ELISA sandwich, tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, Western blot, biosensores basados en reacciones electroquímicas catalizadas por enzimas acoplados a los anticuerpos, por partículas magnéticas tapizadas por anticuerpos, por resonancia de plasmones superficiales, y demás técnicas en las que se detecta la unión de un analito a un anticuerpo.
En una forma preferente de la invención, estos métodos se caracterizan porque emplean preferentemente uno o varios anticuerpos monoclonales con capacidad para detectar epítopos contenidos o similares al péptido 33-mer (SEQ ID N° 1), como pueden ser las secuencias siguientes: SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8. En una forma preferente de la invención los anticuerpos usados por las técnicas inmunológicas serían el G12 y el A1 por su demostrada relación de su reactividad con la potencial inmunotoxicidad de una muestra. También contempla la invención el uso del anticuerpo R5 que reacciona con el epítopo SQ ID N° 9, que también puede hallarse en péptidos del gluten resistente a digestión gastrointestinal, pero con menor especificidad antes péptidos inmunogénicos resistentes a las proteasas. Una forma preferente de la Invención sería el empleo de métodos inmunológicos basados en el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permita un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorigénicos o luminiscentes. Este procedimiento podría usar un patrón de gliadina, gliadina hidrolizada, péptido 33-mer completo o una parte de su secuencia de al menos 6 aminoácidos (SEQ ID N° 2).
Otro objeto de la invención lo constituyen el uso particular de tiras inmunocromatográficas basadas en los anticuerpos anti-33-mer de gliadina, G12 y A1 que permiten una detección semicuantitativa y rápida de los péptidos/proteínas del gluten contenidos en las heces.
La invención propone una medida del gluten ingerido por el individuo a través de la dieta. Se trata de un procedimiento útil para el control del gluten ingerido mediante el empleo de métodos analíticos en los que se ha demostrado una correlación entre la cantidad de gluten ingerida y las estimaciones de proteínas/péptidos del gluten en heces obtenidas a través de estos procedimientos.
La invención propone un instrumento analítico para la monitorización del cumplimiento de la DSG, así como también para descartar la ingesta no controlada de gluten en los pacientes sospechosos de sufrir la llamada enfermedad celíaca refractaria. Además, con este procedimiento, las nuevas alternativas terapéuticas para la desintoxicación enzimática del gluten y otra terapias alternativas también podrán ser controladas en las heces de los pacientes celíacos sometidos a ensayos clínicos o a una prescripción terapéutica en el futuro, ya que la efectividad de la terapia se podría determinar midiendo la presencia o ausencia de péptidos en heces tras 12-48 horas de la ingesta de alguna cantidad controlada de gluten junto con las terapias que eliminen los péptidos inmunotóxicos
Cuestiones aún sin resolver en la práctica clínica, como son el control de una DSG o el control de la exposición involuntaria al gluten por contaminación de los alimentos, podrían ser resueltas con simples ensayos inmunológicos de las heces. Médicos, clínicos y analistas podrían considerar útiles estos métodos para el diseño de ensayos clínicos y seguimientos de sus pacientes celíacos a para establecer conclusiones coherentes sobre el estado de la enfermedad del paciente.
La extracción de los péptidos en las heces se puede llevar a cabo directamente con una solución hidroalcohólica del 40 al 60%. En algunas ocasiones por la naturaleza del alimento ingerido, podría mejorarse la extracción del gluten en heces añadiendo una solución con agentes dispersantes como el cloruro de guanidinio, el cloruro de arginina, etc; o bien detergentes como la polivinilpirrolidona, y agentes reductores como el b-mercaptoetanol, el DTT o el TCEP.
Posteriormente los polipéptidos del gluten extraídos se diluyen en una solución salina tamponada y se usan entonces para hacer la medida con un ELISA, bien competitivo, bien sandwich si se quiere tener una idea de la concentración de los péptidos reactivos. La recta patrón se podría hacer con gliadina estándar pepsino- tripsinada, para simular su digestión gástrica, También se podría usar directamente polipéptido sintetizado que reaccione con los anticuerpos, preferentemente, el 33-mer de gliadina o fragmentos del mismo con la opción de poner algunas modificaciones puntuales que mantengan la reactividad frente a los anticuerpos. Así por ejemplo se podrían usar los péptidos siguientes para los anticuerpos G12: SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, y SEQ ID N° 4. Para el A1 además del 33-mer serían válidos los péptidos SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 o SEQ ID N° 8 para hacer la recta patrón con un ELISA competitivo.
Para un ensayo cualitativo en las que se viera si el valor de polipéptidos del gluten en heces es mayor o menor de una cierta cantidad, se podría usar una tiras inmunocromatográficas que usen el anticuerpo G12 o A1 o bien ambos. El procedimiento se podría llevar a cabo con un kit que contuviese la solución de extracción de los polipéptidos en heces; un patrón de referencia con polipéptidos del gluten hidrolizados por pepsina y tripsina o bien sintetizados; y los componentes de un ELISA con una placa multipocillo y usando los anticuerpos A1 y/o G12 para inmovilizar los pocilios y/o para el revelado del ensayo, o bien tiras inmunocromatográficas.
Realización preferente de ia invención
Ejemplo 1. Evaluación de la viabilidad de monitorización de la DSG mediante determinación de péptidos/proteínas del gluten a través de las heces.
El siguiente ejemplo se lleva a cabo con el objetivo de determinar el tiempo necesario para excretar el gluten consumido en distintos individuos durante días previos y la capacidad de los métodos ¡nmunológicos G12 en la detección de dicho gluten. Así mismo, se estudió la viabilidad y la sensibilidad de los métodos ¡nmunológicos G12 para detectar microdosis de gluten en cantidades conocidas.
Se recogieron muestras fecales de sujetos sanos (n=15) mientras mantenían una dieta no controlada en la que se incluía un consumo de gluten diario (al menos un trozo de pan blanco en el desayuno y una ingesta normal de pasta, galletas, etc.) y seguidamente, se analizó la presencia de péptidos/proteínas del gluten mediante tiras inmunocromatográficas basadas en el anticuerpo G12 (IC-strips G12) y un ELISA competitivo con el anticuerpo G12. La concentración de péptidos/proteínas del gluten obtenida mediante IC-strips fue al menos 100 veces superior a su límite de detección en todos los casos analizados. Así mismo, mediante ELISA competitivo G12 se confirmó la presencia de péptidos tóxicos equivales al 33-mer (33EPs) en todas las muestras fecales procedentes de individuos en dieta con gluten y con valores de excreción entre 226 y 87.092 ng 33EPs/g heces, lo que sugiere que el grado de hidrólisis está fuertemente relacionado con la dieta, el tipo de alimento con gluten consumido y/o las características individuales, tales como la flora intestinal. Aun así, en todos los casos se detecta presencia de péptidos del gluten.
Una vez comprobado que estos métodos ¡nmunológicos eran capaces de detectar gluten en heces, se determinó el tiempo necesario para excretar los péptidos/proteínas del gluten previamente ingeridos. Para ello, un grupo de voluntarios sanos que mantenían una dieta con gluten fueron expuestos a una DSG durante una semana y sus muestras fecales fueron recogidas durante todas los días a lo largo del período en DSG. Según los resultados obtenidos mediante IC-strips y ELISA competitivo G12 fueron necesarios de 2 a 4 días para encontrar niveles indetectables de gluten en heces (Figura 1).
Actualmente se sabe que una parte significativa de los pacientes celíacos muestran una morfología anormal del intestino delgado a pesar de mantener una dieta libre de gluten, probablemente, esto sea debido a una ingesta persistente de pequeñas cantidades de gluten. Catassi y col. (2007, Am J Clin Nutr., 85:160-166) demostraron que en el tratamiento de la enfermedad celíaca es necesaria una ingesta de gluten por debajo 50 mg de gluten al día. Por tanto, con el fin de comprobar si los métodos basados en el anticuerpo monoclonal (AcMo) G12 eran capaces de detectar estas pequeñas cantidades de gluten en muestras fecales, dosis crecientes de gluten (de 50 mg hasta un máximo de 1g de gluten al día) fueron administradas después de una microdosis inicial de 50 mg de gluten. Los sujetos consumieron cantidades controladas de un pan blanco estándar que contenía 25 mg de gluten por pieza y el contenido de gluten fue analizado en sus muestras fecales utilizando IC-strips y ELISA competitivo G12. Ambos métodos fueron capaces de detectar gluten en heces en consumos superiores a 50 mg de gluten al día, con variaciones interindividuales probablemente debidas a diferencias en la digestión entre individuos y/o variaciones en el consumo de alimentos acompañantes. Ejemplo 2. Cuantificación de péptidos/proteínas del gluten en heces de pacientes celíacos
Con el fin de conocer si los métodos basados en el AcMo G12 eran adecuados para la monitorización del gluten consumido en pacientes celíacos, se llevó a cabo un estudio en el que se determinó los péptidos/proteínas del gluten excretados en heces de estos individuos con enfermedad celíaca. El estudio incluyó 43 pacientes con enfermedad celíaca en remisión, los cuales habían estado en DSG por un periodo superior a 2 años, 7 pacientes con enfermedad activa que se encontraban manteniendo una dieta normal en la que el gluten estaba presente hasta el momento del diagnóstico y 3 pacientes en DSG que fueron sometidos a provocación con gluten. Pacientes con otras patologías intestinales y controles sanos fueron usados como controles en este estudio. En 42 de los 43 pacientes con enfermedad celíaca en remisión se encontraron niveles de gluten tóxico en heces por debajo del límite de detección del método. Sin embargo, el paciente restante mostró niveles de gluten por encima de 6 ppm. El paciente, al ser entrevistado al final del estudio confirmó el incumplimiento de la DSG y el consumo de una galleta (que contenía gluten) durante el periodo de estudio. Para el caso de los pacientes con enfermedad activa, niveles de gluten superiores a 6 ppm fueron encontrados en todas las muestras fecales mientras ellos se encontraban en el período de dieta con gluten (118-135 ng 33EPs/g de heces).
Con el objetivo de determinar la presencia de gluten en heces de pacientes en remisión, muestras fecales de 3 pacientes celíacos fueron recogidas durante un periodo de provocación con gluten. Esta provocación fue realizada para confirmar el diagnóstico de enfermedad celíaca. De los 3 pacientes sometidos a provocación con gluten, 2 desarrollaron síntomas tales como vómitos, dolor abdominal y diarrea en los primeros días de la administración de gluten, por lo que fueron excluidos del estudio. Sin embargo, para el paciente que toleró la provocación con gluten, se recogieron muestras fecales durante dicho periodo y se determinaron los niveles de péptidos/proteínas del gluten excretadas mediante métodos inmunológicos G12. De acuerdo con los resultados obtenidos mediante ELISA competitivo G12 (Figura 2), la excreción de péptidos del gluten comenzó en el tercer día de la provocación. Entre los días 3 y 6, los niveles de péptidos tóxicos oscilaron entre 417 y 7.037 ng 33EPs/g de heces. Estos resultados fueron corroborados mediante IC-strips G12.
En sujetos control no celíacos con otras patologías intestinales, el contenido de gluten osciló entre 201 y 29.076 ng 33EPs/g de heces mientras mantenían una dieta normal en la que se incluía el gluten. Las variaciones intra- e inter-individuales encontradas podrían estar relacionadas con la dieta, el tipo de alimentos con gluten consumidos y la variabilidad en la degradación fermentativa.
Ejemplo 3. Evaluación de la viabilidad de monitorización de la DSG mediante determinación de péptidos/proteínas del gluten a través de las heces usando el anticuerpo R5
El presente ejemplo demuestra cómo otros anticuerpos que no han sido creados directamente por inmunización frente al 33-mer pero que lo reconocen, aunque con menor especificidad, pueden ser usados para evaluar el cumplimiento de la DSG en pacientes celíacos. Para este estudio fueron usados métodos inmunologicos basados en el anticuerpo R5 tales como ELISA tipo sándwich y tipo competitivo, así como, strips inmunocromatográficos. Siguiendo las instrucciones del proveedor se determinó la capacidad del AcMo R5, anticuerpo que reconoce las secuencias SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10 para detectar gluten en las muestras fecales previamente ensayadas.
Los valores de péptidos/proteínas del gluten en individuos que mantenían una dieta normal, en la que se incluía un consumo de gluten diario, estuvieron en todos los casos analizados por encima del límite de detección del método R5. Sin embargo, las muestras de heces recogidas durante el periodo en el que los individuos mantuvieron una dieta exenta de gluten presentaron niveles de péptidos/proteínas indetectables por cualquiera de los métodos inmunologicos R5 estudiados. Por lo tanto, los resultados obtenidos demuestran que al igual que el AcMo G12 y A1 , el anticuerpo R5 fue capaz de detectar péptidos/proteínas del gluten en muestras de heces. Estos resultados son equivalentes a los ya obtenidos mediante IC-strips y ELISA competitivo G12 y A1.

Claims

Reivindicaciones
1. - Procedimiento para la monitorización de gluten en heces en el que los métodos inmunologicos usan al menos un anticuerpo con capacidad para detectar los epítopos: SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10.
2. - Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos del gluten en heces según la reivindicación 1 en el que los métodos inmunologicos usan el anticuerpo monoclonal antiprolamina R5 conjugado a un enzima que permite un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorigénicos o luminiscentes.
3. - Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos del gluten en heces según la reivindicación 1 mediante métodos inmunologicos que usan el anticuerpo monoclonal antiprolamina A1 conjugado a un enzima que permite un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorogénicos o luminiscentes.
4. - Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten en heces según la reivindicación 1 mediante un ensayo inmunológico en el que los métodos inmunologicos para la realización de un ensayo semicuantitativo está basado en tiras inmunocromatográficas de detección rápida.
5. - Uso de procedimientos analíticos según las reivindicaciones 1 a 4 para controlar las transgresiones dietéticas en sujetos sanos, pacientes celíacos activos, pacientes celíacos en remisión y pacientes con otras enfermedades gastrointestinales.
6. - Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten en heces mediante un ensayo inmunológico según la reivindicación 1 , caracterizado porque se usa como patrón de referencia algunos péptidos que contenga epítopos descrito en dicha reivindicación.
7. - Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 6 para evaluar diferencias en la flora microbiana en cuanto a su capacidad para degradar el gluten ingerido en sujetos no celíacos, pacientes celíacos activos y pacientes celíacos en remisión.
8. - Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 7 para evaluar el diseño y control de terapias individualizadas de inmunización/ desensibilización basadas en la ingesta controlada de cantidades crecientes de gluten.
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