JP2018201524A - 標的分子を検出する非侵襲的方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、電子形式で配列表とともに出願されている。配列表は、およそ231KBの大きさである、2011年9月7日に作成されたUSA_007WO.TXTと題されたファイルとして提供されている。配列表の電子形式での情報は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
被験体の生理学的状況を評価するための方法であって、
上記被験体から胃腸洗浄液を得ることと、
上記胃腸洗浄液中の胃腸系の外側に由来する標的分子を検出することと
を含む方法。
(項目2)
被験体の生理学的状況を評価するための方法であって、
上記被験体から糞便試料を得ることと、
上記糞便試料中の胃腸系の外側に由来する標的分子を検出することと
を含む方法。
(項目3)
上記胃腸洗浄液が、上記被験体の胃腸系を部分的に浄化することによって上記被験体から得られる、項目1に記載の方法。
(項目4)
上記胃腸洗浄液が、糞便物質を含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記糞便試料が、胃腸洗浄液を含む、項目2に記載の方法。
(項目6)
上記標的分子が、ポリペプチド、抗体、胆汁酸、代謝産物またはグリカンを含む、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
上記標的分子が、バイオマーカーを含む、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
上記バイオマーカーが、疾患、治療に対する正の応答、治療に対する部分的応答、治療に対する負の応答または治療に対する応答がないことと関連している、項目7に記載の方法。
(項目9)
上記標的分子が、癌または癌の素因の存在と関連している、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
上記癌が、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌または胃癌である、項目8に記載の方法。
(項目11)
上記標的分子が、付属消化腺に由来する、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
上記付属消化腺が、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である、項目11に記載の方法。
(項目13)
上記被験体に洗浄液を投与することをさらに含む、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
上記洗浄液が、経口投与される、項目13に記載の方法。
(項目15)
上記洗浄液が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む、項目13に記載の方法。
(項目16)
上記洗浄液が、GOLYTELY、HALFLYTELY、NULYTELY、SUPREP、FLEETのPHOSPHO−SODA、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される、項目13に記載の方法。
(項目17)
上記被験体に対して大腸内視鏡検査を実施することをさらに含む、項目1から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
上記被験体が、哺乳類である、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
上記被験体が、ヒトである、項目1から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
バイオマーカーを同定するための方法であって、
目的の状態または生理学的状況を有する複数の試験被験体から試験胃腸洗浄液、および上記状態も上記生理学的状況も有さない複数の対照被験体から対照胃腸洗浄液を得ることと、
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも5種の標的分子のレベルを決定することと、
上記対照胃腸洗浄液中のレベルに対して上記試験胃腸洗浄液中で有意に異なるレベルで存在する標的分子を同定し、それによってバイオマーカーを同定することと
を含む方法。
(項目21)
上記胃腸洗浄液が、糞便物質を含む、項目20に記載の方法。
(項目22)
上記標的分子が、ポリペプチド、胆汁酸、抗体、代謝産物、グリカンおよびそれらの組合せからなる群より選択される、項目20から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも10種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目20から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも20種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目20から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも30種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目20から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも50種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目20から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも100種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目20から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
上記バイオマーカーが、疾患、治療に対する正の応答、治療に対する部分的応答、治療に対する負の応答または治療に対する応答がないことと関連している、項目20から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
上記バイオマーカーが、癌または癌の素因の存在と関連している、項目20から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
上記癌が、膵臓癌、肝臓癌または胃癌である、項目28に記載の方法。
(項目31)
少なくとも1種の標的分子が、付属消化腺に由来する、項目20から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
上記付属消化腺が、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である、項目31に記載の方法。
(項目33)
上記試験被験体および上記対照被験体に洗浄液を投与することをさらに含む、項目20から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
上記洗浄液が、経口投与される、項目33に記載の方法。
(項目35)
上記洗浄液が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む、項目33に記載の方法。
(項目36)
上記洗浄液が、GOLYTELY、HALFLYTELY、NULYTELY、SUPREP、FLEETのPHOSPHO−SODA、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される、項目33に記載の方法。
(項目37)
上記試験被験体および上記対照被験体に対して大腸内視鏡検査を実施することをさらに含む、項目20から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
上記試験被験体および上記対照被験体が、哺乳類である、項目20から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
上記試験被験体および上記対照被験体が、ヒトである、項目20から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
バイオマーカーを同定するための方法であって、
目的の状態を有する複数の試験被験体から試験糞便試料および複数の対照被験体から対照糞便試料を得ることと、
上記試験糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも5種の標的分子のレベルを決定することと、上記対照糞便試料中のレベルに対して上記試験糞便試料中で有意に異なるレベルで存在する標的分子を同定し、それによってバイオマーカーを同定することと
を含む方法。
(項目41)
上記糞便試料が、胃腸洗浄液を含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
上記標的分子が、ポリペプチド、核酸、胆汁酸、抗体、代謝産物、グリカンおよびそれらの組合せからなる群より選択される、項目40から41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
上記試験糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも10種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
上記糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも20種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
上記糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも30種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
上記糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも50種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
上記糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも100種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
上記バイオマーカーが、疾患、治療に対する正の応答または治療に対する負の応答と関連している、項目40から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
上記バイオマーカーが、癌または癌の素因の存在と関連している、項目40から48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
上記癌が、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌または胃癌である、項目49に記載の方法。
(項目51)
少なくとも1種の標的分子が、付属消化腺に由来する、項目40から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
上記付属消化腺が、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である、項目51に記載の方法。
(項目53)
上記試験被験体および上記対照被験体が、哺乳類である、項目40から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
上記試験被験体および上記対照被験体が、ヒトである、項目40から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
胃腸洗浄液中の標的分子を検出するためのキットであって、
被験体へ経口投与するための洗浄液と、
上記被験体から上記胃腸洗浄液を収集するための容器と、
胃腸系の外側に由来する標的分子を検出するための薬剤と
を含むキット。
(項目56)
糞便試料中の標的分子を検出するためのキットであって、
被験体へ経口投与するための洗浄液と、
上記被験体から上記糞便試料を収集するための容器と、
胃腸系の外側に由来する標的分子を検出するための薬剤と
を含むキット。
(項目57)
プロテアーゼ阻害剤をさらに含む、項目55から56のいずれか一項に記載のキット。
(項目58)
上記標的分子が、ポリペプチド、抗体、胆汁酸、代謝産物またはグリカンを含む、項目55から57のいずれか一項に記載のキット。
(項目59)
上記標的分子が、バイオマーカーを含む、項目55から58のいずれか一項に記載のキット。
(項目60)
上記バイオマーカーが、疾患、治療に対する正の応答または治療に対する負の応答と関連している、項目59に記載のキット。
(項目61)
上記標的分子が、癌または癌の素因の存在と関連している、項目55から60のいずれか一項に記載のキット。
(項目62)
上記癌が、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌または胃癌である、項目61に記載のキット。
(項目63)
上記標的分子が、付属消化腺に由来する、項目55から62のいずれか一項に記載のキット。
(項目64)
上記付属消化腺が、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である、項目63に記載のキット。
(項目65)
上記洗浄液が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む、項目55から64のいずれか一項に記載のキット。
(項目66)
上記洗浄液が、GOLYTELY、HALFLYTELY、NULYTELY、SUPREP、FLEETのPHOSPHO−SODA、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される、項目55から64のいずれか一項に記載のキット。
本明細書において提供される方法および組成物の一部は、GI管および付属消化腺を含めたGI管と関連する器官/組織に関する。当技術分野では周知であるが、GI管は、上部GI管および下部GI管を含む。上部GI管は、口腔または頬側口腔、食道、胃および十二指腸を含む。下部GI管は、空腸、回腸および大腸および肛門を含む。大腸は、虫垂、盲腸、結腸および直腸を含む。
一般に、洗浄液は、被験体に経口投与され得、経口洗浄液は、被験体のGI管を通過し、得られるGLFが被験体から収集される。本明細書において、用語「被験体」とは、哺乳動物、例えば、ヒトなどの動物を含み得る。上記のように、GLFは、糞便/便試料の検査よりも清潔なGI管のサンプリングを提供する。GLFは、食物の摂取、種類および消化状態と関連する可変性を軽減すると思われる。
本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、被験体からGLFを得ることを含む。GLFを得る方法は、当技術分野で周知である。例えば、S字結腸鏡検査、大腸内視鏡検査、X線検査、腸の手術を受ける患者のための準備などの医療手順およびまたは診断手順の際に、腸および結腸が、完全に浄化され、清浄化されることが重要である。特に、腸管粘膜の適切な可視化を可能にするよう、結腸からできるだけ多くの糞便物質が除去されることが必須である。これは、例えば、軟性S字結腸鏡検査または大腸内視鏡検査などの診断手順、結腸の疾患について患者をスクリーニングするために広く実施される診断検査の前には重要である。さらに、結腸の満足のいくX線写真を得るためには、腸管が完全に洗浄されることが重要である。同一状態はまた、結腸が手術のために術前準備される場合、糞便老廃物の除去が、患者の安全にとって非常に重要である場合にも当てはまる。内視鏡的検査のために結腸を準備するには、現在の清浄化手順は、直立歩行結腸洗浄を含む。直立歩行洗浄は、被験体に、4Lのポリエチレングリコール/電解質溶液(参照によりその全文が組み込まれる米国特許出願公開第20070298008号)を含む洗浄組成物を経口投与することを含み得る。いくつかの実施形態は、順行性洗浄および逆行性洗浄を含む。
本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、GI管から得られた試料中の標的分子を検出する方法またはこのような検出にとって有用な組成物に関する。本明細書において、「標的分子」は、GI管から得られた試料中で検出または測定または同定され得る任意の分子を含む。このような試料として、被験体から得られたGLFおよび被験体から得られた糞便試料が挙げられる。標的分子の例として、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、突然変異体タンパク質、選択的スプライシングから生じたタンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、例えば、グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質などの修飾されたタンパク質、抗体(例えば、自己抗体、IgG、IgAおよびIgM)、抗体断片、糖、例えば、単糖、二糖、オリゴ糖およびグリカン、脂質、小分子、例えば、代謝産物、医薬組成物、代謝された医薬組成物およびプロドラッグなどの分子が挙げられる。標的分子のさらなる例として、胆汁酸塩および胆汁酸、例えば、コール酸が挙げられる。さらなる例として、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸およびリトコール酸が挙げられる。標的分子は、GI管およびGI管の外側に由来し得る、例えば、付属消化腺などのGI管と関連している器官および/または組織に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞の断片およびその他の副生成物(biproduct)、例えば、赤血球、白血球および内皮細胞を含めた細胞、生物、例えば、細菌、原虫ならびにウイルスおよびウイルス粒子が、GLFまたは糞便試料中で検出され得る。いくつかの実施形態では、標的分子は、本明細書における表1〜10またはその一部のいずれかに列挙されるタンパク質またはその一部のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、表1〜10のいずれかに列挙されるタンパク質の一部は、表1〜10中に列挙されるタンパク質のいずれかの少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも50個または50個を超える連続するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、標的分子は、配列番号01〜804のうち1種のポリペプチドを含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。配列番号01〜804のうち1種から本質的になるポリペプチドは、配列番号01〜804中のものに対してさらなるアミノ酸または置換アミノ酸を、このようなさらなるアミノ酸または置換アミノ酸が、ポリペプチドが検出可能であることを妨げない場合に含み得る。
本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、GLFまたは糞便試料中の標的分子を特性決定することを含む。標的分子を特性決定することは、例えば、標的分子を同定すること、標的分子を検出することおよび/または標的分子を定量することを含み得る。標的分子を同定、検出および定量する方法は、当技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、GLFまたは糞便試料中で検出される標的分子を、評価して、それらが、疾患または生理学的状況などの特定の状態と関連しているバイオマーカーであるかどうかを決定できる。このようなバイオマーカーは、特定の疾患、疾患素因、予後、特定の治療計画に対する正の応答または特定の治療計画に対する負の応答を示し得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの有無またはそのレベルが、疾患または生理学的状況などの特定の状態と関連している場合がある。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの有無またはそのレベルを、疾患または生理学的状況などの特定の状態と統計的に相互に関連付けることができる。いくつかの実施形態では、生理学的状況は、疾患を含み得る。いくつかの実施形態では、疾患または生理学的状況などの状態を有する被験体におけるバイオマーカーの発現のレベルを、状態または生理学的状況を有さない被験体におけるバイオマーカーの発現のレベルと比較することによって、バイオマーカーを疾患または生理学的状況などの特定の状態と相互に関連付けることができる。
本明細書において提供された方法および組成物のいくつかの実施形態は、GLFまたは糞便試料中の標的分子を検出するため、GLFまたは糞便試料中の標的分子の有無を決定するため、GLFまたは糞便試料中の標的分子を定量するため、またはGLFまたは糞便試料中の標的分子を同定するためのキットに関する。いくつかのこのようなキットは、被験体に経口投与するための洗浄組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウムおよびビサコジルなどの成分を含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄液は、場合により、ビサコジルまたはアスコルビン酸も含めた電解質溶液とともにポリエチレングリコールを含み得る(例えば、GOLYTELY、HALFLYTELY、NULYTELY、MOVIPREP)。いくつかの実施形態では、洗浄液は、リン酸塩(例えば、FLEETのPHOSPHO−SODA)を含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄液は、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムまたは硫酸カリウムなどの硫酸塩を含み得る(例えば、SUPREP)。いくつかの実施形態では、洗浄液は、クエン酸マグネシウムを含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ピコスルファートナトリウムを含み得る。
本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、特定の疾患の診断、予後に関する。いくつかの実施形態は、GI管およびそれと関連している器官と関連している疾患および障害を含む。例示的疾患として、GI管およびそれと関連している器官の癌、例えば、胃癌、肝臓癌、膵臓癌が挙げられる。疾患のさらなる例として、膵炎、膵臓腺癌、胃腸神経内分泌腫瘍、胃腺癌、結腸腺癌、肝細胞癌腫、胆管癌、胆嚢腺癌(adenoccarcinoma)、潰瘍性大腸炎およびクローン病が挙げられる。いくつかの疾患は、炎症性腸疾患(IBD)に関する。本明細書において、用語「炎症性腸疾患」とは、胃腸管の少なくとも一部の炎症を特徴とする広範なクラスの疾患を指し得る。IBD症状は、腸管の炎症を含み、腹部の筋痙攣および持続性の下痢をもたらし得る。炎症性腸疾患として、潰瘍性大腸炎(UC)、クローン病(CD)、不確定大腸炎、慢性大腸炎、不連続または斑状疾患、回腸炎症、結腸外炎症、破裂した陰窩に応じた肉芽腫性炎症、アフタ性潰瘍、貫壁性炎症、顕微鏡的大腸炎、憩室炎および空置性大腸炎が挙げられる。疾患のさらなる例として、セリアックスプルー、吸収不良障害ならびに消化管、肝臓、膵臓および胆樹のその他の状態が挙げられる。
硫酸塩ベースのGLFのプロテオミクス解析
この解析では、硫酸塩ベースのGLFの、プロテオミクス解析を支援する能力を評価した。硫酸塩ベースの洗浄組成物を使用して得ているGLFにおいて標的分子を同定するために、SUPREPを3人のヒト被験体に投与し、得られたGLF中のタンパク質を、質量分析によって解析した。この実施例では、GLFは、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。
ポリエチレングリコールベースのGLFのプロテオミクス解析
この解析では、ポリエチレングリコールベースのGLFの、プロテオミクス解析を支援する能力を評価した。ポリエチレンベースの洗浄組成物を使用して得ているGLFにおいて標的分子を同定するために、ポリエチレングリコールベースの洗浄組成物を2人のヒト被験体に投与し、得られたGLF中のタンパク質を、実施例1に記載されるように質量分析によって解析した。ポリエチレングリコールの除去は、洗浄液のクロロホルム抽出によって大部分が達成された。ポリエチレングリコールベースの洗浄組成物を投与されたこれらの被験体から得られたGLFにおいて、多数の異なるタンパク質が同定された。これまでの表において観察されたものと一致している、同定された最も豊富な同定されたタンパク質の例が、表3に示されている。
クエン酸マグネシウムベースのGLFのプロテオミクス解析
この解析では、クエン酸マグネシウムベースのGLFの、プロテオミクス解析を支援する能力を評価した。クエン酸マグネシウムベースの洗浄組成物を投与されたヒト被験体から得られたGLFにおいて標的分子を同定するために、クエン酸マグネシウムベースの洗浄組成物を被験体に投与し、GLFを、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。GLFのプロテオームを、実施例1に記載されるように質量分析によって解析した。GLFにおいて多数の異なるタンパク質が同定された。最も豊富な同定されたタンパク質の例が、表6に列挙されている。同定されたタンパク質の多くは、異なる大腸内視鏡検査調製物を用いて検出され、このことは、プロテオームが、使用された腸調製物に依存していないことを示唆する。
GLFをSSL−7濃縮と組み合わせて使用して得られた試料における、IgA−1およびIgA−2抗体の検出
この解析では、GLFをSSL−7濃縮と組み合わせて使用して得られた試料の、IgA−1およびIgA−2抗体を検出する能力を評価した。Staphylococcus aureus超抗原様タンパク質7(SSL−7)に対する親和性を用いて、GLFにおいて標的分子を同定するために、ヒト被験体に硫酸塩ベースの洗浄組成物(SUPREP)を投与し、SSL−7親和性ビーズを使用して各GLFにおいてタンパク質を濃縮した。GLFは、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。
GLFをプロテインL濃縮と組み合わせて使用して得られた試料における、IgAおよびIgMの検出
この解析では、GLFをプロテインL濃縮と組み合わせて使用して得られた試料の、IgAおよびIgM抗体を検出する能力を評価した。プロテインLに対する親和性を用いてGLFにおいて標的分子を同定するために、ヒト被験体に硫酸塩ベースの洗浄組成物(SUPREP)を投与し、プロテインL親和性ビーズを使用して各GLFにおいてタンパク質を濃縮した。GLFは、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。
GLFを使用して得られた試料における、細菌起源のタンパク質の検出
この解析では、GLFの細菌起源のタンパク質の検出を容易にする能力を評価した。GLFにおいて細菌と関連している標的分子を同定するために、2人のヒト被験体に硫酸塩ベースの洗浄組成物(SUPREP)を投与し、得られたGLFを、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。各GLFから100μlを用いて、Super Optimal Broth(SOB)培地に播種し、37℃、220rpm振盪で一晩インキュベートした。ペレットを、8M尿素中でビーズビーターにおいて溶解し、溶解物を、50mM重炭酸アンモニウム/10mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンで2M尿素に希釈し、配列決定等級のトリプシン(Promega、Madison、WI)を用いて消化した。データは、先に記載されるように、Orbitrap MSシステムで120分の実施を使用して獲得した。MGF検索ファイルを作成し、真正細菌として特定された生物分類学、親イオンについて(MS)10ppmおよび断片イオンについて(MS/MS)0.6Daの質量精度を用い、RefSeqデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)に対してMascot検索エンジン(Matrix Science、UK)を使用して検索した。細菌と関連しているGLF中に存在する最も豊富な同定されたタンパク質ならびにその対応するMascotスコアおよび有意なペプチドの数が、表9にまとめられている。示された試料では、培養された細菌は、Escherichia coliであった。その他の試料は、洗浄液が依然として腸細菌の一部を保持していることを示す異なる細菌を示す。
いくつかの被験体から得られた組み合わされた試料のプロテオミクス解析
GLFを使用して得られた試料において検出可能である多数の標的タンパク質の同定をさらに容易にするために、12人の被験体から個別に獲得したデータから作製した検索ファイルを、単一の検索ファイルに連結させ、Orbitrapデータについてこれまでに特定したパラメータを使用して検索した。種々のGLF試料において多数のタンパク質を分析し、p<0.05(Mascotスコアおよそ41)の閾値で検出された少なくとも3種の独特の有意なペプチドを(主に)有するタンパク質を選択した。3種のみの列挙されたタンパク質(giの5031863、6466801および115430223)が3種未満の有意なペプチドを有していたが、これらは、タンパク質同定のための95%信頼レベルを十分に上回るおよそ400のMascotスコアを有していた。この組み合わされた解析において同定されたタンパク質は、特定のタンパク質の報告された起源および報告された関連する癌とともに表10に列挙されている。表10はまた、独特の同定されたタンパク質各々について40以上のMascotスコアを有していた同定されたペプチドの配列番号を列挙する。多数の同定されたタンパク質が、膵液中に存在すると報告されている。表10中に列挙される参考文献は、本願において提供される。
糞便試料のプロテオミクス解析
この解析では、糞便試料の、プロテオミクス解析を支援する能力を評価した。糞便試料において標的分子を同定するために、ヒト被験体に洗浄組成物を投与しなかった。糞便試料は、正常な排便の際に、トイレの中に入れられた収集容器を使用して被験体から収集した。少量の糞便(便)試料を、0.1%TFA中でホモジナイズし、次いで、13000×gで遠心分離した。タンパク質を、実施例1に記載されるように、6容量のアセトンを用いて沈殿させ、0.1%TFAに再懸濁し、等容量のクロロホルムを用いて抽出し、次いで、SPEカラム中で処理した。最も豊富な同定されたタンパク質ならびにその対応するMascotスコアおよび有意なペプチドの数が、表11にまとめられている。試料において、大部分はおそらくは膵臓起源であるタンパク質が検出され、これは、GLFにおける発見後は、便が、これらのバイオマーカータンパク質の検出のための供給源であるということを示す。しかし、試料はまた、分析を、特に、バイオマーカーの発見についてはるかに制限されたものにする、いくつかのその他の非ヒト物質を含有していた。
GLFを使用して得られた試料におけるグリカンの検出
この解析では、グリカンの、GLFを使用する試料において得られた試料において検出される能力を評価した。GLFにおいてグリカンを含めた標的分子を同定および分析するために、GLFをヒト被験体から収集した。12mLの氷冷アセトンに1.8mLのGLFを添加し、1時間インキュベートしてタンパク質をペレットにした。試料を12,000×gで15分間遠心分離し、アセトンを除去した。氷冷アセトンを用いて洗浄した後、ペレットを0.1%TFAに再懸濁し、5mLのシリンジスタイルのSepPak C2カラムに通した。60%アセトニトリル/40% 0.1%TFAを用いてタンパク質を溶出した。真空下で溶媒を除去した後、タンパク質画分を100μLの50mM重炭酸アンモニウムに再溶解し、2μLのPNGaseFを用い、37℃、シェーカー中で一晩脱グリコシル化した。1mLの0.1%TFAを用いてクエンチした後、グリカンを、真空マニフォールドを使用して、1mLのシリンジスタイルのSepPak C18カラムからフロースルー画分として収集した。乾燥グリカンを、4−ABEE(エチル4−アミノベンゾエート)を用い、乾燥グリカンに、25μLの誘導体化溶液(35mM ABEEおよび100mM 2−PBを含有する90:10 MeOH:HAc)を添加することおよび65℃で2時間インキュベートすることによって還元的アミノ化によって標識した。1mLのエチルエーテルを添加すること、ボルテックス処理することおよびエーテルを廃棄することによって過剰のABEEを除去した。第2のエーテル抽出後、試料を、SpeedVac中に短時間入れて、あらゆる残存するエーテルを除去した。次いで、標識されたグリカンをHPLCで実施し、Agilent C8逆相カラムから20〜25%の間のアセトニトリルで溶出した。この画分を真空乾燥させ、50μLの0.1%TFAに再溶解し、グリカン解析のためにWaters Q−TOF LC−ESI−MSで実施した。誘導体化したグリカンは、Q−TOF MSでのC18逆相カラムから0.2%ギ酸中、約20〜25%アセトニトリルで溶出された。質量分析計は、MSのみの様式で毎秒m/z150〜2000でスキャンして、誘導体化グリカンプロファイルデータを獲得した。図1は、これらの結果をまとめており、胃腸洗浄液の画分中に存在する種々の糖タンパク質に由来するグリカン構造の相対的存在量のグラフを表す。図1に示されるように、いくつかの糖タンパク質に由来するグリカン構造は、鎖の末端切断と関連している特定の修飾を含む。これらの修飾は、細菌が、タンパク質からグリカンを消化し、消費し得ると知られるように、GLF試料中に存在する細菌活性によるものであり得る。しかし、このような修飾はまた、疾患、特に、異常なグリコシル化が疾患と関係している癌と関連している可能性がある。
GLFを使用して得られた試料における代謝産物の検出
この解析では、代謝産物の、GLFを使用して得られた試料において検出される能力を評価した。GLFにおいて代謝産物を含めた標的分子を同定および解析するために、ヒト被験体にクエン酸マグネシウムベースの洗浄組成物を投与し、コール酸およびその他の胆汁酸塩などの代謝産物について得られたGLFを解析した。得られたGLFは、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。
以下の参考文献の各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
Claims (28)
- 胃腸洗浄液中の標的分子の存在を、被験体における膵臓癌または膵臓癌の素因の指標とする方法であって、
該被験体に洗浄組成物を経口投与して、該被験体の胃腸系の浄化をもたらすことによって該被験体から得られた胃腸洗浄液中の該標的分子を検出すること
を含み、該標的分子は、膵臓癌または膵臓癌の素因と関連し、かつ、ポリペプチド、抗体およびグリカンからなる群より選択される、方法。 - 前記胃腸洗浄液が、前記被験体の胃腸系を部分的に浄化することによって該被験体から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記被験体の胃腸系が洗浄される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的分子がポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドがIgG、IgAまたはIgMである、請求項4に記載の方法。
- 前記洗浄組成物が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含み、および/または
前記洗浄組成物が、GOLYTELY、HALFLYTELY、NULYTELY、SUPREP、FLEETのPHOSPHO−SODA、クエン酸マグネシウムおよびそれらの同等物からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記洗浄組成物が浸透圧性の薬剤または緩下剤のうち少なくとも1種を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記洗浄組成物が、アロエ、ビサコジル、カサンスラノール、カスカラ芳香族流体抽出物、カスカラサグラダ樹皮、カスカラ(Cascada)サグラダ抽出物、カスカラサグラダ流体抽出物、ヒマシ油、ダンスロン、デヒドロコール酸、フェノールフタレイン、センノシドA、センノシドB、ピコスルファートおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される緩下剤を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記胃腸洗浄液を、前記標的分子を安定化または保存するための材料に曝露することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記胃腸洗浄液のpHを、前記標的分子を安定化または保存するために調整することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記材料が、酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤または変性剤のうち少なくとも1種を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記胃腸洗浄液が、前記被験体による非侵襲性自己収集によって得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記胃腸洗浄液が、大腸内視鏡検査手順の一部として得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記被験体が哺乳類である、請求項1に記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 前記胃腸洗浄液中の少なくとも5、10、20、30、50または100種の標的分子を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的分子が膵臓に由来する、請求項1に記載の方法。
- 胃腸洗浄液中の標的分子の存在を、被験体における膵臓癌または膵臓癌の素因の指標として検出するためのキットであって、
該被験体に経口投与するのに適した、該被験体の胃腸系の浄化をもたらすための洗浄組成物と;
該被験体から該胃腸洗浄液を含む試料を収集するための容器と;
該胃腸洗浄液中の該標的分子を検出するための薬剤と
を含み、該標的分子は、膵臓癌または膵臓癌の素因と関連し、かつ、ポリペプチド、抗体およびグリカンからなる群より選択される、キット。 - 前記標的分子がポリペプチドを含む、請求項18に記載のキット。
- 前記ポリペプチドがIgG、IgAまたはIgMである、請求項19に記載のキット。
- 前記標的分子を安定化または保存するための材料をさらに含む、請求項18に記載のキット。
- 前記標的分子を安定化または保存するために前記試料のpHを調整するための材料をさらに含む、請求項21に記載のキット。
- 前記材料が、酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤または変性剤のうち少なくとも1種を含む、請求項21に記載のキット。
- 前記洗浄組成物が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含み、および/または
前記洗浄組成物が、GOLYTELY、HALFLYTELY、NULYTELY、SUPREP、FLEETのPHOSPHO−SODA、クエン酸マグネシウムおよびそれらの同等物からなる群より選択される、請求項18に記載のキット。 - 前記洗浄組成物が浸透圧性の薬剤または緩下剤のうち少なくとも1種を含む、請求項18に記載のキット。
- 前記洗浄組成物が、アロエ、ビサコジル、カサンスラノール、カスカラ芳香族流体抽出物、カスカラサグラダ樹皮、カスカラ(Cascada)サグラダ抽出物、カスカラサグラダ流体抽出物、ヒマシ油、ダンスロン、デヒドロコール酸、フェノールフタレイン、センノシドA、センノシドB、ピコスルファートおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される緩下剤を含む、請求項25に記載のキット。
- 前記胃腸洗浄液中の少なくとも5、10、20、30、50または100種の標的分子を検出するための追加の薬剤を含む、請求項18に記載のキット。
- 前記標的分子が膵臓に由来する、請求項18に記載のキット。
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