ES2715181T3 - Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas - Google Patents
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Abstract
La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico, muestra un procedimiento para la monitorización de la ingestión de gluten mediante la medida de las proteínas/péptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a péptidos inmunogénicos resistentes a digestión gastrointestinal. La presencia o ausencia de dichos péptidos inmunogénicos es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos inmunogénicos del gluten que son resistente a proteólisis. Dichos ensayos pueden ser técnicas cuantitativas ELISAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc. Estas medidas también se podrían aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para mejorar el diagnóstico en casos de síntomas refractarios o agudos de la enfermedad celíaca en casos donde supuestamente se está respetando una dieta sin gluten, o a la investigación clínica de la efectividad de las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas.
Description
DESCRIPCION
Determinacion de niveles de peptidos inmunogenicos del gluten en muestras humanas
OBJETO DE LA INVENCION
La presente invencion, encuadrada en el sector medico-clfnico, muestra un procedimiento para la monitorizacion de la ingestion de gluten mediante la medida de las protefnas/peptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a peptidos inmunogenicos resistentes a digestion gastrointestinal. La presencia o ausencia de dichos peptidos inmunogenicos es controlada por ensayos inmunologicos basados en anticuerpos reactivos frente a peptidos inmunogenicos del gluten que son resistente a proteolisis. Dichos ensayos pueden ser tecnicas cuantitativas ELISAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatograficos rapidos, inmunoblots, etc. Estas medidas tambien se podrfan aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para mejorar el diagnostico en casos de sfntomas refractarios o agudos de la enfermedad celfaca en casos donde supuestamente se esta respetando una dieta sin gluten, o a la investigacion clfnica de la efectividad de las terapias enzimaticas relacionadas con desintoxicacion de las prolaminas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El gluten es un conjunto de protefnas de almacenamiento de los cereales. Las protefnas del gluten procedentes del trigo, la cebada, el centeno y, probablemente la avena, no son toleradas por individuos predispuestos geneticamente que padecen la enfermedad celfaca (EC). En el trigo, el gluten esta compuesto por una fraccion soluble en etanol (prolaminas: a, p, y y w-gliadinas); y otra insoluble, gluteninas (de alto y bajo peso molecular) (Wieser, 2007, Food Microbiol., 24:115-119; Fasano, 2009, Sci Am., 301:54-61). Las gliadinas, asf como tambien las gluteninas, son inusualmente ricas en residuos de prolina (~15%) y glutamina (~35%). Como resultado, mientras que la mayorfa de las protefnas de la dieta son digeridas mediante proteasas gastrointestinales a aminoácidos simples, dipeptidos o tripeptidos, las protefnas del gluten no son completamente digeridas (Erickson y Kim, 1990, Annu Rev Med., 41:133 139; Gray, 1991, New York:Oxford University, pp.411-420; Ganapathy y col., 2006, Academic Press, pp.1667-1692). Por lo tanto, algunos de los peptidos del gluten generados durante la digestion gastrointestinal son altamente resistentes a la digestion por parte de las enzimas gastricas y pancreaticas, por lo que persisten en el intestino. Estos peptidos son capaces de internalizarse en las celulas intestinales y, como consecuencia, los residuos de glutamina que poseen pueden ser desaminados por la transglutaminasa tisular (tTG). La predisposicion genetica de los individuos con EC hace que sean intolerantes a dichos peptidos debido a que su sistema inmunologico reacciona de manera patologica contra autoantfgenos resultantes de la interaccion -peptidos del gluten/tTG- (Korponay-Szabo y col., 2007, BMJ, 335:1244-1247; Bethune y Khosla, 2008, PloS Pathogens, 4:e34; Jabri y Sollid, 2009, Nat Rev Immunol., 9:858-870). Los peptidos deaminados inducen una reaccion inmunologica mediada por celulas T que ocasiona inflamacion cronica del intestino delgado. Las vellosidades intestinales son destruidas debido a la reaccion inmunologica, produciendose disminucion de la absorcion intestinal que puede dar lugar a sfntomas como diarrea, anemia, retraso en el crecimiento, perdida de peso, desordenes oseos, complicaciones neurologicas, cancer, etc. (Alaedini y Green, 2005, Ann Int Med., 142:289-299; Catassi y Fasano, 2008, Curr Opin Gastroenterol., 24:687-691; Tack y col., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213).
Uno de los principales peptidos del gluten descritos hasta la fecha es el peptido 33-mer de la a2-gliadina (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Bethune y col., 2009, Chem Biol., 16:868-881) que ha demostrado ser resistente a la digestion gastrointestinal, sustrato de la desaminacion mediada por la tTG y altamente reactivo frente a las celulas T aisladas de pacientes celfacos. La identificacion del peptido 33-mer, asf como otros peptidos, contribuye a demostrar que los epftopos del gluten con elevada antigenicidad estan localizados en regiones de las gliadinas ricas en residuos de prolina y glutamina (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Tye-Din y col., 2010, Sci Transl Med., 2:41RA51).
La unica terapia existente a dfa de hoy para los pacientes celfacos es una rigurosa dieta sin gluten (DSG). El incumplimiento de la DSG se ha asociado con osteoporosis, anemia por deficiencia de hierro, depresion e infertilidad, todo lo cual se mejora, en cierta medida, mediante la adhesion a la dieta libre de gluten. Estas observaciones nos dan una idea de la importancia de la adherencia a una DSG para reducir los sfntomas, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida del paciente. Sin embargo, varios estudios basados en biopsias intestinales han sugerido que las transgresiones de la dieta son relativamente frecuentes, estando entre el 32,6% y el 55,4% en las poblaciones estudiadas (Ciacci y col., 2002, Digestion, 66:178-185; Silvester y Rashid, 2007, Can J Gastroenterol., 21:557-564). La falta de adherencia a una dieta libre de gluten de manera estricta es la principal razon de enfermedad celfaca mal controlada en adultos.
Asf mismo existe una parte de la poblacion celfaca que no parece responder de manera positiva a la DSG y sufren sfntomas de malabsorcion persistente o recurrente y atrofia de las vellosidades intestinales. Esta poblacion podrfa ser sospechosa de padecer EC refractaria, una enfermedad rara (aproximadamente el 5%-10% de los pacientes con EC) que aparece en los pacientes sin aparente respuesta positiva a la dieta libre de gluten (Al-Toma y col., 2007, Dig
Dis, 25:230-236; Freeman, 2009, Gut Liver, 3:237-246; Rubio-Tapia y Murray, 2010, Gut, 59:547-557). Aunque esta enfermedad refractaria fue descrita en pacientes con supuesta ausencia total de ingesta de gluten, la ingestion involuntaria y la hipersensibilidad a una pequena cantidad de gluten tambien pueden desencadenar los sfntomas propios de la patologfa. La falta de un marcador preciso para el control del cumplimiento de la DSG es pues todavfa una cuestion sin resolver y es especialmente diffcil en el caso de leves transgresiones dieteticas (Fernandez-Calle y col., 1993, Gut, 34:774-777). No hay manera de demostrar la ingesta de gluten y asf evitar posibles secuelas nocivas, de hecho, solo se puede medir las consecuencias de las transgresiones dieteticas observando la inflamacion de las mucosas y/o la atrofia vellositaria para lo cual se tendrfa que realizar biopsias intestinales y como consecuencia anestesiar al paciente con las posibles consecuencias que ello pueda tener.
El control de la anti-tTG, que ha sido propuesto como un marcador para evaluar el estricto cumplimiento de la DSG, sin embargo, la eficacia de dicho marcador para controlar la ingesta de gluten aun no esta clara (Tack y col., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213). Otros marcadores han sido propuestos para el seguimiento de la dieta, como por ejemplo la prueba de permeabilidad (Duerksen et al., 2005) o la calprotectina fecal (Ertekin y col., 2010, J Clin Gastroenterol., 44:544-546.) Estos metodos pueden mostrar que existen procesos inflamatorios, de tal manera que si los valores de estos marcadores se encuentran modificados puede ser como consecuencia de enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias intestinales o de procesos de alergia, lo que significa que no tienen por que ser una medida del consumo directo de gluten. Por lo tanto, no existe un metodo eficaz para comprobar que el enfermo celfaco este realizando una DSG o descartar la posibilidad de que los sfntomas de la EC refractaria sean debidos a una intolerancia hipersensible a trazas de gluten asociada a una exposicion involuntaria a los cereales toxicos.
El cumplimiento de la dieta evaluado mediante entrevista ha sido sugerido como marcador de control de la EC por su bajo coste, su no invasividad, y su demostrada correlacion con el dano intestinal. Sin embargo, la DSG supone numerosas restricciones para los pacientes debido a sus implicaciones sociales y economicas. Ademas, una dieta libre de gluten es diffcil de mantener debido a la ubicuidad del gluten en los alimentos, a la desinformacion educativa, a las variaciones en el etiquetado de los alimentos y a la posible contaminacion cruzada de estos (Bethune y col., 2009, Chem Biol., 16:868-881; Selimoglu y Karabiter, 2010, J Clin Gastroenterol., 44:4-8). Por otra parte, ciertos estilos de vida y algunos sectores de la poblacion dificultan, en cierta medida, el cumplimiento de la DSG. Ademas, no existe una alternativa a las entrevistas a los pacientes para conocer cuanto de fiables son los resultados obtenidos de estos estudios clfnicos.
Una medida mas directa sobre la ingestion de gluten podrfa proporcionar informacion crftica sobre el paciente: la deteccion del incumplimiento de la DSG antes del dano anatomico, la deteccion del consumo inadvertido, la evaluacion de la exactitud de la adherencia al tratamiento en el periodo inicial tras el diagnostico cuando los pacientes estan menos familiarizados con la dieta, etc., proporcionando una confirmacion facil y fiable de los resultados obtenidos. Por tanto, un marcador sensible y fiable para monitorizar y detectar la ingesta de gluten podrfa ser una herramienta util para el correcto cumplimiento de la DSG y, probablemente, para un diagnostico preciso de la EC refractaria.
Los anticuerpos monoclonales (moAbs) G12 y A1 obtenidos frente al principal epftopo inmunogenico de la a-gliadina han demostrado ser muy utiles en la deteccion de peptidos toxicos en muestras de alimentos, asf como en investigacion clfnica de desintoxicacion enzimatica del gluten (Moron y col., 2008, Am J Clin Nutr., 87:405-414; Moron y col., 2008, PloS ONE, 3:e2294; Ehren y col., 2009, PloS oNe, 4:e6313; Alvine Pharmaceuticals, Inc., Biomedal S.L.). La sensibilidad y especificidad de los anticuerpos monoclonales y su capacidad para reconocer peptidos resistentes a la digestion gastrointestinal los podrfan hacer ideales para la monitorizacion de peptidos inmunotoxicos del gluten obtenidos tras digestion intestinal en muestras humanas. Los epftopos de reconocimiento del moAb G12, QP(Q/E)LP(Y/F), estan presentes en los principales peptidos descritos recientemente en un rastreo de alto rendimiento realizado con 2.700 peptidos procedentes de prolaminas de diferentes cereales (Tye-Din y col., 2010, Sci Transl Med., 2:41ra51). Los fragmentos peptfdicos no digeridos procedentes de la ingesta de gluten y no absorbidos, podrfan ser recuperados de las heces, lo que demostrarfa la ingesta de gluten del individuo.
En esta patente, hemos evaluado la viabilidad de la monitorizacion de gluten intacto y digerido en las heces mediante la deteccion de epftopos relacionados con el peptido 33-mer, que podrfa ser aplicada en estudios clfnicos y de seguimiento de la dieta, asf como tambien, en el diagnostico de la EC refractaria.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La dieta sin gluten es el unico tratamiento efectivo a dfa de hoy para la enfermedad celfaca. Por ello, el cumplimiento de la DSG en los pacientes debe ser monitorizado para evitar danos acumulativos directos e indirectos, asf como tambien, para confirmar que la persistencia de cualquier sfntoma tfpico de la celfaca no se debe a una infraccion (voluntaria o no) de la dieta. Sin embargo, actualmente no se dispone de metodos para controlar el cumplimiento de la dieta en pacientes con enfermedad celfaca.
La presente invencion tiene como objeto la aplicacion de metodos inmunologicos para monitorizar el cumplimiento de la dieta libre de gluten mediante la deteccion en heces de peptidos inmunotoxicos resistentes a digestion gastrointestinal. Es objeto de la invencion la aplicacion de tecnicas inmunologicas basadas en anticuerpos que reconocen peptidos inmunogenicos del gluten que resisten la digestion gastrointestinal. Preferiblemente, la invencion emplea tecnicas inmunologicas que usan anticuerpos que reconocen el peptido 33-mer de la gliadina. Una realizacion preferida es la deteccion de los peptidos mediante metodos cualitativos rapidos basados en tiras inmunocromatograficas o bien por metodos cuantitativos y automatizables como las tecnicas de ELISA. El metodo preferido usado en la invencion debe permitir detectar gluten ingerido equivalente a 50 mgs de gluten de trigo por dfa, que es la cantidad maxima descrita para una dieta sin gluten, o en su caso un mfnimo de 20 ppms de gluten equivalente en heces.
Dicho procedimiento y kits analfticos tienen tambien su objeto de la patente en su uso para revelar la falta de adherencia a la DSG, ya sea debido a la contaminacion de los alimentos consumidos o a una ingesta voluntaria/involuntaria ocasional de alimentos que contienen gluten. Ademas, es objeto de la presente invencion la aplicacion de la deteccion de dichos peptidos inmunotoxicos en heces para el control de la investigacion clfnica sobre la enfermedad celfaca, incluidas las terapias enzimaticas relacionadas con desintoxicacion de las prolaminas del gluten, secuestrantes de peptidos inmunotoxicos, y otras terapias alternativas.
El objeto de la presente invencion es un procedimiento para deteccion o monitorizacion del gluten ingerido mediante deteccion de peptidos inmunotoxicos en las heces, caracterizado por el uso de metodos inmunologicos con anticuerpos que reconocen epftopos relacionados con el peptido 33-mer de la gliadina y otras secuencias peptfdicas resistentes a las digestion gastrointestinal seleccionadas de las siguientes secuencias: SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8.
Es objeto de la presente invencion el uso de tecnicas inmunologicas para dicha monitorizacion de gluten, metodos inmunologicos tales como ELISA indirecto, ELISA competitivo, ELISA sandwich, tiras inmunocromatograficas, inmunomicropartfculas fluorescentes, Western blot, biosensores basados en reacciones electroqufmicas catalizadas por enzimas acoplados a los anticuerpos, por partfculas magneticas tapizadas por anticuerpos, por resonancia de plasmones superficiales, y demas tecnicas en las que se detecta la union de un analito a un anticuerpo.
En una realizacion preferida de la invencion, estos metodos se caracterizan porque usan preferentemente uno o varios anticuerpos monoclonales con capacidad para detectar epftopos seleccionados de las siguientes secuencias: SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 y SEQ ID N° 8. En una realizacion preferida de la invencion los anticuerpos usados por las tecnicas inmunologicas serfan el G12 y el A1 por su demostrada relacion de su reactividad con la potencial inmunotoxicidad de una muestra. La invencion tambien contempla el uso del anticuerpo R5 que reacciona con el epftopo SEQ ID N° 9, que tambien puede hallarse en peptidos del gluten resistente a digestion gastrointestinal, pero con menor especificidad antes peptidos inmunogenicos resistentes a las proteasas. Una realizacion preferida de la invencion es el empleo de metodos inmunologicos basados en el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permita un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogenicos, fluorigenicos o luminiscentes. Este procedimiento usa un patron de gliadina, gliadina hidrolizada, peptido 33-mer completo o una parte de su secuencia de al menos 6 aminoácidos (SEQ ID N° 2).
Otro objeto de la invencion es el uso particular de tiras inmunocromatograficas basadas en los anticuerpos anti-33-mer de gliadina, G12 y A1 que permiten una deteccion semicuantitativa y rapida de los peptidos/protefnas del gluten contenidos en las heces.
La invencion propone una medida del gluten ingerido por el individuo a traves de la dieta. Se trata de un procedimiento util para el control del gluten ingerido mediante el empleo de metodos analfticos en los que se ha demostrado una correlacion entre la cantidad de gluten ingerida y las estimaciones de protefnas/peptidos del gluten en heces obtenidas a traves de estos procedimientos.
La invencion propone un instrumento analftico para la monitorizacion del cumplimiento de la DSG, asf como tambien para descartar la ingesta no controlada de gluten en los pacientes sospechosos de sufrir la llamada enfermedad celfaca refractaria. Ademas, con este procedimiento, las nuevas alternativas terapeuticas para la desintoxicacion enzimatica del gluten y otras terapias alternativas tambien podran ser controladas en las heces de los pacientes celfacos sometidos a ensayos clfnicos o a una prescripcion terapeutica en el futuro, ya que la efectividad de la terapia se podrfa determinar midiendo la presencia o ausencia de peptidos en heces tras 12-48 horas de la ingesta de alguna cantidad controlada de gluten junto con las terapias que eliminen los peptidos inmunotoxicos.
Cuestiones aun sin resolver en la practica clfnica, como son el control de una DSG o el control de la exposicion involuntaria al gluten por contaminacion de los alimentos, podrfan ser resueltas con simples ensayos inmunologicos de las heces. Medicos, clfnicos y analistas podrfan considerar utiles estos metodos para el diseno de ensayos clfnicos y seguimientos de sus pacientes celfacos para establecer conclusiones coherentes sobre el estado de la
enfermedad del paciente.
La extraccion de los peptidos en las heces se puede llevar a cabo directamente con una solucion hidroalcoholica del 40 al 60%. En algunas ocasiones por la naturaleza del alimento ingerido, podna mejorarse la extraccion del gluten en heces anadiendo una solucion con agentes dispersantes como el cloruro de guanidinio, el cloruro de arginina, etc; o bien detergentes como la polivinilpirrolidona, y agentes reductores como el b-mercaptoetanol, el DTT o el TCEP.
Posteriormente los polipeptidos del gluten extrafdos se diluyen en una solucion salina tamponada y se usan entonces para hacer la medida con un ELISA, bien competitivo, bien sandwich si se quiere tener una idea de la concentracion de los peptidos reactivos. La recta patron se podna hacer con gliadina estandar digerida por pepsina y tripsina , para simular su digestion gastrica. Tambien se podna usar directamente polipeptido sintetizado que reaccione con los anticuerpos, preferiblemente, el 33-mer de gliadina o fragmentos del mismo con la opcion de poner algunas modificaciones puntuales que mantengan la reactividad frente a los anticuerpos. Asf, por ejemplo, se podnan usar los peptidos siguientes para los anticuerpos G12: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, y SEQ ID N° 4. Para el A1 ademas del 33-mer, senan validos los siguientes peptidos SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 o SEQ ID N° 8 para hacer la recta patron con un ELISA competitivo.
Para un ensayo cualitativo para ver si el valor de polipeptidos del gluten en heces es mayor o menor de una cierta cantidad, se podna usar unas tiras inmunocromatograficas que usen el anticuerpo G12 o A1 o bien ambos. El procedimiento se podna llevar a cabo con un kit que contuviese la solucion de extraccion de los polipeptidos en heces; un patron de referencia con polipeptidos del gluten hidrolizados por pepsina y tripsina o bien sintetizados; y los componentes de un ELISA con una placa multipocillo y usando los anticuerpos A1 y/o G12 para inmovilizar los pocillos y/o para el revelado del ensayo, o bien tiras inmunocromatograficas.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripcion que se esta realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprension de las caractensticas de la invencion, de acuerdo con un ejemplo preferente de realizacion practica del mismo, se acompana como parte integrante de dicha descripcion, con caracter ilustrativo y no limitativo, las figuras siguientes:
Figura 1. Afinidad relativa del moAb G12 frente a peptidos inmunotoxicos derivados de la gliadina PWG tras simulacion de la digestion gastrointestinal. A y B. s DS-PAGE y Western blot de gliadina PWG, PWG gliadina pepsina y gliadina PWG pepsina tripsina/quimotripsina. Las muestras fueron tenidas con plata o transferidas a una membrana de PVDF con el moAb G12. PM: marcador de peso molecular. C. Analisis mediante ELISA competitivo G12-HRP de los peptidos procedentes de la gliadina PWG.
Figura 2. Resistencia del peptido 33-mer a la ruptura mediante enzimas gastrointestinales. A. Secuencia de aminoácidos del peptido 33-mer. La secuencia de reconocimiento del moAb G12 en el peptido 33-mer aparece en negrita. B. ELISA competitivo para la deteccion de 33-mer tras tratamiento con pepsina, tripsina y quimotripsina mediante el uso del moAb G12-HRP. C. Western blot del peptido 33-mer tras tratamiento con enzimas gastrointestinales. PM: marcador de peso molecular. Se realizaron dos ensayos por separado con 3 repeticiones cada uno.
Figura 3. Deteccion de gluten en las heces de individuos sanos sometidos a una dieta controlada de gluten. A y B. Semicuantificacion de peptidos/protemas del gluten en las heces de individuos sanos (n=11) mediante inmunocromatografica G12. La franja azul es un control interno positivo que indica que el dispositivo ha funcionado correctamente, y la franja rosa indica la presencia de gluten. HL901-HL911: sujetos que intervinieron en el estudio. *Se detectaron trazas de gluten. C y D. SDS-PAGE y Western blot de los peptidos de gluten y protemas extrafdas de las heces. PM: marcador de peso molecular.
Figura 4. Concentracion de peptido 33-mer (ng/mg) en las heces tras una dieta controlada de gluten. ELISA competitivo G12-HRP para conocer la relacion entre las protemas del gluten ingeridas/excretas mediante su contenido en peptido 33-mer. La concentracion de peptido 33-mer se determino mediante con una curva estandar de 33-mer. Dos ensayos se realizaron por separado, cada uno con tres repeticiones.
REALIZACION PREFERENTE DE LA INVENCION
Ejemplo 1. Cuantificacion de los peptidos toxicos de la gliadina PWG obtenidos tras simulacion de la digestion gastrointestinal.
En el presente ejemplo se muestra como una parte sustancial de los peptidos inmunogenicos del gluten, permanecen susceptibles de deteccion en heces a pesar de la digestion gastrointestinal. Entre las principales protemas de la dieta, las que forman parte del gluten son las unicas que contienen aproximadamente un 15% de
residuos de prolina y un 35% de residuos de glutamina. El alto contenido en estos dos aminoácidos impide la completa proteolisis de estas protefnas por parte de las enzimas gastricas y pancreaticas, de manera que se forman fragmentos peptfdicos en el intestino delgado que son inmunotoxicos para los pacientes celfacos. En particular, el peptido 33-mer fue encontrado como uno de los principales contribuyentes de la inmunotoxicidad del gluten (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279). Este peptido de la a-2 gliadina contiene 6 epftopos de reconocimiento de las celulas T y es altamente resistente a la proteolisis.
El moAb G12 es especffico para el epftopo de 6 aminoácidos SEQ ID N° 10, con 3 repeticiones en el peptido 33-mer. Ademas, es este anticuerpo es capaz de reconocer otros peptidos inmunoreactivos contenidos en las gliadinas y otras prolaminas toxicas. El objetivo de este ejemplo es conocer la capacidad del anticuerpo G12 para detectar los peptidos toxicos formados tras la simulacion gastrointestinal de la gliadina. Para la estandarizacion de este ensayo se utilizo la gliadina PWG, considerada como un reactivo de referencia internacional en los analisis de gluten debido a su alto contenido en gliadinas, su buena solubilidad, su homogeneidad, su estabilidad y por estar constituida por 28 cultivares de trigo europeo (Eckert y col., 2006, J Cereal Sci., 43:331-341).
La gliadina fue sometida a digestion secuencial con pepsina (la principal proteasa presente en el estomago), con tripsina y quimotripsina (proteasas contenidas en la membrana intestinal). Las muestras fueron incubadas a 37 °C en solucion de HCl (pH 2) que contenfa 0,06 mg/ml de pepsina. Las muestras fueron incubadas durante 60 min y se desactivaron mediante calor a 95 °C durante 5 min. Despues de la simulacion gastrica con pepsina, las digestiones se ajustaron a pH 6.0 con tampon fosfato sodico, e incubados con proteasas pancreaticas: tripsina (0,375 mg/ml) y quimotripsina (0,375 mg/ml). Tras la simulacion duodenal a 37 °C durante 30 min y las muestras fueron inmediatamente inactivadas a 95 °C durante 5 min.
El perfil proteico de las fracciones de prolaminas que constituyen la gliadina PWG fue analizado mediante SDS-PAGE con el fin de observar el patron de bandas obtenido tras el tratamiento enzimatico y confirmar que las muestras habfan sido digeridas. Para el analisis mediante SDS-PAGE, las muestras fueron diluidas en tampon de electroforesis (62.5 mM Tris-HCl a pH 6,8; 10% glicerol; 2% SDS; 0,001% azul de bromofenol y 5% 2-mercaptoetanol) y desnaturalizadas mediante ebullicion a 100°C durante 5 min. Este paso se repitio un total de tres veces. Las muestras se corrieron en geles de poliacrilamida al 15-18% (SDS-PAGE) a un voltaje constante de 100V utilizando el sistema MiniProtein (BioRad Laboratories). Las protefnas separadas en el gel de electroforesis, fueron tenidas usando tincion de plata.
El estudio de la gliadina PWG intacta mediante gel 1D revelo bandas intensas de alfa, beta y gamma gliadinas (Pm= 33-45 kDa) y bandas debiles de omega gliadina (Pm= 50-67 kDa) (Eckert y col., 2006, J Cereal Sci., 43:331-341). La digestion de estas protefnas mediada por pepsina (digestion gastrica) dio lugar a la formacion de fragmentos peptfdicos de menor tamano, inferiores a 25 kDa. Secuencialmente, la digestion con tripsina y quimotripsina genero peptidos mas pequenos (inferiores a 15 kDa), como consecuencia del proceso de hidrolisis mediado por estas enzimas (Figura 1A).
Con el objetivo de comprobar si los peptidos de la gliadina PWG obtenidos mediante el proceso de digestion gastrointestinal eran reconocidos por el anticuerpo anti-33-mer se realizo un Western blot con dicho anticuerpo de las muestras descritas anteriormente: gliadina pWg sin digerir, gliadina PWG sometida a digestion gastrica y gliadina PWG sometida a digestion intestinal (previa digestion gastrica). Los extractos proteicos obtenidos inicialmente fueron separados mediante gel SDS-PAGE y seguidamente incubados con el anticuerpo G12 en membranas de PVDF. Posteriormente, se incubaron en tampon de bloqueo (TBS con leche desnatada al 5%) durante toda la noche, tras lo cual se añadió el anticuerpo G12 (dilucion 1:5000 en solucion de bloqueo). Despues de 3 lavados, las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario anti-mouse IgG conjugado a fosfatasa (Sigma, Sr. Louis, MO) (dilucion 1:2000 en solucion de bloqueo). La membrana se revelo utilizando el sistema Sigma-Fast.
El anticuerpo G12 fue capaz de reconocer las distintas fracciones que componen la gliadina PWG. Tras digestion gastrica, los fragmentos peptfdicos formados continuaron siendo reconocidos por el anticuerpo G12 (Figura 1B). El tratamiento secuencial con enzimas pancreaticas (tripsina, quimotripsina) dio lugar a la presencia de peptidos mas pequenos tambien reconocidos mediante moAb G12.
Con el fin de conocer la capacidad del anticuerpo G12 para cuantificar los peptidos toxicos generados, se determino la concentracion de 33-mer y peptidos analogos obtenidos tras simulacion gastrointestinal de la gliadina PWG mediante ELISA competitivo, usando igualmente el anticuerpo G12. El ELISA competitivo es una tecnica muy apropiada para el seguimiento de la digestion del gluten, ya que es capaz de detectar tanto protefnas intactas como pequenos fragmentos de protefnas: estos ultimos podrfan ser subestimados con ELISA sandwich, debido a que para la deteccion de antfgenos requiere como mfnimo dos epftopos diferentes por molecula de peptido.
La cantidad relativa de epftopos inmunotoxicos contenida en las muestras se cuantifico mediante ELISA competitivo con el uso del moAb G12-HRP (Biomedal S.L., Sevilla, Espana). Para este ensayo se uso placas Maxisorp microtiter
(Nunc, Roskilde, Dinamarca) que fueron recubiertas con 100 pL/pocillo de solucion de gliadina Sigma (5 pg/mL) en 0,1 M de PBS (Na2CO3-NaHCO3 , pH 9,6), e incubadas a 4°C toda la noche. Las placas fueron lavadas con PBS 0,05% Tween® 20 y bloqueadas con solucion de bloqueo (PBS, 5% leche desnatada) durante 1 h a temperatura ambiente. Se realizaron diluciones seriadas del patron (gliadina o peptido 33-mer) y de las muestras de estudio en PBS con BSA 3% (100 pL) y a cada una de ellas se añadió 100 pL de solucion de moAb G12 conjugado con HRP (1:10.000 en PBS con BSA 3%). Se preincubaron las muestras 1 h a temperatura ambiente con agitacion suave, y posteriormente se anadieron en los pocillos. Tras 30 minutos de incubacion, se lavaron las muestras, y se les añadió 100 pL/pocillo de solucion de sustrato (TMB, Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Trascurridos 30 minutos de incubacion a temperatura ambiente en oscuridad, se detuvo la reaccion con ácido sulfurico 1 M (100 pL/pocillo), y la absorbancia se midio a 450 nm (Lector de microplacas UVM340, Asys Hitech GMBH, Eugendorf, Austria). La concentracion de gliadina/33-mer se determino usando el modelo de los 4 parametros.
Con este metodo, se determino la concentracion de 33-mer tanto en la gliadina PWG intacta como sometida a digestion gastrica y a digestion intestinal. La digestion gastrica de la gliadina PWG dio lugar a un ligero aumento en los niveles de peptido toxico. Posiblemente este aumento es debido a la apertura de las moleculas que constituyen las fracciones de gliadina, de esta manera los epftopos del anti-33-mer presentes quedan mas accesibles, y por tanto, se identifican con mayor especificidad (gliadina PWG intacta=21,6 ng 33-mer/pg vs. Gliadina PWG digestion gastrica=24,5 ng 33-mer/pg). Tras el proceso sucesivo de digestion intestinal el moAb G12 continua reconociendo los peptidos de la gliadina PWG formados, aunque con menor especificidad (7,5 ng 33-mer/pg) (Figura 1C).
En contraste con estos resultados, estudios in vitro e in vivo realizados con el peptido 33-mer demuestran la gran estabilidad de este peptido a la ruptura mediante endoproteasas gastricas, pancreaticas e intestinales. Sus caracterfsticas hacen que sea sugerido como el principal promotor de la respuesta inflamatoria al gluten en pacientes celfacos (Figura 2A) (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; 2005, J Proteome Res., 4:1732-1741). Con el objetivo de verificar que el peptido 33-mer permanece intacto tras proteolisis gastrica (mediada por pepsina) y secuencial proteolisis intestinal (mediada principalmente por tripsina y quimotripsina) se realizo una simulacion in vitro de la digestion gastrointestinal de dicho peptido. Las concentraciones de peptido 33-mer obtenidas tras cada uno de los procesos de digestion se determinaron mediante ELISA competitivo usando el anticuerpo monoclonal anti-33-mer. La concentracion de 33-mer obtenida tras digestion gastrica no vario significativamente con respecto al peptido no sometido a digestion (194 pg/mL vs. 186 pg/mL, respectivamente, p=0,4469). Igualmente, la exposicion del 33-mer a las enzimas tripsina y quimotripsina (digestion intestinal), no supuso una variacion de los niveles de este peptido en comparacion con el peptido no tratado (169 pg/mL vs. 186 pg/mL, respectivamente, p=0,1024) (Figura 2B). Estos resultados confirman la gran estabilidad del 33-mer a la hidrolisis por parte de las enzimas implicadas en el proceso digestivo.
Los resultados obtenidos mediante ELISA fueron confirmados mediante analisis Western blot. Tricina-SDS-PAGE y Western blot se realizaron en condiciones estandar (Sousa y col., 2001, Mol Cellular Biol., 7:204-213). El inmunobotting mostro bandas de aproximadamente 3,5 kDa tanto en la muestra que contenfa 33-mer no procesado como en aquella que contenfa 33-mer sujeto a digestion gastrointestinal (Peso molecular teorico 33-mer 3,9 kDa, PIR, Protein Information Resource, Georgetown University Medical Center, E.E.U.U.) (Figura 2C).
Del mismo modo, la capacidad del moAb G12 para detectar hidrolizados se evaluo mediante un sistema de deteccion rapida de gluten, las tiras inmunocromatograficas basadas en el moAb G12 (GlutenTox stick, Biomedal S.L.). El lfmite de deteccion de la gliadina y la gliadina hidrolizada fue de 30 ng/ml (6 ppm de gluten) y 50 ng/ml (10 ppm de gluten hidrolizado), respectivamente, mientras que para el peptido 33-mer y el peptido 33-mer sometido a digestion fue de 0,5 ng/mL en ambos casos. Estos resultados sugieren que el metodo de analisis presenta una alta sensibilidad tanto frente a las protefnas/peptidos intactos como frente a sus respectivos hidrolizados.
Los resultados obtenidos mediante Western blot, ELISA competitivo y tiras inmunocromatograficas sugieren que el anti-33-mer G12 podrfa ser usado para controlar la presencia de los peptidos toxicos de la gliadina y otras prolaminas de gluten durante el proceso digestivo. Al menos un tercio de los peptidos reactivos para G12 se mantuvieron resistentes a la digestion gastrointestinal. Por lo tanto, una parte sustancial de los epftopos de las prolaminas de los alimentos ingeridos que fueron detectados con moAb G12 podrfan ser resistentes a la digestion gastrointestinal y su deteccion podrfa ser adecuada en el tubo gastrointestinal.
Ejemplo 2. Deteccion y semicuantificacion de peptidos/protefnas del gluten en heces de individuos sanos sometidos a una dieta controlada de gluten.
En el presente ejemplo se muestra como ocurre la digestion que sufren las protefnas del gluten in vivo en individuos sanos y como determinar la capacidad del moAb G12 para detectar dichas protefnas/peptidos excretados a traves de las heces. Se llevo a cabo un ensayo en el que se controlo el tipo y la cantidad de gluten consumido en individuos sanos (n=11, 7 mujeres y 4 hombres, edad media 24-42 anos). Los criterios de inclusion comprenden la ausencia de enfermedades, sfntomas digestivos, medicamentos, antibioticos en los ultimos dos meses y ausencia de historia
familiar de EC. Todos los participates fueron evaluados para la EC, mostraron niveles de tTG serica normales y su fenotipo HLA-DQ no fue DQ-2/-8. Los niveles de hemoglobina y el analisis de bioqufmico de sangre, incluyendo las pruebas renales y hepaticas, estaban dentro de los valores normales. El comite de Etico local del “Hospital Universitario de Leon”, fue aprobado para este estudio y se obtuvo el consentimiento informado de los sujetos.
Para este estudio se llevo a cabo el siguiente protocolo:
- Dieta:
Los sujetos fueron instruidos para cumplir una dieta en la que controlo el tipo y la cantidad de gluten consumido durante los 15 dfas que duro este estudio. En primer lugar, los sujetos consumieron una dieta libre de gluten estricta durante una semana. Los siguientes 4 dfas, 9 g de gluten no procesado fueron ingeridos, distribuidos en las tres comidas del dfa. En los ultimos 4 dfas, la dosis de gluten se incremento a 30 g, distribuidos de manera similar.
- Toma de muestra fecal:
Se recogieron las heces frescas de los 11 sujetos que intervinieron en el estudio bajo distintas condiciones de dieta: dieta normal, DSG, DSG+9 g de gluten y DSG+30 g de gluten. La toma de muestras se llevo a cabo antes de la DSG y despues de cada una de las dietas ensayadas. Todas las muestras fueron homogeneizadas y alicuotadas en menos de 3 horas despues de la defecacion.
- La extraccion de las prolaminas de las heces y solucion de gliadina:
Prolaminas se extrajeron mediante la mezcla de 1 g de heces con 10 ml de etanol 60% (v/v) en un agitador rotatorio durante 1 h a temperatura ambiente. La suspension se centrifugo a 13.000 x g durante 10 min y se separo el sobrenadante. El control positivo, gliadina PWG, se preparo, igualmente, en etanol 60% (v/v) a una concentracion de 1 mg/ml.
En primer lugar, se realizo la toma de muestra de heces de los individuos analizados, los cuales mantenfan una dieta normal en la que estaba presente el gluten (pan, pasta, galletas, etc.). La presencia de polipeptidos del gluten en los extractos fecales se determino de manera semicuantitativa usando tiras inmunocromatograficas basadas en el anticuerpo G12, en diluciones seriadas de la muestra con el objetivo de representar un amplio rango desde menos de 6 ppm hasta mas de 500 ppm. Las muestras fueron diluidas (1:10 a 1:20.000) en la solucion de dilucion propuesta por el fabricante (se probaron 6, 25, 50, 100, 250 y 500 ppm de gluten). Las tiras inmunocromatograficas se sumergieron en las distintas muestras (300 pL) durante 10 min y se dejaron secar al aire. En este caso, todos los individuos presentaron una excrecion de protefnas/peptidos del gluten en heces con valores por encima de 500 ppm (Figura 3A y 3B).
Una vez confirmada la viabilidad del metodo para la deteccion del gluten en heces, estudiamos si existfa una correlacion entre la cantidad de gluten consumido y la cantidad de gluten excretado. Para ello, los 11 individuos fueron sometidos a una dieta controlada de gluten. En primer lugar, estos individuos consumieron una dieta estricta libre de gluten durante una semana; a continuacion, se les administro 9 g de gluten al dfa repartidos en las comidas principales durante un periodo de 4 dfas (teniendo en cuenta el tiempo de llenado del intestino grueso) y por ultimo, consumieron 30 g de gluten al dfa, igualmente repartidos en las comidas principales durante un periodo de 4 dfas. Con el fin de evitar diferencias en la determinacion de gluten como consecuencia de la ingesta de diferentes productos con gluten de distinto origen, en todos los casos se les administro el mismo tipo (sin previo tratamiento termico). El calendario propuesto tuvo en cuenta que en personas sanas el tiempo de transito es de 45 ± 16 horas (media ± desviacion estandar) con una dieta rica en fibra y mas de 70 horas en dietas pobres en fibra (Stasse-Wolthuis y col., 1979, Am J Clin Nutr., 32:1881-1888).
Las muestras de heces recogidas durante el periodo en el que los individuos mantuvieron una dieta exenta de gluten presentaron, en todos los casos, niveles de gluten por debajo del lfmite de deteccion del metodo (6 ppm gluten intacto, 10 ppm gluten hidrolizado). En cambio, cuando se realizo una ingesta de 9 g de gluten al dfa se encontro que la cantidad de gluten detectada estaba por encima de 250 ppm en todas las muestras, excepto en una de ellas que presentaba valores entre 6 y 25 ppm. Cuando los individuos consumieron 30 g de gluten al dfa los niveles excretados por encima de 500 ppm (Figura 3A y 3B), mas de 1.000 veces superiores al lfmite de deteccion del metodo. Por tanto, existe una correlacion entre la cantidad de gluten consumida y la cantidad de peptidos con epftopos G12 excretada a traves de las heces.
Con el fin de demostrar la idoneidad del moAb G12 en la deteccion de peptidos/protefnas del gluten excretadas en las heces, los extractos proteicos obtenidos mediante tratamiento con etanol 60%, asf como los controles, gliadina PWG y el gluten ingerido por los sujetos, fueron separados mediante SDS-PAGE. Posteriormente las protefnas/peptidos fueron tenidas con tincion de plata o transferidas a una membrana y posterior analisis Western blot con el moAb G12 (Figura 3C y 3D). Los resultados indicaron que el moAb G12 reacciona con las muestras derivadas de una dieta convencional no controlada, DSG+9 g gluten y DSG+30 g gluten, asf como tambien con los controles positivos, gliadina PWG y el gluten ingerido. Sin embargo, en la muestra derivada de una DSG no se encontraron peptidos/protefnas en heces (Figura 3D).
Claims (10)
1. - Procedimiento para la monitorizacion del gluten ingerido mediante deteccion de peptidos inmunotoxicos en las heces caracterizado por el uso de metodos inmunologicos utilizando anticuerpos que reconocen especfficamente epftopos del peptido gliadina 33-mer de SEQ ID NO: 1 seleccionado de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8.
2. - Procedimiento para la monitorizacion de gluten ingerido de acuerdo a la reivindicacion 1 en el que los metodos inmunologicos usan al menos uno de los anticuerpos monoclonales G12, A1 y R5.
3. - Procedimiento para la monitorizacion de gluten ingerido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en el que los metodos inmunologicos son un ELISA indirecto, ELISA competitivo, ELISA sandwich, tiras inmunocromatograficas, inmunomicropartfculas fluorescentes, inmunopartfculas magneticas, Western blot, biosensores electronicos o biosensores de resonancia.
4. - Procedimiento de monitorizacion de gluten ingerido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que los metodos inmunologicos usan el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permite un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogenicos, fluorigenicos o luminiscentes.
5. - Procedimiento de monitorizacion de gluten ingerido de acuerdo a cualquier de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque se usa como patron de referencia algunos de los peptidos de la reivindicacion 1.
6. - Procedimiento de monitorizacion de gluten ingerido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se usa como patron de referencia gliadina hidrolizada con pepsina y tripsina.
7. - Procedimiento de monitorizacion de gluten ingerido de acuerdo a las reivindicaciones 1 o 2 en el que los metodos inmunologicos usan al menos uno de los anticuerpos monoclonales anti gliadina G12 y A1 para la realizacion de un ensayo semicuantitativo basado en tiras inmunocromatograficas de deteccion rapida.
8. - Uso de procedimientos analfticos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la monitorizacion del cumplimiento de la dieta sin gluten.
9. - Uso de procedimientos analfticos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para detectar la ingesta no controlada de gluten en pacientes celfacos sometidos a dieta sin gluten pero con sfntomas refractarios y agudos de la enfermedad celfaca.
10. - Uso de procedimientos analfticos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para monitorizar la efectividad de las terapias relacionadas con la eliminacion de peptidos inmunogenicos del gluten.
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