ES2385455B2 - Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas. - Google Patents

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Abstract

La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico, muestra un procedimiento para la monitorización de la ingestión de gluten mediante la medida de las proteínas/péptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a péptidos inmunogénicos resistentes a digestión gastrointestinal. La presencia o ausencia de dichos péptidos inmunogénicos es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos inmunogénicos del gluten que son resistente a proteólisis. Dichos ensayos pueden ser técnicas cuantitativas ELISAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc. Estas medidas también se podrían aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para mejorar el diagnóstico en casos de síntomas refractarios o agudos de la enfermedad celíaca en casos donde supuestamente se está respetando una dieta sin gluten, o a la investigación clínica de la efectividad de las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas.

Description

Determinación de niveles de Déptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas
OBJETO DE LA INVENCiÓN
La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico, muestra un procedimiento para la monitorización de la ingestión de gluten mediante la medida de las proteínas/péptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a péptidos inmunogénicos resistentes a digestión gastrointestinal. la presencia o ausencia de dichos péptidos inmunogénicos es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos inmunogénicos del gluten que son resistente a proteólisis. Dichos ensayos pueden ser técnicas cuantitativas ELlSAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc. Estas medidas también se podrian aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para meJorar el diagnóstico en casos de síntomas refractarios o agudos de la enfermedad celiaca en casos donde supuestamente se está respetando una dieta sin gluten, o a la investigación clínica de la efectividad de las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN El gluten es un conjunto de proteínas de almacenamiento de los cereales. Las proteínas del gluten procedentes del trigo, la cebada, el centeno y, probablemente la avena, no son toleradas por individuos predispuestos genéticamente que padecen la enfermedad celíaca (EC). En el trigo, el gluten está compuesto por una fracción soluble en etanol (prolaminas: a, 13, y y w-gliadinas); y otra insoluble, gluteninas (de alto y bajo peso molecular) (Wieser, 2007, Food Microbiol., 24:115-119; Fasano, 2009, Sci Am., 301:54-61). Las gliadinas, así como también las gluteninas, son ¡nusualmente ricas en
residuos de prolina (-15%) y glutamina (-35%). Como resultado, mientras que la mayoría de las proteínas de la dieta son digeridas mediante proteasas gastrointestinales a aminoácidos simples, dipéptidos o tripéptidos, las proteínas del gluten no son completamente digeridas (Erickson y Kirn, 1990, Annu Rev Med., 41 :133-139; Gray, 1991 , New York:Oxford University, pp.411-420; Ganapathy y coL, 2006, Academic Press, pp.1667 -1692). Por lo tanto, algunos de los péptidos del gluten generados durante la digestión gastrointestinal son altamente resistentes a la digestión por parte de las enzimas gástricas y pancreáticas, por lo que persisten en el intestino. Estos péptidos son capaces de internalizarse en las células intestinales y, como consecuencia, los residuos de glutamina que poseen pueden ser desaminados por la transglutaminasa tisular (tTG). La predisposición genética de los individul:>s con EC hace que sean intolerantes a dichos péptidos debido a que su sistema inmunológico reacciona de manera patológica contra autoantígenos resultantes de la interacción -péptidos del gluten/tTG-(Korponay-Szabó y col. , 2007, BMJ, 335:1244-1247; Bethune y Khosla, 2008, PloS Pathogens, 4:e34; Jabr; y Sollid, 2009, Nat Rev Immunol., 9:858-870). Los péptidos desaminados inducen una reacción inmunológica mediada por células T que ocasiona inflamación crónica del intestino delgado. Las vellosidades inte!slinales son destruidas debido a la reacción inmunológica, produciéndose disminución de la absorción intestinal que puede dar lugar a síntomas como diarrea, anemia, retraso en el crecimiento, pérdida de peso, desórdenes óseos, complicaciones neurológicas, cáncer, etc. (Alaedini y Green, 2005, Ann Int Med., 142:289-299; Catassi y Fasano, 2008, Curr Opin Gastroenterol., 24:687691 ; Tack y col. , 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213).
Uno de los principales péptidos del gluten descritos hasta la fecha es el péptido 33-mer de la a2-gliadina (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Bethune y col., 2009, Chem Biol. , 16:868-881) que ha demostrado ser resistente a la digestión gastrointestinal, sustrato de la desaminación mediada por la tTG y altamente reactivo frente a las células T aisladas de pacientes celíacos. La identificación del péptido 33-mer, así como otros péptidos, contribuye a demostrar que los epítopos del gluten con elevada antigenicidad están localizados en regioneis de las gliadinas ricas en residuos de prolina y glutamina (Shan y col., 2002, Science, 2!l7:2275-2279; Tye-Din y col., 2010, Sci Transl Med., 2:41ra51).
La única terapia existente a día de hoy para los pacientes celiacos es una rigurosa dieta sin gluten (DSG). El incumplimiento de la DSG se ha asociado con osteoporosis, anemia por deficiencia de hierro, depresión e infertilidad, todo lo cual se mejora, en cierta medida, mediante la adhesión a la dieta libre de gluten. Estas observaciones nos dan una idea de la importancia de la adherencia a una DSG para reducir los síntomas, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida del paciente. Sin embargo, varios estudios basados en biopsias intestinales han sugerido que las transgresiones de la dieta son relativamente frecuentes, estando entre el 32,6% y el 55,4% en las poblaciones estudiadas (Ciacci y col., 2002, Digestion, 66:178-185; Silvester y Rashid, 2007, Can J Gastroenterol., 21:557-564). La falta de adherencia a una dieta libre de gluten de manera estricta es la principal razón de enfermedad celíaca mal controlada en adultos.
Así mismo existe una parte de la población celiaca que no parece responder de manera positiva a la DSG y sufren síntomas de malabsorción persistente o recurrente y atrofia de las vellosidades intestinales. Esta población podría ser sospechosa de padecer EC refractaria, una enfermedad rara (apn::lximadamente el 5%-10% de los pacientes con EC) que aparece en los pacientes sin aparente respuesta positiva a la dieta libre de gluten (Al-Toma y col., 2007, Dig Dis, 25:230-236; Freeman, 2009, Gut Liver, 3:237-246; Rubio-Tapia y Murray, 2010, Gut, 59:547-557). Aunque esta enfermedad refractaria fue descrita en pacientes con supuesta aUSoencia total de ¡ngesta de gluten, la ingestión involuntaria y la hipersensibilidad a una pequeña cantidad de gluten también pueden desencadenar los síntomas propios de la patología. La falta de un marcador preciso para el control del cumplimiento de la DSG es pues todavía una cuestión sin resolver y es especialmente difícil en el caso de leves transgresiones dietéticas (Fernández-Calle y col., 1993, Gut, 34:774-777). No hay manera de demostrar la ingesta de gluten y así evitar posibles secuelas nocivas, de hecho sólo se puede medir las consecuencias de las transgresiones dietéticas observando la, inflamación de las mucosas ylo la atrofia vellositaria para lo cual se tendría que rea.lizar biopsias intestinales y como consecuencia anestesiar al paciente con las posibles consecuencias que ello pueda tener.
El control de la anti-tTG, que ha sido propuesto como un marcador para evaluar el estricto cumplimiento de la DSG, sin embargo la eficacia de dicho marcador para controlar la ¡ngesta de gluten aún no está clara (Tack y coi., 2010, Gastroenterol Hepatol. , 7:204-213). Otros marcadores han sido propuestos para el seguimiento de la dieta, como por ejemplo la prueba de permeabilidad (Duerksen el al., 2005) o la calprotectina fecal (Ertekin y col. , 2010, J Clin Gastroenterol. , 44:544-546.) Estos métodos pueden mostrar que existen procesos inflamatorios, de tal manera que si los valores de estos marcadores se encuentran modificados puede SH como consecuencia de enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias intestinales o de procesos de alergia, lo que significa que no tienen por qué ser una medida del consumo directo de gluten. Por lo tanto, no existe un método eficaz para comprobar que el enfermo celíaco esté realizando una DSG o descartar la posibilidad de que los síntomas de la EC refractaria sean debidos a una intolerancia hipersensible a trazas de gluten asociada a una exposición involuntaria a los cereales tóxicos.
El cumplimiento de la dieta evaluado mediante entrevista ha sido sugerido como marcador de control de la EC por su bajo coste, su no invasividad, y su demostrada correlación con el daño intestinal. Sin embargo, la DSG supone numerosas restricciones para los pacientes debido a sus implicaciones sociales y económicas. Además, una dieta libre de gluten es difícil de mantener debido a la ubicuidad del gluten en los alimentos, a la desinformación educativa, a las variaGiones en el etiquetado de los alimentos y a la posible contaminación cruzada de éstos (Bethune y col. , 2009, Chem Biol. , 16:868-881 ; Selimoglu y Karabiter, 2010, J Chn Gastmenterol., 44:4-8). Por otra parte, ciertos estilos de vida y algunos sectores de la población dificultan, en cierta medida, el cumplimiento de la DSG. Además no existe una alternativa a las entrevistas a los pacientes para conocer cuánto de fiables son los resultados obtenidos de estos estudios clinicos.
Una medida más directa sobre la ingestión de gluten podría proporcionar información crítica sobre el paciente: la detección del incumplimiento de la OSG antes del daño anatómico, la detección del consumo inadvertido, la evaluación de la exactitud de la adherencia al tratamiento en el periodo inicial tras el diagnóstico cuando los pacientes están menos familiarizados con la dieta, etc., proporcionando una confirmación fácil y fiable de los resultados obtenidos. Por tanto, un marcador sensible y fiable para monitorizar y detectar la ingesta de gluten podría ser una herramienta útil para el correcto cumplimiento de la OSG y, probablemente, para un diagnóstico preciso de la EC refractaria.
Los anticuerpos monoclonales (moAbs) G12 y A1 obteniOos frente al principal epítopo inmunogénico de la a-gliadina han demostrado ser muy útiles en la detección de péptidos tóxicos en muestras de alimentos, así como en investigación clínica de desintoxicación enzimática del gluten (Morón y col., 2008, Am J Clin Nutr., 87:405-414; Morón y col., 2008, PloS ONE, 3:e2294; Ehren y col., 2009, PloS ONE, 4:e6313; Alvine Pharmaceuticals, Inc., Biomedal S.L.). La sensibilidad y especificidad de los anticuerpos monoclonales y su capacidad para reconocer péptidos resistentes a la digestión gastrointestinal los podrían hacer idE=ales para la monitorización de péptidos inmunotóxicos del gluten obtenidos tras digestión intestinal en muestras humanas. Los epítopos de reconocimiento del moAb G'12; SEO ID N° 1, SEO ID N° 2, SEO ID N° 3, SEO ID N° 4; están presentes en los principales péptidos descritos recientemente en un rastreo de alto rendimiento realizado con 2.700 péptidos procedentes de prolaminas de diferentes cereales (Tye-oin y col. , 2010, Sei Transl Med. , 2:41ra51). Los fragmentos peptídicos no digeridos procedentes de la ingesta de gluten y no absorbidos, podrían ser recuperados de las heces, lo que demostraría la ingesta de gluten del individuo.
En esta patente, hemos evaluadQ la viabilidad de la monitorización de gluten
intacto y digerido en las heces mediante· la detección de epítopos relacionados con el
péptido 33-mer, que pOdría ser aplicada en estudios clínicos y de seguimiento de la dieta, así como también, en el diagnóstico de la EC refractaria.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
La dieta sin gluten es el único tratamiento efectivo a dia de hoy para la enfermedad celíaca. Por eilo, el cumplimiento de la DSG en los pacientes debe ser monitorizado para evitar daños acumulativos directos e indirectos, así como también,
para confirmar que la persistencia de cualquier síntoma típico de la celíaca no se debe a una infracción(voluntaria o no) de la dieta. Sin embargo, actualmente no se dispone de métodos para controlar el cumplimiento de! la dieta en pacientes con enfermedad celiaca.
La presente invención tiene como objeto la aplicación de métodos inmunológicos para monitorizar el cumplimiento de la dieta libre de gluten mediante la detección en heces de péptidos inmunotóxicos resistentes a digestión gastrointestinal. Es objeto de la invención la aplicación de técnicas inmunológicas basadas en anticuerpos que reconocen péptidos inmunogénicos del gluten que resisten la digestión gastrointestinal. Preferentemente, la invención emplea técnicas inmunológicas que usan anticuerpos que reconocen el péptido 33-mer de la gliadina. Se tendría una forma preferente de realizarse la detección de los péptidos mediante métodos cualitativos rápidos basado en tiras inmunocromatográficas o bien por métodos cuantitativos y automatizables como las técnicas de EUSA. El método preferente usado en la invención debe permitir detectar gluten ingerido equivalente a 50 mgs die gluten de trigo por día, que es la cantidad máxima descrita para una dieta sin gluten, o en su caso un minimo de 20 ppms de gluten equivalente en heces.
Es objeto también de la presente patente kits o dIspositivos analíticos inmunológicos basados en anticuerpos re!activos frente al 33-mer de gliadina que estén indicados para la detección de los péptidos del gluten en heces.
Dicho procedimiento y kits analíticos tienen también su objeto de la patente en su uso para revelar la falta de adherencia a la DSG, ya sea debido a la contaminación de los alimentos consumidos o a una ¡ngesta voluntaria/involuntaria ocasional de alimentos que contienen gluten. Además, es objeto ele la presente invención la aplicación de la detección de dichos péptidos inmunotóxie:os en heces para el control de la investigación clínica sobre la enfermedad celíaca, incluidas las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas del glut1en, secuestrantes de péptidos inmunotóxicos, y otras terapias alternativas.
El objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para detección o monitorización del gluten ingerido mediante detección de péptidos inmunotóxicos en las heces, caracterizado por el uso de métodos inmunológicos con anticuerpos que reconocen, preferentemente a epitopos relacionados con el péptido 33~mer de la gliadina y otras secuencias peptídicas resistentes a las digestión gastrointestinal.
Es objeto de la presente invención el uso de técnicas inmunológicas para dicha monitorización de gluten, métodos inmunológicos tales como ELlSA indirecto, ELlSA competitivo, ELlSA sandwich, tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, Western blot, biosensores basados en reacciones electroquímicas catalizadas por enzimas acoplados a los anticuerpos, por partículas magnéticas tapizadas por anticuerpos, por resonancia de plasmones superficiales, y demás técnicas en las que se detecta la unión de un analil:o a un anticuerpo.
En una forma preferente de la invención, estos métodos se caracterizan porque emplean preferentemente uno o varios anticuerpos monoclonales con capacidad para detectar epltopos contenidos o similares al péptido 33~mer (SEQ ID N° 5), como pueden ser las secuencias siguientes: SEO ID N') 1, SEO ID N° 3, SEO ID N° 6, SEO ID N° 7, SEO ID N° 8, SEO ID N° 9, SEO ID N° 10. En una forma preferenle de la invención los anticuerpos usados por las técnicas inmunológicas serían el G12 y el A1 por su demostrada relación de su reactividad con la potencial inmunotoxicidad de una muestra. También contempla la invención el uso del anticuerpo R5 que reacciona con el epítopo SEO ID N° 11 , que también puede hallarse en péptidos del gluten resistente a digestión gastrointestinal, pero con menor especificidad antes péptidos inmunogénicos resistentes a las proteasas.
Una forma preferente de la invención sería el empleo de métodos inmunológicos basados en el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permita un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorigénicos o luminiscentes. Este procedimiento podría usar un patrón de gliadina, gliadina hidrolizada, péptido 33-mer completo o una parte de su secuencia de al menos 6 aminoácidos (SEO ID N° 1).
Otro objeto de la invención lo constituyen el uso particular de tiras inmunocromatográficas basadas en los anticuerpos anti-33-mer de gliadina, G12 y A1 que permiten una detección semicuanlitativa y rápida de los péplidos/proteínas del gluten contenidos en las heces.
La invención propone una medida del gluten ingerido por el individuo a través de la dieta. Se trata de un procedimiento útil para el control del gluten ingerido mediante el empleo de métodos analíticos en los que se ha demostrado una correlación entre la cantidad de gluten ingerida y las estimaciones de proteínas/péptidos del gluten en heces obtenidas a través de estos procedimientos.
La invención propone un instrumento analítico para la monitorización del cumplimiento de la DSG, así como tambi·én para descartar la ingesta no controlada de gluten en los pacientes sospechosos de sufrir la llamada enfermedad celiaca refractaria. Además, con este procedimiento, las nuevas alternativas terapéuticas para la desintoxicación enzimática del gluten y otra terapias alternativas también podrán ser controladas en las heces de los pacientes celíacos sometidos a ensayos clínicos o a una prescripción terapéutica en el futuro, ya que la efectividad de la terapia se podría determinar midiendo la presencia o ausencia de péptidos en heces tras 12-48 horas de la ingesta de alguna cantidad controlada de gluten junto con las terapias que eliminen los péptidos inmunotóxicos
Cuestiones aún sin resolver en léll práctica clínica, como son el control de una DSG o el control de la exposición invtjluntaria al gluten por contaminación de los alimentos, podrían ser resueltas con simples ensayos inmunológicos de las heces. Médicos, clínicos y analistas podrían considerar útiles estos métodos para el diseño de ensayos clínicos y seguimientos de sus pacientes celiacos a para establecer conclusiones coherentes sobre el estado ele la enfermedad del paciente.
La extracción de los péptidos en li35 heces se puede lIeval a cabo directamente con una solución hidroalcohólica del 40 al 60%. En algunas ocasiones por la naturaleza del alimento ingerido, podría mejorarse la extracción del gluten en heces añadiendo una solución con agentes dispersanles como el cloruro de guanidinio, el cloruro de arginina, etc; o bien detergentes como la polivinilpirrolidona, y agentes reductores como el b· mercaptoetanol, el DTT o el TCEP.
Posteriormente los pOlipéptidos del gluten extraídos se diluyen en una solución salina tamponada y se usan entonces para hacer la medida con un ELlSA, bien competitivo, bien sandwich si se quiere-tener una idea de la concentración de los péptidos reactivos. La recta patrón se podría hacer con gliadina estándar pepsinotripsinada, para simular su digestión gástrica, También se podría usar directamente polipéptido sintetizado que reaccione con los anticuerpos, preferentemente, el 33-mer de gliadina o fragmentos del mismo con la opción de poner algunas modificaciones puntuales que mantengan la reactividad frente a los anticuerpos Así por ejemplo se podrían usar los péptidos siguientes para los anticuerpos G12: SEO ID N° 1, SEO ID N° 3, SEO ID N° 5, Y SEO ID N° 6. Para el A1 además del 33-mer serian válidos los péptidos SEO ID N° 7, SEO ID N° 8, SEQ ID N° 9 o SEO ID N° 10 para hacer la recta patrón con un ELlSA competitivo.
Para un ensayo cualitativo en las que se viera si el valor de polipéptidos del gluten en heces es mayor o menor de unal cierta cantidad, se podría usar una tiras inmunocromatográficas que usen el anticuerpo G12 o A1 o bien ambos. El procedimiento se podría llevar a cabo con un kit que contuviese la solución de extracción de los polípéptidos en heces; un patrón de referencia con polipéptidos del gluten hidrolizados por pepsina y tripsina o bien sintetizados; y los componentes de un ELlSA con una placa multipocillo y usando los anticuerpos A1 }f/o G12 para inmovilizar los pocillos y/o para el revelado del ensayo, o bien tiras inmunocromatográficas.
DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, con c;arácter ilustrativo y no limitativo, las figuras siguientes:
Figura 1. Afinidad relativa del moAb G12 frente a péptidos inmunotóxicos derivados de la gliadina PWG tras simulación de la digestión gastrointestinal. A y
B. SOS-PAGE y Weslern blot de gliadina PWG, PWG gliadina + pepsina y gtiadina PWG + pepsina + tripsinalquimotripsina. Las muestras fueron teñidas con plata o transferidas a una membrana de PVOF con el moAo G12. PM: marcador de peso molecular. C. Análisis rnediante ELlSA competitivo G12-HRP de los
péptidos procedentes de la gtiadina PWG.
Figura 2. Resistencia del péptido 33-mer a la ruptura mediante enzimas gastrointestinales. A. Secuencia de aminoácidos del péptido 33-mer. La secuencia de reconocimiento del moAb G12 en el péptioo 33-mer aparece en negrita. B. ELlSA competitivo para la detección de 33-mer tras tratamiento con pepsina, tripsina y quimotripsina mediante el uso del moAb G12-HRP. C. Western
blol del péptido 33-mer tras tratamiento con enzimas gastrointestinales. PM: marcador de peso molecular. Se realizaron dos ensayos por separado con 3 repeticiones cada uno.
Figura 3. Detección de gluten en las heces de individuos sanos sumetidos a una dieta controlada de gluten. A y B . Semicuantificación de péptidos/proteínas del gluten en las heces de individuos sanos (n=11) mediante !nmunocromatográfica G12. La franja azul es un control interno positivo que indica que el dispositivo ha funcionado correctamente, y la franja rosa indica la presencia de gluten. HL901HL911: sujetos que intervinieron el1 el estudio. ·Se detectaron trazas de gluten. e
y D. SDS-PAGE y Western blol de Jos péptidoS de gluten y proteínas extraídas de las heces. PM: marcador de peso molecular.
Figura 4. Concentración de pépticio 33-mer (ng/mg) en las heces tras una dieta
controlada de gluten. ELlSA competitivo G12-HRP para conocer la relación entre las proteínas del gluten ingeridas/excretas mediante su contenido en péptido 33mero La concentración de péptido 33-mer se determinó mediante con una curva estándar de 33-mer. Dos ensayos se realizaron por separado, cada uno con tres repeticiones.
REALIZACiÓN PREFERENTE DE LA INVENCiÓN
Ejemplo 1. Cuantificación de los péptiidos tóxicos de la gliadina PWG obtenidos tras simulación de la digestión gastrointestinal.
En el presente ejemplo se muestra como una parte sustancial de los péptidos inmunogénicos del gluten, permanecen susceptibles de detección en heces a pesar de la digestión gastrointestinal. Entre las principales proteínas de la dieta, las que forman parte del gluten son las únicas que contienen aproximadamente un 15% de residuos de prolina y un 35% de residuos de glutamina. El alto contenido en estos dos aminoácidos impide la completa proteolisis de estas proteínas por parte de las enzimas gástricas y pancreáticas, de manera que se forman fragmentos peptídicos el'l el intestino delgado que son inmunotóxicos para los pacientes celiacos. En particular, el peptido 33-mer fue encontrado como uno de los principales contribuyentes de la inmunotoxicidad del gluten (Shan y col., 2002, Seienee, 297:2275-2279). Este péptido de la 0-2 gliadina contiene 6 epi topos de reconocimiento de las células T y es altamente resistente a la proteolisis.
El moAb G12 es específico para el epitopo de 6 aminoácidos SEO ID N° 1, con 3 repeticiones en el péptido 33-mer. Además, es este anticuerpo es capaz de reconocer otros péptidos inmunoreactivos contenidos en las gliadinas y otras prolaminas tóxicas. El objetivo de este ejemplo es mostrar como es conocer la capacidad del anticuerpo G12 para detectar los péptidos tóxicos formados tras la simulación gastrointestinal de la gliadina. Para la estandarización de estel:msayo se utilizó la gliadlna PWG, considerada como un reactivo de referencia internacional en los análisis de gluten debido a su alto contenido en gliadinas, su buena solubilidad, su homogeneidad, su estabilidad y por estar constituida por 28 cultivares de trigo europeo (Eckert y col. , 2006, J Cereal Scl. , 43:331341)
La gliadina fue sometida a digestión secuencial con pepsina (la principal proteasa presente en el estómago), con tripsina y quimotripsina (proteasas contenidas en la membrana intestinal). Las muestras fueron incubadas a 37 oC en solución de HCI (pH 2) que contenía 0,06 mg/ml de pepsina. Las muestras fueron incubadas durante 60 min y se desactivaron mediante calor a 95 oC durante 5 mino Después de la simulación gástrica con pepsina , las digestiones se ajustaron a pH 6.0 con tampón fosfato sódico, e incubados con proteasas pancreáticas: tripsina (0,375 mg/ml) y quimotripsina (0,375 mg/ml). Tras la simulación duodenal a ~17 o C durante 30 min y las muestras fueron inmediatamente inactivadas a 95 oC durante 5 mino
El perfil proteico de las fracciones de prolaminas que constituyen la gliadina PWG fue analizado mediante SDS-PAGE con el fin de observar el patrón de bandas obtenido tras el tratamiento enzimático y confirmar que las muestras habían sido digeridas. Para el análisis mediante SOS-PAGE, las muestras fueron diluidas en tampón de electroforesis
(62.5 mM Tris-Hel a pH 6,8; 10% glicerol; 2% SOS; 0,001% azul de bromofenol y 5% 2mercapto-etanol) y desnaturalizadas mediante ebullición a 100°C durante 5 mino Este paso se repitió un total de tres vece8. Las muestras se corrieron en geles de poliacrilamida al 15-18% (SOS-PAGE) a un voltaje constante de 100 V utilizando el sistema MiniProtein (BioRad LaboratoriHs). Las proteínas separadas en el gel de electroforesis, fueron teñidas usando tinción de plata.
El estudio de la gliadina PWG intacta mediante gel 1 D reveló bandas intensas de alfa, beta y gamma gliadinas (Pm= 33-45 I~Da) y bandas débiles de omega gliadina (Pm= 50-67 kDa) (Eekert y col. , 2006, J Cereal Sei., 43:331-341). La digestión de estas proteínas mediada por pepsina (digestión gástrica) dio lugar a la formación de fragmentos peptídicos de menor tamaño, inferiores a 25 kDa. Secuencialmente, la digestión con tripsina y quimotripsina generó péptidos más pequeños (inferiores a 15 kOa), como consecuencia del proceso de hidrólisis mediado por estas enzimas (Figura lA).
Con el objetivo de comprobar si los péptidos de la gliadina PWG obtenidos mediante el proceso de digestión gastrointestinal eran reconocidos por el anticuerpo anti33-mer se realizó un Western blot con dicho anticuerpo de las muestras descritas anteriormente: gliadina PWG sin digerir, gliadina PWG sometida él digestión gástrica y gliadina PWG sometida a digestión intestinal (previa digestión gástrica). Los extractos proteicos obtenidos inicialmente fueron separados mediante gel SDS-PAGE y seguidamente incubados con el anticuerpo G12 en membranas de PVOF. Posteriormente, se incubaron en tampón de bloqueo (TBS con leche desnatada al 5%) durante toda la noche, tras lo cual se añadió el anticuerpo G12 (dilución 1:5000 en solución de bloqueo). Después de 3 lava.dos, las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario anti-mouse 19G conjugado a fosfatasa (Sigma, Sr. Louis, MO) (dilución 1:2000 en solución de bloqueo). La membrana se reveló utilizando el sistema Sigma-Fas!.
El anticuerpo G12 fue capaz de reconocer las distintas fracciones que componen la gliadina PWG. Tras digestión gástrica, los fragmentos peptídicos formados continuaron siendo reconocidos por el anticuerpo G12 (Figura 18). El tratamiento secuencial con enzimas pancreáticas (tri psina, quimotripsina) dio lugar a la presel"lcia de péptidos más pequeños también reconocidos mediante moAb G12.
Con el fin de conocer la capacidad del anticuerpo G12 para cuantificar los péptidos tóxicos generados, se determinó la concentración de 33-mer y péptidos análogos obtenidos tras simulación gastrointestinal de la gliadina PWG mediante ELlSA competitivo, usando igualmente el anticuerpo G12. El ELlSA competitivo es una técnica muy apropiada para el seguimiento de la digestión del gluten, ya que es capaz de detectar tanto proteínas intactas como pequeños fragmentos de proteínas: estos últimos podrían ser subestimados con ELlSA s~lndwich, debido a que para la detección de antígenos requiere como mínimo dos epítopos diferentes por molécula de péptido.
La cantidad relativa de epítopos inmunotóxicos contenida en las muestras se cuantificó mediante ELlSA competitivo con el uso del moAb G12-HRP (Biomedal S.L. , Sevilla, España). Para este ensayo se usó placas Maxisorp microtiter (Nunc, Roskilde, Dinamarca) que fueron recubiertas con 100 IlUpocillo de solución de gliadina Sigma (5 Ilg/mL) en 0,1 M de PBS (Na2COr NaHC03, pH 9,6), e incubadas a 4°C toda la noche. Las placas fueron lavadas con PBS 0,05% Tween® 20 y bloqueadas con solución de bloqueo (PBS, 5% leche desnatada) durante 1 h a temperatura ambiente. Se realizaron diluciones seriadas del patrón (gliadina o péptido 33-mer) y de las muestras de estudio en PBS con BSA 3% (100 IlL) Y a cada una de ellas se añadió 100 JlL de solución de moAb G12 conjugado con HRP (1 :10.000 en PBS con BSA 3%) Se preincubaron las muestras 1 h a temperatura ambiente con agitación suave, y posteriormente se añadieron en los pocillos. Tras 30 minutos de incubación, se lavaron las muestras, y se les añadió 100 IlUpocillo de solución de sustrato (TMB, Sigma, SI. Louis, Missouri, EE.UU.). Trascurridos 30 minutos de incubación a temperatura ambiente en oscuridad, se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 1 M (100 j.LUpocillo), y la absorbancia se midió a 450 nm (Lector de microplacas UVM340, Asys Hitech GMBH, Eugendorf, Austria). La concentración de gliadina/33-mer se determinó usando el modelo de los 4 parámetros.
Con este método, se determinó la concentración de 33-mer tanto en la gliadina PWG intacta como sometida a digestión gástrica y a digestión intestinal. La digestión gástrica de la gliadina PWG dio lugar a un ligero aumento en los niveles de péptido tóxico. Posiblemente este aumento es debido a la apertura de las moléculas que constituyen las fracciones de gliadina, de esta manera los epitopos del anti-33-mer presentes quedan más accesibles, y por tanto, se identifican coro mayor especificidad (gliadina PWG intacta=21 ,6 ng 33-mer/lJg vs. Glladina PWG digestión gástrica=24,5 n9 33-mer/lJg). Tras el proceso sucesivo de digestión intestinal el moAb G12 continúa reconociendo los péptidos de la gliadina PWG formados, aunque con menor especificidad (7,5 ng 33-mer/~g) (Figura le).
En contraste con estos resultados, estudios in vitro e in vivo realizados con el péptido 33-mer demuestran la gran estabilidad de este péptido a la ruptura mediante endoproteasas gástricas, pancreáticas e intestinales. Sus características hacen que sea sugerido como el principal promotor de la respuesta inflamatoria al gluten en pacientes celiacos (Figura 2A) (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; 2005, J Proleome Res., 4:1732-1741).
Con el objetivo de verificar que el péptido 33-mer permanece intacto tras proteólisis gástrica (mediada por pepsina) y secuencial proteólisis intestinal (mediada principalmente por tripsina y quimotripsina) se realizó una simulación in vitro de la digestión gastrointestinal de dicho péptido. Las concentraciones de péptido 33-mer obtenidas tras cada uno de los procesos de digestión se determinaron mediante ELlSA competitivo usando el anticuerpo monockmal anti-33-mer. La concentración de 33-mer obtenida tras digestión gástrica no varió significativamente con respecto al péptido no sometido a digestión (194 IJg/mL vs. 186 IJg/mL, respectillamente, p=0,4469). Igualmente, la exposición del 33-mer a I;as enzimas tripsina y quimotripsina (digestión intestinal), no supuso una variación de los niveles de este péplido en comparación con el péptido no tratado (169 ~g/mL vs. 186 ~g'/mL, respectivamente, p=0,1024) (Figura 2B). Estos resultados confirman la gran estabil"idad del 33-mer a la hidrólisis por parte de las enzimas implicadas en el proceso digestivo.
Los resultados obtenidos mediante ELlSA fueron confirmados mediante análisis Western blot. Tricina-SDS-PAGE y Western blol se realizaron en condiciones estándar (Sousa y col. , 2001 , Mol Cellular Biol. , 7:.204-213). El inmunobotting mostró bandas de aproximadamente 3,5 kDa tanto en la mUE~stra que conteína 33-mer no procesado como en aquella que contenía 33-mer sujeto a digestión gastrointest'nal (Peso molecular teórico 33-mer 3,9 kDa, PIR, Protein Information Resource, Georgetown University Medical Center. E.E.U.U.) (Figura 2C).
Del mismo modo, la capacidad elel moAb G12 para detectar hidrolizados se evaluó mediante un sistema de detección rápida de gluten, las tiras inmunocromatográficas basadas en el moAb G12 (GlutenTox stick, 8iomedal S.L.). El límite de detección de la gliadina y la gliadina hidrolizada fue de 30 ng/ml (6 ppm de gluten) y 50 ng/ml (10 ppm de gluten hidmlizado), respectivamente, mientras que para el péptido 33-mer y el péptido 33-mer sometido a digestión fue de 0,5 ng/mL en ambos casos. Estos resultados sugieren que el método de análisis presenta una alta sensibilidad tanto frente a las proteínas/péptidos intactos como frente a sus respectivos hidrolizados.
Los resultados obtenidos mediante Western blot, ELlSA competitivo y tiras inmunocromatográficas sugieren que el anti-33-mer G12 podría ser usado para controlar la presencia de los péptidos tóxicos de la ~lliadina y otras prolaminas de gluten durante el proceso digestivo. Al menos un tercio de los péptidos reactivos para G12 se mantuvieron resistentes a la digestión gastrointestinal. Por lo tanto, una parte sustancial de los epítopos de las prolaminas de los alimentos ingeridos que fueron detectados con moAb G12 podrían ser resistentes a la digestión gastrointestinal y su detección podría ser adecuada en el tubo gastrointestinal.
Ejemplo 2. Detección y semicuantificnción de péptidos/proteinas del gluten en heces de individuos sanos sometidos a una dieta controlada de gluten.
En el presente ejemplo se muestra como ocurre la digestión que sufren las proteínas del gluten in vivo en individuo~; sanos y como determinar la capacidad del moAb G12 para detectar dichas proteínas/péptidos excretados a través de las heces. Se
30 llevó a cabo un ensayo en el que se controló el tipo y la cantidad de gluten consumido en individuos sanos (n=11 , 7 mujeres y 4 hombres, edad media 24-42 años). Los criterios de inclusión comprenden la ausencia de enfermedades, síntomas digestivos, medicamentos, antibióticos en los últimos dos meses y alusencia de historia familiar de EC. Todos los participantes fueron evaluados para la EC, mostraron niveles de tTG sérica normales y su fenotipo HLA-OO no fue 00-21-8. Los niveles de hemoglobina y el análisis de bioquímico de sangre, incluyendo las pruebas renales y hepáticas, estaban dentro de los valores normales. El comité de Ético local del "Hospital Universitario de León", fue aprobado para este estudio y se obtuvo el consentimiento informado de los sujetos.
Para este estudio se llevó a cabo el siguiente protocolo:
Dieta:
Los sujetos fueron instruidos para cumplir una dieta en la que controló el tipo y la cantidad de gluten consumido durante los 15 días que duró este estudio. En primer lugar, los sujetos consumieron una dieta libre de gluten estricta durante una semana. Los siguientes 4 días, 9 g de gluten no procesado fueron ingeridos, distribuidos en las tres comidas del día. En los últimos 4 días, la dosis de gluten se incrementó a 30 g, distribuidos de manera similar.
Toma de muestra fecal:
Se recogieron las heces frescas de los 11 sujetos que intervinieron en el estudio bajo distintas condiciones de dieta: dieta normal, DSG, DSG+9 g de gluten y DSG+30 g de gluten. La toma de muestras se llevó a cabo antes de la DSG y después de cada una de las dietas ensayadas. Todas las muestras fueron homogeneizadas y alicuotadas en menos de 3 horas después de la defecación.
La extracción de las prolaminas de las heces y solución de gliadina:
Prolaminas se extrajeron mediante la mezcla de 1 g de heces con 10 mi de etanol 60% (v/v) en un agitador rolatorio durante 1 h a temperatura ambiente. La suspensión se centrifugó a 13.000 x g durante 10 min y se separó el sobrenadanle. El control positivo, gliadina PWG, se preparó, igualmente, en etanol 60% (vlv) a una concentración de 1
mg/ml.
En primer lugar, se realizó la toma de muestra de heces de los individuos analizados, los cuales mantenían una dieta normal en la que estaba presente el gluten (pan, pasta, galletas, etc.). La presenciél de polipéptidos del gluten en los extractos fecales se determinó de manera semicuantitativa usando tiras inmunocromatográficas
basadas en el anticuerpo G12, en diluciones seriadas de la muestra con el objetivo de representar un amplio rango desde menos de 6 ppm hasta más de 500 ppm . Las muestras fueron diluidas (1 :10 a 1:20.0QO) en la solución de dilución propuesta por el fabricante (se probaron 6, 25, 50, 100, 250 Y 500 ppm de gluten)_ Las tiras inmunocromatográficas se sumergieron en las distintas muestras (300 I-lL) durante 10
min y se dejaron secar al aire. En este~ caso, todos los individuos presentaron una excreción de proteínas/péptidos del gluten en heces con valores por encima de 500 ppm (Figura 3A Y 3B).
Una vez confirmada la viabilidad del método para la detección del gluten en heces, estudiamos si existía una correlación entre la cantidad de gluten consumido y la 15 cantidad de gluten excretado. Para ello, IQS 11 individuos fueron sometidos a una dieta controlada de gluten. En primer lugar, estos individuos consumieron una dieta estricta libre de gluten durante una semana; a continuación, se les admininistró 9 g de gluten al día repartidos en las comidas principales durante un periodo de 4 días (teniendo en cuenta el tiempo de llenado del intestino grueso) y por último, consumieron 30 g de 20 gluten al día, igualmente repartidos en las comidas principales durante un periodo de 4 días. Con el fin de evitar diferencias en la determinación de gluten como consecuencia de la ingesta de diferentes productos con gluten de distinto origen, en todos los casos se les administró el mismo tipo (sin previo tratamiento térmico). El calendario propuesto tuvo en cuenta que en personas sanas el tiempo de tránsito es de 45 :t 16 horas (media ±
25 desviación estándar) con una dieta rica en fibra y más de 70 horas en dietas pobres en fibra (Stasse-Wolthuís y col. , 1979, Am J Chn Nutr., 32:1881-1888). Las muestras de heces recogidas durante el periodo en el que los individuos mantuvieron una dieta exenta de gluten presentaron, en todos los casos, niveles de
gluten por debajo del límite de detección del método (6 ppm gluten illtacto, 10 ppm gluten hidrolizado). En cambio, cuando se realizó una ingesta de 9 9 de gluten al día se encontró que la cantidad de gluten detectada estaba por encima de 250 ppm en todas las muestras, exepto en una de ellas que pre:sentaba valores entre 6 y 25 ppm. Cuando los
5 individuos consumieron 30 g de gluten al día los niveles excretados por encima de 500 ppm (Figura 3A y 3B), más de 1.000 veces superiores al limite de detección del método. Por tanto, existe una correlación entre la cantidad de gluten consumida y la cantidad de péptidos con epítopos G 12 excretada a través de las heces.
Con el fin de demostrar la idoneidad del moAb G12 en la detección de
10 péptidosfproteinas del gluten excretadas €!n las heces, los extractos proteicos obtenidos mediante tratamiento con etanol 60%, así como los controles, gliadina PWG y el gluten ingerido por los sujetos, fueron separados mediante SDS-PAGE . Posteriormente las proteínas/péptidos fueron teñidas con tinción de plata o transferidas a una membrana y posterior análisis Western blot con el moAb G12 (Figura 3e y 3D). Los resultados
15 indicaron que el moAb G12 reacciona con las muestras derivadas de una dieta convencional no controlada, DSG+9 g gluten y DSG+30 g gluten, así como también con el controles positivos, gliadina PWG y el gluten ingerido. Sin embargo, en la muestra derivada de una DSG no se encontraron péptidos/proteínas en heces (Figura 3D).
20 Ejemplo 3. Monitorización in vivo de péptidos inmunotóxicos derivados del gluten en heces de individuos sometidos a UOéI dieta controlada de gluten.
En el presente ejemplo se muestra cómo se puede determinar por un método ELlSA la digestión parcial de los pépticlos reactivos con el anticuerpo usado en la 25 invención, por el método más adecuado y ampliamente utilizado en el análisis clínico, al unir sencillez, sensibilidad y economía. En el caso de la detección de proteínas/péptidos del gluten, los sistemas ELlSA tipo sándwich están diseñados para cuantificar proteínas intactas, pero pueden subestimar gluten hidrolizado. El paso del gluten por el tracto gastrointestinal da lugar a la hidrólisis de la mayor parte de este: un ELlSA competitivo es 30 capaz de cuantificar péptidos tóxicos, inc:Juso a nivel de unos POc.os aminoácidos, por
tanto sería un método conveniente para su cuantificación.
Por tanto, el objetivo de este estudio fue determinar la concentración de péptidos tóxicos presentes en heces de individuos sanos mediante EUSA competitivo G12, usando como curva patrón el péptido 3:1-mer. Cada experimento se llevó a cabo por triplicado en días separados. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS para Windows. Los datos se expresaron como media, máxima, mínima y valores de percentiles 25 y 75. Las difmencias entre los grupos fueron examinados mediante el test de Friedman y el tes1 de Wilcoxon para comparar dos muestras relacionadas. La probabilidad estadística de p<0,05 fue considerada significativa.
Al igual que en el ensayo anterior, las muestras de heces analizadas fueron las correspondientes a los periodos de ingEesta: dieta no controlada, GSD, GSO+9 g y GSD+30 g. Las muestras de heces recogidas durante el periodo en el que los individuos mantuvieron una dieta exenta de gluten presentaron niveles de peptido tóxico inferiores al límite de cuantificación del método (5,4 pg 33-mer/mg muestra). Sin embargo, cuando se realizó una ingesta de 9 g de gluten al día en todos los casos se detectaron péptidos inmunoreactivos en heces, encontrándosle en el rango de entre 3 49 Y 9,62 ng de 33mer/mg de heces, 600 veces superior al límite de detección del método. Por último, cuando los individuos consumieron 30 9 de gluten al día los niveles de 33-mer obtenidos ascendieron en todos los casos, con respecto al periodo de ingesta de 9 g/día (6,6928,00 ng de 33-mer/mg faeces, p=0,018, con respecto a DSG+9 g) (Figura 4), más de
1.000 veces superior al límite de detección del método. Estos resultados concuerdan con los obtenidos anteriormente en la detección de gluten en heces mediante inmunocromatografia. El método basado en el anticuerpo anti-33-mer podría estimar la cantidad de proteínas del gluten consumidas mediante la medida de los péptidos reactivos excretados en las heces, ademús la ingestión de algunos gramos de gluten al día pOdrían detectarse en cantidades 600 veces superiores al límite de detección. Por lo tanto, una cantidad de ingesta superior i3 10 mg de gluten al día podría ser asumida como detectable mediante ensayos inmunológicos basados en el moAb G12.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Procedimiento para la monitorización del gluten ingerido mediante detección de péptidos inmunotóxicos en las heces caracterizado por el uso de métodos inmunológicos con anticuerpos que reconocen péptidos de proteínas del gluten con resistencia a la digestión gastrointestinal.
  2. 2.-Procedimiento para la monitorización dE" gluten según la reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos usan al menos un anticuerpo monoclonal con reaclividad por algunas de las secuencias del péptido 33-mer, SEQ ID N° 5.
  3. 3.-Procedimiento para la monitorización dE~ gluten en heces de las reivindicaciones 1 a 2 en el que los métodos inmunológicos usan al menos un anticuerpo monoclonal con capacidad para detectar los epítopos contenidos en el péptido 33-mer (SEO ID N° 5), SEa ID N° 1, SEa ID N° 3, SEa ID N° 6, SEa ID N° 7, SEa ID N° 8, SEa ID N° 9, SEa ID N° 10.
  4. 4.-Procedimiento para la monitorización de~ gluten en heces de las reivindicaciones 1 a 3 en el que los métodos inmunológico:s usan al menos uno de los anticuerpos monoclonales G12, A1 YR5.
  5. 5.-Procedimiento para la monitorización de! gluten en heces de la reivindicaciones 1 a 4 en el que los métodos inmunológicos son un ElISA indirecto, ElISA competitivo, ELlSA sandwich, tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, inmunopartículas magnéticas, Westem blot, biosensores electrónicos, biosensores de resonancia.
  6. 6.-Procedimiento de monitorización de la ¡presencia de péptidos del gluten ingeridos según las reivindicaciones 1 a 5 en el que los métodos inmunológicos usan el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permite un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos , f1uorigénicos o luminiscentes.
    5
    7.Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo inmunológico según algunas de las reivindicaciones del 1 a 6, caracterizado porque se usa como patrón de referencia algunos de los péptidos de la reivindicación 3.
    10
    8. -Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo inmunológico según alguna de las reivindicaciones del 1 a 6, caracterizado porque se usa como patrón de referencia gliadina hidrolizada con pepsina y tripsina.
    15
    9.Procedimiento de monitorización E!n heces de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo en el que los métodos inmunológicos usan al menos uno de los ¡:mticuerpos anti gliadina G12 y A1 para la realización de un ensayo semicuantitativo basado en tiras inmunocromatográficas de detección rápida.
    20
    10.-Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para la monitorización del cumplimiento de la die·ta sin gluten. 11 .-Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para detectar la ingesta no controlada de gluten t~n pacientes celíacos sometidos a dieta sin gluten pero con síntomas refractarios y agudos de la enfermedad celiaca.
    2S
    12.-Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para monitorizar la efectividad de las terapias rEllacionadas con la eliminación de péptidos inmunogénicos del gluten.
    30 35
    13.-Kit analítico para detectar péptidos inmunogénicos del gluten en heces que comprendan: Una solución dedicada a la extracción del gluten en heces. Un patrón de referencia peptídico que comprenda al menos una parte o la totalidad del péptido inmunogénico cilel 33-mer de gliadina. Un ensayo inmunológico que usen sllgún anticuerpo reactivo con el péptido 33mer de gliadina.
  7. 14.-Kit analítico para detectar péptidos inmunogénicos del gluten en heces de la reivindicación 13 que comprenda: Una solución acuosa que tenga en s,u composición alguno de los componentes
    siguientes: un agente dispersante, un detergente suave, un agente reductor, un tampón, y etanol. Un patrón de referencia peptídico obtenido por hidrólisis pepsino-tripsinada de gliadina o un péptido sintético que comprenda parte o la totalidad de la secuencia del 33-mer de la gliadina.
    Un ensayo inmunológico que usen a.lgún anticuerpo reactivo con el péptido 33mer de gliadina del tipo ELlSA, tiras inmunocromatográficas, inmunoblols, biosensores electrónicos.
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