ES2385463B1 - Procedimiento para la selección de semillas de cereales aptas para ser consumidas por los enfermos celíacos. - Google Patents
Procedimiento para la selección de semillas de cereales aptas para ser consumidas por los enfermos celíacos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2385463B1 ES2385463B1 ES201001632A ES201001632A ES2385463B1 ES 2385463 B1 ES2385463 B1 ES 2385463B1 ES 201001632 A ES201001632 A ES 201001632A ES 201001632 A ES201001632 A ES 201001632A ES 2385463 B1 ES2385463 B1 ES 2385463B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- celiac
- seeds
- gliadin
- antibody
- gluten
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims abstract description 36
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims abstract description 36
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims abstract description 31
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 241000209056 Secale Species 0.000 claims abstract description 21
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 7
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims abstract 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims description 81
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 claims description 43
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 23
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 23
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 claims 7
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 14
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 abstract description 9
- 230000037213 diet Effects 0.000 abstract description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 abstract description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 abstract 1
- 241000209761 Avena Species 0.000 description 51
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 27
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 21
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 description 14
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl n-dimethoxyphosphorylcarbamate Chemical compound COP(=O)(OC)NC(=O)OC(C)C XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 9
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 9
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-[[1-[5-amino-2-[[1-[2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1CCC(C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)N1C(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 235000006171 gluten free diet Nutrition 0.000 description 6
- 235000020884 gluten-free diet Nutrition 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 108700039882 Protein Glutamine gamma Glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 description 5
- 102100038095 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Human genes 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 4
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical class [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 2
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 101001109993 Artemia salina 60S acidic ribosomal protein P2 Proteins 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010006002 Bone pain Diseases 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 208000015710 Iron-Deficiency Anemia Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 description 1
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010049644 Williams syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101000832077 Xenopus laevis Dapper 1-A Proteins 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 108010050792 glutenin Proteins 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000006486 human diet Nutrition 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000005024 intraepithelial lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 150000003148 prolines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 208000029138 selective IgA deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012819 small-bowel biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 235000020790 strict gluten-free diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
- A23L7/10—Cereal-derived products
- A23L7/198—Dry unshaped finely divided cereal products, not provided for in groups A23L7/117 - A23L7/196 and A23L29/00, e.g. meal, flour, powder, dried cereal creams or extracts
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a un procedimiento sencillo para la selección de variedades de semillas de trigo, cebada, centeno, y en particular avena, que manipuladas genéticamente o no, permita que dichas semillas puedan ser usadas en la producción de alimentos y bebidas libres de gluten aptos para los pacientes celíacos, e incluso la elaboración de excipientes de determinados fármacos. Esta invención está basada en un sistema sencillo de detección inmunológica que permite cuantificar los péptidos más inmunogénicos del gluten con el objetivo de saber si la variedad de un cereal, preferentemente avena, puede ser usada para producir semillas aptas que puedan formar parte de la dieta de un celíaco. Los ensayos preferentes usarían al menos un anticuerpo que reconoce la parte más inmunogénica de las prolaminas, y cuya reactividad frente a las semillas del cereal haya demostrado ser proporcional a su inmunogenicidad con células T de enfermos celíacos.
Description
Procedimiento la selección de semillas de cereales ser consumidas los enfermos celíacos
OBJETO DE LA INVENCiÓN
La presente invención tiene por objeto un sistema sencillo de detección inmunológica que permite cuantificar los péptidos más inmunogénicos del gluten con el objetivo de saber si la variedad de un cereal, preferentemente avena, puede ser usada para producir semillas aptas que puedan formar parte de la dieta de un celíaco. Se basa en ensayos inmunológicos con anticuerpos monoclonales que detectan el péptido 33-mer de la gliadina y otros péptidos afines tóxicos para los enfermos celíacos.
Se trata de un método específico y fiable que se puede aplicar industrialmente para identificar semillas de avena y otros cereales que sean tolerables y seguras para los pacientes celíacos. Los cereales seleccionados también pueden ser usados para hacer ingredientes que formen parte de excipientes de fármacos, y de otras aplicaciones industriales en productos que van a ser ingeridos por el colectivo celíaco. Por lo tanto, el procedimiento descrito en esta patente puede eventualmente tener un uso no sólo en el sector alimentario sino en el farmacéutico, siendo el sector agrícola el de interés preferente
ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN
La enfermedad celíaca (EC) se define como una altEración de la mucosa del intestino delgado proximal asociada con una intolerancia permanente al gluten, en individuos predispuestos genéticamente a los que se añaden factores ambientales. En esta enfermedad se desarrollan cambios morfológicos de la mucosa del intestino, con largas criptas y atrofias completas o parciales de las vellosidades intestinales después de la ingestión de productos elaborados con
cereales, incluyendo aquellos derivados del trigo, la c.ebada, el centeno y probablemente la avena.
Las características clínicas de la EC difieren considerablemente en función de la edad de presentación. Los síntomas intestinales y el rl3traso del crecimiento son comunes en todos aquellos niños que hayan sido dia~lnosticados dentro de los primeros años de su vida (Stern y coL, 2001, Eur J Gastroenterol HepatoL, 13:741-747). El desarrollo de la enfermedad en momentos posteriores de la infancia viene marcado por la aparición de síntomas extraintestinales, como anemia ferropénica refractaria, dispepsia, estreñimiento, dolores óseos y articulares, ataxia, elevación de las enzimas hepáticas, trastornos en la esfera reproductiva, etc. (Stern y coL, 2001, Eur J Gastroenterol HepatoL, 13:741-747). La EC está asociada a trastornos autoinmunitarios como la enfermedad de Addison, tiroiditis autoinmune, hepatitis autoinmune, etc. Existen además otras patologías asociadas a la enfermedad celíaca como: síndrome de Down, síndrome de Turner, síndrome de Williams y déficit de inmunoglobulina A, enfermedades neurológicas, endocrinas, hepáticas, reumáticas, cardíacas, cutáneas, etc., incluidos tumores malignos de diferente localización, principalmente digestivos.
Originalmente considerado un síndrome raro de malaabsorción infantil, en la actualidad se considera una enfermedad común que afecta aproximadamente al 1% de la población, que puede ser diagnosticada a cualquier edad y que afecta a muchos sistemas orgánicos. Su base genética justifica que puede haber más de un paciente celíaco dentro de una misma familia.
Hasta la fecha, la única terapia efectiva existente es la exclusión completa y permanente del gluten de la dieta, lo que consigue la mejora o desaparición de los síntomas en prácticamente todos los pacientes. Aunque a primera vista llevar una dieta exenta de gluten pueda parecer sencillo, lo cierto es que determinadas situaciones favorecen su ingestión involuntaria, ya que cereales como el trigo están muy arraigados en nuestra sociedad, estando presentes en una gran cantidad de productos manufacturados. Se han llevado a cabo diversos estudios con el fin de determinar la cantidad máxima de gluten diaria que puede ser consumida por un enfermo celíaco de manera segura. Un estudio sugiere que la ingestión de trazas de gluten por los celíacos debe ser mantenida por debajo de 50 mg al día (Catassi y coL, 2007, Am J Clin Nutr., 85:160··166). Sin embargo, y dado que existen distintos niveles de tolerancia a la ingestión de gluten entre los enfermos celíacos, la cantidad de gluten que puede ser ingerida por un enfermo celíaco no puede ser establecida de manera generalizada, existiendo enfermos celíacos que presentan alteraciones de la mucosa intestinal tras la ingesta de sólo 10 mg de gluten al día (Catassi y col., 2007, Am J Clin Nut~., 85:160-166). Por lo tanto, el mantenimiento de una dieta exenta de gluten no es tarea sencilla, no sólo por el elevado coste económico que implica, sino también porque el gluten está presente en la mayoría de los alimentos que existen hoy día en el mercado. Así por ejemplo, el gluten es un ingrediente común en la dieta humana, quizás, después del azúcar es el ingrediente alimenticio más usado en la civilización Occidental. Por otro lado, hay que resaltar que, según la Comisión del Codex Alimentarius, en la actualidad un alimento "exento de glutBn" no es aquel cuyo contenido en gluten es O, sino el que contiene una cantidad je gluten inferior a 20 mg/kg. Por tanto, a pesar de que un paciente celíaco lleve a cabo una dieta estricta libre de gluten, estaría consumiendo de manera involuntaria pequeñas cantidades del mismo.
El gluten es una mezcla compleja de polipéptidos presente en cereales como el trigo, la cebada, el centeno y la avena. Los principales componentes inmunogénicos del gluten pertenecen a una familia de proteínas caracterizadas por su alto contenido en residuos de prolina y glutami'la, conocidas como prolaminas. Las prolaminas del trigo, la cebada, el centeno y la avena, se denominan gliadinas, hordeinas, secalinas y aveninas, respectivamente. La enfermedad se desencadena por la presencia de péptidos procedentes de la fragmentación de las prolaminas, las cuales no son digeridas por las proteasas gastrointestinales y resultan ser tóxicas para los pacientes celíacos. La estructura peptídica es esencial para producir el efecto tóxico, ya que cuando los polipéptidos de las prolaminas se hidrolizan hasta los aminoácidos constituyentes, se pierde la capacidad lesiva para el intestino. Entre los "péptidos tÓXiCOS" identificados el denominado 33-mer, (SEa ID N° 1, residuos 57-89 de la gliadina) que contiene 6 epítopos de reconocimiento de las células T es uno de los péptidos más inmunogénicos presente en la gliadina y uno de los responsable de la reacción inmune que se desencadena en el intestino de los pacientes c:::elíacos (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Sollid, 2002, Nat Rev Immunol., 2:647-655). Estos autores demostraron mediante estudios in vitro e in vivo en ratas y en humanos, que el péptido 33-mer de la a-gliadina es muy resistente a la proteólisis enzimática gástrica pancreática e intestinal. Estos péptidos pasan por la mucosa intestinal donde interaccionan con la transglutaminasa tisular, que transforma los residuos de glutamina en ácido glutámico y, como consecuencia de ello, se producen una serie de cambios que desencadenan reacciones con base inmunológica, que acaban destruyendo las vellosidades intestinales.
Como se ha indicado, actualmente el único tratamiento efectivo para la EC es mantener una dieta estricta exenta de productos elaborados con trigo, cebada, centeno y probablemente la avena. La presencia de este cereal en los alimentos "sin gluten" es controvertida. La avena se diferencia de otros cereales en su contenido en prolaminas, que representa entre un 10-20% del total proteico. Además, las prolaminas de los distintos cereales varían en tamaño molecular y en el contenido aminoacídico. En la avenina, la proporción de prolinas y glutaminas (aminoácidos abundantes en las regiones tóxicas), es menor que en los otros cereales. Algunos investigadores aseguran que los pacientes celíacos toleran la avena sin signos de inflamación intestinal; de hecho en muchos países está permitido el uso de avena en alimentos "sin gluten", por ejemplo Gluten Free Oats®. La reactividad observada con un anticuerpo específico de gliadina en este cereal ha sido atribuida a la contaminación con trigo de alimentos elaborados a base de avena (Hernando y coL, 2008, Eur J Gastroenterol Hepatol., 20:545-554). En contraste, existen investigaciones que confirman la tQ)(lcidad de la avena en determinados tipos de pacientes celíacos y la imposibilidaj de un consumo de avena de manera habitual. Arentz-Hansen y col. (2004, PloS Medic., 1 :84-92) describieron el deterioro intestinal sufrido por algunos pacientes tras el consumo de avena y una dieta libre de gluten. Estos pacientes pueden desencadenar una respuesta inmunológica frente a la avenina similar a la producida por el gluten del trigo, centeno o cebada. Un estudio dirigido por el Dr. Knut Lundin (Lundin y coL, 2003, Gut, 52:1649-1652) con un total de 19 celíacos adultos que estuvieron consumiendo 50 gramos de avena diarios durante doce semanas, demostró que uno de los pacientes celíacos del estudio resultó ser sensible a la avena. La biopsia intestinal mostró una atrofia parcial, que se recuperó considerablemente al dejar de consumir avena, pero de nuevo desarrolló una atrofia subtotal y dermatitis aguda al volver a consumir avena. Esto sugiere la necesidad de distinguir grupos de enfermos celíacos en función de su sensibilidad frente a los cereales e identificar el origen de la inmunogenicidad en los péptidos de las aveninas. Silano y col. (2007, J Gastroenterol Hepatol., 22:528-531; 2007, Scand J Gastroenterol., 42: 1302-1305) realizaron una serie de ensayos in vitro con distintas variedades de avena, aplicando diversas técnicas inmunológicas incluyendo la activación de linfocitos periféricos de pacientes celíacos, y comprobaron que todas las variedades objeto de estudio eran tóxicas para los enfermos celíacos pero existían diferencias en los niveles de toxicidad. Por lo tanto, es crítico aclarar cualitativamente y/o cuantitativamente el potencial inmunotóxico de la avena para los pacientes celíacos por las evidentes consecuencias clínicas.
Otros autores (Spaenij-Dekking y col., 2005, Gastroenterology, 129:797806) han sugerido que hay variaciones en la toxicidad de las distintas variedades de trigo, indicando la posible selección de variedades no tóxicas para enfermos celíacos mediante secuenciación de las prolaminas, reactividadde células T y el uso de algunos anticuerpos específicos de distintas subunidades de las gliadinas y gluteninas. En este trabajo no se propone un método fiable práctico que reproduzca en todos los casos los resultados obtenidos mediante reactividad con células T, necesitando incluso el uso de múltiples anticuerpos para tener datos concluyentes, lo cual lo hace poco práctico para aplicarlo en industria y complica las conclusiones que pueden obtenerse por el diferencial en potencial inmunotóxico de cada péptido detectado.
Por otro lado, otros autores están trabajando en la obtención de semillas de trigo con cantidades de gliadinas reducidas usando técnicas de supresión génica (Gil-Humanes y coL, 2010, Proc Natl Acad Sci USA, 107:17023-17028). Se necesitarán técnicas prácticas que permitan seleccionar e incluso cuantificar la potencial toxicidad de las semillas de las distintas líneas de cereales seleccionados.
Medir la potencial toxicidad para celíacos de variedades de semillas mediante ensayos con células T aisladas de pacientes celiacos, es una técnica inviable para realizarla de manera rutinaria en la industria ya que requiere trabajar con sangre periférica de un número determinado de pacientes celíacos, personal muy especializado, reactivos muy caros y la conservación óptima de estas células inmunológicas. Por otra parte, se necesita que los experimentos a realizar sean aprobados por el Comité Ético del Hospital donde se realiza la toma de muestra. Con estos antecedentes, lo ideal sería tener un ensayo inmunológico in vitro que refleje lo más posible la información que se puede obte'1er tras realizar los experimentos de reactividad con células T aisladas de individuos celíacos, y compararla con la reactividad de anticuerpos obtenidos frente a algún epítopo inmunotóxico predominante en el gluten presente en las semillas. Estos epítopos reconocidos tendrían que estar ausente en cereales seguros como el maíz o el arroz, y tener su análogo en los cereales inmunotóxicos (trigo, cebada, centeno), y presentar análogos menos reactivos en avenas, reflejando la potencial inmunotoxicidad de cada variedad. En trabajos previos, se obtuvieron dos anticuerpos monoclonales (moAbs), G12 y A1, frente al péptido 33-mer de la gliadina (Morón y coL, 2008, Am J Clin Nutr., 87:405-414). Los resultados obtenidos mostraron que la reactividad de cada moAb se correlacionaba con el potencial inmunotóxico de los cereales alimenticios a partir de los que se extrajeron las proteínas. Los ensayos inmunológicos realizados con estos anticuerpos demostraron que son los únicos descritos en el mercado capaces de reconocer con una alta especificidad el péptido 33-mer (Morón y coL, 2008, Am J Clin Nutr., 87:405-414; 2008, PloS One, 3:e2294; Cebolla y col., 2009. 13th International Coeliac Disease Symposium, Amsterdeam, The Netherlands). El péptido 33-mer se caracteriza porque contiene 6 epítopos de reconocimiento de las células T, uno de los péptidos más inmunogénicos presente en la gliadina y uno de los responsables de la reacción inmune que se desencadena en el intestino de los pacientes celíacos. Los ensayos inmunológicos realizados con el anticuerpo G 12 demostraron que es el único, junto con el moAb A 1, descrito en el mercado capaz de reconocer con una alta especificidad el péptido 33-mer (Morón y coL, 2008, Am J Clin Nutr., 87:405-414; 2008, PloS One, 3:e2294). Los estudios con células T indicaron que la activación de éstas por gluten digerido con glutenasas (enzimas que digieren péptidos del gluten) disminuyó de manera equivalente a la detección de péptidos tóxicos con los anticJerpos (Morón y col., 2008, PloS One, 3:e2294; Ehren y coL, 2009, PloS One, 4:e6313). Además, los sistemas inmunológicos descritos son capaces de detectar otros péptidos inmunogénicos que intervienen en la inmunidad innata y adaptativa de la enfermedad celíaca.
Los estudios con células T indicaron que la activación de éstas por gluten digerido con glutenasas (enzimas que digieren péptidos del gluten) disminuyó de manera equivalente a la detección de péptidos tóxicos con los anticuerpos (Morón y coL, 2008, PloS One, 3:e2294; Ehren y coL, 2009, PloS One, 4:e6313). Este ensayo permite evitar los falsos positivos y negativos que SE' obtienen cuando se utiliza un método de análisis que no tiene en cuenta la toxicidad real del gluten.
En estos trabajos previos, los anticuerpos anti-33-mer de gliadina, A 1 Y G12, mostraron reactividad frente a cantidades de avena relativamente más altas que la gliadina de trigo. La reactividad fue claramente por encima del control negativo aunque su detección era menos sensible (Morón y col., 2008, PloS One, 3:e2294).
La presente invención describe un método que se puede aplicar industrialmente para identificar semillas de avena y otros cereales que sean tolerables y seguras para el colectivo celíaco. Se basa en ensayos inmunológicos sencillos mediados por uno o varios anticuerpos monoclonales que detectan el péptido 33-mer y otros péptidos afines tóxicos para los enfermos celíacos. El método descrito es capaz de detectar epítopos que tienen similitud suficiente en la avena a los descritos previamente como más inmunotóxiccs en trigo, y que son detectables en algunas variedades de avena y en otras no. La intensidad de la señal obtenida con el anticuerpo anti-33-mer es proporcional al daño potencial causado en individuos celíacos, medido mediante proliferación celular y producción de interferón-gamma (INF-y) por células T de estos pacientes. El método descrito en la presente invención es específico y fiable para detectar variedades de avena potencialmente seguras para los pacientes celíacos.
Las semillas que no dieran reactividad con el anticuerpo anti-gliadina 33mer serían seguras para ser consumidas por el colectivo celíaco, se podrían cultivar y vender certificadas por su inocuidad en su consumo por el colectivo celíaco, ya que el único tratamiento efectivo hasta la fecha para esta enfermedad es una dieta libre de gluten. Estos métodos inmunológicos serían preferiblemente ELlSAs, pero también contemplan tiras inmunocromatogra-Ficas, micropartículas fluorescentes marcadas recubiertas por anticuerpos (por e)emplo, la tecnología Xmap de Luminex), Western blots, biosensores con detección por anticuerpos. Dichos métodos están constituidos por uno o varios anticuerpos monoclonales con capacidad para identificar y cuantificar los epítopos más inmunogénicos del gluten. El anticuerpo preferente para su uso en la selecciór de semillas sería el anticuerpo anti-gliadina G12, que presenta el epítopo de reconocimiento SEO ID N° 2 dentro del 33-mer, descrito por Morón y col. (2008, PloS One, 3:e2294). Así mismo podría servir el anticuerpo monoclonal A1 (epítopo de reconocimiento SEO ID N° 3 dentro del 33-mer), descrito por los mismos autores, obtenido también por inmunización con el 33-mer, e incluso el R5, que aunque de 100 a 60.000 veces menos sensible para detectar el 33-mer que A1 y G12, detecta otros péptidos similares al 33-mer.
Una forma preferente de la invención sería realizar un ensayo inmunológico tipo ELlSA competitivo caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es el moAb G12 y estaría conjugado a un enzima típicamente usada en estos métodos como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa. Se podría usar en el ensayo un patrón de gliadina, gliadina hidrolizada o péptido 33-mer.
La validez del concepto se manifestaría por la relación de proporcionalidad entre la señal obtenida mediante la reactividad con el anticuerpo monoclonal antigliadin 33-mer, preferiblemente G12, y el daño potencial causado por las proteínas tóxicas en los individuos celiacos medido mediante proliferación celular y producción de INF-y por células T de pacientes con EC.
Otro objeto de la invención lo constituye la aplicación de un ELlSA competitivo, un ELlSA Sandwich o un Western blot con el anticuerpo G12 caracterizados por su capacidad para detectar prolaminas de trigo, cebada, centeno y, según su potencial inmunogénico, prolaminas de avena.
Este procedimiento se caracteriza por su capacidad para identificar y cuantificar los péptidos más inmunogénicos del gluten en distintas variedades de un cereal. Así como también para la selección de cereales empleados en la elaboración de ingredientes que formen parte de excipientes de fármacos, y de otras aplicaciones industriales en productos que van a ser ingeridos por el colectivo celíaco.
Mediante los estudios de reactividad con anticuerpos anti-33-mer frente a las diferentes variedades y su correlación en los ensayos bio,ógicos con células T, quedaría demostrado que existe una gran variabilidad en el potencial inmunotóxico de los diferentes cultivares de avena.
Dado que las células T o ensayos biológicos similares no son utilizados normalmente como técnicas rutinarias para evaluar el riesgo de los alimentos en controles de seguridad alimentaria, técnicas inmunoqu micas basadas en anticuerpos que reflejen dicha toxicidad de forma reproducible, son métodos convenientes para evaluar la inmunotoxicidad potencial que U'1 determinado cereal pueda tener para el colectivo celiaco.
Con esta invención se dispone de un camino racional 'lacia la selección de
variedades de cereales, y en particular de la avena, que podrían ser seguras para una dieta exenta de gluten, lo que permitiría la incorporación de este cereal en la dieta diaria de los enfermos celíacos aportándole un 9ran beneficio a este colectivo, ya que en los últimos años el interés sobre la avena para consumo 5 humano ha aumentado debido al reconocimiento de su valor nutricional y sus beneficios para la salud. Los granos de avena contienen altas cantidades de nutrientes como fibras solubles, proteínas, ácidos grasos !nsaturados, vitaminas, minerales y fitoquímicos. La incorporación de algunas variedades de avena y otros cereales que se determinasen seguros por este método, podrían ser introducidos lOen la dieta sin gluten de los celíacos lo que permitiría mejorar la calidad de la nutrición del colectivo celíaco y utilizarlos en las dietas de determinadas enfermedades. Es también objeto de la presente invencióf\, la selección de otros cereales por el mismo método inmunológico, que puedan tener alta variabilidad en el contenido de péptidos inmunotóxicos, como semillas de trigo y otros cereales
15 manipulados genéticamente con el fin de suprimir los peptidos inmunotóxicos. Dicha selección previa de semillas podría ser posteriormente verificada por ensayos inmunológicos en células de enfermos celíacos.
20 Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, con carácter ilustrativo y no limitativo, las figuras siguientes:
25 Figura 1. Evaluación de la presencia de ADN amplificable en variedades de avena, así como en trigo y arroz mediante PCI~. Gel de agarosa de los productos de amplificación por PCR de dos muestras representativas de avena, trigo y arroz. M: marcador de peso molecular de ADN (200 pb). Control positivo: ADN de los cereales amplificado con los primers 18S. Los primers
30 usados fueron: a. 18S, b. w-avenina (avena), c. w-hordeína (cebada), d. wsecalina (centeno) y e. w-gliadina (trigo). Figura 2. Comparación de las fracciones de clveninas extraídas a partir de distintas variedades de avena. Espectros de las aveninas de 9
variedades diferentes obtenidos mediante MALDI-TOF MS. Análisis del extracto proteico de las diferentes variedades mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. M: Marcador de peso molecular proteico.
Figura 3. Afinidad relativa del anticuerpo monoclonal G12 frente a distintas variedades de avena. A. ELlSA competitivo utilizando el anticuerpo G12HRP para determinar la reactividad de este anticuerpo frente a distintas variedades de avena. Se realizaron tres ensayos con tres replicas cada uno. Como control positivo se utilizó gliadina. B. IC50 y RC de las distintas variedades de avena. N.A.: No aplicable. C. Western blot de las fracciones tóxicas de las prolaminas extraídas de los granos de avena. La membrana fue revelada con el anticuerpo G12. El código de colores utilizado fue el mismo que en A y B. M: Marcador de peso molecular proteico.
Figura 4. Detección de la concentración del péptido 33-mer en diferentes variedades de avena. La concentración de 33-mer se determinó mediante ELlSA competitivo utilizando el anticuerpo G12-HRP. Se realizaron tres ensayos con tres replicas cada uno. Porcentaje de 33 -mer de la variedad ensayada respecto a la variedad más reactiva, OM719. * Concentración de 33-mer inferior al límite de cuantificación del ensayo (5,4 ng/mL). N.,A..: No aplicable.
Figura 5. Respuesta proliferativa de las células T de pacientes celíacos frente a péptidos desaminados de las prolaminas de tres variedades de avena. Las PBMCs fueron expuestas durante 48 h a prolaminas digeridas y tratadas con transglutaminasa tisular. Los valores se expresan como unidades de
0.0. a 450 nm. Gliadina y orzenina se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. Se representa la media ± SEM de dos ensayos en dos días distintos. *Diferencias estadísticamente significativas con respecto a la orzenina (p<0,05).
Figura 6. Producción de INF-y por las células T de pacientes EC expuestas a prolaminas digeridas y desaminadas de tres variedades de avena. La producción de INF-y fue evaluada mediante ELlSA tras 48 !-Joras de incubación. Gliadina y orzenina se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. Se representa la media ± SEM de dos E~nsayos en dos días distintos. *Diferencias estadísticamente significativas con respecto a la orzenina (p<0,05).
REALIZACiÓN PREFERENTE DE LA INVENCiÓN
En el presente ejemplo, se muestra la importancia de verificar la pureza de las semillas de avena que se van a analizar antes de oHterminar su potencial inmunotóxico, ya que cualquier contaminación de otros cereales (cebada, trigo etc) darían falsos positivos. Trabajos previos han propuesto que la toxicidad de los alimentos elaborados a base de avena es debida a la contaminación de los mismos con otros cereales tóxicos para los enfermos celiacos (trigo, cebada y centeno). Un ejemplo de ello, es el trabajo publicado por f-Jernando y col. (2008, Eur J Gastroenterol Hepatol., 20:545-554) en el que se establece que la reactividad del anticuerpo R5 frente a determinados alimentos elaborados con avena se debe a la contaminación de este cereal con tn90, cebada o centeno (Pulido y col., 2009, Adv Food Nutr Res., 57:235-285). Para este estudio la pureza de las muestras de las distintas variedades de avena fue controlada de dos formas, la primera de ellas realizando un examen visual de forma individualizada de los granos de avena para evitar la presencia de granos de otros cereales. La segunda forma de control fue utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ya que es un método altamente específico y sensible para la detección de pequeñas cantidades de ácido nucleico. En los estudios de calidad alimentaria, la PCR ha sido aplicada en la detección de organismos modificados genéticamente, hongos patógenos, microorganismos y virus, así como para la identificación de especies animales en productos cárnicos o para la detecció'1 y discriminación de la contaminación de alimentos exentos de gluten con cerE~ales. En general, la presencia de proteínas de cereales está relacionada con la presencia de ADN, en este estudio se ha usado la tecnología de la PCR para léI detección de ácido nucleico de diversos cereales (trigo, centeno y cebada) en las muestras de avena.
Para detectar la contaminación de cereales (trigo, cl3nteno y cebada) en las diferentes variedades de avena, se eligieron para la amplificación determinadas secuencias diana específicas de fragmentos codificantes de gliadina (trigo), secalina (centeno), hordeína (cebada) y avenina (avena). La secuencia nucleotídica de estos genes de proteínas de almacenamiento de cereales está bien caracterizada y secuenciada, mostrando un elevado grado de homología entre las secuencias de los genes de las prolaminas del trigo, de la cebada y del centeno. Sin embargo, fue posible diseñar parejas de primers que podían discriminar entre los distintos cereales. Los primers utilizados para la amplificación de los genes w-gliadina, w-secalina, w-hordeína y w-avenina, fueron diseñados con el software PRIMER3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3 www.cgi). Los primers específicos forward y reverse
- respectivamente,
- fueron: 5' TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3' y 5'
- AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3'
- para el gen 18S ribosómico, 5'
- CAGAAAGCGAGTGGAAAGATGAAAG-3'
- y 5'
- GCAAGGAGGACAAAGA TGAGGGAA-3'
- para el gen w-gliadina (longitud del
fragmento amplificado de 181 pb), 5'-TTTTTCAGAAAGCGAGTTCAATGATG-3' y 5'-CGAGGACAAAGATGAGGAAGGTCT-3' para el gen w-secalina (longitud del fragmento amplificado de 181 pb), 5'-ATTAATTCCCAAACTGAACGACTA-3' y 5'CATGGCGAACAA TGTGAAC-3' para el gen w-hordeína (fragmento amplificado de 164 pb), 5'-CGCTCAGTGGCTTCTAAGA-3' y 5'TTTTATTTTATTTGTCACCGCTAC-3' para el gen w-avenina (fragmento amplificado de 104 pb). Los oligonucleótidos utilizados fueron proporcionados por Biomedal S.L. (Sevilla, España).
Usamos el sistema de PCR para la amplificación de los genes de las prolaminas de trigo, cebada, centeno y avena. Para ello, se utilizaron semillas de avena (Avena sativa) de distintas variedades: OM719, OE717, OL715, OA729, OH727, OC723, OF720, OR721 y OP722, suministradas por diferentes fuentes comerciales españolas y australianas. Se usaron semillas de trigo (Triticum durum, variedad Don Pedro, C.S.I.C., Córdoba, España) y arroz (Oryza sativa subespecie Japónica, variedad J. Sendra, Federación dE~ Arroceros, Sevilla, España) como control positivo y negativo, respectivamente.
Los granos de los distintos cereales fueron triturados en un molinillo eléctrico para obtener muestras homogéneas. La extracción del ácido nucleico se realizó usando el método del CTAB modificado. Cada muestr-a fue congelada con nitrógeno líquido y transferida a un tubo de 2 mL que contenía 1 mL de tampón de extracción [Tris-HCI 100 mM (pH 8,0), NaCI 1,4 M, EDTA 20 mM (pH 8,0), CTAB 2% (w/v) y 2-mercapto-etanol (14,3 N)]. Posteriormente, 'as muestras fueron incubadas a 65°C durante 30 minutos agitándolas cada cierto tiempo. Tras la incubación, se añadió 500 ¡..tL de cloroformo y las muestras se centrifugaron a 16000 g durante 15 minutos. El sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo de 2 mL, al que se añadió 0,8 volúmenes de isopropanol para la precipitación del ADN. Los lavados fueron realizados con etanol al 70% (v/v). Finalmente, el ADN fue eluido en 60 mL de tampón Tris-HCI 10 mmol/L (pH 8,0) que contenía 20 /-tLlmL de RNasa (solución RNasa A, Promega). Las concentraciones de ADN fueron determinadas por absorción de UV a 260 nm y la pureza de la solución de ADN fue evaluada por la proporción de absorción 260/280 nm.
La premezcla de PCR (Laboratorios Biotools B&M, Madrid, España) fue utilizada con 1 pmol de cada primer y 50 ng del DNA molde. La reacción de amplificación fue realizada bajo las siguientes condiciones: dclo 1, 95°C durante 3 min; ciclo 2, 95°C durante 30 s, 52°C durante 30 s y 72°C durante 30 s (repitiendo las mismas condiciones durante 35 ciclos); ciclo 3, 72°C durante 5 mino Los productos de PCR fueron analizados en un gel de electroforesis al 2% (w/v) de agarosa MS (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).
De esta forma se determinó que la longitud del fragmento amplificado varió en los distintos cereales, desde 104 bp para la avena, 164 bp para la cebada hasta 181 bp para el trigo y el centeno. En estos experimentos, se obtuvieron resultados negativos en las muestras de avena para PCR específica de trigo, centeno y cebada; sin embargo, se obtuvieron resultados positivos al amplificar las muestras de avena con los primers específico 18S. La amplificación de trigo mostró resultados positivos en la PCR específica para el 18S y la gliadina. El análisis en gel de agarosa de los productos de ADN amplificados mediante PCR confirmó que todas las muestras de avena estaban exentas de contaminación con trigo, cebada, centeno o mezcla de estos cereales (Figura 1)
Ejemplo 2: Análisis de la variabilidad de las aveninas de los cultivares de avena
En el presente ejemplo de aplicación se muestra como hay una gran variabilidad de las aveninas de distintos cultivares de avena, lo que en principio también es indicativo de una potencial diversidad en la inmunotoxicidad potencial. La tecnología MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry) se utiliza actualmente para la identificación de un gran número de subunidades de gliadinas y gluteninas en el trigo y otros cereales (Qian y col., 2008, J Am Mass Spectrom., 19:1542-1550). En este estudio hemos usado dicha técnica junto con SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) para analizar el contenido en prolaminas de la avena y encontrar rasgos moleculares que permitan identificar y caracterizar las distintas variedades. Para ello, las muestras de harinas (6 g) de las distintas variedades de avena se obtuvieron mediante trituración de las semillas, se resuspendieron en etanol al 70% (v/v) (30 mL) y se mantuvieron durante 24 horas en agitación. Posteriormente, la mezcla fue filtrada y las prolaminas fueron precipitadas mediante adicción de etanol absoluto hasta conseguir una ,:oncentración final del 93%. Las prolaminas fueron obtenidas tras incubación de las muestras a 4°C durante 16h. Trascurrido este tiempo se centrifugó a 8.000 g durante 10 minutos y se recogió el precipitado que contenía las proteínas objeto de estudio. La concentración proteica fue medida por el método de Bradford (Bradford, 1976, Anal Biochem., 72:248-254).
Para el análisis mediante MALOI-TOF MS a las extracciones de las aveninas (5 ¡.tL) se les añadió 2 uL de detergente octyl-J3-0-glucopiranosido, y como solución matriz se usó 25 ¡.tL de ácido sinapínico saturado en acetonitrilo al 30% (v/v) que contenía ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v). La mezcla matrizmuestra fue secada durante 15 min en una centrífuga speed-vac y posteriormente resuspendida en 6 ¡.tL de etanol al 60% con ácido trifluoroacético al 0,1%. 2 ¡.tL de la mezcla fueron depositados en una sonda de acero inoxidable y secados durante 5 min a temperatura ambiente. Las muestras se midieron en el sistema PE Biosystems MALOI-TOF Voyager DE-PRO con una configuración estándar. El espectro de masas fue registrado en un modo linear positivo con un voltaje de aceleración de 25 kV Y el espectro final se obtuvo por acumulación de 200 espectros de disparo de laser único bajo irradiación umbral El equipo se calibró externamente usando señales de carga simple y doble de BSA con masas moleculares de 66.430 y 33.215 Da respectivamente. La identificación de aveninas por MALOI-TOF MS mostró perfiles de masas protonadas característicos (Camafeita y col., 1977, J Mass Spectrom., 32:444-449).
Para el análisis mediante SOS-PAGE, las prolaminas anteriormente extraídas fueron diluidas en tampón de electroforesis (62.5 rnM Tris-HCI a pH 6,8; 10% glicerol; 2% SOS; 0,001 % azul de bromofenol y 5% 2-mercapto-etanol) y desnaturalizadas mediante ebullición a 100°C durante 5 min Este paso se repitió un total de tres veces. Las muestras se corrieron en gele~~ de poliacrilamida al 12,5% a un voltaje constante de 100 V utilizando el sistema MiniProtein (BioRad Laboratories). Las proteínas separadas en el gel de electroforesis, fueron teñidas usando tinción de plata.
El espectro obtenido por MALOI-TOF MS de las fracciones de aveninas de las diferentes variedades de avena, así como la distribución electroforética de las prolaminas observadas mediante SOS-PAGE, revelaren que las distintas variedades presentaban perfiles proteicos diferentes, lo que podría permitir una identificación más exhaustiva (Figura 2). Tanto en el espectro obtenido mediante MALOI-TOF como en el SOS-PAGE, en todos los casos, la distribución de pesos moleculares se localizó entre 19 y 31 kOa, lo que concuerda con lo descrito hasta la fecha por otros autores (Chesnut y col., 1989, The Plant Cell, 1 :913-924; Hernando y coL, 2008, Eur J Gastroenterol Hepatol., 20:545-554). El número y la intensidad relativa de los picos obtenidos por MALOI-TOF I~n los 9 cultivares fue muy variable, lo que indica que existen diferencias entre las aveninas extraídas de los distintos cultivares. La variabilidad en cuanto al tamaño y distribución proteica también fue evidente en los geles SOS, las bandas obtenidas difieren tanto en la movilidad electroforética como en intensidad. Estos resultados indican la presencia de distintas subunidades de prolaminas en las 9 variedades de avena que difieren tanto en su composición aminoacídica como en su tamaño.
En el presente ejemplo se muestra cómo un anticu,erpo que reconoce el péptido 33-mer de gliadina, puede tener una gran variabilidad de reactividad con las distintas variedades de avena. En el ejemplo se muestra como el moAb G12 que era capaz de detectar epítopos relacionados con el péptido 33-mer en prolaminas de varios cereales, reacciona de forma distinta con distintas variedades de avena siendo su reactividad nula en algunas de dichas variedades. Los resultados indican que el moAb anti-33-mer muestra reactividad frente a prolaminas de trigo, cebada y centeno, cereales tóxicos para los pacientes celíacos. Este anticuerpo también fue capaz de detectar ave"inas presentes en la avena, aunque la sensibilidad obtenida en este caso fue menor, lo que puede ser debido en parte, a la menor proporción de estas prolaminas con respecto al contenido proteico total de este cereal en relación a la proporción de gliadinas, hordeínas o secalinas en sus respectivos granos, y prinCipalmente a la menor afinidad de este anticuerpo frente a epítopos de las aveninas. El anticuerpo G 12 no reaccionó con las prolaminas extraídas de arroz (orzenina) y maíz (zeína), cereales no tóxicos para pacientes celíacos. La reducción de la sensibilidad del anticuerpo G12 hacia las prolaminas de la avena podría ser debido a una menor prevalencia de los epítopos de reconocimiento de este anticuerpo en las aveninas, con respecto a las gliadinas, hordeínas y secalinas.
Para determinar si el moAb G 12 presentaba distinta reactividad frente a diferentes variedades de avenas, la afinidad del anticuerpo fue determinada mediante ELlSA competitivo. Para este ensayo se usó placas Maxisorp microtiter (Nunc, Roskilde, Dinamarca) que fueron recubiertas con 100 ¡.tLlpocillo de solución de gliadina Sigma (5 ¡.tg/mL) en 0,1 M de PBS (Na<C03-NaHC03, pH 9,6), e incubadas a 4°C toda la noche. Las placas fueron lavadas con PBS 0,05% Tween® 20 y bloquedas con solución de bloqueo (PBS, 5% leche desnatada) durante 1 h a temperatura ambiente. Se hicieron diluciones seriadas de la gliadina y de las muestras de estudio en PBS con BSA 3% (100 ¡.tL) Y a cada una de ellas se añadió 100 ¡.tL de solución de moAb G12 conjugado con HRP (peroxidasa)
(1:10.000 en PBS con BSA 3%). Se preincubaron las muestras 1 h a temperatura ambiente con agitación suave, y posteriormente se añadieron en los pocillos. Tras 30 minutos de incubación, se lavaron las muestras, y se les añadió 100 ¡.tLlpocillo de solución de sustrato (TMB, Sigma, St Louis, Missouri, EE UU.). Trascurridos 30 minutos de incubación a temperatura ambiente en oscuridad, se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 1 M (100 ¡.tLlpocillo) , y la absorbancia se midió a 450 nm (Lector de microplacas UVM340, Asys Hitech GMBH, ELJ~Jendorf, Austria).
Los resultados obtenidos mostraron que las distintas variedades de avena presentaban diferente reactividad hacia al anticuerpo G12 (Figura 3A). En función de la afinidad del anticuerpo frente a las distintas varie'dades de avena se pudieron distinguir claramente tres grupos: un grupo con elevada afinidad hacia el anticuerpo (variedades OM719, OA729 Y OE717), un grupo de reconocimiento intermedio (variedades OH727, OL715 Y OC723) y otro que no fue reconocido por el moAb G12 (variedades OF720, OR721 y OP722). Resultados similares a los descritos fueron obtenidos con el anticuerpo A 1 (Morón y col., 2008, PloS One, 3:e2294).
Con el fin de cuantificar la afinidad del anticuerpo (312 por las diferentes variedades de avena, se determinó la concentración de antígeno con la que se obtenía una reducción del 50% de la señal máxima (IC50) y la reactividad cruzada (RC) de cada una de ellas (Figura 3B). La RC se determina como (IC50 de la variedad de avena que presenta la mayor afinidad por el antlcuerpo/IC50 de cada variedad ensayada) x 100. Las variedades OE717 y OA729 mostraron una RC entorno al 60 y 75% respectivamente, en relación a la variedad más sensible (OM719). Así mismo, OH727, OL715 Y OC723 con una RC de 25, 24 Y 12 % respectivamente, son reconocidas por el anticuerpo G12 pero con una menor sensibilidad. Al igual que el control negativo (arroz), las aveninas de las variedades OF720, OR721 y OP722 no fueron reconocidas por el anticuerpo. Los resultados obtenidos parecen indicar que las variedades OF720, OR721 y OP722 de avena podrían ser potencialmente seguras para ser LJ":ilizadas en una dieta exenta de gluten en los pacientes celíacos.
Con el objetivo de confirmar los resultados obtenidos en el ELlSA competitivo mediante otra técnica inmunológica e identificar el perfil proteico reactivo para el anticuerpo anti-33-mer, se llevó a cabo un análisis mediante immunoblotting usando el moAb G12. Los extractos proteicos obtenidos inicialmente fueron separados mediante gel SDS-PAGE y seguidamente incubados con el anticuerpo G12 en membranas de PVDF. Posteriormente, se incubaron en tampón de bloqueo (T8S con leche desnatada al 5%) durante toda la noche, tras lo cual se añadió el anticuerpo G12 (dilución '1:5000 en solución de bloqueo). Después de 3 lavados, las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario anti-mouse IgG conjugado a fosfatasa (Sigma, Sr. Louis, MO) (dilución 1 :2000 en solución de bloqueo). La membrana se reveló utilizando el sistema Sigma-Fast. Los resultados obtenidos mediante Western blot (Figura 3C) muestran que el moAb G12 presenta afinidad por las variedades OM719, OA729, OE717, OH727, OL715 Y OC723. Sin embargo, dicho anticuerpo no reaccionó con OF720, OP722 y OR721. De esta forma, la variabilidad en la reactividad observada en el Western blot confirma los resultados previamente obtenidos en el ELlSA competitivo, así mismo, se observó que los perfiles proteicos obtenidos en las variedades reactivas difieren unas de otras. Las variedades OM719 y OE717, presentaron fracciones proteicas reactivas similares, sin embargo, OA729, OC723, OH727 y OL715 presentaron perfiles proteicos cuyas bandas se diferenciaban en peso molecular e intensidad. Estos resultados sugieren la presencia de distintas subunidades de prolaminas en las variedades de avena, que difieren entre sí en cuanto a composición en aminoácidos y tamaño. Así mismo, las diferencias en la reactividad con el anticuerpo monoclonal G12 parecen indicar variaciones en la secuencia proteica de los epítopos de reconocimiento del anticuerpo presentes en las aveninas de las distintas variedades de avenas.
En el presente ejemplo se muestra cómo se puede determinar la concentración equivalente de péptido 33-mer en semillas usando un anticuerpo anti-33-mer de gliadina con un péptido con dicha secuencia como referencia. El péptido 33-mer ha sido definido como uno de los principales contribuyentes de la inmunotoxicidad del gluten (Shan y coL, 2002, Science, 297:2275-2279). Este péptido de la 0-2 gliadina contiene 6 epítopos de reconocimiento para las células T Y es muy resistente a la proteólisis. El anticuerpo monoclonal G12 es específico para el epítopo de 6 aminoácidos SEQ ID N° 2, que aparece 3 veces a lo largo de la secuencia peptídica del 33-mer. Este anticuerpo monoclonal es capaz de reconocer otros péptidos inmunoreactivos presentes en la gliadina y en otras prolaminas tóxicas (Morón y coL, 2008, PloS One, 3:e2294; Ehren y coL, 2009, PloSOne,4:e6313).
Con el fin de determinar la cantidad relativa de epítopos inmunotóxicos presentes en las prolaminas de las diferentes variedades de avena, elegimos de cada grupo identificado anteriormente una variedad. Para. el grupo de mayor afinidad por el anticuerpo elegimos OM719, para el de reactividad intermedia, escogimos la variedad OH727, y OF720 del grupo de variedades que el anticuerpo G12 no reconoció. La presencia de péptidos inmunoreactivos fue determinada por ELlSA competitivo G12, utilizando como patrón el péptido 33mero El ensayo se llevo a cabo usando el mismo protocolO de ELlSA descrito anteriormente, pero en este caso se utilizó el péptido 33-mer como curva estándar para medir la concentración de epítopos tóxicos presentes en las muestras de estudio. La concentración de 33-mer en cada una de las muestras se determinó mediante el cálculo de la ecuación que definió la recta patrón y posterior extrapolación a partir de los datos de absorbancia obtenidos en cada muestra.
La presencia equivalente de 33-mer en la variedad más reactiva, OM719, fue del orden de 1,340 ng por mg de avenina (Figura 4). En la variedad OH727, los niveles de 33-mer se vieron disminuidos del orden de 4 veces con respecto a los de OM719. Sin embargo, en el caso de OF720, la concentración de péptido 33-mer se redujo más de 1300 veces en relación a OM71 B, llegando a niveles indetectables por nuestro método. Estos resultados confirman los datos obtenidos previamente mediante IC50 y reactividad cruzada, así corro por Western blot.
Igualmente, estos resultados indican la gran diferencia que existe entre unas variedades y otras en cuanto a la presencia de secuencias inmunotóxicas para el paciente celíaco, y la posibilidad de encontrar semillas de avena sin cantidades equivalentes de 33mer detectables.
Ejemplo 5: Correlación entre la reactividad del anticuerpo G12 y la inmunogenicidad de las diferentes variedades de avena
En el presente ejemplo se muestra como las variaciones de la reactividad del anticuerpo anti-33-mer observadas para las diferentes variedades de avena se correlacionan con la mayor o menor inmunogenicidad del cereal. La inmunogenicidad fue determinada mediante ensayos de proliferación de células T y producción de INF-y. La capacidad de las aveninas de inducir una respuesta inmune fue analizada usando linfocitos periféricos de individuos celíacos, utilizando como control positivo gliadina de trigo y como negativo prolaminas de arroz. Para realizar este ejemplo se seleccionó tres cultivares de avena, uno de cada grupo identificado previamente, así la variedad OM719 representaba al grupo que mostró mayor afinidad hacia el anticuerpo G12, OH727 al de reactividad intermedia, y OF720 al grupo que no fue reconocido con el anticuerpo. Se evaluó si existía una correlación entre el potencial inmunotóxico de las distintas variedades de avena y su reactividad frente al anticuerpo G12. Para ello se llevaron a cabo los siguientes procedimientos:
5.1. Digestión con pepsina, tripsina y quimotripsina La fracción proteica soluble en etanol fue extraída de la harina y sometida a digl3stión secuencial con pepsina, tripsina y quimotripsina (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Se simuló la digestión gastrointestinal de manera que se incubaron las muestras de prolaminas con 0,6 mg/mL de pepsina en HCI 0,2 M durante 1 h a 37°C con agitación suave. Trascurrido dicho tiempo, se modificó el pH de las muestras con Na2HP04 hasta alcanzar un pH entorno a 6-7, tras lo cual se añadieron las enzimas tripsina y quimotripsina con una concentración de 0,375 mg/mL. Las muestras se incubaron nuevamente durante 30 minutos a 37°C con agitación suave. Para la inactivación de las enzimas, las muestras sufrieron tratamiento térmico (100°C durante al menos 5 min). Las prolaminas digeridas fueron liofilizadas y almacenadas a -20°C hasta su posterior uso.
5.2. Desaminación de las muestras con transglutaminasa tisular: la desaminación específica de los péptidos de las prolaminas por la transglutaminasa tisular, es habitualmente necesario para la unión a las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (002/008) de las células presentadoras de antígeno y el posterior reconocimiento por las células T. Por ello, los péptidos de las aveninas de las diferentes variedades de avena, así como los controles de gliadina y orzenina, fueron tratados, durante 4 h a 37°C, con 100 g/mL de transglutaminasa tisular (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) en presencia de CaCI22 mM.
5.3. Pacientes: Este estudio se realizó tras la aprobación del Comité Ético del "Hospital Virgen de las Nieves". Las biopsias de intestino delgado fueron obtenidas por endoscopía gastrointestinal bajo consentimiento de los pacientes para utilizarlas en investigaciones sobre la enfermedad celíaca (los pacientes fueron monitorizados en el "Hospital Virgen de las Nieves" de Granada, España). Los pacientes con enfermedad celíaca presentaban atrofia parcial o total de las vellosidades con aumento en los linfocitos intraepiteliales. Los casos de histología positiva se clasificaron de acuerdo al criterio Marsh (tipos ¡-IV) (Marsh y Crowe, 1995, Baillieres Clin Gastroenterol., 9:273-293). El diagnóstico de los pacientes con enfermedad celíaca se realizó mediante test serológico acompañado de biopsia intestinal y confirmación de una respuesta clínica a la supresión del gluten de la dieta. Se analizaron anticuerpos antiendomisio, anticuerpos anti-gliadina, anticuerpos anti-transglutaminasa tisular y tipaje HLA específico de enfermedad celíaca (HLA-OO).
5.4. PBMCs Y cultivos celulares: Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de los pacientes con enfermedad celíaca activa que mantenían una dieta con gluten, fueron aisladas de 6 mL de sangre heparinizada mediante centrifugación en gradiente con HISTOPAOUE (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) y, posteriormente cultivadas hasta obtener una densidad de 1x106 células/mL en medio de cultivo RPMI-1640. Tras 48 h, las PBMCs fueron incubadas con los péptidos obtenidos de avenina, gliadina y orzenína (50 ug/mL).
5.5. Análisis de proliferación celular: La proliferación de células T se analizó tras 48 h de incubación utilizando el test ELlSA 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) de proliferación celular (Roche, USA). Los resultados se expresaron como densidad óptica (0.0.) a 450 nm. La proliferación celular se cleterminó mediante la incorporación de BrdU. Este ensayo colorimétrico consiste en la medida inmunoquímica de la incorporación de BrdU, un análogo de la timidina, a una cadena de AON en elongación durante la síntesis activa de este ácido nucleico.
5.6. Producción de INF-y: Para la determinación de la producción de INF-y se tomaron, tras 48 h de incubación, alícuotas del sobrenadante de los cultivos de células T y se almacenaron a -80°C. Para el análisis se utilizó un kit ELlSA comercial siguiendo las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific, España). La sensibilidad del ensayo fue menor a 2 pg/mL.
5.7. Análisis estadístico de los ensayos de proliferación celular y producción de INF-y: cada experimento se realizó por duplicado en días diferentes. Los datos se expresaron como la media ~ el error estándar de la media (SEM). Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa STATGRAPHICS de Windows. Cuando la interacción fue significativa, las diferencias entre los grupos fueron evaluadas mediante test ANOVA. Para comparar las medias individuales se utilizó el test Bonferronl corregido con la t de Student. Una probabilidad estadística de p<0,05 fue considerada significativa. La proliferación de PBMC expuestas a las diferentes aveninas, y a los controles positivos y negativos, gliadina y prolaminas de arroz, respectivamente fue expresada en 0.0. (Figura 5). De esta manera, tras 48 horas de exposición con los distintos fragmentos de aveninas, encontramos aumentos significativos en la proliferación de células T en los cultivos incubados con la variedad OM719 y con gliadina (0.0.=0,35 y 0,47 respectivamente), y también con OH727 (0.0.=0,24). De esta manera, se observa claramente que la gliadina y OM719 muestran una reactividad más elevada, siendo las de mayor potencial inmunogénico (Figura 5). La incubación con la variedad OF720 mostró un aumento de la proliferación celular (0.0=0,12) similar a la del control negativo (pépt,dos de la orzenina) (0.0.=0,11). El INF-y es la principal citoquina involucrada en la respuesta inflamatoria de la enfermedad celíaca. Por ello se analizó la secreción de INF-y en el medio de cultivo tras la exposición de los linfocitos T periféricos a los péptidos de avenina desaminados (Figura 6). Según este análisis, la gliadina y la variedad OM719, fueron muy inmunogénicas presentando los valores de secreción de INF-y más elevados (0,11 IU/mL y 0,09 IU/mL, respectivamente), mientras que la exposición a OH727 indujo una menor secreción de INF-y (0,07 IU/mL) Por último, OF720 y el arroz, fueron los menos inmunogénicos (0,024 IU/rilL y 0,015 IU/mL, respectivamente) .
Ejemplo 6. Detección del potencial inmunotóxico con cereales con otros anticuerpos con reacción cruzada frente al 33-mer.
El presente ejemplo demuestra como otros anticuerpos que no han sido creados directamente por inmunización frente al 33-mer pero que lo reconocen, aunque con menor especificidad pueden ser usados para 13valuar si las semillas de avena pueden ser inmunogénicas para enfermos celíacos. Aunque trabajos previos establecen que la reactividad del anticuerpo R5 frente a determinados alimentos elaborados con avena se debe a la contaminación con trigo, cebada o centeno, y no a un reconocimiento directo de epítopos de Bste anticuerpo en las prolaminas de la avena (Pulido y col., 2009, Adv Food Nutr Res., 57:235-285), experimentos realizados para la presente invención demuestran la reactividad del anticuerpo R5 con semillas de avena de pureza controlada molecularmente. Siguiendo las instrucciones del proveedor se determinó la capacidad del moAb R5, anticuerpo específico para la secuencia QQPFP, para detectar las variedades de avena previamente ensayadas. Igualmente, la pureza de las muestras fue controlada mediante PCR con el fin de evitar falsos positivos Los valores de péptido QQPFP obtenidos en las variedades OM719, OA729, OE717 Y OH727 oscilaron entre 25,18 Y 97,86 mg de péptido/g cereal, lo que correspondería según las instrucciones del proveedor a valores de gliadina de entre 100 y 400 ppm. En las variedades OL715 y OC723 los niveles de péptido estuvieron entre 1,5 Y 9,2 mg de péptido/g cereal respectivamente (6,3-37,2 ppm de gliadina, respectivamente). Por lo tanto los resultados obtenidos demuestran que al igual que el moAb G12 y A 1, el anticuerpo R5 fue capaz de detectar las variedades descritas. Sin embargo, en las variedades OF72Cl, OR721 Y OP722 no se detectó gliadina. Estos resultados son equivalentes a los ya obtenidos mediante ELlSA competitivo G12. La detección de péptidos similares a QQPFP en 6 variedades de avena de las 9 ensayadas, demuestra que la señal obtenida por el anticuerpo R5 en muestras de avena es debido al reconocimiento de epítopos potencialmente tóxicos en las prolaminas de este cereal y r'o a contaminaciones cruzadas con otros cereales.
Ejemplo 7. Detección del nivel de péptidos equivalentes a 33-mer en semillas de trigo manipuladas genéticamente. El presente ejemplo muestra como en semillas de cereales manipuladas genéticamente para suprimir los niveles de las gliadinas tóxicas, el nivel de
reactividad con el anticuerpo anti-33-mer disminuye en una medida proporcional a la inmunogenicidad. Las líneas transgénicas publicadas por Gil-Humanes y col. (2010, Proc Natl Acad Sci USA, 107: 17023-17028) fueron analizadas con el anticuerpo monoclonal G12 determinándose la concentración de péptido tóxico presente en cada una de estas líneas con respecto al contro . Las líneas transgénicas 28A, 288, 0783, X387, 0770, 0793, 0894 Y X077, transformadas con el vector pOhp-w/a; E35, transformada con el vector pOhpw/a+pghpg8.1; A 1152 Y C655 transformadas con el vector pghpg8.1 fueron analizadas con respecto al control 8W208. La concentraciór de péptido tóxico 33mer fue determinada mediante ELlSA competitivo G12. El ensayo inmunológico mostró una reducción significativa de los niveles de péptido tóxico superior al 90% en las líneas 28A, 288, 0783, X387, 0770, 0793 Y X077. En contraste, las líneas 0894 y E35 presentaron una reducción del 42,42 y 48,57'%. Por su parte, las líneas transformadas con el vector pghpg8.1 no mostraron una reducción significativa en los niveles de 33-mer con respecto a la línea BW208. Así mismo fueron analizadas otras líneas transgénicas como son 0874, 0876, X678 (transformadas con el vector pOhp-w/a), C217 y 0598 (transformadas con el vector pghpg8.1) con respecto al control 8W2003. 0874, 0876 Y X678 presentaron una reducción superior al 95%. Sin embargo, en las líneas C217 y 0598 la reducción del porcentaje de péptido tóxico fue del 52,21 y 43,96%, respectivamente. En este ejemplo se vuelve a demostrar una correlación entre los niveles de péptido tóxico obtenidos con el anticuerpo G12 y los resultados con células T publicados por Gil-Humanes y col. (2010, Proc Natl Acad Sci USA, 107: 1702317028) en las gliadinas anuladas de las líneas transgénicas empleadas.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1a ._ Método de selección de semillas de cereales caracterizado por el uso de métodos inmunológicos con anticuerpos que reconocen al péptido 33-mer de la gliadina, de forma que cuando no presentan reactividad al gluten extraido de las semillas indican que son tolerables por individuos celíacos.2a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos son ELlSA indirecto, ELlSA competitivo, ELlSA sandwich, tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, Western blots, biosensores, que usan al menos un anticuerpo que reconoce el péptido 33-mer de la gliadina.3a._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos usan al menos un anticuerpo monoclonal con capacidad para detectar los epítopos contenidos en el 33-mer de la g!iadina SEO ID N° 1" SEO ID N° 2, SEO ID N° 3, SEO ID N° 4, SEO ID N° 5, SECl ID N° 6, SEO ID N° 7, SEO ID N° 8..4a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos usan al menos un anticuerpo monoclonal de los siguientes G12, el A1 y el R5.5a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos usan el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permita un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorigénicos o luminiscentes.6a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 mediante un ensayo inmunológico según las reivindicaciones del 2-5, caracterizado porque el ensayo podría usar un patrón de gliadina, gliadina hidrolizada, el péptido 33-mer completoo una parte de su secuencia de al menos 6 aminoácidos (SEQ ID N° 2).7a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos están caracterizados por la relación de proporcionalidad entre la señal obtenida con el método objeto de la patente y el daño potencial causado por las proteínas tóxicas en los individuos celíaGos medido mediante proliferación celular y producción de INF-y por células T de pacientes con enfermedad celíaca.sa._ Método de selección de semillas según reivindicación " usando los métodos inmunológicos según reivindicaciones 2-7 en el que las semillas son de trigo, cebada, centeno o avena.ga._ Método de selección de variedades de semillas según reivindicación 1 usando los métodos inmunológicos según reivindicaciones 2-7 en el que las semillas son avena.10a .-Método de selección de cultivares de cereales según reivindicación 1 usando los métodos inmunológicos según reivindicaciones 2-7 en el que las semillas son de cereales manipulados genéticamente para disminuir su grado de inmunogenicidad para enfermos celíacos.11 a.-Uso de variedades de cereales seleccionadas según las reivindicaciones 1 a 7 como ingrediente en alimentos que vayan a ser etiquetados como libres de gluten.12a.-Uso de cultivares de avenas seleccionadas según las reivindicaciones 1 a 7, como ingrediente en alimentos que vayan a ser etiquetados como libres de gluten.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201001632A ES2385463B1 (es) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | Procedimiento para la selección de semillas de cereales aptas para ser consumidas por los enfermos celíacos. |
| US13/982,073 US20190191748A1 (en) | 2010-12-28 | 2011-12-28 | Method for selecting cereal seeds suitable for consumption by coeliac patients |
| EP11852487.5A EP2660592A4 (en) | 2010-12-28 | 2011-12-28 | METHOD FOR SELECTING CEREAL SEEDS WHICH CAN BE CONSUMED BY C LIAQUE DISEASES |
| CA2825977A CA2825977A1 (en) | 2010-12-28 | 2011-12-28 | Method for selecting cereal seeds suitable for consumption by coeliac patients |
| PCT/ES2011/000378 WO2012089867A2 (es) | 2010-12-28 | 2011-12-28 | Procedimiento para la selección de semillas de cereales aptas para ser consumidas por los enfermos celíacos |
| AU2011351324A AU2011351324A1 (en) | 2010-12-28 | 2011-12-28 | Method for selecting cereal seeds suitable for consumption by coeliac patients |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201001632A ES2385463B1 (es) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | Procedimiento para la selección de semillas de cereales aptas para ser consumidas por los enfermos celíacos. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2385463A1 ES2385463A1 (es) | 2012-07-25 |
| ES2385463B1 true ES2385463B1 (es) | 2013-06-06 |
Family
ID=46383572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201001632A Active ES2385463B1 (es) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | Procedimiento para la selección de semillas de cereales aptas para ser consumidas por los enfermos celíacos. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20190191748A1 (es) |
| EP (1) | EP2660592A4 (es) |
| AU (1) | AU2011351324A1 (es) |
| CA (1) | CA2825977A1 (es) |
| ES (1) | ES2385463B1 (es) |
| WO (1) | WO2012089867A2 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6738888B2 (ja) * | 2016-02-23 | 2020-08-12 | 田中貴金属工業株式会社 | グリアジン検出用免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析キットおよび免疫クロマト分析方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR122018009860B1 (pt) * | 2007-08-13 | 2021-05-04 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Produto produzido a partir do grão de cevada adequado para consumo de indivíduos portadores de doença celíaca e método para produzir grãos de cevada |
-
2010
- 2010-12-28 ES ES201001632A patent/ES2385463B1/es active Active
-
2011
- 2011-12-28 US US13/982,073 patent/US20190191748A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-28 EP EP11852487.5A patent/EP2660592A4/en not_active Withdrawn
- 2011-12-28 AU AU2011351324A patent/AU2011351324A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-28 CA CA2825977A patent/CA2825977A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-28 WO PCT/ES2011/000378 patent/WO2012089867A2/es active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2011351324A1 (en) | 2013-10-24 |
| CA2825977A1 (en) | 2012-07-05 |
| EP2660592A2 (en) | 2013-11-06 |
| ES2385463A1 (es) | 2012-07-25 |
| WO2012089867A2 (es) | 2012-07-05 |
| US20190191748A1 (en) | 2019-06-27 |
| WO2012089867A3 (es) | 2012-08-16 |
| EP2660592A4 (en) | 2014-05-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kahlenberg et al. | Monoclonal antibody R5 for detection of putatively coeliac-toxic gliadin peptides | |
| Thomas et al. | A multi-laboratory evaluation of a common in vitro pepsin digestion assay protocol used in assessing the safety of novel proteins | |
| Spaenij–Dekking et al. | Natural variation in toxicity of wheat: potential for selection of nontoxic varieties for celiac disease patients | |
| Diaz-Amigo et al. | Accuracy of ELISA detection methods for gluten and reference materials: a realistic assessment | |
| Larré et al. | Assessment of allergenicity of diploid and hexaploid wheat genotypes: Identification of allergens in the albumin/globulin fraction | |
| Palosuo et al. | Wheat ω-5 gliadin is a major allergen in children with immediate allergy to ingested wheat | |
| Moron et al. | Toward the assessment of food toxicity for celiac patients: characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide | |
| Ballabio et al. | Molecular characterisation of 36 oat varieties and in vitro assessment of their suitability for coeliacs’ diet | |
| van den Broeck et al. | Label free targeted detection and quantification of celiac disease immunogenic epitopes by mass spectrometry | |
| Bittner et al. | Identification of wheat gliadins as an allergen family related to baker's asthma | |
| Comino et al. | Significant differences in coeliac immunotoxicity of barley varieties | |
| Bouchez-Mahiout et al. | Low molecular weight glutenins in wheat-dependant, exercise-induced anaphylaxis: allergenicity and antigenic relationships with omega 5-gliadins | |
| Rallabhandi et al. | Immunological characterization of the gluten fractions and their hydrolysates from wheat, rye and barley | |
| Misra et al. | Partial characterization of red gram (Cajanus cajan L. Millsp) polypeptides recognized by patients exhibiting rhinitis and bronchial asthma | |
| US7993869B2 (en) | Method for detecting gluten | |
| Mena et al. | Analytical tools for gluten detection: Policies and regulation | |
| Mujico et al. | Natural variation in avenin epitopes among oat varieties: Implications for celiac disease | |
| Alves et al. | Determination of gluten peptides associated with celiac disease by mass spectrometry | |
| CN112079909A (zh) | 变态反应的抗原及其表位 | |
| Zhu et al. | How does a celiac iceberg really float? The relationship between celiac disease and gluten | |
| Zhu et al. | Development and validation of a specific sandwich ELISA for determination of soybean allergens and its application in processed foods | |
| US9410962B2 (en) | Determination of levels of immunogenic gluten peptides in human samples | |
| ES2385463B1 (es) | Procedimiento para la selección de semillas de cereales aptas para ser consumidas por los enfermos celíacos. | |
| Birinyi et al. | Immunoanalytic investigation of grain proteins antigenic for celiac disease patients in an einkorn collection | |
| Waga et al. | Gliadin immunoreactivity and dough rheological properties of winter wheat genotypes modified by thioredoxin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2385463 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20130606 |