ES2279980T3 - Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca. - Google Patents
Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2279980T3 ES2279980T3 ES03787825T ES03787825T ES2279980T3 ES 2279980 T3 ES2279980 T3 ES 2279980T3 ES 03787825 T ES03787825 T ES 03787825T ES 03787825 T ES03787825 T ES 03787825T ES 2279980 T3 ES2279980 T3 ES 2279980T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- immunochromatographic
- iga
- strip
- aga
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un sistema inmunocromatográfico para el diagnóstico de enfermedad celiaca (EC) en humanos, que comprende los siguientes elementos: I) una tira inmunocromatográfica que permite la identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos -tipo IgA- específicos de los autoantígenos característicos de la EC, AGA (antigliadina) y t-TG (transglutaminasa tisular) que comprende: a) un sistema de visualización de la reacción que comprende un anticuerpo anti-IgA, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con un anticuerpo monoclonal anti-IgA, b) antígenos AGA y t-TG inmovilizados en la misma tira, y c) un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica, y, II) una tira inmunocromatografica que permite la identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos IgA/IgM/IgG frente al autoantígeno t-TG, que comprende: a) un sistema de visualización de la reacción que comprende antígeno t-TG, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con antígeno t-TG, b) antígeno t-TG inmovilizados en la misma tira, y c) un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica.
Description
Sistema y procedimiento inmunocromatográfico
para la identificación simultánea de anticuerpos frente a AGA y
t-TG, y su uso en el diagnóstico de enfermedad
celiaca.
La presente invención se encuadra en el área de
la biotecnología, y en concreto en el diagnóstico de enfermedades
humanas. El objeto de esta invención es un procedimiento rápido y
sencillo de identificación de anticuerpos
anti-antígenos asociados con la enfermedad celiaca
(EC) en muestras de suero, plasma o sangre de humanos.
La enfermedad celiaca (EC) es una enteropatia
caracterizada por una intolerancia a proteínas del trigo, centeno,
cebada y avena (gluten) en individuos genéticamente predispuestos.
La lesión intestinal está inmunológicamente mediada, siendo la
gliadina el disparador de una serie de cascadas que producen una
activación del sistema inmune y desembocan en la producción del
aplanamiento de la mucosa intestinal y la hiperplasia de las criptas
(Marsh. Correlative aspects of mucosal Pathology across the
spectrum of gluten-sensitivity. In. C.F.a.
C.O'Farrelly de. Gastrointestinal Immunology and
Gluten-sensitive disease. Dublin: Oak Tree Press,
1994: 145-157). La prevalencia de la EC, incluyendo
tanto la sintomática como la silente o atípica, recientemente se ha
estimado en 1/160 cuando se realiza el análisis de la misma en la
población general. La mortalidad ligada al mayor riesgo de
neoplasias, así como la morbilidad -que incluye abortos, osteopenia,
osteoporosis, enfermedades autoinmunes, etc- asociada con la EC no
tratada, clama por un diagnóstico temprano, cuyos beneficios se han
demostrado después de suministrar una dieta libre de gluten. Para
confirmar la enteropatía es necesaria una biopsia de intestino
delgado con estudio histopatológico, así como distintas pruebas
serológicas frente a antígenos celulares o de los alimentos que han
ganado en aceptación en los últimos años para seleccionar a los
candidatos para la realización de dicha biopsia intestinal.
Desde que recientemente se identificó la
transglutaminasa tisular (t-TG) como el mayor
autoantígeno presente en las estructuras del endomisio (Dieterich
W, Ehnis T, Bauer M et al., Identification of tissue
transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nat Med 197;
3: 797-801; WO 98/03872 Immunological process for
detecting antibodies directed towards tissue transglutaminase
(TTG), use of TTG for diagnostic purposes and therapy control, and
oral pharmaceutical agent containing TTG, Schuppan D, Dieterich W),
la técnica ELISA frente a t-TG es la más aceptada
universalmente para el despistaje en el diagnóstico de la Enfermedad
Celiaca (EC). Otros autores propugnan un ensayo inmunológico donde
los anticuerpos de los enfermos de EC reaccionarían mejor con un
antígeno formado por la t-TG y un sustrato de la
misma (WO01/29090, IMMCO DIAGNOSTICS, Immunological assay for
detection of antibodies in celiac disease).
Por otro lado, se ha descrito un ensayo
inmunocromatográfico de un paso para la detección de los anticuerpos
tipo IgA y IgG frente a la t-TG en plasma o suero
humano (Sorell L, Garrote JA, Acevedo b et al.,
One-step immunocromatographic assay for screening
of coeliac disease. Lancet 2002; 359: 945-946). De
acuerdo con estos últimos autores el ensayo inmunocromatográfico
anti t-TG presentó una sensibilidad y una
especificidad del 100% en el diagnóstico de la EC, es decir, unos
datos similares a los obtenidos con biopsia intestinal que
constituye la prueba patrón oro en el diagnóstico de la EC. Sin
embargo, hay que indicar que dicho trabajo se realizó en un pequeño
grupo de pacientes con EC (n=50) por lo que estos resultados deben
considerarse como excesivamente prometedores. Estos mismos autores
presentaron una patente relacionada con el uso teórico de
t-TG en la elaboración de un ensayo
inmunocromatográfico para el diagnóstico de EC aunque no indicaron
ninguna realización práctica de dicho ensayo ni resultados
concretos con muestras de pacientes con EC (EP1164375, Assay for
anti transglutaminase antibodies, Sorell LT, Aroya H,Acevedo, BE,
Cerro, H).
Los anticuerpos antigliadina (AGA) también son
indicativos de EC aunque la especificidad de los ensayos ELISA
anti-AGA realizados es menor que con los otros
ensayos y deben realizarse ensayos separados para la identificación
de los anticuerpos IgA y IgG. También existe recientemente un ensayo
visual de diagnóstico de AGA (Garrote J A, Sorell L, Alfonso P
et al 1999. A simple visual immunoassay for the screening of
coeliac disease. Eur. J Clin Invest 29; 697-699) y
un inmunoensayo en fase sólida para anticuerpos específicos frente a
AGA (ES 2141679). Otra patente relacionada con el diagnóstico de EC
mediante la identificación de anticuerpos antigliadina es la
patente WO 00/25793 (Diagnosis of coeliac disease using a gliadin
epitope, Anderson R, Hill A, Jewell, D) aunque es un procedimiento
laborioso al manejarse linfocitos T in vitro.
Bazzigaluppi et al. (Bazzigaluppi E.
et al., Journal of Autoimmunity, Vol. 12, No. 1, Feb. 1999,
pp 51-56) describen un ensayo de radiounión para
IgG e IgA específicas frente a t-TG; las IgA e IgG
para AGA se miden mediante relaciones competitivas con métodos
inmuno-enzimáticos. También se han descrito métodos
ELISA para medir IgA frente a AGA e IgA frente a
t-TG (Palacios eE. et al., An. Esp. Pediatr.
Vol. 53, Nnº 6, Julio 2000, pp 542-546).
Por todo ello, aunque la sensibilidad y
especificidad de los marcadores serológicos, tales como anticuerpos
antigliadina (AGA), anti-endomisio (EmA) y
anti-transglutaminasa tisular (t-TG)
puede ser alta, la realización de dichas técnicas de ELISA y de
inmunofluorescencia requieren laboratorios bien equipados y una
plantilla cualificada, que no puede estar disponible en todo el
mundo, y la repetición de las técnicas para una misma muestra
biológica para identificar las distintas IgA, IgG o IgM.
Por tanto, de ahí el interés en desarrollar un
nuevo método de ensayo, más barato y fácil de realizar, para ser
usado en el diagnóstico de la EC, especialmente en poblaciones de
riesgo. Hasta ahora sólo unos pocos de estos ensayos se han
desarrollado, la mayoría de los cuáles están basados en la respuesta
serológica frente a la gliadina y últimamente frente a la
t-TG, que se han determinado como los anticuerpos
más frecuentes asociados a EC. El procedimiento que se describe en
esta patente es el primer procedimiento visual que usa
t-TG humana recombinante, y el primer procedimiento
visual que permite detectar en un mismo ensayo, es decir, con una
única tira inmunocromatográfica, anticuerpos de tipo IgA frente a
t-TG y AGA.
Un objeto de la presente invención lo constituye
un sistema inmunocromatográfico doble que permite la puesta en
marcha del procedimiento descrito anteriormente y que incluye
simultáneamente los elementos necesarios para la determinación y
visualización de la reacciones inmunocromatográficas (IC) entre
anticuerpos IgA (tira doble AGA/t-TG) e IgG o IgM
(tira anti t-TG IgA/G/M) característicos de enfermos
celiacos con al menos dos antígenos inductores de la respuesta
inmune de la EC.
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento de identificación de anticuerpos presentes en
pacientes con enfermedad celiaca mediante un sistema
inmunocromatográfico que valora de forma conjunta y simultánea la
presencia en una muestra biológica de anticuerpos -IgA, IgG o IgM
por separado en cada sistema- específicos de los autoantígenos
característicos de la EC AGA y t-TG.
Finalmente, un objeto de la presente invención
lo constituye el uso del sistema inmunocromatográfico y del
procedimiento de la presente invención para la identificación de
anticuerpos presentes en pacientes con enfermedad celiaca.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que la identificación conjunta y simultánea
de anticuerpos presentes en pacientes con enfermedad celiaca es
posible mediante un sistema inmunocromatográfico (tiras
inmunocromatográficas) con unos valores de sensibilidad y
especificidad mejores que realizados por separado y similares a los
obtenidos por otras técnicas inmunológicas, por ejemplo ELISA. Así,
la presencia de anticuerpos frente a distintos autoantígenos de la
EC, en concreto AGA y t-TG, ha podido ser
determinada en una misma tira inmunocromatográfica y con las mismas
condiciones de reacción; y para los casos en los que los pacientes
de EC presentan ausencia de IgA se ha desarrollado otra tira
inmunocromatográfica basada en el mismo autoantígeno
t-TG de la anterior tira.
Un objeto de la presente invención lo constituye
un sistema inmunocromatográfico doble que permite la puesta en
marcha del procedimiento descrito anteriormente y que incluye
simultáneamente los elementos necesarios para la determinación y
visualización de la reacciones inmunocromatográficas (IC) entre
anticuerpos característicos de enfermos celiacos con al menos dos
antígenos inductores de la respuesta inmune de la EC. En concreto,
dicho sistema inmunocromatográfico para el diagnóstico de
enfermedad celiaca en humanos está formado por los siguientes
elementos:
I) una tira inmunocromatográfica que permite la
identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos -tipo
IgA- específicos de los autoantígenos característicos de la EC, AGA
y t-TG, que comprende
- a)
- un sistema de visualización de la reacción, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con un anticuerpo monoclonal anti IgA,
- b)
- antígenos AGA y t-TG inmovilizados en la misma tira, y
- c)
- un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica, y,
II) una tira inmunocromatografica que permite la
identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos
IgA/IgM/IgG frente al autoantígeno t-TG que
comprende
- a)
- un sistema de visualización de la reacción, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con antígeno t-TG,
- b)
- antígeno t-TG inmovilizados en la misma tira, y
- c)
- un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "muestra biológica" se refiere a una muestra biológica
tipo suero, plasma, saliva o sangre de un paciente sospechoso de
padecer EC.
\newpage
El término "AGA" tal como se utiliza en la
presente invención se refiere a un extracto de proteínas obtenido
de uno o de una mezcla de varios cereales pertenecientes al
siguiente grupo -trigo, cebada, centeno y avena- y que induce
anticuerpos en pacientes con EC.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "t-TG" se refiere a la proteína
transglutaminasa de origen animal o humana, sintética o
recombinante y también a fragmentos de dicha t-TG
que inducen una respuesta inmunológica en pacientes con EC similar
a la obtenida con la t-TG completa.
Un objeto particular de la presente invención es
un sistema inmunocromatográfico en el que el antígeno AGA se ha
obtenido a partir de una variedad de cereal o mezcla de cereales
como por ejemplo trigo de la variedad Triana y el antígeno
t-TG es una t-TG humana recombinante
(ver Ejemplo 1).
Así, una realización particular de la presente
invención lo constituye una tira inmunocromatográfica de flujo
lateral doble como soporte inerte que determina y visualiza en una
única tira las reacciones IC entre IgA y AGA e IgA y
t-TG realizada según el Ejemplo 1a) y que comprende
un sistema de visualización de la reacción (por ejemplo, partículas
coloidales o microesferas coloreadas recubiertas por un anticuerpo
monoclonal frente a IgA humana), la inmovilización de los antígenos
de EC, AGA y t-TG (en este caso
t-TG), un soporte inerte que permite el flujo de
dichos elementos reconstituidos al añadir el suero o plasma, y un
sistema control de las condiciones de la propia reacción
inmunocromatográfica. Por otro lado, forman parte de la presente
invención cualquier otra tira IC doble que pueda ser desarrollada a
partir del estado de la técnica existente en el área de las
técnicas inmunocromatográficas y conocido por los expertos.
Además, otra realización particular de la
presente invención lo constituye una tira inmunocromatográfica (tira
anti t-TG IgA/IgG/IgM, ver Ejemplo 1b)) que permite
la determinación de anticuerpos IgA o IgG o IgM de pacientes con EC
frente al autoantígeno t-TG utilizado en la tira
doble AGA/t-TG comentada anteriormente.
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento de identificación de anticuerpos presentes en
pacientes con enfermedad celiaca mediante un sistema
inmunocromatográfico que valora de forma conjunta y simultánea la
presencia en una muestra biológica de anticuerpos -IgA, además de
IgM o IgG por separado en cada tira inmunocromatográfica-
específicos de los autoantígenos característicos de la EC AGA y
t-TG mediante dos tiras inmunocromatográficas
distintas (tira doble AGA/t-TG y tira anti
t-TG IgA/IgG/IgM).
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye un procedimiento descrito anteriormente en el que en
lugar de realizarse simultáneamente la valoración de los anticuerpos
específicos de EC mediante las dos tiras inmunocromatográficas se
realiza en primer lugar el análisis de los anticuerpos mediante la
tira inmunocromatográfica doble AGA/t-TG (Ejemplo
1a)) y en el caso de un resultado negativo se realiza una segunda
valoración de la presencia de anticuerpos tipo IgA, IgG e IgM frente
a t-TG mediante un sistema inmunocromatográfico
sencillo (Ejemplo 1b)).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un procedimiento según esta patente en el que la
reacción inmunocromatográfica desarrollada tiene lugar entre los
autoantígenos de EC dispuestos en la tira inmunocromatográfica AGA
y t-TG y anticuerpos IgG o IgM de la muestra
biológica separadamente. En estos casos, las partículas coloidales
o microesferas coloreadas de la tira doble estarían recubiertas por
un anticuerpo monoclonal que reconoce IgG o IgM humana,
respectivamente para cada una de las tiras.
Finalmente, un objeto de la presente invención
lo constituye el uso del sistema inmunocromatográfico constituido
por las tiras inmunocromatográficas y del procedimiento de la
presente invención para la identificación de anticuerpos (IgA, IgM
o IgG) presentes en pacientes con enfermedad celiaca.
Esta figura muestra la representación de las
bandas visualizadas tras los ensayos inmunocromatográficas con las
tiras doble (AGA/t-TG) y sencilla
(t-TG (IgA/IgG/IgM). 1+, tira positiva frente a
t-TG mediante tira sencilla; 2+, tira negativa
frente a t-TG mediante tira sencilla; 3+ y 3-,
comparación de una tira sencilla y doble en un paciente con
deficiencia de IgA; 4-, tira negativa frente a
t-TG/AGA en tira doble; 5+, tira positiva frente a
AGA en una tira doble; 6+, tira positiva frente a
t-TG en una tira doble; 7+, tira positiva frente a
AGA/t-TG en una tira doble.
Ejemplos de
realización
El procedimiento desarrollado en la presente
invención se basa en unas tiras inmunocromatográficas de flujo
lateral producidas en la empresa Operón SA (Zaragoza, España). A
continuación se presentan los dos modelos de tiras elaboradas: a)
tiras frente a AGA y t-TG tipo IgA, y b) tiras
frente a t-TG IgA/IgG/IgM. Las tiras constan de
varias capas que aportan todos los reactivos necesarios en cada
tipo.
Se trata de un test de tres bandas (ver Figura
1). Las muestras de suero humano, provenientes de enfermos de EC o
de casos control, se diluyen en una solución tamponadora que
contiene albúmina de suero bovino (BSA) y un detergente no iónico,
pudiéndose realizar dicha dilución bien en tubos "eppendorf",
bien en placas de microtitulación. La tira o stick se introduce por
su región absorbente en la dilución 1/15 del suero tamponado
mencionado anteriormente. Si el suero del paciente presenta
anticuerpos tipo IgA frente a t-TG, gliadinas o
ambos, cuando el líquido asciende por capilaridad (tira
inmunocromatográfica de flujo lateral) reconstituye unas
microesferas coloreadas situadas en esta región absorbente de la
tira y que en este caso están recubiertas por un anticuerpo
monoclonal frente a IgA humana. Una vez reconstituidas, el complejo
formado por las microesferas rojas recubiertas con anticuerpo
monoclonal frente a IgA humana, los anticuerpos (tipo IgA) frente a
la t-TG, o a las gliadinas, o frente a ambos
antígenos, asciende y reacciona de forma separada con 2 líneas
distintas (separadas físicamente), que contienen inmovilizadas
tanto gliadinas purificadas (en una de ellas), como
t-TG humana recombinante (en la otra), lo que
resulta en una o dos bandas rojas, tras la reacción inmunológica
correspondiente, en distintos niveles, dependiendo de que el suero
presente anticuerpos (tipo IgA) frente a la t-TG,
frente a las gliadinas (AGA) o frente a ambos antígenos. En caso de
inmunorreactividad, además de la banda control en este ejemplo de
color azul, pasados unos 5-10 minutos se puede
desarrollar una banda en este ejemplo roja correspondiente a
t-TG, o a AGA, o dos bandas correspondiendo a
anticuerpos frente a AGA y a t-TG de tipo IgA. La
banda control de color azul aparece en lo alto de la tira validando
el resultado de la prueba, la banda roja correspondiente a la
presencia de anticuerpos, tipo IgA, frente a las gliadinas (AGA)
aparece en el medio, y la banda roja que indica la presencia de
anticuerpos, tipo IgA, frente a la t-TG aparece en
la parte inferior de la tira.
La banda de color azul es un control interno de
la tira inmunocromatográfica que indica que las condiciones
necesarias para la reacción antígeno-anticuerpo y su
posterior visualización han sido correctas.
La t-TG recombinante humana
(Rt-TG) se obtuvo de Diarect (Freiburg Alemania), y
la gliadina purificada fue aislada de una variedad de trigo,
variedad Triana, por los propios inventores en la Unidad de Gluten
del Centro Nacional de Biotecnología. Esta purificación se realizó
mediante una extracción etanólica, seguida de una concentración
usando ultrafiltración, y posterior liofilización del extracto. El
anticuerpo monoclonal frente a IgA humana se produjo en Operón SA
(Zaragoza, España).
Con este tipo de tiras se probaron 248 sueros,
correspondiendo el 50% a pacientes con EC y el otro 50% a casos
control no-EC de igual manera que las de las tiras
sencillas.
Se trata de una prueba de dos bandas. Los sticks
o tiras son introducidos bien en tubos "eppendorf" o en placas
de microtitulación que contienen una dilución 1:20, previamente
preparada, del suero de los pacientes a estudiar, con una solución
salina tamponadora a base de fosfatos (PBS) a pH y concentración
salina fisiológica con un 1% de albúmina de suero bovino (BSA). Al
poner la tira dentro de la muestra diluida, el líquido asciende por
capilaridad y reconstituye las microesferas coloreadas en rojo que
se encontraban secas y recubiertas con t-TG
recombinante humana (Rt-TG) si la muestra contiene
anticuerpos frente a la transglutaminasa tisular
(t-TG). El complejo formado por las microesferas
rojas coloreadas, la t-TG recombinante humana y los
anticuerpos anti t-TG presentes en la muestra del
paciente, asciende y alcanza una región que contiene una línea de
t-TG recombinante humana, provocando una
inmunorreacción que da como resultado una banda roja. Esa banda roja
indica la presencia de anticuerpos anti t-TG, tipo
IgA, IgG o IgM, en la muestra analizada. Como control del sistema,
en la región absorbente de la tira también están situadas otras
microesferas secas coloreadas en azul recubiertas con una proteína
determinada. El complejo de las microesferas azules recubiertas de
proteína, reconstituidas, asciende por la tira hasta alcanzar una
región en la que están inmovilizados unos anticuerpos monoclonales
frente a dicha proteína, reaccionando inmunológicamente y dando
como resultado una banda azul. Cuando el suero no es
inmunorreactivo sólo se desarrolla una banda de control azul,
mientras que en caso de inmunorreactividad, además de la banda
azul, se desarrolla una banda de resultados roja pasados uno
5-10 minutos.
En caso de no aparecer ninguna de las dos bandas
el análisis no es válido y habría que repetirlo usando otra nueva
tira. No se necesita equipamiento adicional para el desarrollo del
ensayo.
Los resultados obtenidos en las pruebas con los
dos tipos de tiras, doble y sencilla, se compararon con los
resultados obtenidos por ELISA para anticuerpos
anti-tTG y AGA.
En el caso de la tira de diagnóstico doble se
encontró una sensibilidad del 92,7% y 83,2%, con una especificidad
del 96,2% y del 96,7% para la t-TG y AGA,
respectivamente, cuando se analizaron los resultados de
t-TG y AGA por separado (Tabla I). Estos datos
mostraron una concordancia frente al ELISA del 99,3% y del 99,2%,
respectivamente. Por otro lado, hay que destacar que el análisis
conjunto de los resultados en una misma tira doble, es decir,
número de casos positivos frente a uno de los dos antígenos AGA y
t-TG por separado o ambos positivos, permitió
obtener valores de sensibilidad y especificidad mayores que los
observados por separado, 95,2% y 96,2% respectivamente. En
concreto, se observó que tres pacientes con EC con AGA positiva en
la tira doble eran t-TG negativos, quince pacientes
con EC con t-TG positivo eran AGA negativos y cien
pacientes con EC fueron positivos para AGA y t-TG.
Es decir, que la realización de una tira doble permitió identificar
tres pacientes con EC que hubieran sido posible identificar con un
análisis AGA o t-TG por separado (esto es lo que
incrementa la sensibilidad del 92,7% al 96,3%).
En los casos EC negativos frente a
AGA/t-TG obtenidos con la tira doble se analizó la
presencia de anticuerpos IgA/IgM/IgG frente a t-TG
realizando un ensayo inmuno-cromatográfico con la
tira sencilla, observándose un caso positivo frente a
t-TG en el que se confirmó además el déficit de IgA
en este paciente mediante la técnica de nefelometría. Una de las
ventajas más destacables del uso combinado de ambas tiras, doble y
sencilla, es que permite la detección de pacientes con déficit
selectivo de IgA, y que presentan EC, cuando la banda de la
t-TG es positiva en la tira sencilla, y negativa en
la tira doble con lo que la sensibilidad obtenida por ambas pruebas
se incrementa (en nuestro caso del 95,2% al 96%).
Como se puede observar en la tabla, existe una
alta correlación entre los distintos ensayos visuales y los test
ELISA respectivos.
Los resultados obtenidos en los ensayos
inmunocromatográficos presentados muestran estos métodos como
extremadamente eficientes para el diagnóstico de la EC, lo que
unido a la facilidad, no es imprescindible un operario especialmente
cualificado, rapidez (no más de 10 minutos) de su realización, y la
no necesidad de equipamientos tecnológicamente complejos, hacen del
método una herramienta muy útil para inspeccionar poblaciones de
riesgo para EC y seleccionar candidatos para la realización de una
biopsia de intestino delgado.
Otra característica importante es que estas
tiras presentan unos valores mayores de sensibilidad y especificidad
que los ELISAs correspondientes de t-TG y AGA,
siendo extremadamente eficientes para el despistaje y diagnóstico
de la EC.
La tira doble AGA/t-TG determina
tanto AGA como t-TG, de tipo IgA, en un único
análisis, eliminando, por tanto, la necesidad de usar dos ELISAs
paralelos t-TG y AGA.
Ambas tiras son significativamente más baratas
que el ELISA, más simples de manejar e interpretar, y se cree que
estas características le pueden hacer un test ideal para el
diagnóstico de EC en grandes poblaciones, especialmente en países
en desarrollo.
Claims (6)
1. Un sistema inmunocromatográfico para el
diagnóstico de enfermedad celiaca (EC) en humanos, que comprende
los siguientes elementos:
I) una tira inmunocromatográfica que permite la
identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos -tipo
IgA- específicos de los autoantígenos característicos de la EC, AGA
(antigliadina) y t-TG (transglutaminasa tisular)
que comprende
- a)
- un sistema de visualización de la reacción que comprende un anticuerpo anti-IgA, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con un anticuerpo monoclonal anti-IgA,
- b)
- antígenos AGA y t-TG inmovilizados en la misma tira, y
- c)
- un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica, y,
II) una tira inmunocromatografica que permite la
identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos
IgA/IgM/IgG frente al autoantígeno t-TG, que
comprende
- a)
- un sistema de visualización de la reacción que comprende antígeno t-TG, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con antígeno t-TG,
- b)
- antígeno t-TG inmovilizados en la misma tira, y
- c)
- un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica.
2. Un sistema inmuncromatográfico según la
reivindicación 1, en el que la t-TG es una
t-TG humana recombinante y la AGA es un extracto de
proteínas obtenido de una variedad de trigo.
3. Un procedimiento inmunocromatográfico de
identificación de anticuerpos presentes en pacientes con enfermedad
celiaca (EC), que comprende valorar
a) la presencia simultánea en una muestra
biológica de anticuerpos -tipo IgA- específicos de los autoantígenos
característicos de la EC, AGA (antigliadina) y t-TG
(transglutaminasa tisular), mediante una tira
inmuno-cromatográfica según la reivindicación 1 I),
y
b) la presencia en la misma muestra biológica de
a) de anticuerpos IgA/IgM/IgG frente al autoantígeno
t-TG mediante una tira inmunocromatográfica según
la reivindicación 1 II).
4. Un procedimiento según la reivindicación 3,
en el que la muestra biológica consiste en suero, plasma, saliva o
sangre de un paciente sospechoso de padecer EC.
5. Un procedimiento inmunocromatográfico de
identificación de anticuerpos presentes en pacientes con enfermedad
celiaca (EC), que comprende
a) valorar la presencia en una muestra biológica
de anticuerpos -tipo IgA- específicos de los autoantígenos
característicos de la EC, AGA (antigliadina) y t-TG
(transglutaminasa tisular), mediante una tira
inmuno-cromatográfica según la reivindicación 1 I),
y, en caso de que el resultado fuera negativo
b) valorar la presencia en la misma muestra
biológica de a) de anticuerpos IgA, IgM e IgG frente al autoantígeno
t-TG mediante una tira inmunocromatográfica según
la reivindicación 1 II).
6. Uso del sistema inmunocromatográfico según
las reivindicaciones 1 y 2, y del procedimiento según las
reivindicaciones 3 a 5, para la identificación de anticuerpos (IgA,
IgM o IgG) presentes en muestras de pacientes con enfermedad
celiaca.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200201939 | 2002-08-16 | ||
ES200201939A ES2214108B1 (es) | 2002-08-16 | 2002-08-16 | Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca. |
PCT/ES2003/000425 WO2004016065A2 (es) | 2002-08-16 | 2003-08-14 | SISTEMA Y PROCEDIMIENTO INMUNOCROMATOGRÁFICO PARA LA INDENTIFICACIÓN SIMULTÁNEA DE ANTICUERPOS FRENTE A AGA Y t-TG, Y SU USO EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDAD CELIACA |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2279980T3 true ES2279980T3 (es) | 2007-09-01 |
Family
ID=31725577
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200201939A Expired - Fee Related ES2214108B1 (es) | 2002-08-16 | 2002-08-16 | Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca. |
ES03787825T Expired - Lifetime ES2279980T3 (es) | 2002-08-16 | 2003-08-14 | Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200201939A Expired - Fee Related ES2214108B1 (es) | 2002-08-16 | 2002-08-16 | Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca. |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1538445B1 (es) |
AT (1) | ATE352037T1 (es) |
AU (1) | AU2003260516A1 (es) |
DE (1) | DE60311278T2 (es) |
ES (2) | ES2214108B1 (es) |
PT (1) | PT1538445E (es) |
WO (1) | WO2004016065A2 (es) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090305303A1 (en) * | 2006-07-25 | 2009-12-10 | Cecile Besson Duvanel | immunochromatography device for the diagnosis of diseases in a sample |
CN101261270B (zh) * | 2007-03-09 | 2012-11-07 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种免疫层析多重检测试纸盘及免疫层析多重检测方法 |
ES2385455B2 (es) * | 2010-12-28 | 2013-09-25 | Universidad De Sevilla | Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas. |
WO2013098441A1 (es) * | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Universidad De Sevilla | Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas |
CN108700571A (zh) * | 2016-02-23 | 2018-10-23 | 田中贵金属工业株式会社 | 麦醇溶蛋白检测用免疫层析分析装置、免疫层析分析试剂盒以及免疫层析分析方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2141679B1 (es) * | 1998-05-22 | 2000-12-01 | Consejo Superior Investigacion | Aplicacion de un inmunoensayo visual para la identificacion de la enfermedad celiaca utilizando como antigeno gliadinas de trigo. |
CU22968A1 (es) * | 2000-06-07 | 2004-07-14 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Procedimiento para la detección de anticuerpos anti transglutaminasa con utilidad en el diagnóstico de la enfermedad celíaca |
-
2002
- 2002-08-16 ES ES200201939A patent/ES2214108B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-08-14 EP EP03787825A patent/EP1538445B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-14 PT PT03787825T patent/PT1538445E/pt unknown
- 2003-08-14 AT AT03787825T patent/ATE352037T1/de active
- 2003-08-14 DE DE60311278T patent/DE60311278T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-14 WO PCT/ES2003/000425 patent/WO2004016065A2/es active IP Right Grant
- 2003-08-14 ES ES03787825T patent/ES2279980T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-14 AU AU2003260516A patent/AU2003260516A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE60311278T2 (de) | 2007-11-15 |
AU2003260516A1 (en) | 2004-03-03 |
DE60311278D1 (de) | 2007-03-08 |
EP1538445A2 (en) | 2005-06-08 |
PT1538445E (pt) | 2007-04-30 |
ES2214108B1 (es) | 2005-11-16 |
EP1538445B1 (en) | 2007-01-17 |
AU2003260516A8 (en) | 2004-03-03 |
WO2004016065A2 (es) | 2004-02-26 |
ATE352037T1 (de) | 2007-02-15 |
WO2004016065A3 (es) | 2004-03-25 |
ES2214108A1 (es) | 2004-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11255854B2 (en) | Signal amplification in lateral flow and related immunoassays | |
ES2283397T3 (es) | Procedimiento para el diagnostico de la sensibilidad alimentaria inmunologica. | |
Li et al. | Plasmonic gold chips for the diagnosis of Toxoplasma gondii, CMV, and rubella infections using saliva with serum detection precision | |
KR101805451B1 (ko) | 아나플라즈마 파고사이토필리움 균주의 탐지용 조성물, 및 이를 포함하는 면역진단키트 | |
CN110346557A (zh) | 一种检测试剂盒 | |
Sakly et al. | Performance of anti-deamidated gliadin peptides antibodies in celiac disease diagnosis | |
RU2214835C2 (ru) | Метод обнаружения антител к трансглутаминазе для применения в диагностике целиакии | |
ES2279980T3 (es) | Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca. | |
CA3033035A1 (en) | Method for the diagnosis of acute pancreatitis (ap) by detection of glycoprotein 2 isoform alpha (gp2a) | |
ES2715181T3 (es) | Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas | |
AU2439600A (en) | Urinary trypsin inhibitor to diagnose aids | |
US20080038760A1 (en) | Method for Detecting Anti-Transglutaminase Antibodies | |
CN104849455B (zh) | 一种基于梅毒血清学检测蛋白芯片制备与应用 | |
Garrote et al. | A novel visual immunoassay for coeliac disease screening | |
ES2372547T3 (es) | Métodos para la detección y diagnosis de la infección por trypanosoma cruzi. | |
ES2327772T3 (es) | Procedimiento para la determinacion de sustancias eliminadas por celulas detectables. | |
WO2015121526A1 (es) | Péptido, péptido magnético y método para detectar la enfermedad celíaca | |
CN110346558A (zh) | 一种检测试剂盒的使用方法 | |
TW201901152A (zh) | 評估個體之登革熱病毒感染嚴重程度的方法 | |
EP4220166A1 (en) | In vitro method for detecting antibodies in a sample | |
CN110741099B (zh) | 评估个体的登革热病毒感染严重程度的方法、检测装置及检测试剂盒 | |
Marti et al. | Evaluation of a DGP point-of-care test for celiac disease in a pediatric population | |
KR20230092004A (ko) | 쉬스토소마 감염의 검출을 위한 단백질 | |
Siqueira | Identification of New Antigens for the Diagnosis of Visceral Leishmaniasis-Application in Immunochromatography | |
JP2022096812A (ja) | 抗原ポリペプチド |