ES2214108A1 - Procedimiento inmunocromatografico de identificacion conjunta de anticuerpos iga frente a aga y t-tg y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca. - Google Patents
Procedimiento inmunocromatografico de identificacion conjunta de anticuerpos iga frente a aga y t-tg y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca.Info
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Abstract
Sistema y procedimiento inmunocromatográfico para la identificación simultánea de anticuerpos frente a AGA y t-TG, y su uso en el diagnóstico de enfermedad celiaca. El objeto de la presente invención es un sistema inmunocromatográfico que comprende dos tiras o sticks inmunocromatográficas que permiten la identificación simultánea de distintos anticuerpos presentes en una muestra biológica de pacientes con enfermedad celiaca (EC) específicos de los autoantígenos característicos de la EC como el AGA (anticuerpos antigliadinas) y t TG (transglutaminasa tisular). Otro objeto de la invención lo constituye un procedimiento de identificación de anticuerpos presentes en pacientes con EC basado en el sistema inmunocromatográfico anterior y el uso de ambos, sistema y procedimiento inmunocromatográfico, para el diagnóstico de pacientes con enfermedad celiaca.
Description
Sistema y procedimiento inmunocromatográfico para
la identificación simultánea de anticuerpos frente a AGA y
\hbox{t-TG}, y su uso en el diagnóstico de enfermedad celiaca.
La presente invención se encuadra en el área de
la biotecnología, y en concreto en el diagnóstico de enfermedades
humanas. El objeto de esta invención es un procedimiento rápido y
sencillo de identificación de anticuerpos
anti-antígenos asociados con la enfermedad celiaca
(EC) en muestras de suero, plasma o sangre de humanos.
La enfermedad celiaca (EC) es una enteropatia
caracterizada por una intolerancia a proteínas del trigo, centeno,
cebada y avena (gluten) en individuos genéticamente predispuestos.
La lesión intestinal está inmunológicamente mediada, siendo la
gliadina el disparador de una serie de cascadas que producen una
activación del sistema inmune y desembocan en la producción del
aplanamiento de la mucosa intestinal y la hiperplasia de las
criptas (Marsh. Correlative aspects of mucosal Pathology across the
spectrum of gluten-sensitivity. In. C.F.a.
C.O'Farrelly de. Gastrointestinal Immunology and
Gluten-sensitive disease. Dublin: Oak Tree Press,
1994: 145-157). La prevalencia de la EC, incluyendo
tanto la sintomática como la silente o atípica, recientemente se ha
estimado en 1/160 cuando se realiza el análisis de la misma en la
población general. La mortalidad ligada al mayor riesgo de
neoplasias, así como la morbilidad -que incluye abortos, osteopenia,
osteoporosis, enfermedades autoinmunes, etc- asociada con la EC no
tratada, clama por un diagnóstico temprano, cuyos beneficios se han
demostrado después de suministrar una dieta libre de gluten. Para
confirmar la enteropatía es necesaria una biopsia de intestino
delgado con estudio histopatológico, así como distintas pruebas
serológicas frente a antígenos celulares o de los alimentos que han
ganado en aceptación en los últimos años para seleccionar a los
candidatos para la realización de dicha biopsia intestinal.
Desde que recientemente se identificó la
transglutaminasa tisular (t-TG) como el mayor
autoantígeno presente en las estructuras del endomisio (Dieterich W,
Ehnis T, Bauer M et al., Identification of tissue transglutaminase
as the autoantigen of celiac disease. Nat Med 197; 3:
797-801; WO 98/03872 Immunological process for
detecting antibodies directed towards tissue transglutaminase (TTG),
use of TTG for diagnostic purposes and therapy control, and oral
pharmaceutical agent containing TTG, Schuppan D, Dieterich W), la
técnica ELISA frente a t-TG es la más aceptada
universalmente para el despistaje en el diagnóstico de la
Enfermedad Celiaca (EC). Otros autores propugnan un ensayo
inmunológico donde los anticuerpos de los enfermos de EC
reaccionarían mejor con un antígeno formado por la
t-TG y un sustrato de la misma (WO01/29090, IMMCO
DIAGNOSTICS, Immunological assay for detection of antibodies in
celiac disease).
Por otro lado, se ha descrito un ensayo
inmunocromatográfico de un paso para la detección de los
anticuerpos tipo IgA y IgG frente a la t-TG en
plasma o suero humano (Sorell L, Garrote JA, Acevedo b et al.,
One-step immunocromatographic assay for screening
of coeliac disease. Lancet 2002; 359: 945-946). De
acuerdo con estos últimos autores el ensayo inmunocromatográfico
anti t-TG presentó una sensibilidad y una
especificidad del 100% en el diagnóstico de la EC, es decir, unos
datos similares a los obtenidos con biopsia intestinal que
constituye la prueba patrón oro en el diagnóstico de la EC. Sin
embargo, hay que indicar que dicho trabajo se realizó en un pequeño
grupo de pacientes con EC (n=50) por lo que estos resultados deben
considerarse como excesivamente prometedores. Estos mismos autores
presentaron una patente relacionada con el uso teórico de
t-TG en la elaboración de un ensayo
inmunocromatográfico para el diagnóstico de EC aunque no indicaron
ninguna realización práctica de dicho ensayo ni resultados
concretos con muestras de pacientes con EC (EP1164375, Assay for
anti transglutaminase antibodies, Sorell LT, Aroya H, Acevedo, BE,
Cerro, H).
Los anticuerpos antigliadina (AGA) también son
indicativos de EC aunque la especificidad de los ensayos ELISA anti
AGA realizados es menor que con los otros ensayos y deben
realizarse ensayos separados para la identificación de los
anticuerpos IgA y IgG. También existe recientemente un ensayo visual
de diagnóstico de AGA (Garrote J A, Sorell L, Alfonso P et al 1999.
A simple visual immunoassay for the screening of coleliac disease.
Eur. J Clin Invest 29; 697-699; Spanish Office for
Patents and Marks No. 9801067). Otra patente relacionada con el
diagnóstico de EC mediante la identificación de anticuerpos
antigliadina es la patente WO 00/25793 (Diagnosis of coeliac disease
using a gliadin epitope, Anderson R, Hill A, Jewell, D) aunque es
un procedimiento laborioso al manejarse linfocitos T in
vitro.
Por todo ello, aunque la sensibilidad y
especificidad de los marcadores serológicos, tales como anticuerpos
anti-gliadina (AGA), anti-endomisio
(EmA) y anti-transglutaminasa tisular
(t-TG) puede ser alta, la realización de dichas
técnicas de ELISA y de inmunofluorescencia requieren laboratorios
bien equipados y una plantilla cualificada, que no puede estar
disponible en todo el mundo, y la repetición de las técnicas para
una misma muestra biológica para identificar los distintos IgA, IgG
o IgM.
Por tanto, de ahí el interés en desarrollar un
nuevo método de ensayo, más barato y fácil de realizar, para ser
usado en el diagnóstico de la EC, especialmente en poblaciones de
riesgo. Hasta ahora sólo unos pocos de estos ensayos se han
desarrollado, la mayoría de los cuáles están basados en la
respuesta serológica frente a la gliadina y últimamente frente a la
t-TG, que se han determinado como los anticuerpos
más frecuentes asociados a EC. El procedimiento que se presenta en
esta patente es el primer procedimiento visual que usa
t-TG humana recombinante, y el primer procedimiento
visual que permite detectar en un mismo ensayo, es decir, con una
única tira inmunocromatográfica, anticuerpos de tipo IgA frente a
t-TG y AGA.
Un objeto de la presente invención lo constituye
un sistema inmunocromatográfico doble que permite la puesta en
marcha del procedimiento descrito anteriormente y que incluya
simultáneamente los elementos necesarios para la determinación y
visualización de la reacciones inmunocromatográficas (IC) entre
anticuerpos IgA (tira doble
\hbox{AGA/t-TG)}e IgG o IgM (tira anti t-TG IgA/G/M) característicos de enfermos celiacos con al menos dos antígenos inductores de la respuesta inmune de la EC.
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento de identificación de anticuerpos presentes en
pacientes con enfermedad celiaca mediante un sistema
inmunocromatográfico que valora de forma conjunta y simultánea la
presencia en una muestra biológica de anticuerpos -IgA, IgG o IgM
por separado en cada sistema- específicos de los autoantígenos
característicos de la EC AGA y t-TG.
Finalmente, un objeto de la presente invención lo
constituye el uso del sistema inmunocromatográfico y del
procedimiento de la presente invención para la identificación de
anticuerpos presentes en pacientes con enfermedad celiaca.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que la identificación conjunta y
simultánea de anticuerpos presentes en pacientes con enfermedad
celiaca es posible mediante un sistema inmunocromatográfico (tiras
inmunocromatográficas) con unos valores de sensibilidad y
especificidad mejores que realizados por separado y similares a los
obtenidos por otras técnicas inmunológicas, por ejemplo ELISA. Así,
la presencia de anticuerpos frente a distintos autoantígenos de la
EC, en concreto AGA y t-TG, ha podido ser
determinada en una misma tira inmunocromatográfica y con las mismas
condiciones de reacción; y para los casos en los que los pacientes
de EC presentan ausencia de IgA se ha desarrollado otra tira
inmunocromatográfica basada en el mismo autoantígeno
t-TG de la anterior tira.
Un objeto de la presente invención lo constituye
un sistema inmunocromatográfico doble que permita la puesta en
marcha del procedimiento descrito anteriormente y que incluya
simultáneamente los elementos necesarios para la determinación y
visualización de la reacciones inmunocromatográficas (IC) entre
anticuerpos característicos de enfermos celiacos con al menos dos
antígenos inductores de la respuesta inmune de la EC. En concreto,
dicho sistema inmunocromatográfico para el diagnóstico de
enfermedad celiaca en humanos está formado por los siguientes
elementos:
I) una tira inmunocromatográfica que permite la
identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos -tipo
IgA- específicos de los autoantígenos característicos de la EC AGA
y t-TG que comprende
- a)
- un sistema de visualización de la reacción, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con un anticuerpo monoclonal anti IgA,
- b)
- antígenos AGA y t-TG inmovilizados en la misma tira, y
- c)
- un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica, y,
II) tira inmunocromatografica que permite la
identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos
IgA/M/G frente al autoantígeno t-TG que
comprende
- a)
- un sistema de visualización de la reacción, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con antígeno t-TG,
- b)
- antígeno t-TG inmovilizados en la misma tira, y
- c)
- un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "muestra biológica" se refiere a una muestra biológica
tipo suero, plasma, saliva o sangre de un paciente sospechoso de
padecer EC.
El término "AGA" tal como se utiliza en la
presente invención se refiere a un extracto de proteínas obtenido
de uno o de una mezcla de varios cereales perteneciente al
siguiente grupo -trigo, cebada, centeno y avena- y que induce
anticuerpos en pacientes con EC.
\newpage
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "t-TG" se refiere a la proteína
transglutaminasa de origen animal o humana, sintética o recombinante
y también a fragmentos de dicha t-TG que induzcan
una respuesta inmunológica en pacientes con EC similar a la
obtenida con la t-TG completa.
Un objeto particular de la presente invención es
un sistema inmunocromatográfico en el que el antígeno AGA se ha
obtenido a partir de una variedad de cereal o mezcla de cereales
como por ejemplo trigo de la variedad Triana y el antígeno
t-TG es una t-TG humana recombinante
(ver Ejemplo 1).
Así, una realización particular de la presente
invención lo constituye una tira inmunocromatográfica de flujo
lateral doble como soporte inerte que determina y visualiza en una
única tira las reacciones IC entre IgA y AGA e IgA y
\hbox{t- TG}realizada según el ejemplo 1 a) y que comprende un sistema de visualización de la reacción (pj. partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas por un anticuerpo monoclonal frente a IgA humana), la inmovilización de los antígenos de EC AGA y t-TG (en este caso Rt.TG), un soporte inerte que permita el flujo de dichos elementos reconstituidos al añadir el suero o plasma, y un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica. Por otro lado, forman parte de la presente invención cualquier otra tira IC doble que pueda ser desarrollada a partir del estado de la técnica existente en el área de las técnicas inmunocromatográficas y conocido por los expertos.
Además, otra realización particular de la
presente invención lo constituye una tira inmunocromatográfica
(tira anti t-TG IgA/G/M, ver ejemplo 1b)) que
permite la determinación de anticuerpos IgA o IgG o IgM de
pacientes con EC frente al autoantígeno t-TG
utilizado en la tira doble AGA/t-TG comentada
anteriormente.
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento de identificación de anticuerpos presentes en
pacientes con enfermedad celiaca mediante un sistema
inmunocromatográfico que valora de forma conjunta y simultánea la
presencia en una muestra biológica de anticuerpos -IgA, además de
IgM o IgG por separado en cada tira inmunocromatográfica-
específicos de los autoantígenos característicos de la EC AGA y
t-TG mediante dos tiras inmunocromatográficas
distintas (tira doble AGA/t-TG y tira anti
t-TG IgA/G/M).
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye un procedimiento descrito anteriormente en el que en
lugar de realizarse simultáneamente la valoración de los
anticuerpos específicos de EC mediante las dos tiras
inmunocromatográficas se realiza en primer lugar el análisis de los
anticuerpos mediante la tira inmunocromatográfica doble
AGA/t-TG (Ejemplo 1a)) y en el caso de un resultado
negativo se realiza una segunda valoración de la presencia de
anticuerpos tipo IgA, IgG y IgM frente t-TG mediante
un sistema inmunocromatográfico sencillo (Ejemplo 1b).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un procedimiento según esta patente en el que la
reacción inmunocromatográfica desarrollada tiene lugar entre los
autoantígenos de EC dispuestos en la tira inmunocromatográfica AGA
y t-TG y anticuerpos IgG o IgM de la muestra
biológica separadamente. En estos casos, las partículas coloidales
o microesferas coloreadas de la tira doble estarían recubiertas por
un anticuerpo monoclonal que reconoce IgG o IgM humana,
respectivamente para cada una de las tiras.
Finalmente, un objeto de la presente invención lo
constituye el uso del sistema inmunocromatográfico constituido por
las tiras inmunocromatográficas y del procedimiento de la presente
invención para la identificación de anticuerpos (IgA, IgM o IgG)
presentes en pacientes con enfermedad celiaca.
Representación de las bandas visualizadas tras
los ensayos inmunocromatográficas con las tiras doble
(AGA-t TG) y sencilla (t TG (IgA/G/M). 1+, tira
positiva frente t TG mediante tira sencilla; 2+, tira negativa
frente t TG mediante tira sencilla; 3+ y 3-, comparación de una
tira sencilla y doble en un paciente con deficiencia de IgA; 4-,
tira negativa frente t TG-AGA en tira doble; 5+,
tira positiva frente AGA en una tira doble; 6+, tira positiva frente
a t TG en una tira doble; 7+, tira positiva frente AGA/t TG en una
tira doble.
El procedimiento desarrollado en la presente
invención se basa en unas tiras inmunocromatográficas de flujo
lateral producidas en la empresa Operón SA (Zaragoza, España). A
continuación se presentan los dos modelos de tiras elaboradas: a)
tiras frente a AGA y t-TG tipo IgA, y b) tiras
frente a t-TG IgA/G/M. Las tiras constan de varias
capas que aportan todos los reactivos necesarios en cada tipo.
Se trata de un test de tres bandas (ver Figura
1). Las muestras de suero humano, provenientes de enfermos de EC o
de casos control, se diluyen en una solución tamponadora que
contiene albúmina de suero bovino (BSA) y un detergente no iónico,
pudiéndose realizar dicha dilución bien en tubos "eppendorf",
bien en placas "microtiter". La tira o stick se introduce por
su región absorbente en la dilución 1/15 el suero tamponada
mencionada anteriormente. Si el suero del paciente presenta
anticuerpos tipo IgA frente a t-TG, gliadinas o
ambos cuando el líquido asciende por capilaridad (tira
inmunocromatográfica de flujo lateral) reconstituye unas
microesferas coloreadas situadas en esta región absorbente de la
tira y que en este caso están recubiertas por un anticuerpo
monoclonal frente a IgA humana. Una vez reconstituidas, el complejo
formado por las microesferas rojas recubiertas con anticuerpo
monoclonal frente a IgA humana, los anticuerpos (tipo IgA) frente a
la t-TG, o a las gliadinas, o frente a ambos
antígenos, asciende y reacciona de forma separada con 2 líneas
distintas (separadas físicamente), que contienen inmovilizados
tanto gliadinas purificadas (en una de ellas), como
t-TG humana recombinante (en la otra), lo que
resulta en una o dos bandas rojas, tras la reacción inmunológica
correspondiente, en distintos niveles, dependiendo de que el suero
presente anticuerpos (tipo IgA) frente a la t-TG,
frente a las gliadinas (AGA) o frente a ambos antígenos. En caso de
inmunorreactividad, además de la banda control en este ejemplo de
color azul, pasados unos 5-10 minutos se puede
desarrollar una banda en este ejemplo roja correspondiente a
t-TG, o a AGA, o dos bandas correspondiendo a
anticuerpos frente a AGA y a t-TG de tipo IgA. La
banda control de color azul aparece en lo alto del stick validando
el resultado de la prueba, la banda roja correspondiente a la
presencia de anticuerpos, tipo IgA, frente a las gliadinas (AGA)
aparece en el medio, y la banda roja que indica la presencia de
anticuerpos, tipo IgA, frente a la t-TG aparece en
la parte inferior del stick.
La banda de color azul es un control interno de
la tira inmunocromatográfica que indica que las condiciones
necesarias para la reacción antígeno-anticuerpo y su
posterior visualización han sido correctas.
La t-TG recombinante humana
(Rt-TG) se obtuvo de Diarect (Freiburg Alemania), y
la gliadina purificada fue aislada de una variedad de trigo,
variedad Triana, por los propios inventores en la Unidad de Gluten
del Centro Nacional de Biotecnología. Esta purificación se realizó
mediante una extracción etanólica, seguida de una concentración
usando ultrafiltración, y posterior liofilizado del extracto. El
anticuerpo monoclonal frente a IgA humana se produjo en Operón SA
(Zaragoza, España).
Con este tipo de tiras se probaron 248 sueros,
correspondiendo el 50% a pacientes con EC y el otro 50% a casos
control No EC. de igual manera que las de las tiras sencillas.
Se trata de una prueba de dos bandas. Los sticks
o tiras son introducidos bien en tubos "eppendorf" o en placas
"microtiter" que contengan una dilución 1:20, previamente
preparada, del suero de los pacientes a estudiar, con una solución
salina tamponadora a base de fosfatos (PBS) a pH y concentración
salina fisiológica con un 1% de albúmina de suero bovino (BSA;
bovine serum albumin). Al poner la tira dentro de la muestra
diluida, el líquido asciende por capilaridad y reconstituye las
microesferas coloreadas en rojo que se encontraban secas y
recubiertas con t-TG recombinante humana
(Rt-TG) si la muestra contiene anticuerpos frente a
la transglutaminasa tisular (t-TG). El complejo
formado por las microesferas rojas coloreadas, la
t-TG recombinante humana y los anticuerpos anti
t-TG presentes en la muestra del paciente, asciende
y alcanza una región que contiene una línea de t-TG
recombinante humana, provocando una inmunorreacción que da como
resultado una banda roja. Esa banda roja indica la presencia de
anticuerpos anti t-TG, tipo IgA, IgG o IgM, en la
muestra analizada. Como control del sistema, en la región absorbente
del stick también están situadas otras microesferas secas
coloreadas en azul recubiertas con una proteína determinada. El
complejo de las microesferas azules recubiertas de proteína,
reconstituidas, asciende por el stick hasta alcanzar una región en
la que existen inmovilizados unos anticuerpos monoclonales frente a
dicha proteína, reaccionando inmunológicamente y dando como
resultado una banda azul. Cuando el suero no es inmunorreactivo
sólo se desarrolla una banda de control azul, mientras que en caso
de inmunorreactividad, además de la banda azul, se desarrolla una
banda de resultados roja pasados uno 5-10
minutos.
En caso de no aparecer ninguna de las dos bandas
el análisis no es válido y habría que repetirlo usando otra nueva
tira. No se necesita equipamiento adicional para el desarrollo del
ensayo.
Los resultados obtenidos en las pruebas con los
dos tipos de tiras, doble y sencilla, se compararon con los
resultados obtenidos por ELISA para anticuerpos
anti-tTG y AGA.
En el caso de la tira de diagnóstico doble se
encontró una sensibilidad del 92.7% y 83.2%, con una especificidad
del 96.2% y del 96.7% para la t-TG y AGA,
respectivamente, cuando se analizaron los resultados de
t-TG y AGA por separado (Tabla I). Estos datos
mostraron una concordancia frente al ELISA del 99.3% y del 99.2%,
respectivamente. Por otro lado, hay que destacar que el análisis
conjunto de los resultados en una misma tira doble, es decir, número
de casos positivos frente a uno de los dos antígenos AGA y
t-TG por separado o ambos positivos, permitió
obtener valores de sensibilidad y especificidad mayores que los
observados por separado, 95.2% y 96.2% respectivamente. En concreto,
se observó que tres pacientes con EC con AGA positiva en la tira
doble eran t-TG negativos, quince pacientes con EC
con t-TG positivo eran AGA negativos y cien
pacientes con EC fueron positivos para AGA y t-TG.
Es decir, que la realización de una tira doble permitió identificar
tres pacientes con EC que hubieran sido posible identificar con un
análisis AGA o t-TG por separado (esto es lo que
incrementa la sensibilidad del 92.7% al 96.3%).
En los casos EC negativos frente a
AGA/t-TG obtenidos con la tira doble se analizó la
presencia de anticuerpos IgA/M/G frente a t-TG
realizando un ensayo inmunocromatográfico con la tira sencilla,
observándose un caso positivo frente a t-TG en el
que se confirmó además el déficit de IgA en este paciente mediante
la técnica de nefelometría. Una de las ventajas más destacables del
uso combinado de ambas tiras, doble y sencilla, es que permite la
detección de pacientes con déficit selectivo de IgA, y que
presentan EC, cuando la banda de la t-TG es
positiva en la tira sencilla, y negativa en la tira doble con lo que
la sensibilidad obtenida por ambas pruebas se incrementa (en
nuestro caso del 95.2% al 96%).
Tira Doble | Sensibilidad | Especificidad | Concordancia | Sueros |
AGA/t-TG (IgA) | (%) | (%) | (%) | (n) |
Interpretación por separado de AGA y t-TG | ||||
Tira t-TG (IgA) | 92.7 | 96.2 | ||
99.3 | 248 | |||
ELISA t-TG(IgA) | 93.6 | 95.27 | ||
Stick AGA (IgA) | 83.2 | 96.7 | ||
99.2 | 248 | |||
ELISA AGA (IgA) | 84.8 | 92.8 | ||
Interpretación conjunta de AGA y t-TG | ||||
Tira Doble * AGA/t- | ||||
95.2 | 96.7 | 248 | ||
TG(IgA) | ||||
99.2 | ||||
ELISA AGA (IgA)* | ||||
96.0 | 96.7 | 248 | ||
+ ELISA t-TG (IgA)* | ||||
\bullet Un solo Stick doble frente a dos test ELISA. |
Como se puede observar en la tabla, existe una
alta correlación entre los distintos ensayos visuales y los test
ELISA respectivos.
Los resultados obtenidos en los ensayos
inmunocromatográficos que presentamos muestran estos métodos como
extremadamente eficientes para el diagnóstico de la EC, lo que
unido a la facilidad, no es imprescindible un operario
especialmente cualificado, rapidez (no más de 10 minutos) de su
realización, y la no necesidad de equipamientos tecnológicamente
complejos, hacen del método una herramienta muy útil para
inspeccionar poblaciones de riesgo para EC y seleccionar candidatos
para la realización de una biopsia de intestino delgado.
Otra característica importante es que estas tiras
presentan unos valores mayores de sensibilidad y especificidad que
los ELISAs correspondientes de t-TG y AGA, siendo
extremadamente eficientes para el despistaje y diagnóstico de la
EC.
La tira doble AGA/t-TG determina
tanto AGA como t-TG, de tipo IgA, en un único
análisis, eliminando, por tanto, la necesidad de usar dos ELISAs
paralelos t-TG y AGA.
Ambas tiras son significativamente más baratas
que el ELISA, más simples de manejar e interpretar, y creemos que
estas características le pueden hacer un test ideal para el
diagnóstico de EC en grandes poblaciones, especialmente en países
en desarrollo.
Claims (5)
1. Sistema inmunocromatográfico para el
diagnóstico de enfermedad celiaca en humanos caracterizado
porque comprende los siguientes elementos:
I) una tira inmunocromatográfica que permite la
identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos -tipo
IgA- específicos de los autoantígenos característicos de la EC AGA
y t-TG que comprende
- d)
- un sistema de visualización de la reacción, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con un anticuerpo monoclonal anti IgA,
- e)
- antígenos AGA y t-TG inmovilizados en la misma tira, y
- f)
- un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica,
- y,
II) tira inmunocromatografica que permite la
identificación en una muestra biológica humana de anticuerpos
IgA/M/G frente al autoantígeno t-TG que
comprende
- d)
- un sistema de visualización de la reacción, por ejemplo, partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con antígeno t-TG,
- e)
- antígeno t-TG inmovilizados en la misma tira, y
- f)
- un sistema control de las condiciones de la propia reacción inmunocromatográfica.
2. Sistema inmuncromatográfico según la
reivindicación 1 caracterizado porque la
t-TG es una t-TG humana recombinante
y el AGA es un extracto de proteínas obtenida de una variedad de
trigo.
3. Procedimiento inmunocromatográfico de
identificación de anticuerpos presentes en pacientes con enfermedad
celiaca caracterizado porque se valora
- a)
- la presencia simultánea en una muestra biológica de anticuerpos -tipo IgA- específicos de los autoantígenos característicos de la EC AGA y t-TG mediante una tira inmunocromatográfica según la reivindicación 1 a), y
- b)
- la presencia en la misma muestra biológica de a) de anticuerpos IgA/M/G frente al autoantígeno t-TG mediante una tira inmunocromatográfica según la reivindicación 1 b).
4. Procedimiento según la reivindicación 3
caracterizado porque la muestra biológica consiste en suero,
plasma, saliva o sangre de un paciente sospechoso de padecer
EC.
5. Uso del sistema inmunocromatográfico según las
reivindicaciones 1 y 2 y del procedimiento según las
reivindicaciones 3 y 4 para la identificación de anticuerpos (IgA,
IgM o IgG) presentes en pacientes con enfermedad celiaca.
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