ES2327772T3 - Procedimiento para la determinacion de sustancias eliminadas por celulas detectables. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar la cantidad de sustancias secretadas por células detectables, especialmente para el diagnóstico y/o el seguimiento de la terapia de enfermedades, en el que las sustancias secretadas por las células se hacen visibles sobre al menos una superficie de ensayo de un soporte mediante moléculas de captura con ayuda de superficies coloreadas, de manera que las superficies son descompuestas en puntos individuales y estos últimos son elaborados, caracterizado por el hecho de que se mide cuantitativamente la intensidad de la coloración total sobre la superficie de ensayo, donde la superficie de ensayo es descompuesta en una multitud de puntos individuales, la intensidad de color de cada punto individual es medida por separado y los valores de intensidad medidos son adicionados y la coloración producida por las sustancias secretadas se disminuye en su intensidad por puntos individuales y/o se aumenta su extensión superficial.
Description
Procedimiento para la determinación de
sustancias eliminadas por células detectables.
La invención se refiere a un procedimiento para
determinar la cantidad de sustancias secretadas por células
detectables, especialmente para el diagnóstico y/o el seguimiento
de la terapia de enfermedades.
La prueba de inmunosorción enzimática ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay) es un
procedimiento de comprobación inmunológica para las más diversas
biomoléculas, particularmente para proteínas y hormonas. El
procedimiento ELISA clásico se realiza como un llamado
procedimiento sandwich con dos anticuerpos que son ambos altamente
específicos para el antígeno a comprobar, en el cual un anticuerpo
(anticuerpo de recubrimiento) es inmovilizado sobre un soporte fijo
y se añade un segundo anticuerpo (anticuerpo de detección),
particularmente en forma de un conjugado de enzimas que permite una
comprobación colorimétrica, después de una cierta fase de
incubación. Con ayuda del procedimiento ELISA pueden ser probadas
por consiguiente las sustancias secretadas por células, por lo cual
en muchos casos podría ser difícil un análisis cuantitativo y
también cualitativo de la actividad-intensidad
celular de la reacción celular ante una influencia exógena
determinada, por ejemplo a un antígeno.
Un desarrollo ulterior en vista de un dictamen
mejorado de la actividad celular representa el llamado
procedimiento ELISA-Spot (procedimiento ELIspot),
en el cual las moléculas de captura que pueden ligar sustancias
secretadas por células son inmovilizadas sobre un soporte. Debido a
la presencia simultánea de las sustancias ajenas estimulantes de
las células, particularmente los antígenos, se provoca la
segregación o separación de sustancias específicas de las células a
examinar, particularmente sustancias de defensa y/o sustancias
mensajeras, que son ligadas por las moléculas de captura
inmovilizadas y que pueden ser llevadas a una reacción coloreada que
refleje la actividad de una célula individual. Estos procedimientos
para la determinación de la actividad celular se basa en la
medición del número de células, a pesar del hecho de que células
individuales puedan reaccionar de manera muy diferente a la misma
sustancia ajena, lo que se manifiesta particularmente en la
cantidad de sustancias secretadas por las células. Así pueden darse
absolutamente unas diferenciaciones de calidades respecto a la
actividad de las células individuales, que no son captadas con el
procedimiento ELIspot convencional.
Por lo tanto en años anteriores se realizaron
grandes esfuerzos para desarrollar procedimientos inmunológicos que
permitieran obtener también un valor informativo de las actividades
celulares. De la patente DE 198 21 289 se puede deducir
particularmente un procedimiento perfeccionado, en el que se toma
en consideración la calidad de la actividad de las células
individuales por la determinación del tamaño de las superficies de
color producidas (Spots) sobre una superficie de ensayo. El
procedimiento se basa en el conocimiento de que las células más
activas producen spots más grande que las células menos activas y
que el tamaño de los spots es proporcional a la actividad de las
células individuales.
En la patente DE 103 52 678 A1 se describe otro
procedimiento eficaz, en el que la medición de la calidad de la
actividad de las células individuales se determina con ayuda del
tamaño y de la intensidad de los spots producidos sobre una
superficie examinada. Por consiguiente se tiene en cuenta la
circunstancia de que por ejemplo un spot pequeño que presenta una
coloración intensa refleja una reacción celular más fuerte que un
spot grande que tenga un color menos intenso. Sin embargo en tales
casos pueden darse ciertas dificultades en la evaluación de la
actividad celular siendo necesario un dictamen de calidad y
eventualmente una diferenciación de la calidad de los spots que
presentan intensidades de color que están por encima del valor
máximo de la intensidad de color técnicamente mensurable. En estos
casos, la actividad medida de las células no corresponde a su
actividad real, por lo cual pueden obtenerse resultados de medición
imprecisos. Pueden aparecer otros problemas particularmente en caso
de existir formaciones celulares (grupos), que puedan dar lugar a
coloraciones solapadas, de manera que en tales casos se complica
aún más una medición de la calidad de la actividad de células
individuales.
La invención tiene por consiguiente el objetivo
de proveer un procedimiento para determinar la actividad total de
células, que permita también un dictamen exacto y fiable de la
actividad celular total cuando se manifiesten superficies de
intenso coloreado y particularmente superficies de colores solapados
sobre una superficie de ensayo, particularmente en cuanto a la
calidad de la actividad total de las células sobre la superficie de
ensayo.
Objeto de la invención es un procedimiento para
determinar la cantidad de sustancias secretadas por células
detectables, especialmente para el diagnóstico y/o el seguimiento
de la terapia de enfermedades, en el cual sobre al menos una
superficie de ensayo de un soporte son visualizadas sustancias
secretadas por células mediante moléculas de captura con ayuda de
superficies coloreadas, descomponiendo las superficies en puntos
individuales y elaborando estos últimos, midiendo cuantitativamente
la intensidad de la coloración total sobre la superficie de
ensayo.
Bajo el concepto "actividad total" en el
sentido de la presente invención debe entenderse la intensidad
total de la reacción de todas las células sobre la superficie de
ensayo total a una influencia exógena definida, por ejemplo un
antígeno.
Bajo el concepto "terapia" en el sentido de
la presente invención deben entenderse tanto el tratamiento de
enfermedades, el tratamiento de alteraciones del estado de ánimo
que acompañan a las enfermedades así como las correspondientes
medidas preventivas.
Según la invención, la superficie de ensayo del
soporte se descompone en una multitud de puntos individuales, se
mide por separado la intensidad de color de cada punto individual y
se añaden los valores de intensidad medidos. Está previsto
especialmente que 1 a 2 millones, en particular aprox. 1,5 millones
de puntos de imagen (pixels) por superficie de ensayo son captados
por ejemplo por una cámara. Para medir la intensidad de color de un
punto individual sobre la superficie de ensayo hay disponibles
entre 200 y 300, particularmente entre 220 y 260 y preferiblemente
aprox. 256 graduaciones (escala de colores grisáceos). La
elaboración y evaluación de los pixels puede ser realizada
particularmente con un aparato de lectura. Se mide preferiblemente
el número total de pixels así como su intensidad con ayuda de un
analizador de imágenes. Por consiguiente es posible una medición de
la coloración total referida a la superficie de ensayo o una parte
determinada de la misma. Como valor de referencia puede servir un
punto incoloro sobre la superficie de ensayo, eventualmente también
de otra superficie de ensayo. La medida de la actividad total se
obtiene entonces del número de pixels (coloreados) estimulados,
multiplicado por la escala de color (por ejemplo la escala de
colores grisáceos entre 0 y 256) de cada pixel estimulado. El
producto es dividido convenientemente por 1000, para obtener valores
numéricos fácilmente manejables. La captación y evaluación de los
pixels se realiza preferiblemente desde arriba (sobre la superficie
de ensayo). La elaboración a una imagen bidimensional se realiza
preferiblemente con ayuda de técnicas informáticas.
En el procedimiento ELISA-Spot
conocido se pretende obtener las reacciones de color más intensas
posibles y concentradas en un spot, para que se pueda averiguar lo
mejor posible el número de células activas.
Por otro lado en el procedimiento adoptado se
reducen preferiblemente los componentes que participan en la
reacción de color en su cantidad y/o posición con respecto a las
condiciones habituales, particularmente en sus concentraciones,
para mantener también el máximo color de una reacción celular en
una zona cuantificable para la medición de la intensidad.
Según la invención se toman medidas, por las que
la coloración producida por las sustancias secretadas disminuye en
su intensidad por puntos individuales en comparación con el estado
de la técnica y/o aumenta en su extensión superficial, es decir el
número de los puntos individuales por célula. Debido al aumento de
la extensión superficial se debilita particularmente la coloración
por unidad de superficie y por consiguiente se ven más claras las
diferencias de coloración entre las superficies individuales y/o
dentro de una superficie mayor. El solapamiento de las superficies
de color de las sustancias secretadas por las células no perturba.
De esta manera se llevan las intensidades de color de los puntos
individuales en el sector técnicamente mensurable. Por
consiguiente, las superficies intensamente coloreadas, cuyas
intensidades han sobrepasado el valor máximo técnicamente
comprobable, pueden pasarse a una medición de diferenciación,
considerando particularmente la cantidad y la calidad de la
reacción celular con ayuda de la cantidad de sustancias secretadas,
mediante el procedimiento según la invención, debido a la mayor
extensión superficial. Una medición de la intensidad de color
efectuada a continuación sobre la superficie coloreada produce por
consiguiente resultados precisos y por lo tanto reproducibles en
cuanto a la actividad total de las células. Mediante el
procedimiento es por lo tanto también posible medir particularmente
la actividad total de estructuras celulares que pueden dar lugar a
superficies de color solapadas sobre la superficie de ensayo. En
este caso ya no importa un contaje de las células activas.
Según la invención es especialmente preferible
que se use un material de soporte que presente poca afinidad con
las moléculas de captura, para un enlace de las moléculas de
captura sobre el soporte. La afinidad es preferiblemente una
afinidad de enlace que puede establecerse particularmente por
enlaces covalentes, interacciones electroestáticas, enlaces de
puentes de hidrógeno y/o interacciones hidrófobas, particularmente
las fuerzas de Van-der-Waals. La
poca afinidad del material de soporte a las moléculas de captura
provoca un número pequeño de moléculas de captura inmovilizadas
sobre la superficie de ensayo, por lo cual las sustancias
secretadas por las células pueden recorrer un trayecto de difusión
más largo sobre la superficie de ensayo, antes de que reaccionen
con las moléculas de captura y se hagan visibles por una reacción
coloreada adecuada. Las vías de difusión prolongadas de las
sustancias secretadas provocan la coloración más débil por unidad
de superficie ya descrita arriba y por ello dan lugar a resultados
de medición más exactos y más fiables.
Como material de soporte apropiado puede usarse
particularmente el poliestireno, difluoruro de polivinilideno
(PVDF), nitrocelulosa o nylon, siendo especialmente preferido el
poliestireno debido a su poca afinidad de enlace a las moléculas de
captura. En el caso del poliestireno se puede tratar
particularmente de un poliestireno inyectado o fundido. Son
adecuados especialmente las placas de 96 pocillos de
poliestireno.
En otra forma de realización del procedimiento
según la invención, como otra medida de reducción de la intensidad
por punto individual y de aumento de la extensión superficial, se
puede trabajar con una concentración reducida en moléculas de
captura. Así, en el procedimiento ELIspot se trabaja
particularmente con una concentración de moléculas de captura de
aprox. 5 \mug/ml. Utilizando concentraciones más escasas se
inmoviliza una cantidad más pequeña de moléculas de captura sobre
la superficie de ensayo, por lo cual surgen spots más grandes con
diferencias de coloración claras sobre la superficie de ensayo.
Ventajosamente el tiempo de incubación tiene lugar de 4 a 18 horas
después de la ocupación del soporte con las moléculas de captura.
Una vez efectuada la incubación se lavan las moléculas de captura
sobrantes no inmovilizadas por el soporte.
Según la invención es particularmente preferido
que durante la ocupación del soporte se trabaje con una
concentración en moléculas de captura de 2 a 3 \mug/ml,
particularmente de aprox. 2,5 \mug/ml, por 20 mm^{2}.
Preferiblemente se inmovilizan aprox. 1 \mug de moléculas de
captura sobre la superficie de ensayo del soporte.
En otra forma de realización especialmente
preferida del procedimiento según la invención, la reducción de la
intensidad de los puntos individuales de la coloración debida a las
sustancias secretadas así como al aumento de la extensión
superficial puede producirse tanto por una reducción de la
concentración de las moléculas de captura como también por la
utilización de un material de soporte con poca afinidad a las
moléculas de captura, particularmente el poliestireno.
En algunos casos puede ser deseable medir, en su
caso adicionalmente a la medición de la intensidad de color total,
el número de células activas, por lo cual puede darse la dificultad
de que las células presentes en una estructura celular no sean
captables individualmente, debido a su enlace funcional y/o
estructural y por el solapamiento de coloración recíproco. En este
caso puede preverse que el número de células, particularmente en
una estructura celular, con secreción de sustancias detectables en
caso de coloraciones solapadas recíprocamente, sea determinado de
manera que en cada caso se determinen los máximos de color (valores
máximos de intensidad de color) a atribuir a las células
individuales y estos sean contados.
Preferiblemente en el procedimiento se utilizan
células eucarióticas, especialmente células humanas y/o animales,
obteniendo las células preferiblemente del organismo vivo. Las
células son particularmente células sanguíneas, por ejemplo células
inmunocompetentes, preferiblemente linfocitos, células T,
particularmente células ayudantes T (células T_{H}), y/o células
dendríticas, particularmente células que presentan antígenos, por
ejemplo macrófagos. Preferiblemente en el procedimiento se usan
células ayudantes T, particularmente células T_{H1} y
T_{H2}.
Está previsto además que las células sean
enriquecidas antes de la medición, particularmente antes de la
fijación, sobre la superficie de ensayo del soporte. El
enriquecimiento de las células puede tener lugar por ejemplo con
ayuda de la centrifugación, particularmente en un gradiente de
azúcar. De esta manera es particularmente posible separar los
eritrocitos pesados de las células inmunocompetentes más
ligeras.
Está previsto particularmente que las células
sean lavadas antes de la aplicación sobre la superficie de ensayo
del soporte, particularmente en una solución tamponada. Las células
en particular se recuentan. Las células son depositadas
preferiblemente en forma de una capa simple (monocapa) sobre la
superficie de ensayo del soporte.
Como moléculas de captura se usan ventajosamente
las moléculas orientadas contra las sustancias secretadas por las
células. Preferiblemente en lo que concierne las moléculas de
captura, éstas son proteínas, preferiblemente anticuerpos. Las
moléculas de captura pueden presentar particularmente marcaciones
que permitan una verificación colorimétrica. Preferiblemente las
moléculas de captura, particularmente los anticuerpos, son los
llamados conjugados que presentan una proteína apropiada para la
verificación colorimétrica, en particular una enzima,
preferiblemente fosfatasa alcalina o peroxidasa, por ejemplo una
peroxidasa de rábano picante.
En una forma de realización avanzada del
procedimiento pueden usarse como moléculas de captura unos
conjugados con oro o plata, preferiblemente plata. Las marcaciones
de oro o plata de las moléculas de captura pueden ser usadas en el
marco de los procedimientos de comprobación usuales del experto,
por ejemplo procedimientos inmuno-oro, para generar
superficies coloreadas sobre la superficie de ensayo del soporte.
Preferiblemente se usan conjugados de anticuerpos con oro o plata,
preferiblemente plata. Como coloración se entienden radiaciones que
se distinguen de aquellas del fondo. A ellas pertenecen también
coloraciones negras, blancas o grises así como radiaciones no
visibles.
En una forma de realización preferida, para la
visualización de las sustancias secretadas por las células, se usan
moléculas de detección junto a las moléculas de captura. Las
moléculas de detección son preferiblemente anticuerpos. Las
moléculas de detección son conjugadas convenientemente con
compuestos que permitan una verificación colorimétrica. Los
compuestos son particularmente proteínas, preferiblemente enzimas.
Entonces las moléculas de detección pueden ser conjugadas por
ejemplo con fosfatasa o peroxidasa, en particular con peroxidasa de
rábano picante. Las moléculas de detección pueden ser conjugadas
además con oro o plata. Con respecto a otros detalles y
características se hace referencia a la descripción precedente.
En otra forma de realización se coloca un
reactivo de color del procedimiento sobre las células fijadas sobre
la superficie de ensayo del soporte. Preferiblemente el reactivo de
color es un substrato de una enzima conjugado con la molécula de
captura, particularmente un paranitrofenilfosfato, carbazol o
bromocloro-indolil-fosfato. Dichas
formas de realización para producir una reacción coloreada son
conocidas por el experto, de modo que no se hace una descripción
detallada en este punto.
En una configuración avanzada del procedimiento,
las sustancias secretadas son particularmente sustancias
mensajeras, preferiblemente citoquinas. Según la invención es
especialmente preferido que las sustancias secretadas sean al menos
un representante del grupo consistente en interleuquina 2,
interleuquina 4, interleuquina 5, interleuquina 10, interferón
gamma y/o TNF\beta (Factor de necrosis tumoral \beta), siendo
especialmente preferido el interferón gamma según la presente
invención.
La secreción de las sustancias es motivada
especialmente por las sustancias ajenas inmunológicas, los llamados
antígenos, sobre la superficie de ensayo. Los antígenos pueden ser
particularmente patógenos completos, por ejemplo virus y/o
bacterias. En una forma de realización especial del procedimiento,
los antígenos son los llamados epítopes (fragmentos),
particularmente de péptidos, por ejemplo con una longitud de
aminoácidos de 9 a 11 aminoácidos. Adicionalmente, debido a la
presencia de células dendríticas, particularmente los macrófagos,
pueden producirse epítopes sobre la superficie de ensayo debido a
la fagocitosis de patógenos completos, que se presentan
preferiblemente sobre la superficie de células que presentan los
llamados antígenos.
La superficie de ensayo del soporte es
preferiblemente plana. Esto es especialmente preferido, puesto que
de esta manera pueden evitarse modificaciones de concentración
locales sobre la placa de análisis. Además, la superficie de ensayo
puede ser particularmente una superficie redonda, por ejemplo el
fondo perforado de una placa perforada. Las placas perforadas son
placas de microtitulación comercialmente disponibles, que pueden
presentar un número diferente de agujeros (cavidades o pocillos).
Preferiblemente se usa dentro del marco del procedimiento según la
invención una placa perforada con 96 agujeros (placa de 96
pocillos).
Las placas de 96 pocillos tienen preferiblemente
un diámetro de pocillo de aprox. 5 mm en el fondo, lo que
corresponde a una superficie de base de aproximadamente 20
mm^{2}. En algunos casos puede ser necesario trabajar con
superficies de ensayo más pequeñas. Según la invención puede
preverse emplear superficies de base que sean menores de 15
mm^{2}, particularmente menores de 10 mm^{2}. La superficie
preferida de 20 mm^{2} sirve particularmente para permitir el
acceso de los equipos desarrollados para las placas perforadas
habituales, particularmente placas de 96 pocillos, especialmente
para el llenado, el lavado, la extracción y la medición
automáticos.
Las enfermedades que pueden ser diagnosticadas
con ayuda del procedimiento y/o cuyo transcurso puede ser
observado, son particularmente enfermedades infecciosas,
enfermedades autoinmunes y/o alergias. Preferiblemente, las
enfermedades infecciosas son la tuberculosis, el virus citomegálico
(CMV), la borreliosis, el virus de Eppstein-Barr
(EBV), herpes, gripe y/o hepatitis C. Las enfermedades autoinmunes
son preferiblemente la artritis reumatoide.
El procedimiento según la invención permite, al
influir particularmente en la disminución de las intensidades de
las superficies coloreadas así como al aumentar la extensión
superficial de las superficies coloreadas sobre la superficie de
ensayo, un dictamen exacto y fiable particularmente de la actividad
total cuantitativa de células. Debido al valor significativo
cuantitativo mejorado de los resultados de medición puede
realizarse una estimación mejorada del llamado estado inmunológico
de un paciente. Así se puede determinar particularmente, con ayuda
del procedimiento, si los afectados presentan una infección aguda o
una infección ya reminiscente o incluso padecen una enfermedad
crónica. Con ayuda del procedimiento es posible además determinar
la actividad total de enlaces celulares. Otra ventaja resulta del
hecho de que el procedimiento según la invención pueda realizarse
con concentraciones reducidas de moléculas de captura,
particularmente anticuerpos caros.
Sobre el fondo perforado (diámetro: 20 mm^{2}
se añade aprox. 2,5 \mug de un anticuerpo que es conjugado con
fosfatasa alcalina. La incubación tiene lugar a 37ºC durante 4 a 12
horas, preferiblemente por la noche. A continuación, los
anticuerpos no ligados son lavados del fondo de la placa perforada
de una placa de 96 pocillos, encontrándose luego aprox. 1 \mug de
anticuerpos en cada fondo perforado. A continuación se pone aprox.
50 \mul de una fracción celular purificada (con ayuda de la
centrifugación) sobre el fondo perforado. Esto produce una capa
monocapa de aprox. 200.000 células por pocillo. La incubación con
una suspensión de antígenos de 50 \mul tiene lugar igualmente a
37ºC durante 18 horas, preferiblemente por la noche. Después de la
adición de p-Nitrofenilfosfato se determina la
actividad de todas las células sobre la superficie de ensayo con
ayuda de la coloración total producida.
Para detectar el estado inmunológico con
presencia de una tuberculosis se hacen en total 8 estimaciones,
donde la 1ª solución de estimación corresponde al valor del blanco
(ninguna actividad: aprox. 0 a 200 unidades). La 2ª solución de
estimación contiene el antígeno de fitolaca, que estimula aprox. el
0,5 a 2% de todas las células T presentes sobre la superficie de
ensayo. Una actividad medida de aprox. 100.000 corresponde a la
actividad a observar en un paciente que tenga un sistema
inmunitario que normalmente funciona bien. Si se mide una actividad
inferior a 60.000, el paciente padece una inmunodebilidad. Este
pronóstico es especialmente significativo, puesto que muchos
pacientes de tuberculosis padecen una supresión inmunológica a
consecuencia de la terapia. La 3ª solución de estimación contiene el
antígeno de micobacterias. Una actividad medida de hasta 500 indica
que el paciente presenta tuberculosis negativa. Por lo demás no es
demostrable ninguna protección por una vacunación anterior. Una
actividad medida de más de 1.000 indica una tuberculosis en el
afectado. La 4ª solución de estimación contiene los antígenos de
tuberculosis ESAT6 y CFP10. Una actividad negativa puede significar
la no presencia de tuberculosis aguda o latente, donde se deduce una
tuberculosis latente de una actividad de hasta aprox. 800
(actividad escasa). Alternativamente puede dictaminarse el
resultado también como una tuberculosis ya desaparecida. Por
consiguiente es posible diagnosticar formas de tuberculosis
latente. Una actividad por encima de 1.000 demuestra por lo
contrario una tuberculosis obvia, supuestamente una infección aguda.
Las soluciones estimadas 5, 6 y 7 son respectivamente la misma
solución que en la solución 4 (las llamadas soluciones de
repetición). La solución 8 sirve de valor del blanco u otros
controles.
Para detectar el estado inmune para un control
exitoso en una vacunación se realizan igualmente 8 estimaciones. La
solución 1ª corresponde al valor del blanco (ninguna actividad:
aprox. 0 a 200 unidades, corresponde a un valor del blanco bueno).
La solución 2 contiene antígenos de fitolaca. La solución 3
presenta una mezcla de virus citomegálico, virus de
Eppstein-Barr y antígenos de Flue influenza (CEF),
que suscita en muchos pacientes una respuesta inmune específica
inducida por T_{H-1}, puesto que la mayoría de las
personas estaban infectadas ya una vez con al menos uno de los
agentes patógenos arriba citados. Una actividad medida de hasta 500
indica que el paciente es negativo con respecto a los patógenos
conteniendo CEF y tampoco ha padecido una infección anterior. Una
actividad medida superior a 1.000 indica que el sistema inmunitario
del afectado ha reaccionado específicamente a al menos uno de los
agentes patógenos contenidos en CEV. La 4ª solución de estimación
contiene los componentes de la vacuna, donde una actividad negativa
justifica un éxito de vacunación fallido. Una actividad medida
hasta 800 (actividad escasa) indica un éxito de vacunación solamente
escaso, que supuestamente no proporciona ninguna protección eficaz
por vacunación. Una actividad medida por encima de 1.000 indica una
protección por vacunación. En lo que concierne las soluciones de
estimación 5, 6 y 7 se trata de las llamadas soluciones de
repetición. La solución de estimación 8 puede servir de valor del
blanco u otro control.
Para detectar el estado inmunológico durante la
medición de la funcionalidad normal del sistema inmunitario se
efectúan en total 8 estimaciones. La 1ª solución sirve de valor del
blanco. La solución 2 contiene el antígeno de fitolaca. La solución
3 puede contener una agrupación de péptidos virulenta, por ejemplo
del virus de Eppstein-Barr (EBV) y del virus
citomegálico (CMV), donde una actividad medida de más de 1.000
demuestra una activabilidad buena y una actividad medida de menos
de 1.000 justifica una respuesta inmunológica débil contra los
virus arriba citados. La solución 4 contiene los antígenos
completos EBV y CMV (virus enteros), donde una actividad medida de
aprox. 800 justifica una respuesta positiva escasa a los virus
citados. Una actividad medida de más de 1.000 indica una reacción
clara a EBV y CMV. Si se mide en la solución 3 una actividad alta y
en la solución 4 sin embargo una actividad solamente débil o
incluso una actividad negativa, entonces se puede deducir un
defecto inmunológico que afecta la facultad de procesamiento
(fagocitosis de antígenos completos, digestión del antígeno
completo con respecto a epítopes así como su presentación en la
superficie de las llamadas células que presentan antígenos). Esto
significa que particularmente la función de las células dendríticas
está alterada. La solución 5 contiene antígenos bacterianos, por
ejemplo el derivado proteico purificado PPD, tuberculina (Purified
Protein Derivative, Tuberkulin) o el toxoide tétano. La solución
puede servir de control para la reactividad contra bacterias, donde
se debe adoptar un dictamen análogo como en la solución 4. La
solución 6 contiene antígenos de hongos, por ejemplo de cándida o
aspergillus, y sirve de control del sistema inmunitario sobre la
reactividad contra hongos o levaduras. La solución 7 contiene por
ejemplo un alérgeno. La solución 8 sirve para medir la actividad
celular de las células asesinas naturales NK (Natural Killer), en la
que son utilizados los llamados esfingolípidos para la estimulación
(solamente estimulan las células NK) o se utilizan anticuerpos
activadores de las células NK. Con ayuda de la solución 8 pueden
evaluarse las respuestas inmunológicas a células degeneradas.
Se efectúan en total 8 soluciones, para
determinar el estado inmunológico para la medición de la
funcionalidad. La solución 1 corresponde al valor del blanco. La
solución 2 contiene el antígeno de fitolaca. La solución 3 presenta
una agrupación de péptidos provenientes del virus de
Eppstein-Barr y sirve para la verificación de una
respuesta inmunológica a los viruses y autoantígenos, donde una
actividad medida superior a 1.000 justifica una activabilidad buena
y posiblemente una enfermedad autoinmunológica. La solución 4
contiene péptidos EBV que representan autoantígenos, donde una
actividad medida por encima de 1.000 justifica una respuesta
autoinmunológica unívoca, mientras que una actividad por debajo de
800 indica una respuesta autoinmunológica positiva solamente
escasa. Las soluciones 5 y 6 corresponden a las soluciones 3 y 4,
pero pueden ser incubadas eventualmente también con otros
antígenos. En el caso de la solución 7 se utiliza un antígeno
especial, que es individual para el afectado, por ejemplo una
proteína de choque térmico. La solución 8 sirve para la medición del
antígeno especial CCP (péptido citrulinado cíclico).
Se efectúan en total 8 soluciones para detectar
el estado inmunológico, donde la solución 1 sirve de valor del
blanco. La solución 2 presenta el antígeno de fitolaca. La solución
3 presenta antígenos especiales, por ejemplo antígenos de hepatitis
C. Una actividad medida por encima de 1.000 justifica una respuesta
unívoca a los antígenos, mientras que una actividad medida por
debajo de 800 demuestra solamente una respuesta positiva escasa. La
solución 4 corresponde a la solución 3, donde la interleuquina 4 y
la interleuquina 5 son medidas como sustancias secretadas y se
verifica una respuesta positiva a partir de una actividad medida de
aprox. 300. La solución 5 corresponde a la solución 3, donde
solamente la interleuquina 10 es medida como sustancia secretada y
se puede hablar de una respuesta positiva a partir de una actividad
medida de 2.000. Las soluciones 6, 7 y 8 corresponden a las
soluciones 3, 4 y 5. En lo que concierne las interleuquinas 4, 5 y
10 se trata de las llamadas citoquinas suprimidas. Si hay más
citoquinas en comparación con el interferón gamma, entonces el
sistema inmunitario está totalmente suprimido y aumenta el riesgo
de una infección crónica.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de los documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
- \bullet DE 19821289 A1 [0004]
- \bullet DE 10352678 A1 [0005]
Claims (7)
1. Procedimiento para determinar la cantidad de
sustancias secretadas por células detectables, especialmente para
el diagnóstico y/o el seguimiento de la terapia de enfermedades, en
el que las sustancias secretadas por las células se hacen visibles
sobre al menos una superficie de ensayo de un soporte mediante
moléculas de captura con ayuda de superficies coloreadas, de manera
que las superficies son descompuestas en puntos individuales y
estos últimos son elaborados, caracterizado por el hecho de
que se mide cuantitativamente la intensidad de la coloración total
sobre la superficie de ensayo, donde la superficie de ensayo es
descompuesta en una multitud de puntos individuales, la intensidad
de color de cada punto individual es medida por separado y los
valores de intensidad medidos son adicionados y la coloración
producida por las sustancias secretadas se disminuye en su
intensidad por puntos individuales y/o se aumenta su extensión
superficial.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que para un enlace de las
moléculas de captura al soporte se usa un material de soporte que
presenta poca afinidad para las moléculas de captura, donde se usa
como material de soporte el poliestireno, difluoruro de polivinilio
(PVDF), nitrocelulosa o nylon, preferiblemente el poliestireno.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado por el hecho de que en la ocupación del
soporte se trabaja con una concentración de moléculas de captura de
2 a 3 \mug/ml, particularmente de aprox. 2,5 \mug/ml.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que se ligan aprox. 1 \mug de moléculas de captura sobre la
superficie de ensayo, particularmente sobre el fondo perforado de
una placa de 96 pocillos.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que para la visualizar las sustancias secretadas por las células se
usan las moléculas de detección además de las moléculas de
captura.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que en lo que concierne las sustancias secretadas por las células,
éstas son al menos un representante del grupo consistente en
interleuquina 2, interleuquina 4, interleuquina 5, interleuquina
10, interferón \gamma y/o TNF\beta (Factor de necrosis tumoral
beta), preferiblemente el interferón \gamma.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que en lo que concierne las enfermedades, éstas son tuberculosis,
CMV (virus citomegálico), borreliosis, EBV (Virus de
Eppstein-Barr), herpes, gripe y/o hepatitis C.
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