ES2215301T3 - Aparato para la diagnosis de alergias. - Google Patents
Aparato para la diagnosis de alergias.Info
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- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
Abstract
Se presenta un aparato para la comprobación analítica de inmunoensayos para la diagnosis de alergias, el aparato comprende una zona para recibir una muestra que contiene un analito, una zona para recibir una fase noble (la zona puede ser la misma que la zona de recepción de la muestra o una zona diferente), un medio de detección para permitir la detección del analito mediante inmunorreación, una primera trayectoria de flujo para el flujo del analito en la fase móvil desde la zona de recepción de la muestra hasta el medio de detección y una segunda trayectoria de flujo que permite el flujo de una fase móvil hasta el medio de detección.
Description
Aparato para la diagnosis de alergias.
La presente invención se refiere a un aparato
para la diagnosis de alergias.
En concreto, la invención se refiere a un aparato
de inmunoanálisis que no requiere equipamiento de laboratorio
sofisticado o conocimientos técnicos y es adecuado para su uso en
casa o en la consulta del médico.
Varios equipos que utilizan tecnología para
ensayos inmunológicos (principalmente para pruebas de embarazo o
pronóstico de fertilidad) son fáciles de obtener para su uso en
casa o en la consulta de un médico. El formato de la técnica para
ensayos inmunológicos en dichos equipos es similar en general,
utilizando tiras de prueba que contienen un reactivo inmunológico
inmovilizado y que requieren que el usuario proporcione y aplique
una muestra de un fluido corporal predeterminado. Algunos aparatos
que utilizan orina como fuente del analito no requieren más
intervención que la aplicación de la muestra en el aparato. Ésta
sería una situación ideal en la que la orina no sólo contiene el
analito sino que también actúa como el componente fluido de una fase
móvil, la cual inicia la reacción química dentro del aparato. Sin
embargo, puede que otras muestras no estén fácilmente disponibles
en volúmenes tan abundantes. Para aplicaciones donde la orina no
sea apropiada, se requiere generalmente una muestra de sangre,
aunque también se pueden utilizar otros fluidos corporales, por
ejemplo, saliva o lágrimas. Por razones prácticas y éticas, los
aparatos que son diseñados para su uso en casa y que requieren una
muestra de sangre deben funcionar con una muestra capilar de un
volumen generalmente inferior a unos cuantos cientos de
microlitros.
Para la mayoría de los aparatos, debido a
limitaciones físicas tales como las propiedades de flujo, este
volumen es insuficiente para iniciar la reacción química y permitir
que el proceso continúe. Entonces se deben añadir componentes
fluidos adicionales al equipo para poder obtener una fase móvil.
Esta fase móvil se puede contener dentro de un compartimento en el
interior del aparato, de donde se libera o bien mediante
intervención física por parte del usuario, o mediante una
interacción química de la muestra con una barrera física que separa
la fase móvil de los reactivos inmunológicos. La fase móvil también
podría ser añadida desde un contenedor independiente a un
receptáculo en el mismo aparato. Por supuesto, cuantos más pasos se
necesiten para operar el equipo, la posibilidad de que el usuario
cometa un error es mayor y menor la probabilidad de obtener un
resultado correcto.
Para algunas circunstancias médicas es importante
obtener un rápido resultado de la prueba. Por ejemplo, puede ser
necesario obtener un resultado a los pocos minutos de la aplicación
de la muestra en las pruebas a utilizar en situaciones de
emergencia, mientras que en otras circunstancias puede que no sea
necesario obtener un resultado en pocos minutos.
EP0314499 revela un aparato de prueba
cromatográfica para detectar la presencia de un analito en una
muestra de líquido. El aparato tiene al menos dos zonas conductoras
de líquidos que forman trayectorias de flujo líquido
independientes, las cuales llevan corrientes de líquidos
independientes hasta una zona de reacción. EP0186799 revela un
aparato de diagnóstico similar, en el cual un fluido biológico es
puesto en contacto con un sector funcional específico del aparato,
migrando dicho fluido a través de varios sectores funcionales
situados uno junto al otro y conteniendo componentes reactivos
adecuados.
EP0590695 revela un aparato de transferencia de
líquidos de un solo uso para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico
bioquímico. El aparato comprende dos conductos de flujo líquido que
llevan desde un par respectivo de extremos de los conductos a un
emplazamiento en una porción de conducto común en la que se juntan
los conductos, y operable para transportar líquido a este
emplazamiento de una forma secuencialmente prevista tras la
aplicación simultánea de dicho líquido en los extremos del
conducto. WO9517676 revela un aparato para separación y detección
de moléculas objetivo en una muestra de líquido.
El aparato disponible actualmente es a menudo no
secuencial por naturaleza, o sea, la reacción supone un único paso.
Sin embargo, uno de los principales problemas con los equipos de
prueba inmunométricos no secuenciales es la aparición de un
fenómeno llamado un "efecto de gancho de dosis alta". El
efecto de gancho de dosis alta es evidente cuando elevados niveles
de anfígeno en el sistema saturan el ensayo. Ello es debido a que
se queda analito suelto en la muestra después de que todo el
reactivo inmunológico marcado disponible haya reaccionado y por la
insuficiente capacidad de enlace del inmunoadsorbente para la
cantidad de analito complejo y suelto en el sistema. Este analito no
marcado puede en ese caso competir a lo largo de la corriente por
el reactivo inmunológico inmovilizado. En algunos casos, cuando hay
una gran cantidad de analito en la muestra, se pueden obtener
falsos resultados negativos debido simplemente a la saturación del
inmunoadsorbente e reactivo inmunológico marcado. Estos falsos
resultados negativos, o anormalmente bajos, pueden influir en las
decisiones sobre el tratamiento que realice el usuario o clínico.
Esto no ocurre si hay suficiente inmunoadsorbente presente. Sin
embargo, hay limitaciones a la capacidad de enlace de un
inmunoadsorbente, y generalmente no es práctico aumentar la
cantidad de reactivo inmunológico en el sistema para superar el
efecto de gancho de dosis alta, ya que ello hará que aumente el
enlace no específico del reactivo inmunológico marcado, reduciendo
de este modo la sensibilidad analítica del ensayo, dando lugar a
una interpretación (en blanco) de referencia elevada. En ensayos
inmunológicos convencionales de laboratorio, este problema se
supera llevando a cabo ensayos secuenciales, con pasos de lavado
diferenciados entre cada adición de muestra y reactivo
inmunológico. Ensayos inmunométricos secuenciales pueden ser
realizados fácilmente en un laboratorio. Por ejemplo, se puede
hacer reaccionar una muestra que contiene analito con un reactivo
inmunológico inmovilizado específico para el analito en cuestión.
Después de un periodo de incubación predeterminado, cualquier
analito suelto en la muestra puede ser arrastrado, generalmente
mediante una combinación de decantación y lavado. A continuación se
añaden los reactivos inmunológicos marcados. Otro método para
sortear el efecto de gancho de dosis alta, y evitar el formato
secuencial, sería la utilización de un formato de ensayo
competitivo. Sin embargo, esto no es lo ideal. Por ejemplo, con
tales ensayos, la precisión depende en gran manera de la región de
la curva de respuesta a la dosis que es examinada. En contraste con
los ensayos inmunométricos, la respuesta en ensayos competitivos es
inversamente proporcional a la respuesta – o sea, se obtiene una
señal inferior con altas concentraciones de analito. Por lo
general, esto no es una característica preferida para un equipo de
prueba casero donde la ausencia de una señal confiere un resultado
positivo. Una forma preferible para evitar el efecto de gancho de
dosis alta a la vez que se mantiene un formato de ensayo aceptable
es un enfoque de ensayo inmunométrico secuencial. Sin embargo, la
necesidad de una adición independiente de reactivos por el usuario
y los pasos intermedios de lavado diferenciados harían que dicho
aparato de prueba fuera demasiado engorroso para su utilización en
casa o en la consulta.
La presente invención pretende superar los
problemas asociados con los ensayos inmunométricos no secuenciales
proporcionando un aparato de autodiagnosis que puede utilizar un
método de inmunoanálisis secuencial, pero que no requiere
sofisticado equipamiento de laboratorio o conocimiento técnico.
Es un objeto de la presente invención para
proporcionar un aparato de autodiagnosis utilizando tecnología de
ensayos inmunológicos, el cual es especialmente útil para la medida
de la inmunoglobulina humana antígeno- específica E (IgE), como en
la diagnosis de la alergia, pero que puede ser utilizado también
para otros analitos e isótopos.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un aparato para pruebas analíticas de ensayos
inmunológicos para examinar la presencia de un analito en una
muestra de fluido corporal obtenido de un sujeto animal (en
concreto un sujeto humano), comprendiendo dicho aparato:
- (a)
- un primer canal de flujo que incluye una zona receptora de la muestra para recibir dicha muestra;
- (b)
- un segundo canal de flujo que incluye material inmunoreactivo marcado no inmovilizado que puede reaccionar con dicho analito;
- (c)
- una zona receptora de una fase móvil para recibir una fase móvil, estando dicha zona receptora de fase móvil en comunicación con los mencionados primer y segundo canales de flujo; y
- (d)
- una zona de detección que incluye un inmunoadsorbente para unir dicho analito cuando dicho analito está presente en la muestra;
donde dicho primer canal de flujo está dispuesto
y configurado para permitir el flujo de dicha muestra en dicha fase
móvil desde dicha zona de recepción de la muestra a la mencionada
zona de detección, el cual permite que cuando dicho analito esté
presente en la muestra, se una sustancialmente con dicho
inmunoabsorbente, y el mencionado segundo canal de flujo está
dispuesto y configurado para permitir el flujo de dicho material
inmunoreactivo marcado en dicha fase móvil a dicha zona de
detección esencialmente después de que dicha muestra haya llegado a
dicha zona de detección, donde se permite que dicho material
inmunoreactivo se una sustancialmente a dicho analito cuando dicho
analito se ha unido a dicho inmunoabsorbente, de forma que se
proporcione una señal de la presencia de dicho analito en dicha
muestra.
Los susodichos problemas asociados con ensayos
inmunométricos no secuenciales pueden ser superados permitiendo que
el analito llegue a la zona de detección, donde es inmunoextraído
por un inmunoabsorbente, antes de que una cantidad sustancial de
material inmunoreactivo marcado llegue a la zona de detección.
De acuerdo con una primera materialización de la
presente invención, esto se puede lograr proporcionando una zona de
detección que puede ser separable de las trayectorias de flujo
permitiendo de este modo que se mueva la zona de detección desde el
canal de flujo que comprende el analito al canal de flujo que
comprende el material inmunoreactivo marcado únicamente después de
que se haya llevado a cabo una inmunoabsorción del analito
suficiente en la zona de detección.
Por lo tanto, de acuerdo con una primera
materialización de la presente invención, la zona de detección es
movible desde una primera posición en comunicación con dicho primer
canal de flujo a una segunda posición en comunicación con el
mencionado segundo canal de flujo, donde cuando dicha zona de
detección está en dicha primera posición, hay flujo de dicha muestra
en dicha fase móvil desde dicha zona de recepción de muestra a
dicha zona de detección, y cuando dicha zona de detección está en
dicha segunda posición, hay flujo de dicho material inmunoreactivo
marcado en dicha fase móvil a la susodicha zona de detección.
Los canales de flujo de acuerdo con la presente
invención comprenden material en forma de láminas alargadas o tiras
que tiene una porción que se puede conectar con dicho primer y/o
segundo canal de flujo. Los canales de flujo están diseñados para
potenciar el flujo hacia la zona de detección permitiendo el
movimiento de la fase móvil en una dirección longitudinal.
De acuerdo con una segunda materialización de la
presente invención, la llegada del material inmunoreactivo marcado
a la zona de detección se puede retrasar por tener un canal de
flujo más largo para el material inmunoreactivo marcado relativo al
canal de flujo para el analito.
El aparato de inmunoanálisis de acuerdo con la
presente invención comprende preferiblemente un cuerpo externo y un
cuerpo interno. El cuerpo externo incluye por regla general un
receptáculo para la adición de una muestra que contiene el analito,
y un compartimento donde se puede observar el resultado de la
prueba.
Además, el cuerpo externo del aparato puede
comprender una lanceta para permitir al usuario del aparato obtener
una muestra de sangre. La lanceta puede estar moldeada
integralmente al cuerpo exterior del aparato o puede ser
proporcionada separadamente.
Además, se puede incluir también una tableta
desecante en el aparato y se puede sellar herméticamente toda la
unidad para evitar el deterioro debido a cambios de humedad. El
aparato es adecuado en particular para su uso en casa, para un
paciente en cama o en la consulta de un doctor.
Otra materialización del aparato es la inclusión
de un hueco en el cuerpo exterior del aparato, en el cual se añade
una gota de sangre. Es preferible que este hueco dé directamente a
la superficie del primer canal de flujo. El hueco puede estar
dispuesto para evitar que el usuario toque la superficie del canal
de flujo durante el transcurso de la prueba.
Todos los componentes necesarios para obtener un
resultado, excepto la muestra que contiene el analito que debe ser
detectado, pueden ser proporcionados como un equipo y por lo tanto
el uso del aparato de acuerdo con la invención no está limitado al
laboratorio.
Para manejar el aparato de acuerdo con la
presente invención, un usuario proporciona una muestra que contiene
el analito, por ejemplo, una muestra de sangre. Se puede tomar una
muestra de sangre capilar utilizando una lanceta (la cual está
preferiblemente incorporada al aparato) para pinchar un dedo. A
continuación la sangre u otra muestra es recogida en una zona de
recepción de muestra. La zona de recepción de muestra comprende
preferiblemente un filtro de sangre adecuado para permitir separar
el plasma de la muestra total de sangre. A continuación se puede
aplicar la fase móvil en contra de la corriente de la muestra.
Alícuotas de fase móvil se pueden aplicar indirectamente a la zona
de recepción de la fase móvil desde un contenedor independiente que
mantiene la fase móvil, por ejemplo, mediante uno o más
cuentagotas. La fase móvil, en este caso, sería aplicada a una fase
sólida adsorbente que es una continuación del cuerpo del aparato de
prueba, o puede ser aplicada en forma de hueco con una cámara que
conecta con la zona de aplicación de la muestra y otros elementos
conductores. Alternativamente, la fase móvil, que por regla general
comprende preservativos fisiológicos salinos y antimicrobianos,
puede ser liberada directamente al aparato desde un compartimento
integrado. En este caso, la fase móvil puede estar contenida en una
ampolla o similar, permitiendo la liberación de la fase móvil
durante la operación del aparato. La fase móvil puede ser liberada
mediante la aplicación de presión o, por ejemplo, a través de
medios adecuados de perforación, sobre la superficie de la ampolla
provocando que la ampolla se pinche. Los medios de perforación
pueden estar incorporados en el aparato. Una vez perforada, la
presión en la parte superior de la ampolla provoca la deformación de
la ampolla, expulsando de este modo la fase móvil fuera de la
ampolla. Alternativamente, la liberación directa de la fase móvil
puede llevarse a cabo mediante intervención química. La
intervención química puede ser iniciada mediante compuestos en la
muestra que actúan para "digerir" una membrana, liberando de
este modo los contenidos de un compartimento para la fase móvil. No
se requiere más intervención del usuario excepto que lea el
resultado de la prueba, estando indicado un resultado positivo
mediante color en la zona de detección, después de un tiempo de
incubación predeterminado.
Tal como se ha mencionado previamente, la
presente invención es adecuada particularmente para su uso en casa
o en la consulta del médico. Por lo tanto, es poco práctico obtener
una muestra de sangre superior a unos pocos \mul en volumen,
siendo el volumen preferible menor de 50 \mu1. Este volumen de
sangre total es aproximadamente 50% celular, lo que generalmente
deja menos de 20 \mul de muestra líquida disponible para
análisis. Las pruebas de alergia tienen que ser muy sensibles para
detectar diminutas cantidades de IgE presente en la sangre
circulante. Por lo tanto, es ventajoso extraer tanto plasma en el
sistema de prueba como sea posible. Un sistema que utiliza la
muestra como una fuente de fase móvil para el reactivo inmunológico
marcado y los posteriores pasos de lavado de un inmunoanálisis
secuencial es, por lo tanto, poco práctico para los diminutos
volúmenes disponibles en este caso. Aquí una fase móvil
independiente es añadida desde un compartimento que expulsa el
plasma fuera de la muestra lateralmente a través del filtro.
De forma ventajosa, es más esta separación
lateral que el flujo transversal de la muestra de sangre capilar a
través de unos medios de filtración adecuados (que pueden contener
de forma ventajosa el material del primer canal de flujo) la que da
por resultado una extracción eficiente de componentes de plasma
libres de glóbulos rojos. La fase móvil desplaza el componente de
plasma fuera de la muestra haciendo que el plasma se traslade
lateralmente a lo largo de la longitud del canal de flujo (en lugar
de provocar una separación atravesando la profundidad de un filtro
de manera convencional, lo que provocaría que una fracción
considerable del plasma quedara retenido). La muestra, libre de
células, es desplazada lateralmente a través del canal de flujo
mediante la adición de una fase móvil, la cual puede contener
también reactantes marcados, hacia el inmunoadsorbente. Ello sucede
en contraste con los aparatos de un solo paso, en los cuales los
reactantes inmovilizados más cercanos a la zona de aplicación están
expuestos a más cantidad del analito que los reactantes
inmovilizados más lejanos de la zona de aplicación.
En una materialización de la presente invención,
el aparato comprende además un filtro de sangre. Se puede aplicar
una muestra de toda la sangre (por regla general 50 \mul
aproximadamente) a la superficie de un filtro de células apropiado,
por ejemplo, un filtro CytoSep (filtración Ahlstrom) o un filtro de
fibra de vidrio tal como GF/A (Whatman), o GF51 (Schleicher y
Schuell), el cual puede ser tratado previamente con detergentes,
anticoagulantes u otros reactivos comunes en la tecnología de
ensayos inmunológicos. El receptáculo que contiene tal filtro
protege al usuario de los contenidos químicos y alergénicos del
aparato. El filtro puede contener un anticoagulante químico como
oxalato o fluoruro, un agente quelante (como EDTA) o un
anticoagulante como heparina. Algunas células también pueden ser
eliminadas mediante agentes específicos de enlace inmovilizados
cerca de la zona de aplicación de la muestra, tales como lectinas
reactivas de grupo polifuncional. Las células también pueden ser
eliminadas mediante una descarga física o química, tal como un
cambio en el pH o en el entorno iónico, congelación, calentamiento,
desecación o la acción de agentes biológicos específicos de
expulsión o compuestos orgánicos. Sin embargo, para algunos
analitos no es necesaria la eliminación de células para el uso
sucesivo del aparato según la invención.
Una vez que una muestra de sangre o similar ha
sido adsorbida completamente, se puede separar el plasma de las
células permitiendo que el extremo libre del filtro entre en
contacto con una solución que contenga IgE no humana, que puede ser
calificado o directamente marcado, junto con preservativos y
estabilizadotes (comunes a la práctica de desarrollo de ensayos
inmunológicos utilizada para minimizar interacciones no
específicas). Sin embargo, el uso de IgG no humanas puede ser útil
para diagnosticar alergias a la comida que no dependen de
mecanismos IgE. Si se añade una etiqueta indirecta al paso anterior,
entonces se puede añadir un segundo reactivo con grupos marcados en
el anticuerpo anti-lgE o anti-lgG
simplemente mediante la exposición del extremo libre del filtro a un
reactivo que contiene el segundo anticuerpo marcado. Por ello este
último método aumenta la sensibilidad del método de detección.
Después de un tiempo predeterminado, el inmunoadsorbente mostrará
una huella del perfil alérgico del paciente en una serie de
franjas, que se pueden atribuir a la existencia a la existencia de
anticuerpos alergénicos específicos IgE o IgG, indicando así la
posibilidad de reacciones alérgicas mediadas IgE/IgG contra dichos
alergénicos probados.
Refiriéndose específicamente a la materialización
descrita con zona de detección movible, la fase móvil puede ser
absorbida simultáneamente a lo largo de dos canales independientes
que salen desde la zona de recepción de la fase móvil. La zona de
recepción de muestra puede comprender un filtro de sangre. Ello
permitirá la separación lateral del plasma de las células y el
consiguiente flujo de plasma a la zona de detección. Después de un
tiempo establecido, por regla general 10 minutos, el componente de
plasma de la muestra de sangre habrá sido extraído de la muestra de
sangre y pasado a través de la zona de detección, seguido de una
fase móvil que tiene el efecto de eliminar cualquier analito libre
que no haya reaccionado del plasma de la zona de detección.
El filtro de sangre puede contener además
aditivos para la eliminación específica de isótopos
no-IgE del plasma. Como la muestra de plasma de un
sujeto categóricamente de prueba puede contener anticuerpos
dirigidos contra los alergénicos en la zona detectora, que no sean
IgE alergénica específica (cuya condición puede estar bastante
marcada en pacientes con alergias a la comida), habrá una
propensión de los anticuerpos IgG, por ejemplo, en la muestra de
plasma, a inundar el enlace de los anticuerpos IgE contra el
alergénico. Ello podría producir que la muestra de plasma diera un
resultado negativo falso debido a la inhibición de la prueba por
isótopos de anticuerpo no-IgE. Aquí gran cantidad
del plasma, y por lo tanto del analito, pasa a través del filtro de
sangre que ayuda a eliminar los anticuerpos no-IgE.
Los medios para la eliminación de los componentes
no-IgE pueden comprender material de intercambio
iónico que permite a los anticuerpos IgE que atraviesen sin verse
afectados pero une a los isótopos no-IgE, evitando
su entrada en la zona de detección.
La matriz o filtro para la eliminación de
componentes no-IgE puede ser proporcionada
independientemente del filtro de sangre. El filtro de sangre y/o la
matriz para la eliminación de componentes no-IgE
están situados preferiblemente entre la zona de aplicación de la
muestra y la zona de detección.
Una importante materialización del aparato según
la invención que aumenta la especificidad de la prueba de
diagnóstico es que la muestra, por ejemplo para IgE específica
alergénica de medición, puede ser adsorbida libre de isótopos
no-IgE haciendo pasar la muestra a través de una
matriz que contenga un reactivo adsorbente con IgG, IgM o IgA
humanas por ejemplo lectinas, proteína A o anticuerpos no humanos,
que no sean los anticuerpos específicos utilizados, facilitando de
este modo la absorción de isótopos no específicos (para mediciones
de IgE, IgD, y subclases IgA o IgG). La incorporación de una matriz
de absorción entre la zona de aplicación de la muestra y el
inmunoadsorbente dará lugar a ensayos de alergia más específicos y
sensibles, al excluir interferencias con anticuerpos
no-IgE. Alternativamente, se puede proporcionar la
matriz en la zona de aplicación de la muestra dentro del filtro de
sangre. Alternativamente, la matriz se proporciona por separado del
filtro de sangre. También es posible inmovilizar anticuerpos para
proporcionar una zona en los medios de detección antes de los
medios impregnados de alergénico. Por ejemplo, la presencia de
grandes cantidades de anticuerpos alergénicos no-IgE
en la muestra inhibirá el enlace de anticuerpos IgE por competición
con el alergoabsorbente, dando la posibilidad de un resultado
negativo falso que puede ser especialmente importante para la
diagnosis de una alergia a la comida mediada por IgE, o en casos
donde los pacientes se han sometido a inmunoterapia con extractos
alergénicos (que pueden dar como resultado una elevación de
isótopos de inmunoglobulina no IgE). Por lo tanto, se esperaría que
un ensayo que utiliza el aparato según la invención clasificaría a
algunos pacientes como que reaccionan positivamente a ciertos
alergénicos, mientras que otros ensayos de alergia comerciales
podrían haberlos clasificado como negativos o de una clase de
alergia inferior. Ello puede ser una importante característica
cuando se quieren realizar mediciones objetivas de IgE en ausencia
de otros isótopos, o cuando se miden isótopos específicos de
anticuerpo sin interferencia de otros isótopos. Otra implicación
más de esta materialización es la eliminación de complejos
inmunitarios de alergénico, IgE y IgG debido a la naturaleza
policlonal de la respuesta inmunitaria a una serie de epítopes sobre
la superficie alergénica. La eliminación de dichos complejos puede
reducir el número de resultados positivos de IgE específicas no
sintomáticas, lo que se encuentra generalmente con pruebas de
alergia clásicas corrientes para la medición de IgE específica. La
técnica de absorción también se puede extender a la eliminación de
antígenos de reacción cruzada en el caso de ensayos inmunológicos
para otros analitos, o para la eliminación de componentes que
interfieren (tales como complejos inmunológicos de ciertas
afecciones médicas) y también allí donde componentes biológicamente
activos o materiales que intervienen químicamente (tales como
proteasas y otras sustancias de enlace) necesitan ser
eliminadas.
La fase móvil también pasa a lo largo del segundo
canal de flujo a través del material inmunoreactivo marcado hasta
la zona de detección. Durante la separación inicial de diez minutos
del plasma de la muestra de sangre total, la fase móvil también
sirve para rehidratar el reactivo de desarrollo seco, tal como un
anticuerpo IgE no humana marcada, en el segundo canal de flujo.
Después de un periodo de tiempo específico, por
regla general diez minutos, la segunda fase de reacción se inicia
mediante el movimiento físico de la zona de detección desde el
primer canal de flujo hasta el segundo canal de flujo. Este proceso
puede ser llevado a cabo manualmente o por otros medios. Ahora el
canal de flujo activo es desde el compartimento o zona de recepción
de la fase móvil a través de los anticuerpos marcados rehidratados
hasta la zona de recepción. Una característica importante de la
ruptura del flujo del primer canal de flujo es que hay pocas
posibilidades de que los glóbulos rojos de la muestra de sangre se
difundan en la zona de detección tapando de este modo el resultado
en el filtro de detección.
Los reactivos inmunológicos marcados pasan a
través de la zona de detección como un bolus que sirve para dos
propósitos:
- (i)
- se aumenta la concentración de los reactivos inmunológicos marcados en la zona de detección aumentado así la tasa de reacción;
- (ii)
- el bolus es seguido por una zona de fase móvil que sirve para despejar la zona de detección de los reactivos inmunológicos marcados sobrantes reduciendo de este modo cualquier enlace no específico y aumentando la señal para lecturas preparatorias.
Al final de la zona de detección hay un colector
que puede estar o no siempre en contacto con la zona de detección
excepto durante la segunda fase de la prueba, en el cual la zona de
detección y el segundo canal de flujo están en contacto. Esta área
sirve como colector para cualquier material que no haya reaccionado
y de ese modo puede acumular reactivos inmunológicos marcados que
no hayan reaccionado (exceso) cambiando de ese modo la apariencia
visual del colector ya sea directamente en el caso de etiquetas
particulares o indirectamente mediante reacción de los reactivos
inmunológicos marcados por otro agente de desarrollo. Ello permite
que los reactivos inmunológicos marcados sobrantes sirvan como
medio para determinar cuando la prueba está terminada.
El movimiento de la zona de detección es una
característica clave. La zona de detección es unida al segundo
canal de flujo y mantiene de manera importante el filtro en ángulo
con la superficie de la zona de detección. El primer canal de flujo
y el segundo canal de flujo están inclinados también en un ángulo
similar tal como cuando la zona de detección es apartada del primer
canal de flujo, la zona de detección es presionada contra el segundo
canal de flujo, asegurando un buen contacto para permitir la
continuidad del flujo de la fase móvil y los reactantes que
transporta. La zona de detección puede contener también una ventana
a través de la cual se puede observar el resultado del test.
De acuerdo con otra característica de la presente
invención, se puede utilizar un allergosorbente. Debido a la alta
sensibilidad requerida por la detección de pequeñas cantidades de
IgE alergénica específica en comparación con la IgG alergénica
específica, y el hecho de que la IgE pueda ser dirigida solamente a
una pequeña fracción del allergosorbente, las propiedades del
substrato para unir los alergénicos debería ser altamente
eficiente. La tasa de flujo es importante también, porque una tasa
de flujo demasiado rápida daría como resultado una sensibilidad
demasiado baja. Se ha descubierto que una membrana de nitrocelulosa
con plástico en la parte trasera (SSLU, Schleicher y Schuell) con
un tamaño de poro de 3 a 5 \mum, o un Whatman 3mm es apropiada
para la determinación del IgE alergénica específica.
El aparato según la invención puede ser utilizado
para la detección de IgE alergénica múltiple específica más que IgE
hacia un alergénico único. Por ejemplo, en el caso de la
materialización de acuerdo con la presente invención con una zona
de detección no movible, la tasa de flujo a través del
allergosorbente será proporcional a la longitud del canal de flujo
respectivo. De aquí que cuanto mayor sea el panel de alergénicos
probados, más largo será el tiempo de desarrollo para que se pueda
observar un resultado.
Los alergénicos se pueden aplicar a la
nitrocelulosa con un bolígrafo capaz de dispensar extractos acuosos
de alergénicos a 1 pl por cm lineal a concentraciones que oscilan
entre 1 y 10 mg/ml en 50mM Tris de salina amortiguada pH7.4
(dependiendo la concentración de proteína de la fuente del extracto
utilizado). A continuación se deja secar la nitrocelulosa a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Los grupos reactivos
sobrantes de la nitrocelulosa son tapados entonces durante 1 hora
con una solución salina amortiguada Tris que contiene 0.05% v/v
Tween-20. Un lavado posterior con el amortiguador
anterior puede ser realizado durante 15 minutos antes de dejar que
la membrana se seque a temperatura ambiente durante 3 horas y a
continuación se almacena el material desecado a
2-8°C.
Es preferible que la zona de detección comprenda
un inmunoadsorbente. Muchos aparatos de inmunoanálisis corrientes
actúan sobre el flujo de la muestra a través de una zona de
reactivos inmunológicos marcados a lo largo de la corriente desde
la zona de aplicación de la muestra, cuyos reactivos inmunológicos
se unen específicamente con el analito si resulta estar presente en
la muestra. La etiqueta constituye los medios por los cuales el
analito específico se hace detectable al usuario. Este reactivo
inmunológico marcado puede ser directo, por ejemplo, cuando se une
a partículas de látex tintadas, coloides de oro o coloides de
tinte. El reactivo inmunológico marcado también puede ser
indirecto, como cuando la etiqueta es un enzima biológico que
requiere tratamiento con un substrato y cromógeno antes de la
detección de la etiqueta, o cuando reactivos de aumento de plata
son requeridos antes de que etiquetas de oro anteriormente
imperceptibles sean hechas visibles. Los reactivos inmunológicos
marcados pueden ser libres de moverse junto con la fase móvil.
Aquí, por ejemplo, otro reactivo inmunológico, de
nuevo específico para el analito (pero de un grupo reactivo
diferente en el analito) puede unirse al complejo de
analito-reactivo inmunológico marcado, a lo largo de
la corriente desde la zona de marcado. La presencia de analito en
la muestra puede ser visualizada de este modo por la acumulación de
complejo marcado en el emplazamiento del inmunoadsorbente. En otra
característica del aparato, dependiendo de la naturaleza de los
reactivos inmunológicos marcados, la fase móvil puede tener una
base de agua (por ejemplo una solución salina), puede contener un
substrato y/o cromógeno para una etiqueta enzimática, o puede
contener un reactivo de aumento de plata (como uno apropiado
disponible comercialmente para la visualización de secciones
histológicas con reactivos de oro coloidales de
Sigma-Aldrich Company) o uno de los componentes de
tal reactivo cuando los reactivos inmunológicos marcados de oro son
utilizados para la detección (u otros agentes de detección en
efecto).
El ensayo puede resultar más sensitivo por el
flujo lateral de una solución aumentada con plata. Ello permite el
uso de coloides de oro más pequeños que proporcionan mejor
penetración y resolución de la membrana pero entonces mejorada por
la sedimentación de plata metálica sobre la superficie del oro
coloidal. Ello debería ser útil para el laboratorio clínico allí
donde se requieran aplicaciones que impliquen volúmenes de muestras
diminutos o donde se requieran sistemas de detección
ultra-sensibles para la determinación simultánea de
múltiples analitos en una muestra diminuta. Los conjugados de oro
también pueden recibir una capa de plata antes de su inclusión en
el aparato de acuerdo con la invención.
Tales conjugados pueden ser preparados incubando
una alícuota titulada de anticuerpo marcado de oro (dializado o
diluido adecuadamente para eliminar iones tales como cloruro),
preferiblemente de 5nm o menos, con una solución reactiva de un
intensificador de plata durante 5 a 10 minutos, seguido de
centrifugación y tres lavados con volúmenes iguales de agua
destilada, para eliminar el exceso del intensificador de plata.
Un resultado positivo en tales ensayos
inmunológicos que utilizan dichos conjugados de oro teñidos
previamente de plata con conjugado de oro teñido de plata se
representa mediante una coloración negra intensa en el sitio de
enlace, proporcionando de este modo sensibilidades con magnitudes
superiores en muchos grados a aquellas del coloide de oro original.
Estos conjugados de oro teñidos de plata pueden ser fácilmente
preparados y son estables tanto en forma líquida como seca.
Conjugados de oro más pequeños de 5 nm o menos son los más
apropiados para teñirse de plata. La intensidad del teñido de plata
se puede modular mediante la concentración de reactantes, la
eliminación de sales que interfieren, la temperatura (una reducción
en temperatura se puede utilizar para controlar la tasa de
reacción) y el tipo de sistema de marcado utilizado. Estos
conjugados de oro teñidos de plata también pueden ser útiles cuando
se utiliza un formato de inmunoanálisis pasivo, tal como en el
secado de proteínas clásicas y ácido nucleico.
En otra materialización de la invención, se puede
incluir un control a bordo que indica cuándo el ensayo ha sido
finalizado o exitoso. Este control (o un control posterior) también
se puede utilizar como referencia al resultado de la prueba
obtenido con el analito específico. Por lo tanto, comparando la
intensidad de la referencia con el resultado de la prueba, se
obtendrá una indicación sobre si el resultado de la prueba ha sido
positivo o negativo. Por eso, mediante otro aparato que mida la
intensidad de la respuesta, se podría obtener una medida
cuantitativa comparando la actividad de la referencia con el
resultado de la prueba.
Alternativamente, el aparato puede contener
también medios electrónicos para detectar el resultado, la
terminación de la prueba e instrucciones paso a paso audibles o
visibles para llevar a cabo la prueba. La inclusión de estas
características electrónicas permitiría una mayor confianza al
usuario al realizar la prueba correctamente y reduciría la
necesidad de la lectura de los folletos de instrucciones antes de
su uso. Por ejemplo, algunas partes del aparato podrían contener
sensores que detectaran la humedad de los canales de flujo
determinando así el paso en el que se encuentra la prueba durante el
proceso de la muestra. Dichos sensores podrían estar conectados a
unos expositores visuales o audibles del paso del proceso e indicar
el siguiente paso. Tales sensores en la zona de detección pueden
incluir mediciones densitométricas, que determinan la cantidad de
anticuerpo marcado unido específicamente por analito en la zona de
detección con el fin de producir un resultado cuantitativo o unos
medios para indicar cuándo los medios de detección deberían ser
llevados a la posición de desarrollo, tales como un aviso audible o
instrucción visual o señal. El sensor electrónico también podría
indicar cuándo se ha añadido suficiente sangre a la zona de
recepción de la muestra mediante, por ejemplo, la determinación del
cambio en la conductividad de los filtros entre el estado seco y
mojado o cuando la composición iónica del filtro cambia debido a la
adición de solventes polares o muestra o mediante la medición de un
cambio en la densidad óptica tal como el debido a la adición de una
muestra coloreada como ocurre en el caso de una gota de sangre
mediante el uso de una fotocélula por ejemplo.
Otra materialización podría incluir los medios
para medir la cantidad de muestra añadida, lo que podría hacerse de
nuevo a través de medios electrónicos como los descritos
anteriormente o más simplemente a través del uso de un tubo capilar
integral o similar que podría "preparar" un volumen fijo de
muestra en el aparato para el análisis.
El detector también podría tomar la forma de un
aparato electrónico en el que las propiedades físicas de la fase
sólida a la cual son absorbidos los alergénicos cambia por el
enlace de los anticuerpos IgE no humanas marcadas a estas zonas
cuando están en la presencia del analito o IgE alergénica
específica.
Por lo tanto, la presente invención ayuda a
eliminar los escollos comunes en tecnología de ensayos
inmunológicos asociada con los aparatos conocidos.
El ensayo secuencial también permite la
amplificación del sistema de ensayo mediante el uso de adiciones
múltiples de anticuerpos; por ejemplo, en el caso de una prueba de
alergia sensible, el primer anticuerpo puede ser un IgE no humana
biotinilada, que es arrastrado por un segundo anticuerpo
anti-biotina marcado de oro, el cual es fácilmente
visible a simple vista cuando se encuentra concentrado en forma de
una zona de reacción diferenciada en el emplazamiento del
inmunoadsorbente.
Las interrupciones entre los pasos de lavado
diferenciados común a los ensayos secuenciales de rutina tal como
se realizan en laboratorios clínicos son innecesarias para este
formato del ensayo debido a la naturaleza capilar de los filtros y
membranas, ya que el primer anticuerpo es eliminado mediante lavado
con poca reacción y mezcla del segundo anticuerpo. Lo mismo se puede
decir sobre la muestra que es expulsada del filtro por la entrada
del anticuerpo primario.
Una materialización principal del aparato según
la invención es evitar la necesidad de pasos de lavado
diferenciados a la vez que se mantiene todavía un formato de ensayo
inmunométrico secuencia) y es aplicable especialmente para aparatos
a utilizar en casa o en la consulta del doctor. Ello se consigue
mediante la interpretación y, en el caso de una materialización con
medios de detección no movibles, geometría de los elementos
conductores que transportan la fase móvil. En contraste con el
aparato conocido, una característica del aparato de acuerdo con la
invención es que la muestra puede ser aplicada a una región cerca
del inmunoadsorbente. A continuación, la fase móvil puede ser
aplicada en contra de la corriente de la muestra ya sea mediante
liberación desde un compartimento en el aparato o añadido desde un
contenedor separado suministrado como parte del aparato. Ello evita
la necesidad de que la fase móvil entre en la zona del reactivo
inmunológico marcado antes de que alcance la muestra.
De acuerdo con la materialización de la invención
con medios de detección no movibles, se puede permitir que la fase
móvil atraviese más de una ruta simultáneamente. La ruta más
directa de la fase móvil es a través del punto de aplicación de la
muestra del paciente y dentro del inmunoadsorbente. Sin embargo,
simultáneamente, la fase móvil también se puede desplazar a lo
largo de un elemento conductor diferente. En esta ruta alternativa,
la fase móvil pasa a través de una zona de reactivo inmunológico
marcado libre de moverse en el elemento conductor únicamente en
estado húmedo. Esta trayectoria alternativa de fase móvil
transportando los reactivos inmunológicos marcados también lleva al
inmunoadsorbente.
Por lo tanto, debido a una posible diferencia en
las características del flujo de las dos trayectorias descritas
anteriormente, es evidente que la llegada de los reactivos
inmunológicos marcados al inmunoadsorbente mucho más tarde que el
analito inicial desde el punto de aplicación de la muestra dará
eficazmente como resultado un ensayo inmunométrico secuencial. Este
procedimiento permite que el formato secuencial descrito tenga lugar
sin el requisito de una interacción previa con un reactivo
inmunológico marcado y sin pasos de lavado diferenciados o
distintas aplicaciones múltiples de reactivos por el usuario.
En otra materialización de la invención, el
número de trayectorias no tiene que estar limitado a dos. Un
aumento posterior en el número de trayectorias de características
de flujo variables proporciona más flexibilidad con el sistema de
prueba, permitiendo que tengan lugar químicas más complejas o
faciliten pasos de lavado mejorados si es necesario, o reacción o
pasos de modificaciones químicas con diferentes reactivos
inmunológicos marcados en la fase sólida. Sin embargo, el único
requisito para el usuario, sin tener en cuenta el número de canales
de flujo, es proporcionar una muestra en el punto de aplicación y a
continuación iniciar el flujo de la fase móvil ya sea desde dentro
del aparato o vía un contenedor externo.
La trayectoria más rápida no tiene que llevar
necesariamente a la muestra. La presente invención también puede
ser aplicable para llevar a cabo la inmovilización de reactivos
inmunológicos durante el funcionamiento del aparato en lugar de ser
preparado por el fabricante.
Un formato secuencial es especialmente útil
cuando anticuerpos monoclonales no están disponibles. En general,
anticuerpos policlonales pueden proporcionar potencialmente mayor
sensibilidad en ensayos inmunológicos y pueden ser más estables
cuando se etiquetan que los anticuerpos monoclonales. Cuando se
utiliza un aparato de ensayo no secuencial, tal como se describe
anteriormente, es importante que el anticuerpo marcado sea
específico para un epítope mientras que el inmunoreactivo
inmovilizado sea específico para un epítope distante espacialmente
distinto. Sin embargo, en algunos casos, ello impediría el uso de
anticuerpos policlonales debido a la posibilidad de reacción con los
epítopes reconocidos por el reactivo inmunológico inmovilizado en
el inmunoadsorbente, ocultando efectivamente de este modo los
epítopes al inmunoadsorbente, reduciendo el enlace y por lo tanto
reduciendo la señal.
Un formato de ensayo secuencial elimina estos
problemas y es útil especialmente cuando el analito es una
inmunoglobulina o cuando sólo hay antisueros policlonales
disponibles. El inmunoadsorbente es generalmente extracto
alergénico inmovilizado. No obstante, se pueden realizar ensayos de
alergénicos específicos utilizando un anticuerpo IgE no humana
inmovilizada y alergénicos marcados. La detección múltiple
simultánea de anticuerpos IgE y IgG dirigidos contra un alergénico
también se podría llevar a cabo mediante la adaptación de este
método utilizando alergénicos marcados. En este método, por
ejemplo, el detector puede comprender dos zonas:
- (a)
- una zona que contiene un anticuerpo anti-IgE inmovilizado; y
- (b)
- un reactivo de enlace IgG inmovilizado tal como proteína A o anticuerpo anti-IG.
A diferencia de muchos ensayos inmunométricos
donde el inmunoadsorbente es una preparación de anticuerpo
purificado, los extractos alergénicos son generalmente mezclas
complejas de una multitud de proteínas. Por ejemplo, extractos del
ácaro del polvo común contienen muchos anfígenos y alergénicos que
reaccionan cada uno de manera diferente con muestras de sangre de
diferentes individuos. Aquí, la reacción previa de la IgE presente
en una muestra de sangre capilar con anticuerpos IgE no humanos
marcados, como ocurriría si se utilizaran aparatos convencionales
para pruebas en casa/en la consulta, puede inhibir posiblemente las
interacciones con la fase sólida del allergosorbente debido a que
la orientación del complejo anti IgE/IgE interfiere con el enlace
de dicho complejo al inmunoadsorbente. Una característica
particular de la mayoría de las pruebas de alergia realizadas en
laboratorios es que adoptan un formato de ensayo secuencial,
evitando así el problema de impedimento estérico al permitir que la
IgE se una primero a la fase sólida alergénica en la muestra del
paciente. A continuación, se puede utilizar en exceso una
preparación de anticuerpo IgE no humano marcado policlonal para
asegurar una estimación cuantitativa del enlace IgE específico.
Una importante ventaja del uso del formato
secuencial en un aparato de diagnóstico es en el caso de enfermedad
coelíaca. Aquí, la presencia de anticuerpos de Inmunoglobulina A
(IgA) contra la proteína cereal gliadina en la sangre y otros
fluidos del cuerpo, por ejemplo la saliva, es una indicación de
enfermedad coelíaca. Sin embargo, la fracción de IgA específica de
gliadina comparada con la IgA total en las muestras de sangre de
individuos con enfermedad coelíaca puede ser muy pequeña. Esto
significa que para detectar IgA específica de gliadina, se necesita
un sistema de detección sensible además de un gran volumen de
muestra, si se quiere distinguir la señal obtenida con una muestra
que contiene anticuerpos de IgA específica de gliadina de aquellas
muestras de sangre en que no. El aumento en el tamaño de la muestra
se corresponde con un aumento de la IgA total respectivamente, lo
que da por resultado que los ensayos no secuenciales existentes
podrían ser demasiado insensibles, ya que existe una posibilidad de
que, debido al incremento del volumen de muestra y los niveles
totales de IgA, los altos niveles de IgA específica no gliadina
podrían potencialmente inundar la detección de la IgA específica de
gliadina por saturación de los anticuerpos de IgA no humana
marcados.
De esta manera, el uso de un ensayo secuencial
que primero permita a la IgA específica humana
anti-gliadina unirse a un inmunoadsorbente de
gliadina inmovilizado, y que a continuación reaccione en una etapa
diferente a partir de entonces con la IgA no humana marcada, dará
como resultado una posibilidad más específica, sensible y reducida
de ensayos negativos falsos que pueden haber sido causados por
saturación del sistema de ensayo con la IgA específica no gliadina
encontrada en la muestra de sangre. Es también posible que la fase
móvil pudiera ser utilizada para provocar una liberación lenta o
gradual de los reactantes marcados de una matriz que actuaría en
colaboración con el formato secuencial de ensayo descrito
anteriormente para proporcionar una separación incluso más clara de
reactivos inmunológicos durante el funcionamiento del aparato. Por
ejemplo, en el caso de una IgA específica contra gliadina, el
ensayo sería relativamente insensible si la IgA no específica no
fuera eliminada antes de la detección con una etiqueta
anti-IgA, lo cual se evita en ensayos inmunológicos
realizados en laboratorio mediante un formato de ensayo secuencial,
el cual incorpora un paso de lavado para eliminar reactivos
inmunológicos no específicos antes de la adición de un anticuerpo
marcado. No obstante, en un aparato de diagnóstico diseñado para su
uso en casa o en la consulta, los diferentes pasos de lavado son
incómodos y engorrosos y una posible fuente de error.
El resultado depende de una serie de factores que
incluyen; la intensidad manual del lavado realizado por el
operario, los reactivos utilizados para el paso de lavado pueden
ser diferentes, especialmente si se recomienda agua de grifo, por
ejemplo, contaminantes, microbiano, particulados, fuerza y
temperatura. Para evitar el requisito de un paso de lavado, el
aparato debería contener si fuera necesario los medios para la
eliminación de reactantes no específicos. Por lo tanto, lo que se
describe aquí es otra materialización del aparato en el cual, si
fuera necesario y dependiendo del analito a medir, los medios para
una liberación lenta o desorción de los reactivos inmunológicos
marcados deberían ser una parte integral del funcionamiento. En la
práctica, un mecanismo de liberación tan lento podrían tener la
forma de una barrera mecánica, por ejemplo, un gel o material de
encapsulado, o los medios químicos tales como absorción a una
matriz cargada tal como un material de intercambio de iones o
afinidad adsorbida por una propiedad específica de enlace del
reactante marcado para un ligando inmovilizado y desorbido por un
cambio apropiado de fuerza iónica, concentración de iones de
hidrógeno, o adición de compuestos que antagónicos con el enlace de
ligando-reactivo. La lenta liberación en el último
caso puede ser mediada por el hecho de que el analito marcado
inmovilizado esté rodeado por un entorno que apoyó el enlace
mientras que la fase móvil es antagónica a este enlace. Básicamente,
ello establece una pendiente a través de la matriz que alberga el
reactante marcado adsorbido, hasta que al final a una determinada
fuerza de la pendiente, el material adsorbido comenzará a ser
liberado. Antes de la liberación del reactante marcado, el paso de
la fase móvil a través de la zona de adsorción de la muestra
permitirá el enlace específico del anticuerpo humano específico por
el ligando inmovilizado en la zona de detección sin la interferencia
de los reactantes marcados con analitos no específicos.
Se puede conseguir la translocación de la fase
móvil incluyendo los reactivos inmunológicos mediante el movimiento
a lo largo de las cámaras o canales formados por el cuerpo del
mismo aparato, tubos capilares específicos, cauces y canales o
desde compartimentos con orificios que limitan el flujo o
movimiento a lo largo de mechas por acción capilar. Tales mechas
pueden ser de materiales sintéticos o naturales. La elección de
material adecuado para la translocación debe ser tal que la
absorción pasiva de los reactivos inmunológicos sobre estos
elementos conductores no ocurra; el material puede ser tratado para
evitar la sedimentación de los reactivos inmunológicos sobre la
superficie de los elementos conductores. Si fuera necesario, los
materiales empleados para los elementos conductores puede ser o
bien tratados antes de que el aparato sea montado y/o durante el
funcionamiento del aparato. Por ejemplo, no deberían estar
presentes elementos de bloqueo tales como proteínas irrelevantes,
polímeros, detergentes y otros reactivos de bloqueo que se utilizan
de forma rutinaria habituales en la práctica del diseño de ensayos
inmunológicos. El principal objetivo de los elementos capilares es
proporcionar una trayectoria de flujo para la fase móvil y conectar
secciones del aparato que contengan reactivos inmunológicos o
agentes de detección que deben ser separados antes de que la prueba
sea llevada a cabo y facilitar que se añadan reactivos al
inmunoadsorbente en diferentes momentos. El uso de modificadores de
viscosidad se puede utilizar para ajustar la tasa de translocación
junto con las características del flujo de los elementos
conductores. También se pueden modificar regiones de los elementos
conductores para realizar interacciones químicas/inmunológicas con
la fase móvil y sus contenidos en una región particular del
aparato. Por lo tanto, la elección del material para los elementos
conductores es de gran importancia para el correcto funcionamiento
del aparato.
Una materialización importante por el cual se
puede llevar a cabo un ensayo secuencial mediante una única adición
de fase móvil al comienzo del funcionamiento del aparato, es tener
una serie de elementos conductores independientes. En un sistema
semejante, los elementos conductores salen de un único
compartimento que puede contener constituyentes química o
inmunológicamente activos o no, tal como se requiere para que el
analito en cuestión pueda ser detectado. Haciendo que un único
compartimento alimente una serie de elementos conductores, se
permite que se apliquen diferentes reactivos a la zona de prueba en
diversas posiciones y a intervalos de tiempo controlados. Es decir,
variar de forma diferente las características del flujo de cada
elemento conductor dará como resultado diferentes tasas de flujo y
por lo tanto, la llegada de los distintos reactivos al
inmunoadsorbente en momentos diferentes. El flujo de la fase móvil y
los reactantes a través de un elemento conductor concreto también
podría ser modulado por la composición de la matriz de elemento
conductor y también por la adición de modificadores de flujo en
cada uno de los elementos conductores para cambiar la viscosidad.
Una materialización importante de esta invención es evitar la
necesidad de moduladores de agentes de detección. Por ejemplo, se
pueden utilizar agentes de reducción para evitar la formación
prematura de cromógeno cuando se utiliza reactivos inmunológicos
marcados de peroxidasa de rábano.
El aparato de acuerdo con la invención puede
permitir un número ilimitado de adiciones de reactivos incluso
aunque todas se inicien desde un único compartimento de fase móvil.
Ello mejorará mucho la utilidad potencial de tal aparato de paso
único ya que se puede superar el problema de la adición secuencial
de reactivos. El sistema de elementos conductores múltiples evita la
necesidad de diferentes pasos de lavado en un aparato semejante,
permitiendo la medición de un rango dinámico más amplio de analitos
y concentraciones, a la vez que se elimina la posibilidad de los
efectos de gancho de dosis alta que pueden ocurrir en algunos
ensayos inmunométricos no secuenciales que no tengan un paso de
lavado incorporado para eliminar el analito no unido al reactivo
inmunológico inmovilizado de la fase sólida.
Los elementos de conducción múltiples pueden ser
dispuestos como una lámina en dos dimensiones o como una estructura
tridimensional, en la que se puede separar más de una "lámina"
de elementos conductores mediante capas de "aislamiento" de
material formando un sándwich de elementos conductores. Para
algunos analitos, la configuración óptima del aparato puede ser una
combinación de los dos formatos, especialmente si se debe detectar
más de un analito a la vez. De cualquier manera, un diseño
semejante permitiría que una serie compleja de reacciones químicas
e inmunológicas sucedieran distanciadas en tiempo y lugar pero que
finalmente se unirían en la secuencia correcta en la zona de
detección para dar el resultado requerido.
La apariencia exterior del aparato (Figura 1)
incluye un receptáculo para recibir la fase móvil (1), una zona
para la adición de la muestra del usuario que contiene el analito
(2), la cual también puede ser añadida en (1), estando tanto (1)
como (2) cerca de la superficie de la cubierta del aparato (3). La
zona de detección (4) está situado dentro de la cubierta (3) y puede
estar protegida por una ventana transparente. La zona de detección
contiene el inmunoadsorbente sobre el cual se observará el
resultado.
Una materialización importante del aparato de la
Figura 2 es la construcción de los elementos conductores. En
principio, el aparato consiste en elementos conductores de diversas
longitudes de canal y características de flujo. El canal más rápido
y directo para la fase móvil está en el punto de la aplicación en
el compartimento (1) donde se añade la fase móvil y lleva a la zona
de aplicación de la muestra (2) situada sobre o cerca del
inmunoadsorbente. La geometría de la fase sólida, junto con los
materiales utilizados para construir el compartimento (1), colector
(8), elementos conductores (6) e inmunoadsorbente (4) están
diseñados para potenciar el flujo hacia el colector (8). La zona de
aplicación de la muestra lleva al reactante inmovilizado sobre el
inmunoadsorbente (5) a través de un filtro 9 para eliminar los
componentes no-IgE. La zona de anticuerpo marcado
(7) es libremente movible dentro de los elementos conductores
cuando la fase móvil desde el compartimento está presente y puede
llevar directamente al inmunoadsorbente o pasar a través de la zona
de muestra tal como se indica en la Figura 2. El tiempo que tardan
los reactantes marcados para alcanzar el inmunoadsorbente es mayor
que el de la muestra. Esta configuración es sencilla para que pueda
ser fabricada con materiales disponibles y dará como resultado un
formato de ensayo secuencial debido esencialmente a la diferencia
en tiempos de llegada de la muestra y del anticuerpo marcado u
otros reactivos a la zona del reactivo inmunológico
inmovilizado.
En cuanto a la Figura 3, otra materialización de
la presente invención se representa mediante un compartimento (1)
que comprende la fase móvil, y un primer canal de flujo que
comprende una zona de aplicación de la muestra (2), un filtro (9)
para la eliminación de componentes no-IgE y un
segundo canal de flujo que comprende una zona de anticuerpo marcado
(7). Además se proporciona una zona de detección movible (4), que
comprende un colector (8). La zona de detección (4) se muestra en
conexión con el primer canal de flujo.
En cuanto a la Figura 4, se muestra el aparato de
la Figura 3 con la zona de detección (4) en el segundo canal de
flujo.
Como se muestra, no tiene que haber limitación a
dos elementos conductores, pero puede que haya muchos cuando se
desea una química más compleja de reactantes. Esta disposición
también puede ser simplemente extrapolada para formar una
estructura tridimensional en la que los elementos conductores de
varias propiedades físicas están apilados uno sobre otro antes de
ponerse al lado del inmunoadsorbente.
A continuación se explica la invención con más
detalle en relación a los siguientes ejemplos de trabajo.
Un trozo de nitrocelulosa con plástico en la
parte trasera (SSLU) de Schleicer y Schuell de 5 mm x 60 mm se
preparó tal como se describe anteriormente. Se grabaron tres líneas
de alergénico en la nitrocelulosa separadas por 10 mm representando
alergénicos mixtos de Timothy Grass/Cocksfoot (2 mg/ml),
alergénicos Cat (10mg/ml, Bayer) y extracto de pteronyssinus
Dermatophagoides (20 mg/ml, Smithkline Beecham). Se pegó un trozo
de papel de filtro de fibra de vidrio GF/A (Whatman, 5 mm x 35 mm)
al extremo más próximo de la nitrocelulosa y un trozo de CHR17
(Whatman, 5 mm x 40 mm) al extremo más alejado mediante un adhesivo
solvente a un soporte plástico, con una superposición de 5 mm sobre
la superficie de la nitrocelulosa. Una muestra de 25 \mu1 de tres
grupos de suero RAST de grado 3 a 4 positivo para o bien polen de
hierba, alergénicos de gato o ácaro o un grupo normal de suero de
cabra fueron mezclados con un volumen igual de glóbulos rojos
frescos de un donante humano normal, y añadido como una alícuota de
50 \mul en el centro del filtro GF/A. Una vez absorbido, el
extremo libre del filtro se puso en contacto con 200 \mul de una
solución salina amortiguada de pH 7.4 de 50 mM Tris que contiene 0.5
\mug de IgE no humana de cabra biotinilada (Vector Laboratories)
y se deja absorber durante 1 hora. A continuación, el extremo libre
del filtro es puesto en contacto con 300 \mul del tampón anterior
que contiene 30 \mul de anti-biotina (British
Biocell Internacional) marcado de cabra de oro (40 nm) y se deja
absorber. Después de 30 minutos se observaron resultados positivos
por la presencia de líneas rosas/rojas que se corresponden con los
alergénicos representativos de cada uno de los grupos de sueros,
excepto para el suero de cabra normal que sirvió como control
negativo donde no apareció ninguna línea para ninguno de los
alergénicos probados.
Un trozo de nitrocelulosa de Schleicer y Schuell
(5 x 30 mm) se impregnó con extracto de ácaro tal como se describe
anteriormente. Un trozo de GF51 (Schleicher y Schuell, 5 x 25 mm)
se pegó a la nitrocelulosa con una superposición de 5 mm y ambos
componentes se fijaron mediante adhesivo al soporte plástico. A
continuación se añadió una alícuota de suero de 25 \mul de RAST
grado 4 positivo de un grupo de paciente positivo de ácaro de polvo
al GF51 en una región impregnada previamente con 0.5 \mul de IgE
no humana de cabra biotinilado en 10 \mul de solución salina con
tampón Tris. A continuación se añadió una alícuota de 100 \mul de
anti-biotina de cabra marcado de oro (40 nm) en
Tris búfer que contiene 1% w/v albúmina de suero bovino mediante
gotas al filtro GF51. En el plazo de 30 minutos se observó una
franja positiva correspondiente a la reactividad del suero con el
extracto de ácaro.
Probablemente es mejor que los reactantes,
excepto la fase móvil, sean almacenados en el aparato en forma
sólida para aumentar la estabilidad, ya que es preferible que el
aparato sea almacenado en condiciones ambientales. Los componentes
biológicos son conocidos por su degradación en una solución,
mientras que su almacenamiento en estado seco o acoplados
químicamente a alguna matriz confiere cierta protección a su
inestabilidad innata. Otro problema con materiales biológicos
(especialmente proteínas) es su tendencia a absorber no
específicamente a superficies de matriz tales como cristal, papel o
plásticos. Estas interacciones deben ser minimizadas si se quiere
que los reactantes sean de alguna utilidad en el aparato. Un método
sería tratar previamente la matriz que alberga los reactantes con un
reactivo de bloqueo no específico tal como se describe
anteriormente. Otro método podría ser unirlos químicamente a la
fase sólida pero incluyendo un agente liberador que libere el
reactante desde la fase sólida a la fase móvil. Una forma de añadir
los reactantes sería en forma líquida sobre la matriz no adsorbente
y a continuación eliminar el líquido secándose de este modo como
una película. Los reactantes también pueden ser añadidos en forma
de gel (como agarosa o gelatina), o simplemente secados en la
matriz con un detergente. Los componentes del aparato también
contienen preservativos para ayudar a evitar el deterioro del
producto por organismos microbianos y para ayudar a proteger contra
condiciones medioambientales adversas, por ejemplo, temperatura, luz
y humedad.
Claims (11)
1. Un aparato para pruebas analíticas de ensayos
inmunológicos para examinar la presencia de un analito en una
muestra de fluido corporal obtenida de un sujeto animal (en
concreto, de un sujeto humano), donde dicho aparato comprende:
- (a)
- un primer canal de flujo que incluye una zona de recepción de la muestra para recibir dicha muestra;
- (b)
- un segundo canal de flujo que incluye material inmunoreactivo marcado no inmovilizado que puede interactuar con dicho analito;
- (c)
- una zona de recepción de fase móvil para recibir una fase móvil, estando dicha zona de recepción de fase móvil en comunicación con dichos primer y segundo canales de flujo; y
- (d)
- una zona de detección que incluye inmunoadsorbente para unir dicho analito cuando dicho analito está presente en la susodicha muestra, siendo dicha zona de detección movible desde una primera posición en comunicación con dicho primer canal de flujo a una segunda posición en comunicación con dicho segundo canal de flujo;
donde cuando dicha zona de detección está en su
primera posición, hay flujo de dicha muestra en dicha fase móvil
desde dicha zona de recepción de la muestra a dicha zona de
detección, donde dicho analito, cuando está presente en la
susodicha muestra, se une sustancialmente con dicho
inmunoadsorbente, y cuando dicha zona de detección está en su
segunda posición, hay flujo de dicho material inmunoreactivo
marcado en dicha fase móvil a la susodicha zona de detección, donde
dicho material inmunoreactivo marcado se une sustancialmente a dicho
analito cuando dicho analito se ha unido a dicho inmunoadsorbente,
de forma que proporcione una indicación de la presencia de dicho
analito en dicha muestra.
2. Un aparato de acuerdo con la reivindicación 1,
donde:
- (a)
- dicha zona de detección está en contacto con dicho primer canal de flujo cuando dicha zona de detección está en dicha primera posición y dicha zona de detección está en contacto con el susodicho segundo canal de flujo cuando dicha zona de detección está en dicha segunda posición; y/o
- (b)
- dicha zona de detección es movible para estar en comunicación o en contacto con dicho primer y segundo canales de flujo en secuencia; y/o
- (c)
- dicha zona de detección es movible manualmente desde dicha primera posición a dicha segunda posición.
3. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho primer y/o segundo canal
de flujo:
- (a)
- potencian el flujo hacia dicha zona de detección, preferiblemente por acción capilar u otro mecanismo de tensión de superficie; y/o
- (b)
- comprenden láminas alargadas o material en tiras, o material absorbente de dicha fase móvil.
4. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde:
- (a)
- dicho aparato comprende además un colector para recoger el fluido que salga de la zona de detección;
y/o
- (b)
- dicho analito siendo examinado sea IgE alergénica específica.
5. Un aparato según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho primer canal de flujo
incluye:
- (a)
- una matriz para la eliminación de componentes no-IgE; y/o
- (b)
- un filtro dispuesto para separar componentes de dicha muestra, preferiblemente un filtro de sangre dispuesto para permitir que el plasma pase a la vez que se atraen otros componentes de la sangre.
6. Un aparato de acuerdo con la reivindicación 5,
donde dicha matriz y/o filtro es suministrado:
- (a)
- entre dicha zona de recepción de la muestra y dicha zona de detección; o
- (b)
- en dicha zona de recepción de la muestra.
7. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el material que comprende dicho
primer canal de flujo permite el transporte de dicha muestra (o al
menos un componente de dicha muestra) a lo largo del primer canal
de flujo.
8. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicha zona de recepción de fase
móvil incluye una reserva de fases móviles liberables y/o dicha
fase móvil es suministrada en un contenedor independiente, donde
dicha fase móvil puede ser liberada en dicha zona de recepción de
fase móvil.
9. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho segundo canal de flujo
comprende al menos una parte de dicho primer canal de flujo o dicho
segundo canal de flujo comprende sustancialmente la totalidad de
dicho primer canal de flujo.
10. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende una pluralidad de
canales de flujo incluyendo dicho primer y segundo canales de
flujo, donde dicha pluralidad de canales de flujo están
apilados.
11. Un método para examinar la presencia de un
analito en una muestra de fluido corporal, donde dicho método
comprende:
- (a)
- suministrar un aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;
- (b)
- poner en contacto dicha muestra con dicha zona de recepción de la muestra;
- (c)
- cargar dicha zona de recepción de fase móvil con una fase móvil ya sea algo antes, simultáneamente, o después del paso (b); y
- (d)
- observar dicha zona de detección por si hubiera indicaciones de la presencia de dicho analito en dicha muestra.
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