ES2208746T3 - Dispositivo y metodo de deteccion diagnostica. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA UNA CELULA DE ANALISIS MEJORADA PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE UN ANALITO EN UNA MUESTRA DE LIQUIDO. EL DISPOSITIVO TIENE UNA CUBIERTA ALARGADA (10) QUE DEFINE UNA ENTRADA DE LA MUESTRA DE LIQUIDO, UN VOLUMEN DE RESERVA, UN VOLUMEN DE ANALISIS Y UNA VENTANA (16) A TRAVES DE LA CUBIERTA EN EL VOLUMEN DE ANALISIS. DENTRO DE LA CELULA HAY UN ABSORBENTE DE MUESTRAS, UN NUEVO SUSTRATO BIFASICO Y UN RESERVORIO, QUE CONJUNTAMENTE SON CAPACES DE TRANSPORTAR UNA SOLUCION ACUOSA DENTRO DE LA CUBIERTA A LO LARGO DE UNA VIA DE FLUJO QUE SE EXTIENDE DESDE LA ENTRADA DE LA MUESTRA A TRAVES DEL VOLUMEN DE ANALISIS HASTA EL VOLUMEN DE RESERVA. LA INVENCION CONSTA TAMBIEN DE UN METODO PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE UN ANALITO EN UNA MUESTRA DE LIQUIDO MEDIANTE EL DISPOSITIVO Y DE UN MATERIAL CROMATOGRAFICO BIFASICO PARA APLICAR EL METODO. EL MEDIO DE LIBERACION ES, P. EJ., PAPEL ABSORBENTE, Y PRESENTA UNA BANDA DE SOLUCION ANTICUERPO-METAL, Y UNA BANDA DE, P. EJ., ANTICUERPO-BIOTINA QUE SE UNEN AL PRIMER Y SEGUNDO EPITOPOS DEL ANALITO, RESPECTIVAMENTE. EL LUGAR DE CAPTURA ES, P. EJ., NITROCELULOSA O NILON, Y CONTIENE UN COMPONENTE DE CAPTURA INMOVILIZADO, COMO ESTREPTAVIDINA. PUEDE EXISTIR UN LUGAR DE CONTROL. EL MEDIO DE LIBERACION Y EL LUGAR DE CAPTURA ESTAN UNIDOS MEDIANTE SOLAPAMIENTO PARA FORMAR EL SUSTRATO CROMATOGRAFICO.

Description

Dispositivo y método de detección diagnóstica.

La presente invención se refiere a ensayos para un analito, tal como un antígeno, en una muestra líquida, tal como fluido corporal. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método y a un dispositivo para la detección de un analito en un fluido corporal, utilizando una célula de pruebas del flujo lateral, que contiene un sustrato cromatográfico bifásico novel.

Se han usado muchos tipos de ensayos ligando-receptor para detectar la presencia de diversas sustancias en fluidos corporales, tales como orina o sangre. Generalmente estos ensayos implican unas reacciones antígeno-anticuerpo, conjugados sintéticos que comprenden trazadores enzimáticos, fluorescentes u observables visualmente, y cámaras de reactor especialmente diseñadas. En la mayoría de estos ensayos, hay un receptor (por ejemplo un anticuerpo), que es específico para el antígeno seleccionado, y unos medios para detectar la presencia y/o cantidad del producto de reacción antígeno-anticuerpo. La mayor parte de las pruebas corrientes se destinan a hacer una determinación cuantitativa, pero en muchos casos todo lo que se requiere, es una indicación positiva/negativa. Ejemplos de este tipo de ensayos cualitativos incluyen la tipificación hemostática, la prueba del embarazo y muchos tipos de análisis de orina. Para estas pruebas, se prefieren indicios observables visualmente, como por ejemplo, la presencia de aglutinación o un cambio de color.

Los ensayos positivos/negativos deben ser muy sensibles a causa de la, muchas veces, pequeña concentración del ligando de interés en el fluido de la prueba. Positivos falsos pueden ser inoportunos, particularmente con aglutinación y otros métodos de detección rápida, tales como varilla de nivel o pruebas de cambio de color. Debido a estos problemas, se han desarrollado ensayos sándwich y otros métodos de detección sensitiva, que utilizan soles de metal u otros tipos de partículas coloreadas. Sin embargo, estas técnicas no han resuelto la totalidad de los problemas encontrados en estos métodos de detección rápida. Es un objeto de la presente invención proveer un dispositivo de detección perfeccionado y un método que tiene mayor sensibilidad y discriminación para analitos de interés. Otro objeto de la invención es proveer un dispositivo de ensayo, que es más simple de fabricar.

Los siguientes documentos dan a conocer unos dispositivos de detección del diagnóstico: WO-A-91/12528, WO-A-94/01775, W0-A-94/15215, DE-A-4314493, EP-A- 374684, EP-A- 0582231, EP-A- 560411, WO-A-94/06012. Sin embargo, ninguno de estos documentos pone de manifiesto dispositivos que comprenden sustratos cromatográficos bifásicos del tipo dado a conocer y reivindicado en esta memoria descriptiva.

La WO 91/12528 describe una tira de prueba inmunocromatográfica, que tiene un conjugado (i) el cual consta de oro coloidal conjugado a un anticuerpo al antígeno (hCG); un componente (ii) capturable, que comprende un segundo anticuerpo biotinilado al antígeno, y un sitio de captura, que consta de un compuesto de látex y avidina.

La presente invención proporciona un dispositivo sensible, rápido y un método para detectar la presencia de analitos en fluidos corporales. El método y el dispositivo tienen alta sensibilidad y dan por resultado positivos virtualmente no falsos. El uso del presente dispositivo y método provee un sistema de ensayo, el cual implica un número mínimo de pasos de procedimiento, y da reproduciblemente unos resultados fiables, incluso cuando se usan por personas inexpertas.

El dispositivo y el método utilizan un único medio cromatográfico bifásico, el cual aumenta la velocidad y sensibilidad del ensayo. Por esta razón, en un primer aspecto la invención provee un dispositivo (5) para determinar la presencia de un analito en una muestra líquida, en la que depositada en un extremo proximal del dispositivo se desplaza aguas abajo a lo largo de un recorrido del líquido a un extremo distal del dispositivo, comprendiendo dicho
dispositivo:

-

un sustrato (18) bifásico que comprende un medio de liberación (30) de un primer material hidrofílico, absorbente y, en comunicación de líquido y aguas abajo del mismo, un medio de captura (32) de un segundo material polímero, hidrofílico, con diferente microporosidad, en que situados en dicho medio de liberación de dicho sustrato bifásico para liberación del mismo hay

i.

conjugado marcado, que comprende un elemento de unión susceptible de reaccionar con un primer epitopo de dicho analito señalado con un marcador detectable, y

ii.

un componente capturable, susceptible de reaccionar con un segundo epitopo de dicho analito, de tal suerte que, si dicho analito está presente en dicha muestra, dicho analito es capaz de formar un complejo de dicho conjugado marcado, dicho analito y dicho componente capturable, y ubicado dentro de dicho medio de captura de dicho sustrato hay un lugar de captura (34) para capturar dicho complejo, habiendo inmovilizado en él un componente de captura, que tiene una afinidad de unión para dicho componente capturable.

De conformidad con la presente invención, se provee un elemento de sustrato bifásico, que comprende un medio de liberación unido a un medio de captura ubicado aguas abajo, de dicho medio de liberación. Los medios de liberación y de captura comprenden dos diferentes fases, que tienen diferentes características específicas. Las dos fases se juntan entre sí para formar un único recorrido del líquido de tal manera que un frente disolvente puede desplazarse sin impedimento desde el extremo proximal (aguas arriba) del medio de liberación al extremo distal (aguas abajo) del medio de captura.

El medio de liberación comprende un material hidrofílico, absorbente, tal como papel secante. Materiales preferidos para su empleo como un medio incluyen papel de borra de algodón o papel hecho a base de celulosa juntamente con un material fibroso polímero, tal como fibras de poliamida o rayón, y material de fibra de vidrio. La función primordial del medio de liberación es en primer lugar soportar y subsecuentemente liberar y transportar los diversos componentes inmunológicos del ensayo, tal como un elemento de unión marcado y un componente capturable, ambos con una afinidad específica para el analito de interés. Esta liberación y transporte se efectúan durante la operación habitual del ensayo.

El medio de captura comprende un material polímero hídrofílico, preferentemente una membrana de nitrocelulosa o nylón. Los materiales preferidos para su uso como un medio de captura son las películas microporosas o membranas microporosas, las cuales permiten que los reactivos de proteínas sean inmovilizados directamente en la membrana por medio de la adsorción pasiva sin necesidad de fijación química o física. Con este fin, son preferibles las membranas de nitrocelulosa, nylon (66) o materiales similares, que tienen el tamaño de un poro comprendido entre unas 5\mu y unas 20\mu. La membrana de nitrocelulosa podría ser nitrocelulosa sola o un éster de nitrocelulosa mixto. Con preferencia la membrana de nitrocelulosa se reviste o lamina convirtiéndose en una película polímera transparente o translúcida a fin de proveer un soporte físico para la membrana. En el caso de una forma de realización preferida, se usa un polímero de nitrocelulosa, que ha sido fundido en una película de poliéster, como por ejemplo, Mylar (R). Con carácter alternativo se podría usar una membrana de nitrocelulosa laminada en una película de poliéster. Se podrán usar otros materiales de soporte además del poliéster. La función principal del medio de captura consiste en inmovilizar un agente de afinidad químico o inmunológico en uno o más puntos o sitios de captura para capturar los reactivos liberados del medio de liberación.

Como queda expuesto más arriba, los medios de liberación y de captura se juntan entre sí para formar una única trayectoria o vía de líquido. En los medios de liberación y de captura se disponen unos reactivos para detectar, marcar y capturar el analito de interés. En el medio de liberación se ubica un elemento de unión susceptible de reaccionar con un primer epitopo del analito de interés. El elemento de unión va marcado por un marcador detectable. En el medio de liberación aguas abajo del elemento de unión se ubica un componente capturable, el cual comprende un agente de ligazón, susceptible de reaccionar con un segundo epitopo del analito, y un elemento de un par de afinidad. El componente capturable es capaz de formar un complejo con el elemento de ligazón o unión marcado y el analito. Tanto el elemento de unión marcado como el componente capturable se unen de manera amovible al medio de liberación de tal manera que, cuando el frente disolvente creado por la muestra de líquido que se está analizando, pasa a través del medio de liberación, tanto el elemento de ligazón marcado como el componente capturable se solubilizan por el líquido y el flujo con el solvente a lo largo de la trayectoria del líquido. Durante la operación, si un analito está presente en la muestra líquida, en primer lugar reacciona aquél con el elemento de ligazón o unión marcado, y luego con el componente capturable a medida que el frente avanza a lo largo de la trayectoria del líquido. En el momento en que el frente disolvente alcanza la sección del medio de captura del material se ha formado el complejo capturable.

El sitio de captura ubicado en el medio de captura comprende el otro elemento del par de afinidad específico para el componente capturable. Se inmoviliza el elemento de afinidad, con preferencia mediante simple adsorción, en el punto de captura, y no avanza con el frente disolvente.

En el caso de una forma de realización preferente, también se ubica un punto de regulación en el medio de captura aguas abajo del punto de captura. El sitio de control o regulación ha inmovilizado en él un agente de unión, que tiene una afinidad para el elemento de ligazón marcado. El agente de ligazón capturará cualquier elemento de unión marcado, que no se captura en el punto de captura aguas arriba. En funcionamiento la presencia del marcador detectable en el sitio o punto de regulación indica que ha funcionado adecuadamente el transporte por sorción.

Además, la presente invención provee un dispositivo para detectar la presencia de un analito en una muestra líquida. El dispositivo comprende una carcasa alargada que aloja el medio bifásico, y define una entrada para la muestra líquida, un volumen de reserva, un volumen de prueba interpuesto entre la entrada y el volumen de reserva, y una ventana a través de la carcasa para observar el resultado de las pruebas. Con preferencia, la entrada para la muestra y la ventana se ubican en los lados opuestos de la carcasa. Esta última se adapta para recibir los materiales de ensayo, que se disponen secuencialmente dentro de la carcasa en el medio bifásico. Los materiales de ensayo comprenden un absorbente de muestra opcional, el sustrato cromatográfico bifásico y un absorbente de reserva. El medio cromatográfico se posiciona dentro de la carcasa de tal modo que el punto de captura y el punto de reglaje, si lo hubiera, son visibles a través de la ventana. El absorbente de muestra, el sustrato cromatográfico bifásico y el absorbente de reserva están en comunicación del fluido y en conjunto forman una vía o trayectoria del líquido.

En el caso de una forma de realización comúnmente preferida, el dispositivo comprende una carcasa que define una entrada para muestras, un volumen de prueba y un volumen de reserva. Dispuestos en el interior de la caja se hallan un absorbente de muestra, el sustrato cromatográfico bifásico y el absorbente de reserva. El absorbente de muestra se dispone dentro de la carcasa opuesto a la entrada para las muestras. Se encuentra ubicado aguas abajo el absorbente de muestra el sustrato cromatográfico bifásico, que comprende un medio de liberación y un medio de captura juntados entre sí para formar una única vía o trayectoria del líquido. Con preferencia, el medio de liberación comprende papel absorbente, y el medio de captura comprende preferentemente membrana de nitrocelulosa. Con preferencia, tanto el medio de liberación como el medio de captura están laminados formando una película u hoja plástica transparente. En dicho medio de liberación se ubican (i) un elemento de ligazón o enlace, que comprende una proteína de ligazón específica, por ejemplo un anticuerpo monoclonal susceptible de reaccionar con un primer epitopo de dicho analito, estando marcado dicho anticuerpo con un marcador visualmente detectable, tal como partículas de oro coloidales; y (ii) y un componente capturable, que comprende una proteína de ligazón biotinilizada, por ejemplo, en un anticuerpo preferentemente colocado aguas abajo de dicho anticuerpo marcado. El anticuerpo biotinilizado es susceptible de reaccionar con un segundo epitopo del analito y es capaz de formar un complejo con el anticuerpo marcado y el analito. En el medio de captura se halla ubicado un punto de captura para capturar e inmovilizar el complejo. El sitio de captura ha inmovilizado en él un componente de captura, que tiene una elevada afinidad para la porción de biotina del complejo, con preferencia, estreptavidina.

Además, con preferencia, el medio cromatográfico bifásico comprende un punto de regulación colocado en el medio de captura aguas abajo de dicho punto de captura. El sitio de regulación tiene inmovilizado en él un agente capaz de capturar dicho anticuerpo marcado. La función principal del punto de regulación es capturar e inmovilizar el anticuerpo marcado, que no ha sido capturado en el punto de captura. En el caso de la forma de realización preferida corrientemente, el sitio de regulación tiene inmovilizado en él antisueros policlonales específicos para el anticuerpo marcado. La aparición de color procedente de las partículas de oro en el sitio de regulación indica un adecuado funcionamiento de la prueba, independientemente de la presencia o ausencia de analito en la muestra. Tanto el sitio de captura y el sitio de regulación deben ser visibles a través de la ventana de la carcasa.

En el método de la invención, el extremo proximal del sustrato bifásico se pone en contacto con la muestra líquida que se va a analizar. La muestra líquida, impelida por efectos superficiales, como por ejemplo, por acción capilar, se desplaza a lo largo de la vía o trayectoria del líquido formada por el sustrato. Si el analito de interés está presente en la muestra, reacciona secuencialmente con el elemento de ligazón marcado y el componente capturable, formando el complejo capturable, seguido de reacción del complejo con el componente de captura inmovilizado en el sitio de captura. Este proceso da por resultado el complejo marcado que se acumula en el sitio de captura. Se determina la presencia del analito mediante la observación de la presencia del marcador detectable en el sitio de captura. Si no se presenta en la muestra el analito, no se formará el complejo capturable y no aparecerá en el sitio de captura ningún marcador detectable. Si se presenta un sitio de regulación, en el sitio de regulación se acumularán el complejo no ligado o el elemento de ligazón libre marcado.

El método de la invención también podría destinarse a explotar técnicas convencionales "sándwich" o "competitivas" . En el caso de la técnica sándwich, el elemento de ligazón marcado comprende un anticuerpo, que se liga a un epitopo en el analito de interés para formar un complejo antígeno-anticuerpo marcado. Luego este complejo migra al sitio de captura para reaccionar con un componente capturable, el cual, en esta forma de realización, comprende un segundo anticuerpo específico para un segundo epitopo de dicho analito. Por ejemplo, en el caso de la biotina, el elemento de afinidad podría ser la estreptavidina. En el sitio de captura, el analito y el anticuerpo marcado reaccionan con el elemento de captura inmovilizado, para formar un "sándwich" del segundo anticuerpo, analito y anticuerpo marcado. Este complejo sándwich se produce progresivamente en el sitio de captura a medida que la muestra continúa pasando. Cuando se inmoviliza en el sitio de captura conjugado cada vez más marcado, se agregan las partículas coloreadas y se hacen visibles a través de la ventana de la carcasa, indicando la presencia del analito en la muestra líquida. Tanto en la presencia como en la ausencia de un nivel detectable de analito, las partículas coloreadas se acumulan en el sitio de regulación, que también es visible a través de la ventana.

En el caso de la técnica competitiva, se presenta una cantidad conocida del analito de interés en el medio de liberación ubicado aguas arriba de un anticuerpo específico para ello. El analito presente en el medio de liberación está marcado. El analito marcado en el medio de liberación podría comprender, por ejemplo, una muestra auténtica del analito, o una fracción de la misma que tiene afinidad comparable para el anticuerpo. A medida que la muestra líquida se transporta a lo largo del medio de liberación, el analito marcado presente en el medio de liberación y cualquier analito no marcado presente en la muestra compiten por sitios de enlace al anticuerpo. Si en la muestra no aparece ningún analito, en el sitio de captura se agrega anticuerpo-analito marcado, y la presencia de color indica la ausencia de niveles detectables de analito en la muestra. Si se presenta analito, se reduce la cantidad de analito marcado, que se liga en el sitio de prueba, debido a la ligazón de analito en la muestra con el anticuerpo, y no se desarrolla ningún color, o un color apagado.

Con carácter alternativo, se podría usar el sistema descrito para ensayo "sándwich". El anticuerpo específico para el analito se biotiniliza, con estreptavidina que se inmoviliza en el sitio de captura.

El empleo del sistema de detección de partículas coloreadas en combinación con el único sustrato bifásico facilita la construcción de una familia de sistemas de ensayo extremadamente sensibles, los cuales minimizan la ocurrencia de positivos falsos y se pueden usar efectivamente por personas inexpertas.

Ahora se describirá más concretamente la presente invención con referencia a los dibujos adjuntos y como se ilustra en los mismos, pero de manera no limitada, en los cuales:

La figura 1A es una vista desde arriba de una manera de realización de una célula de prueba útil en el dispositivo y proceso de la presente invención, que muestra la ventana del indicador.

La figura 1B es una vista lateral longitudinal del dispositivo de la figura 1A.

La figura 1C es una vista de abajo arriba del dispositivo de la figura 1A.

La figura 1D es una vista del extremo trasero o parte de atrás del dispositivo de la figura 1A.

La figura 1E es una vista en perspectiva de un dispositivo corrientemente preferido, construido de acuerdo con la presente invención.

La figura 2 es una vista esquemática desde arriba del dispositivo de prueba formado por el absorbente de muestra, el sustrato bifásico y el material de reserva.

La figura 3 es una vista esquemática desde arriba de un sustrato bifásico de la presente invención.

La figura 4 es una vista lateral esquemática del dispositivo de prueba de la figura 2.

La figura 5 es una vista esquemática desde arriba del dispositivo de prueba construido de conformidad con la invención.

La figura 6 es una vista esquemática desde arriba de un sustrato de prueba para su uso en una forma de realización varilla de nivel de la presente invención.

La figura 7 es una vista esquemática desde arriba de una forma de realización varilla de nivel de una célula de prueba útil en el dispositivo y procedimiento de la presente invención.

En los dibujos, como caracteres de referencia en las respectivas figuras dibujadas indican las correspondientes piezas o partes.

El método de la invención implica el uso de un nuevo sustrato cromatográfico bifásico para conseguir una indicación fácilmente legible, sensible y reproducible, de la presencia de un analito, tal como una gonadotropina coriónica humana (hCG), u hormona luteinizante (LH), en una muestra de prueba como, por ejemplo, una muestra de orina humana. El método y el dispositivo también se podrían emplear para detectar la presencia de agentes infecciosos en sangre, plasma, moco u otro fluido corporal.

El sustrato cromatográfico bifásico de la presente invención forma la base de pruebas de diagnóstico basados inmunológicamente para la detección de diversos analitos. El uso del sustrato en un dispositivo de diagnóstico permite al operador determinar con alta precisión y sensibilidad la presencia o la ausencia de un marcador biológico, el cual suministra indicaciones de una condición o estado fisiológico.

El sustrato cromatográfico bifásico implica la unión de dos medios diferentes, cada uno con una función específica. El medio de liberación tiene ubicados en él dos reactivos difusibles, secos: un elemento de ligazón específico para un sitio concreto en el analito marcado con oro coloidal u otra marca directa, y un componente capturable, que comprende un elemento de ligazón específico para un sitio diferente en el analito conjugado a un elemento de un par de afinidad. En reconstitución, en contacto con la solución testigo, y en la presencia del analito, los reactivos difusibles reaccionan con el analito para formar un sándwich difusible, el cual se transporta mediante acción capilar al medio de captura. Este último contiene dos reactivos no difusibles: un componente de captura que comprende el otro elemento del par de afinidad y un reactivo específico para el elemento de unión o ligazón marcado. Después de su difusión en el medio de captura, el sándwich difusible se concentra mediante la interacción del elemento de afinidad de captura con la mitad de afinidad capturable, que produce una señal visual.

El sustrato cromatográfico bifásico comprende un medio de liberación juntado a un medio de captura de tal manera que forme una única vía de líquido. El medio de liberación está formado partiendo de una sustancia que tiene en cuenta la liberación de reactivos indicadores, y el medio de captura está formado partiendo de una sustancia, que permite la inmovilización de reactivos para la detección. Con preferencia, el medio de liberación se compone de un material absorbente hidrófilo, siendo su función principal mantener, liberar y transportar diversas partes inmunológicas de la prueba, tal como el componente marcado de prueba. Esta liberación y este transporte se efectúan durante la operación rutinaria del procedimiento de prueba. Los materiales útiles en la formación del medio de liberación incluyen, por ejemplo, papel de borra de algodón, tal como S&S 903 y S&S GB002 (disponible en la firma Schleicher & Schuell, Inc., Keene, N.H.), y BFC 180 (disponible en la firma Whatman, Fairfield, N.J.), y materiales celulósicos tales como Grade 939 hecho de celulosa con poliamida y Grade 1281 hecho de celulosa y rayón con poliamida (disponible en la firma Filtertek Inc.) y fibra de vidrio tal como Borosilicato Lydall (disponible en la Firma Lydall, Inc., Rochester, N.H.). Con preferencia, el medio de liberación se reviste con una solución acuosa, que contiene seroalbúmina bovina (BSA) y un surfactivo no iónico, tal como TritónX-100 (disponible en la firma Rohm & Haas Co., F Philadelphia, PA) a fin de prevenir la ligazón no específica y facilitar la liberación de los reactivos difusibles. Una combinación de aproximadamente un 3% BSA (seroalbúmina bovina) y aproximadamente un 0,1% Triton X-100 resulta útil a este efecto.

\newpage

Con preferencia, el método de captura comprende una película polímera microporosa de nitrocelulosa, nylón 66, una combinación de los dos, u otros diversos materiales de naturaleza similar, que se conocen por aquellas personas expertas en la técnica. Con preferencia, el tamaño de poros oscila entre unas 5\mu y unas 20\mu. La función principal del medio de captura consiste en inmovilizar los reactivos no difusibles usados para detectar la presencia del analito en la prueba. Los reactivos de proteína se pueden inmovilizar en el medio de captura por medio de adsorción, sin la necesidad de modificaciones químicas o físicas. La nitrocelulosa podría incluir nitrocelulosa sola o combinada con un éster de ácido nítrico u otros ácidos. En el caso de una forma de realización preferida, la nitrocelulosa se funde directamente formando una película de polímero clara. Las películas de poliéster comercialmente disponibles, tales como las que se pueden adquirir con el nombre comercial Mylar (R) resultan útiles a este respecto (Mylar (R) es una marca de fábrica de la DuPont DeNemours Company) . La membrana de nitrocelulosa se podría fabricar por técnicas reconocidas, que incluyen la fundición directa del polímero de nitrocelulosa en una hoja o lámina de poliéster, o mediante laminación de una película de nitrocelulosa con una hoja de poliéster. Láminas u hojas prelaminadas o prefundidas útiles en la presente invención se pueden adquirir comercialmente, por ejemplo, en las firmas Millipore Corporation, Bedford, MA y Coming Costar, Norristown, PA. Ambos medios se presentan en la forma de tiras planares, que se juntan entre sí para formar una única vía o trayectoria del líquido. En el caso de una forma de realización preferida, el medio de liberación y el medio de captura se juntan por medio de solapamiento del borde aguas abajo del medio de liberación sobre el borde aguas arriba del medio de captura, adhiriendo a continuación el material bifásico resultante a una película u hoja clara de polímero, manteniéndose de este modo los medios en su lugar.

Ahora se describe el método para la manufactura del único medio cromatográfico bifásico utilizado en la presente invención. En resumen, el medio de liberación y el medio de captura se posicionan de tal suerte que se solapan ligeramente, y en el lado posterior de cada uno de ellos se coloca un adhesivo (siendo la cara posterior el lado opuesto a la que recibirá los reactivos). El adhesivo podría ser cualquier adhesivo fundido en caliente, el cual no llena los poros del medio de liberación o de captura, permitiendo de este modo un flujo sin obstáculo del frente de disolvente a través de los medios. Adhesivos útiles en la presente invención se pueden adquirir comercialmente, por ejemplo, en la firma Adhesives Research Corp. En el caso de una forma de realización corrientemente preferido, el adhesivo se extiende sobre un soporte de polímero claro. A continuación los medios de liberación y de captura solapados se pasan a través de los cilindros o rodillos laminadores de una laminadora juntamente con el adhesivo del dorso, formando un laminado de los medios de captura y de liberación, el adhesivo y el soporte de polímero. Luego el sustrato bifásico laminado resultante está preparado para recibir los reactivos, que se depositan como "tiras" continuas en la parte superior del sustrato. Una vez que se han depositado y secado los reactivos, si fuera necesario, se corta el sustrato en el tamaño deseado.

Los reactivos difusibles y no difusibles se pueden aplicar a los medios de liberación y de captura, respectivamente, por medio de cualquier técnica bien conocida. En el caso de una forma de realización corrientemente preferida, se aplican los reactivos de anticuerpo difusibles al medio de liberación mediante la aplicación directa en la superficie del medio y se secan para formar una banda o cinta estrecha. Los reactivos no difusibles se aplican al medio de captura mediante adsorción pasiva.

Para su uso, el sustrato cromatográfico bifásico se sitúa dentro de un dispositivo de pruebas, el cual también forma parte de esta invención. Como mínimo, el dispositivo comprende un alojamiento que encierra el sistema bifásico para llevar a cabo el ensayo. En la solicitud de diseño, número de serie o fabricación 29/023,294 registrada el 23 de mayo de 1994 se muestra una configuración de alojamiento preferida.

El método y el dispositivo de la invención coadyuvan a facultar a personal inexperto la comprobación segura de la presencia de cantidades sumamente pequeñas de un analito concreto evitándose al mismo tiempo positivos falsos y simplificando los procedimientos de prueba en juegos o conjuntos de prueba para sobre ensayos - contra ensayos, que posibilitan a un usuario el autodiagnóstico, por ejemplo, el embarazo, la ovulación, la enfermedad venérea y otra enfermedad, la infección o la anormalidad clínica, que da por resultado la presencia de una sustancia de marcador antigénica en un fluido corporal, con inclusión de la determinación de la presencia de metabolitos de drogas o toxinas. El proceso del ensayo y el dispositivo están diseñados específicamente para detectar la presencia de un analito individual preseleccionado, presente en un fluido corporal.

Además del sustrato cromatográfico bifásico el dispositivo podría comprender un absorbente de muestra dispuesto en el interior de la carcasa en la proximidad del sustrato cromatográfico y en comunicación de fluido con la misma. Con preferencia el absorbente de muestra es un material hidrófilo absorbente, el cual facilita la adsorción y el transporte de una muestra del fluido al medio cromatográfico bifásico. Este tipo de materiales podrían incluir acetato de celulosa, poliéster hidrofílico y otros materiales que poseen propiedades similares. También se podrá usar una combinación de materiales absorbentes. Los materiales preferidos incluyen acetato de celulosa ligado, poliolefina ligada o poliéster hidrofílico, tales como aquellos materiales comercialmente disponibles en la American Filtrona Company (Richmond, VA). Otros materiales preferidos incluyen papeles absorbentes como, por ejemplo, Grade 939 o Grade 1281, disponible en la firma Filtertek, Inc. Con preferencia, el absorbente de la muestra se recubre con una solución tamponada que contiene -BSA (seroalbúmina bovina) y un surfactivo no iónico, como, por ejemplo, Triton X-100. La presencia de BSA (seroalbúmina bovina) y del agente surfactivo minimizan la absorción no específica del analito. Una concentración de aproximadamente el 1% de BSA y aproximadamente el 0,2% de agente surfactivo en tris tampón es efectivo para este fin.

\newpage

Además, el dispositivo podrá incluir un absorbente de reserva aguas abajo del sustrato cromatográfico y en comunicación de fluido con él. Al proveer una reserva de material sorbente dispuesto aguas abajo del sustrato cromatográfico, se puede arrastrar a través de la zona de prueba un volumen relativamente grande del líquido de prueba y cualquier analito contenido en él para ayudar la sensibilidad. Con preferencia, el material de reserva comprende un material hidrófilo, el cual podría ser el mismo que el absorbente de la muestra aguas arriba. El fin del absorbente de reserva es facilitar la acción capilar a lo largo del sustrato cromatográfico y absorber el líquido excedente contenido dentro del dispositivo. Con preferencia, el absorbente de reserva comprende papel absorbente o secante hecho de fibras largas de borra de algodón, como por ejemplo, S&S 300, S&S 470 y S&S 900, (disponible en la firma Schleicher & Scuell, Inc.) o materiales celulósicos, tales como Grade 3MM (disponible en Whatman) y Grade 320 (disponible en Alhstrom).

Con carácter general, el dispositivo y el método de la invención se pueden emplear para detectar cualquier analito, que hasta ahora ha sido examinado utilizando procedimientos de inmunoensayo conocidos, o es detectable mediante esta clase de procedimientos, que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales u otras proteínas. Diversos protocolos de ensayo específicos, reactivos y analitos útiles en la práctica de la invención son conocidos per se, véase por ejemplo, US Patente n° 4,313,734 y US Patente n° 4,366,241.

La combinación de características estimadas como responsables de la excelente sensibilidad y reproducibilidad de los ensayos estructurados de conformidad con la invención es el uso del nuevo sustrato cromatográfico bifásico y el uso de un sol de metal u otra partícula coloreada como un sistema marcador, el cual permite la observación visual directa del desarrollo del color. También se podría incluir un medio de filtración que limita la introducción de contaminantes procedentes de la muestra al sitio de prueba.

El ensayo se realiza mediante la simple colocación de la entrada del dispositivo en contacto con la muestra de prueba líquida. La carcasa del dispositivo podría estar configurada para permitir el contacto directo con un fluido corporal, o como una varilla de nivel para su inmersión en un contenedor del fluido corporal o de otra solución de prueba. Después del contacto con el fluido de prueba, tan solo se espera a que la muestra de la prueba pase a través del sustrato cromatográfico bifásico y se ponga en contacto reactivo con el sitio de prueba (y opcionalmente uno o más sitios de regulación) visible a través de una ventana o varias ventanas en la carcasa exterior del dispositivo. En el caso de una forma de realización preferida, el elemento de ligazón marcado específico para el analito se ubica en forma preservada en el medio de liberación en la vía o trayectoria del flujo dentro del dispositivo. Si en la muestra está presente el analito, pasa este a través de la entrada y el interior del dispositivo a lo largo del sustrato cromatográfico, donde, en el caso de la forma de realización sándwich, reacciona con la proteína de ligazón marcada, y un componente capturable conjugado con un agente de afinidad. El complejo formado por el analito, el elemento de enlace marcado y el conjugado de afinidad reacciona con un agente de afinidad de captura inmovilizado en el sitio de captura, que es específico para el agente de afinidad en el conjugado. En el sitio o punto de captura se forma un complejo, que comprende agente de captura inmovilizado, conjugado capturado, analito y elemento de ligazón marcado. La presencia del complejo y, por consiguiente, el analito, se indican mediante el desarrollo de color causado por la agregación de las partículas de soles de metales en el sitio o punto de captura.

De lo que precede se pondrá de manifiesto o evidenciará el éxito del procedimiento de prueba depende del analito presente en la muestra, que reacciona con el elemento de unión marcado, o de la competición reproducible entre el analito y el elemento de enlace o ligazón por sitios de unión en el sitio de captura. De conformidad con la invención, como queda indicado más arriba, el elemento de ligazón marcado y el conjugado capturable se disponen en forma preservada, por ejemplo, secados al aire o liofilizados, en el medio de liberación dentro del dispositivo aguas arriba de los puntos o sitios de captura y de regulación. El analito, si lo hubiera, que pasa a través del dispositivo y se arrastra en el interior del líquido se desplaza en contacto con el elemento de ligazón marcado y el componente capturable formando un complejo inmune o iniciando la competición in situ a medida que continúa el flujo, dicho complejo por último es capturado por los reactivos inmovilizados en el medio de captura.

Refiriéndonos ahora a los dibujos, las figuras 1A-E ilustran esquemáticamente una forma de realización de un dispositivo de pruebas (5) diseñado de acuerdo con la invención útil en la exposición de sus principios de construcción. Comprende una carcasa exterior, moldeada (10), la cual define un cerramiento hueco, alargado. La carcasa (10) define una entrada (14) para el líquido de la prueba y una abertura (16), la cual comprende una ventana, a través de la cual son visibles los puntos de captura y de regulación. Como queda ilustrado en las figuras 1A - E, la ventana (16) se ubica en un lado de la carcasa (10) opuesto a la entrada (14) de la muestra. Esta configuración reduce la incidencia de contaminación del sitio de prueba que se ubica en el interior de la carcasa (10) y se puede ver a través de la ventana (16). La abertura de ventilación (38) reduce la incidencia de "obstrucción por vapor" en el interior del dispositivo durante su uso. La presencia de unas aberturas (40 y 42) ayuda a reducir la "inundación o desbordamiento" del sustrato cromatográfico, lo cual pudiera ocurrir si el usuario aplica demasiada muestra al dispositivo.

La figura 2 ilustra esquemáticamente una forma de realización preferida de los materiales de ensayo, que, cuando el dispositivo está totalmente ensamblado, se sitúan en el interior de la carcasa (10). Los materiales de ensayo incluyen el material absorbente (12), el sustrato cromatográfico bifásico (18) y el material de reserva (24). Los materiales de ensayo y el interior de la carcasa (10) juntamente definen una vía o trayectoria de flujo que, generalmente, pasa de derecha a izquierda en las figuras 1A, B y C. Cuando el dispositivo de prueba queda colocado con la entrada (14) ubicada en el interior o, sino, en contacto con una muestra líquida, el líquido se transporta mediante acción capilar, empaquetadura de algodón o simple humectación a lo largo de la vía o trayectoria de flujo aguas abajo a través del absorbente (12), a lo largo del sustrato cromatográfico (18), y penetra en la cubeta de reserva (24), por lo general, como se representa gráficamente por la flecha. El material absorbente (12) dispuesto en el interior de la entrada (14) también sirve de filtro que se puede retirar de muestras de prueba impuras materia en partículas y factores de interferencia.

La figura 3 ilustra esquemáticamente el sustrato cromatográfico bifásico (18) que comprende un medio de liberación (30) y un medio de captura (32). Colocado de forma amovible en el medio de liberación (30) hay una banda (26) de elemento de ligazón marcado deshidratado, por ejemplo, sol de metal-anticuerpo. A medida que la muestra líquida se desplaza más allá de la banda o franja (26) el elemento de ligazón marcado es arrastrado en el líquido, reconstituido, y reacciona o compite con cualquier analito presente en la muestra líquida. Situado aguas abajo del elemento de ligazón marcado hay una franja (28) de complejo capturable deshidratado. Este último incluye un elemento de ligazón, unión o enlace, el cual se liga a un segundo epitopo del analito, por ejemplo, un anticuerpo y un componente de afinidad capturable, por ejemplo biotina. El complejo capturable también es arrastrado en la muestra líquida a medida que avanza a lo largo del sustrato (18).

El sitio de captura (34) y el sitio de regulación (36) respectivamente quedan inmovilizados en el medio de captura (32). En la figura 3, se ilustran los sitios de regulación y de captura ubicándose en serie a lo largo de la vía o trayectoria de flujo. Con carácter alternativo, el sitio o los sitios de regulación y de captura se podrían ubicar lado a lado o en otras relaciones espaciales. El sitio de captura (34) comprende una cantidad preseleccionada de un elemento de afinidad de captura específico para el componente de afinidad capturable, ubicado en el medio de liberación. El componente capturable queda inmovilizado en su sitio dentro de la vía o trayectoria de flujo. Por ejemplo, cuando el elemento de afinidad capturable es biotina, el componente de captura podría ser estreptavidina. El sitio de control (36) comprende antisueros inmovilizados o anticuerpo específico para el elemento de ligazón, unión o enlace marcado.

La figura 4 ilustra esquemáticamente una vista lateral de la porción operativa de los materiales de ensayo. Como queda representado, el material absorbente (12) se sitúa en la proximidad del medio de liberación (30), y solapa al medio de liberación en un extremo. A su vez el medio de liberación (30) solapa al medio de captura (32), que se ubica distal al medio de liberación (30). El absorbente de reserva (24) solapa el extremo distal del medio de captura (32). Estos cuatro componentes en conjunto forman una única vía de flujo, y cooperan o contribuyen a hacer que el líquido de muestra fluya desde el absorbente (12) a lo largo del medio de liberación (30) y el medio de captura (32) al absorbente de reserva (24).

La figura 5 ilustra esquemáticamente una forma de realización preferente de la porción operativa del dispositivo de ensayo. Como queda representado, el medio de liberación (30) tiene colocada en él de manera amovible una franja de elemento de ligazón marcado (28), el cual, en el caso de la forma de realización preferida, es un anticuerpo monoclonal conjugado a partículas de soles de oro. Dispuesta aguas abajo de la franja (26) se halla la franja (28), que incluye el componente capturable, el cual, en el caso de la forma de realización preferente, es un segundo anticuerpo específico para el mismo analito conjugado a la biotina. La franja (28) también está ubicada de forma amovible en el medio de liberación (30). Situado aguas abajo del medio de liberación (30) está el medio de captura (32), que tiene inmovilizado en él el sitio de captura (34), el cual, en el caso de la forma de realización preferente, es la estreptavidina. En el medio de captura (32) aguas abajo del sitio de captura (34) se ubica el sitio de regulación (36), el cual, en el caso de la forma de realización preferida, es antisuero policlonal específico para el anticuerpo marcado de la franja (26).

La invención no resulta limitada por la naturaleza concreta del sitio de captura (34) y el correspondiente sitio de reglaje (36), y de hecho, si se desea, se podría eliminar enteramente el sitio de reglaje (36). Generalmente, el anticuerpo u otro agente de afinidad se pueden inmovilizar en el punto o sitio de captura (34) y en el sitio de regulación (38) por medio de absorción o acoplamiento iónico o covalente, de conformidad con métodos conocidos per se. Con preferencia, se selecciona el medio de captura (32) para ligar los reactivos de captura sin la necesidad de acoplamiento químico. Tanto la nitrocelulosa como el nylón permiten la ligazón no química del componente de captura y del reactivo de regulación.

Como queda representado en la figura 5, aguas abajo del medio de captura (32) se dispone el reservorio (24) que comprende una cantidad o volumen relativamente grande de material absorbente o superabsorbente. La finalidad del reservorio (24) consiste en asegurar que una cantidad razonablemente grande del líquido de prueba atraviesa el medio cromatográfico.

La figura 6 es una ilustración esquemática de una forma de realización de los materiales de ensayo útiles en la ejecución de ensayos con varilla de nivel. En la forma de realización representada, se omite el absorbente de la muestra (12) y el medio de liberación (30) actúa como el absorbente de la muestra.

Antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales o fracciones de los mismos con propiedades de ligazón específicas y alta afinidad para virtualmente cualquier sustancia antigénica, que son útiles en la presente invención como elementos de enlace, unión o ligazón y materiales de captura, son conocidos y comercialmente disponibles, o se pueden producir partiendo de líneas de células estables, que utilizan la fusión celular bien conocida y técnicas de tamizado. La bibliografía está llena de protocolos para la producción e inmovilización de proteínas. Ver por ejemplo, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular,Biology, Tijssen, Vol. 15, Práctica y Teoría de inmuno-ensayos de enzimas, capítulo 13, La Inmovilización de inmunorreactivos en Fases Sólidas, páginas 297-328, y las referencias citadas en el mismo.

\newpage

También son conocidos per se los soles de metales y otros tipos de partículas coloreadas útiles como sustancias marcadoras en los procedimientos de ensayos inmunológicos. Véase, por ejemplo la US Patente n° 4,313,734. Para detalles y principios de ingeniería implicados en la síntesis de conjugados de partículas coloreadas, véase Horisberger, Evaluación de Oro Coloidal como un Marcador Citocrómico para la Transmisión y la Micro Electrónica y de Exploración Radiográfica, Biol. Celular, 36, 253-258 (1979); Leuvering et al., Inmuno-ensayos con partículas de soles, J. Immunoassay, 1 (1): 77-91 (1980), y Frens, Nucleación Controlada para la Regulación del Tamaño de Partícula en Suspensiones de Oreo Monodispersas, Nature. Ciencia Física, 241: 20-22 (1973).

En el caso de una forma de realización corrientemente preferida, el dispositivo para ensayo inmunológico de la presente invención está destinado a detectar el embarazo humano. En esta forma de realización, el elemento de ligazón marcado es un anticuerpo monoclonal (Mab) contra la gonadotropina coriónica humana (hcG) marcada con oro coloidal. Para este objeto, se prefiere el Mab designado con 2G9 (disponible en la firma Carter-Wallace, Inc. Para el complejo capturable se usan anticuerpos anti-hCG, marcados con biotina. Los anticuerpos monoclonales, que se pueden usar para este fin, incluyen los anticuerpos monoclonales específicos hCG designados 2B2 y B 109 (disponibles en la firma Carter-Wallace, Inc.) y CCF01 (disponible en la firma Scripps Laboratory). Son bien conocidos los métodos para conjugar la biotina a anticuerpos y no forman un plan de la presente invención. Con preferencia, se coloca un sitio de regulación aguas abajo del sitio de captura. El sitio de regulación tiene inmovilizado en la cabra anti-ratón IgC específico para el anti-hCG (disponible en Scantibodies Laboratory). * (El término "cabra" que aparece y aparecerá en lo sucesivo con la expresión "cabra anti-ratón", "cabra anti-conejo" proviene de que una proteína de conejo se inyecta en una cabra y la cabra produce anticuerpo contra esa proteína de conejo. Esos anticuerpos se denominan anticuerpo "cabra anti-conejo" lo mismo sucede con la expresión "cabra anti-ratón").

En el caso de otra forma de realización preferente, el presente dispositivo de ensayos inmunológicos se destina a detectar la ovulación humana. En esta forma de realización el elemento de ligazón marcado comprende Mab 2G9, que es específico para la hormona luteinizante (LH) y hCG, marcadas con oro coloidal. El complejo capturable comprende Mab LH26 LH-específico biotinilizado (disponible en la firma Carter-Wallace, Inc.). Con preferencia, el sitio de captura comprende estreptavidina y el sitio de regulación comprende cabra anti-ratón IgC específico para el MAb marcado.

En el caso de otra forma de realización, el dispositivo podría ser adaptado para detectar agentes infecciosos, tales como estreptococos. En esta forma de realización, el elemento de ligazón marcado es un anticuerpo policlonal conejo, específico para estreptococos marcado con oro coloidal u otro marcador directo. El complejo capturable es el mismo anticuerpo policlonal conjugado a biotina, y los componentes de captura y de reglaje incluyen estreptavidina y cabra anti-conejo IgC.

La carcasa (10) puede tomar diversas formas. Por lo general, comprenderá una carcasa alargada, que presentará partes encajadas entre sí, fabricadas a base de un material plástico, como por ejemplo, cloruro de polivinilo, polipropileno, poliestireno o polietileno. La vía del flujo interior contendrá un material relativamente inerte o una combinación de materiales idóneos para facilitar el transporte del líquido. La carcasa (10) se podría adecuar para el contacto directo con un líquido de la muestra, como se representa en la forma de realización ilustrada en las figuras 1A -E, o se podría adaptar a la forma de varilla de nivel, que no se representa en esta memoria descriptiva, pero es bien conocida en la técnica.

De lo que precede resultará evidente que las ventajas en reproductibilidad, sensibilidad y evitación de positivos falsos de los sistemas de ensayo diseñados de conformidad con la invención son trazables para formar una combinación de características de la invención. En la práctica, el sustrato cromatográfico bifásico da por resultado un eficiente transporte de los reactivos, lo cual permite una detección más sensible del analito.

La presente invención será descrita más detalladamente con referencia a la siguiente exposición. En ella los dispositivos de las pruebas se describen con referencia a las figuras 1 - 6 de los dibujos que han sido descritos brevemente más arriba.

Prueba de embarazo

La configuración comúnmente preferida para la carcasa destinada al dispositivo de pruebas, que incorpora la invención, se representa en las figuras 1A-E. La configuración corrientemente preferida de los materiales de la prueba, que incluyen el absorbente de la muestra, el sustrato cromatográfico bifásico y el reservorio se representa en las figuras 2-5. En la figura 6 se representa una modificación de los materiales de prueba descritos gráficamente en las figuras

\hbox{2-5.}

Como se representa en las figuras 1A-E, la célula de prueba preferida de la invención comprende un par de partes polímeras, encajadas entre sí, las cuales, cuando está ensamblado el dispositivo, define un cerramiento. La carcasa (10) se destina a recibir el sustrato cromatográfico bifásico y los relativos absorbentes, mostrados en las figuras 2-5. Los materiales del ensayo se disponen dentro de la carcasa (10), de tal manera que el soporte de polímeros claros (46) se sitúa opuesto a la ventana (16) (figura 1A). Los resultados del ensayo se pueden leer a través de la capa de polímeros claros (46), la presencia de la capa (46) impide la contaminación del sitio de prueba durante su uso. En funcionamiento, el líquido de la prueba aplicado a través de la entrada (14) se absorbe por el absorbente (12) de la muestra, y se remoja a lo largo del sustrato (18) cromatográfico, que define la vía o trayectoria de flujo, introduciéndose en el volumen de reserva (24). En el caso de la forma de realización con varilla de nivel, el sustrato cromatográfico representado en la figura 6, que carece de material absorbente (12), se dispone en una carcasa, destinada a recibirlo, lo que queda representado en la figura 7.

En el caso de la forma de realización corrientemente preferida, el absorbente (12) es poliéster hidrofílico ligado (American Filtrona); el medio de liberación es papel S&S 903 o papel S&S GB002 (ambos procedentes de la firma Schleicher & Schuell); el medio de captura es membrana de nitro-celulosa fundida (o laminada) en tereftalato polietileno claro (PET) (disponible en la firma Millipore Corp.); el absorbente de reserva (24) es papel S&S 300 (Schleicher & Schuell). Los medios de liberación y de captura se laminaron en PET claro 5 mil, pre-revestido con un adhesivo (disponible en Adhesives Research). Las dimensiones del material absorbente (12) son aproximadamente 5.0 x 1.27 x 0.25 cm (2.0 x 0.5 x 0.1 pulgadas) en cada lado. Las dimensiones del medio de liberación (32) del sustrato cromatográfico bifásico (18) son aproximadamente 2.8 x 0.8 x 0.06 cm. (1.1 x 0.32 x 0.025 pulgadas), y para el medio de captura, aproximadamente 2.5 x 0.8 x 0.018 cm. (1 x 0.32 x 0.007 pulgadas). Las dimensiones de la almohadilla del absorbente de reserva son aproximadamente 2.0 x 0.26 x 1.06 cm. (0.8 x 0.1 x 0.4 pulgadas). Un número de estos sustratos se produjeron y además se trataron para adaptarlos a la detección del embarazo por medio del ensayo de orina para la presencia de gonadotropina coriónica humana (hCG). Los reactivos de la prueba fueron anticuerpo monoclonal hCG 2G9 (obtenidos en la firma Carter-Wallace, Inc.) marcado con oro coloidal 15-30 nm. En tamaño; anticuerpo CCFO1 monoclonal hCG biotinilado (obtenido en Scripps Laboratory); estreptavidina, material liofilizado, reconstituido en tampón de fosfato hasta una concentración de 2 mg/ml; y cabra anti-ratón IgG, solución ajustada a una concentración de 1 mg/ml en tampón de dosfato. Los reactivos de la prueba fueron posicionados en los medios, como queda representado en las figuras 3 y 5.

Protocolo de las pruebas

Se prepararon dos muestras del ensayo de embarazo mediante el empleo de medios cromatográficos bifásicos como queda descrito más arriba. Se preparó una muestra designada "prueba 1") utilizando como medio de captura una membrana nitrocelular, que ha sido fundida formando un soporte de poliéster. Todos los otros aspectos de los medios cromatográficos bifásicos eran idénticos.

La prueba se llevó a cabo mediante la aplicación de unas soluciones que contienen cantidades conocidas de hCG (gonadotropina coriónica humana) comercialmente disponibles al extremo proximal de los medios cromatográficos, y permitiendo la continuación de las soluciones de la prueba mediante la acción capilar a través del medio bifásico.

Para comparación, un conjunto de pruebas de embarazo de venta en los comercios (Primera Respuesta™, Carter-Wallace, Inc., New York, NY) se sometió al mismo procedimiento. El conjunto de pruebas comercial usa un medio cromatográfico monofásico, que consta de un material celulósico hidrófilo. Las diferencias entre las muestras de prueba y la prueba comercial figuran en la tabla 1.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Los resultados del procedimiento de la prueba se registran en la tabla 2.

TABLA 2

2

El color rosado fue claramente visible en 50 mIU de gonadotropina coriónica humana para ambas muestras de prueba, pero no para el producto comercial. Los resultados indican que la prueba de la presente invención puede detectar el embarazo en un ser humano tan pronto como el día de un periodo menstrual perdido. En las fases iniciales de verificación, se han realizado aproximadamente 50 muestras negativas desde diversas fuentes con positivos no falsos o incluso casos límite. Por contraste, en 50 mIU de hCG, la prueba comercial de embarazo mostró un resultado negativo.

La tabla 3 ilustra las cantidades de reactivos necesitados para la prueba de embarazo (Prueba 2) hecha utilizando el sustrato bifásico de la presente invención en comparación con la prueba comercial. Como queda consignado en fa tabla 3, las pruebas de la presente invención requieren significativamente menos reactivo y (como se indica en la tabla 2) ambos son más sensibles y más exactos.

TABLA 3

3

La tabla 4 muestra los resultados de pruebas actuales o reales efectuadas mediante el empleo del presente dispositivo de la prueba de embarazo. Todas las versiones enumeradas en la tabla 4 contienen el medio bifásico y los reactivos descritos anteriormente, pero difieren en la configuración de la carcasa (10). Sorprendentemente se ha descubierto que ciertas modificaciones físicas en la carcasa (10), concretamente la introducción de respiraderos (38), (40) y (42) (figuras 1 B, 1 E), dan por resultado una significativamente más elevada exactitud y unos resultados menos nulos. Las diferencias entre las distintas versiones consignadas en la tabla 4 son las siguientes:

Versión 1

Esta versión tenía largos postes o pilares que se rompieron fácilmente cuando los componentes se almacenaron en bolsas de plástico. Los dispositivos se partieron fácilmente cuando se dejaron caer desde encima de la mesa.

Versión 2

En esta versión se acortaron los postes o pilares para eliminar la rotura. Se añadió un stop de la orina para impedir que la orina contornee el medio de liberación y humedezca la membrana.

Versión 3

Esta versión añadió pilares para impedir la desunión del dispositivo cuando se deja caer. Se incluyeron unos stops adicionales para la orina a fin de evitar, además, el desbordamiento de la membrana. Se añadió una varilla transversal al alojamiento superior para impulsar el absorbente aguas arriba contra la membrana a fin de ayudar en el flujo de la muestra y en la separación del oro.

Versión 4

Se modificaron los dispositivos de la versión 3, recortando a mano unos respiraderos en el dispositivo. Para impedir la inundación de la membrana se recortaron en el alojamiento superior dos respiraderos laterales largos y un respiradero de base corto.

Versión 4 modificada

Se modificaron los dispositivos de la versión 4 mediante el recortado de una ventana en el alojamiento superior similar a la zona de recogida de la orina en el alojamiento inferior. Este dispositivo se llamó "bilateral". La muestra se podía aplicar al anverso o al reverso del dispositivo.

La versión 5 representa la forma de realización corrientemente preferida del dispositivo para la prueba de orina. Como queda consignado en la tabla 4, las pruebas se terminaron en menos de cinco minutos, con resultados no nulos.

Claims (40)

1. Un método o procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra líquida, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en:

a)

preparar un sustrato (18) cromatográfico bifásico, que comprende un primer medio de liberación (30) de un material hidrofílico o absorbente y, en comunicación del flujo de líquido con dicho medio y aguas abajo del mismo, un medio de captura (32) de un segundo material polímero, hidrófilo con diferente microporosidad, en que dichos medios de liberación y de captura forman en conjunto una única vía o trayectoria del flujo de líquido, y en que se disponen de manera amovible en dicho medio de liberación:

(i)

un conjugado marcado, que comprende un elemento de unión o enlace susceptible de reaccionar con un primer epitopo de dicho analito marcado con un marcador detectable, y

(ii)

un componente capturable, susceptible de reaccionar con un segundo epitopo de dicho analito, de tal manera que, si el analito está presente en la muestra, dicho analito produce un complejo, que comprende dicho conjugado marcado, dicho analito y dicho componente capturable, y en dicho medio de captura queda situado un sitio de captura (34) para capturar dicho complejo, presentando inmovilizado en él el sitio de captura un componente de captura, que tiene una afinidad de unión o ligazón para dicho componente capturable;

b)

poner en contacto una muestra líquida con el medio de liberación (30) de tal suerte que el líquido circule aguas abajo a lo largo de la trayectoria del flujo de líquido para llegar a dicho sitio de captura o fijación (34); y

c)

determinar la presencia o ausencia del analito mediante observación de la presencia o ausencia de dicho marcador detectable en dicho sitio o punto de captura (34).

2. El método o procedimiento según la reivindicación primera, en que dicho componente capturado se dispone aguas debajo de dicho conjugado marcado en dicho medio de liberación (30).

3. El método según la reivindicación primera, en que dicho analito es la gonadotropina coriónica humana.

4. El método según la reivindicación primera, en que dicho analito es la hormona luteinizante.

5. El método según la reivindicación primera, en que dicho medio de captura está laminado formando un material polímero transparente o fundido en este último.

6. Un método según la reivindicación primera, en que dicho marcador detectable es una partícula coloreada.

7. El método según la reivindicación sexta, en que dicha partícula coloreada comprende una partícula de sol de oro.

8. El método según la reivindicación primera, en que dicho componente capturable es un anticuerpo biotinilizado.

9. El método según la reivindicación primera, en que dicho componente de captura inmovilizado es la avidina o la estreptavidina.

10. El método o procedimiento según la reivindicación primera, en que, además, dicho medio de captura (32) comprende un sitio de regulación o control (36), ubicado aguas debajo de dicho sitio de captura (34), que presenta inmovilizado en el mismo un agente susceptible de capturar dicho conjugado marcado.

11. Un dispositivo (5) para determinar la presencia de un analito en una muestra líquida, en que la muestra líquida depositada en un extremo proximal del dispositivo se desplaza aguas abajo a lo largo de una vía de líquido hasta el extremo dista) del dispositivo, comprendiendo dicho dispositivo lo siguiente:

un sustrato (18) bifásico, que comprende un medio de liberación (30) constituido por un primer material hidrofílico, absorbente y, en comunicación líquida y aguas debajo de éste, un medio de captura (32) constituido por un segundo material polímero hidrófilo con diferente microporosidad, en que en el medio de liberación del dicho sustrato bifásico para la liberación del mismo figuran o se ubican:

(i)

un conjugado marcado, que comprende un elemento de unión o enlace, susceptible de reaccionar con un primer epitopo de dicho analito marcado con un marcador detectable, y

(ii)

un componente capturable, susceptible de reaccionar con un segundo epitopo de dicho analito, de tal manera que, si dicho analito está presente en dicha muestra, dicho analito es capaz de formar un complejo de dicho conjugado marcado, dicho analito y dicho componente capturable, y en dicho medio de captura de dicho sustrato se dispone o sitúa.

un sitio de captura (34) para capturar dicho complejo, quedando inmovilizado en el mismo un componente de captura, que tiene una afinidad de ligazón o enlace para dicho componente capturable.

12. El dispositivo según la reivindicación undécima, que comprende, por otra parte, un sitio de reglaje o control (36), que se halla situado aguas debajo de dicho sitio de captura (34) en dicho medio de captura, quedando inmovilizado en dicho sitio de reglaje un agente capaz de capturar dicho conjugado marcado.

13. El dispositivo según la reivindicación undécima, en que dicho analito es gonadotropina coriónica humana.

14. El dispositivo según la reivindicación undécima, en que dicho analito es una hormona luteinizante.

15. El dispositivo según la reivindicación undécima, en que dicho componente capturable es un anticuerpo biotinilizado.

16. El dispositivo según la reivindicación undécima, en que dicho componente de captura inmovilizado comprende la avidina, la estreptavidina o un anticuerpo de antibiotina.

17. El dispositivo según la reivindicación undécima, en que dicho componente capturable se dispone aguas abajo del conjugado marcado en el medio de liberación (30).

18. El dispositivo según la reivindicación undécima que, por otra parte, comprende un material de hoja transparente, impermeable al analito sobre una cara de dicho medio de captura (32).

19. El dispositivo según la reivindicación decimooctava, que comprende una carcasa (10) la cual aloja dicho sustrato y define una ventana (16) para observar dicho sitio de captura (34), y una entrada (14) para la muestra líquida, en comunicación de fluido con dicho medio de liberación (30), quedando situadas dicha ventana y dicha entrada en los lados opuestos de dicha carcasa.

20. Un dispositivo para determinar la presencia, en una muestra líquida, de un analito, en que una muestra líquida se deposita en un extremo proximal del dispositivo, se desplaza o circula aguas abajo a lo largo de una vía o trayectoria de líquido hasta el extremo distal del dispositivo, comprendiendo dicho dispositivo lo siguiente:

a)

un sustrato (18) bifásico, que comprende un medio de liberación (30) constituido por un primer material hidrofílico, absorbente y en comunicación de líquido aguas abajo del mismo, un medio de captura (32), constituido por un segundo material polímero hidrófilo con diferente microporosidad, en que se disponen dentro de dicho medio de liberación de dicho sustrato bifásico con el fin de este último:

(i)

un conjugado marcado, que comprende un elemento de ligazón o enlace, susceptible de reaccionar con un primer epitopo de dicho analito con un marcador detectable, y

(ii)

un componente capturable susceptible de reaccionar con un segundo epitopo de dicho analito, de tal manera que, si dicho analito está presente en dicha muestra, dicho analito produce un complejo, que comprende dicho conjugado marcado, dicho analito y dicho componente capturable, y en dicho medio de captura de dicho sustrato bifásico se dispone un sitio de captura (34) para capturar dicho complejo, quedando inmovilizado en dicho sitio de captura un componente de captura, que tiene una afinidad de unión o ligazón para dicho componente capturable; y

b)

una carcasa (10), que encierra dicho sustrato bifásico definiendo dicha carcasa una entrada (14) para la muestra en comunicación de fluido con dicho medio de liberación de dicho sustrato bifásico y una abertura (16) de detección para observar dicho sitio o punto de captura.

21. El dispositivo según la reivindicación vigésima, que, por otro lado, comprende un sitio de reglaje o control (36) situado aguas debajo de dicho sitio de captura (34), teniendo inmovilizado en él dicho sitio o punto de regulación o control un agente capaz de capturar dicho conjugado marcado.

22. El dispositivo según la reivindicación vigésimo primera, en que dicha carcasa define, por otra parte, una abertura de control o reglaje, ubicada aguas debajo de dicha abertura de detección para observar dicho sitio de regulación o control.

23. El dispositivo según la reivindicación vigésima, en que dicha abertura de detección se dispone en un lado de dicha carcasa opuesto a dicha entrada para la muestra.

24. El dispositivo según la reivindicación vigésima, en que dicho sustrato bifásico presenta la forma de una hoja plana y en que dichos conjugado marcado, componente capturable y sitio de captura se sitúan sobre una superficie de dicha hoja.

25. El dispositivo según la reivindicación vigésima, en que dicho medio de captura está laminado o fundido para formar un material polímero transparente.

26. El dispositivo según la reivindicación vigésima que, por otra parte, presenta o comprende un absorbente (22) de la muestra, el cual se ubica aguas debajo de dicho sustrato bifásico y en comunicación de fluido con dicho
sustrato.

27. El dispositivo según la reivindicación vigésima, que comprende, por otro lado, un absorbente de reserva (24), que se halla situado aguas debajo de dicho sustrato bifásico y en comunicación de fluido con dicho sustrato.

28. El dispositivo según la reivindicación undécima o vigésima, en que dicho elemento de ligazón o enlace de dicho conjugado marcado es un anticuerpo.

29. El dispositivo según la reivindicación undécima o vigésima, en que dicho componente capturable es un anticuerpo biotinilizado.

30. El dispositivo según la reivindicación vigésimo novena, en que dicho componente de captura inmovilizado comprende la avidina, la estreptavidina o un anticuerpo de antibiotina.

31. El dispositivo según la reivindicación undécima o vigésima, en que dicho medio de liberación (30) y dicho medio de captura o fijación (32) de dicho sustrato bifásico quedan ambos inmovilizados en un único soporte de apoyo dorsal.

32. El dispositivo según la reivindicación undécima o vigésima, en que dicho primer material hidrofílico, absorbente de dicho sustrato bifásico es un papel absorbente secante.

33. El dispositivo según la reivindicación undécima o vigésima, en que dicho segundo material polímero hidrófilo, microporoso de dicho sustrato bifásico es la nitrocelulosa o el nylón.

34. Un dispositivo (5) para determinar la presencia de un analito en una muestra líquida, en que la muestra líquida depositada en un extremo próximo de dicho dispositivo circula o se desplaza aguas abajo a lo largo de una vía o trayectoria hasta un extremo distal de dicho dispositivo, comprendiendo dicho dispositivo:

un sustrato (18) bifásico, que comprende un medio de liberación (30) de un primer material hidrofílico, absorbente y, en comunicación de fluido y aguas abajo del mismo, un medio de captura (32) constituido por un segundo material diferente de nylón o nitrocelulosa, en que tanto dicho medio de liberación y dicho medio de captura quedan inmovilizados en un único soporte de apoyo dorsal, y en que dicho medio de liberación de dicho sustrato bifásico se disponen con el fin de su liberación de este último:

(i)

un conjugado marcado, que comprende un primer anticuerpo que se liga o une a un primer epitopo de dicho analito marcado con un marcador detectable, y

(ii)

un componente capturable, que comprende un segundo anticuerpo biotinulado que se une o liga a un segundo epitopo diferente de dicha analito, de tal suerte que, si está presente en dicha muestra dicho analito, este último produce un complejo, que comprende dicho conjugado marcado, dicho analito y dicho componente capturable, y

se ubica en dicho medio de liberación de dicho sustrato bifásico un sitio de captura (34) para capturar dicho complejo, quedando inmovilizado en dicho sitio de captura o fijación un componente de captura para unirse o ligarse a dicho componente capturable.

35. El dispositivo según la reivindicación trigésimo cuarta, que comprende, por otro lado, un absorbente de muestra (12) situado aguas arriba con respecto a dicho sustrato bifásico y en comunicación de fluido con este último.

36. El dispositivo según la reivindicación trigésimo cuarta, que comprende, por otra parte, un absorbente de reserva (24) ubicado aguas abajo con respecto a dicho sustrato bifásico y en comunicación de fluido con este último.

37. El dispositivo de la reivindicación trigésimo cuarta, en que dicho primer material hidrófilo, absorbente de dicho sustrato bifásico es un papel secante o absorbente.

38. El dispositivo de la reivindicación trigésimo cuarta, en que dicho componente de captura o fijación es la avidina o la estreptavidina.

39. El método o procedimiento de la reivindicación primera, en que dicho primer material hidrófilo, absorbente de dicho sustrato bifásico es un papel absorbente.

\newpage

40. El método de la reivindicación primera, en que dicho segundo material polímero hidrófilo microporoso de dicho sustrato bifásico es la nitrocelulosa o el nylón.