PT659275E - Dispositivo de teste analitico dotado de controlos negativo e positivo incorporados - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"DISPOSITIVO DE TESTE ANALÍTICO DOTADO DE CONTROLOS NEGATIVO E POSITIVO INCORPORADOS"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se ao campo do diagnóstico clínico. Mais particularmente, refere-se a dispositivos baseados em química seca, processos para os fabricar, assim como da sua utilização.

ANTECEDENTES E TÉCNICA ANTERIOR 0 diagnóstico clínico refere-se, em geral, à determinação e medida de várias substâncias que se relacionam com a saúde ou o estado geral de um indivíduo. Médicos, profissionais de cuidados de saúde, e público em geral estão preocupados com a presença e os níveis de várias substâncias em fluidos corporais tais como sangue, urina, e afins. Entre as substâncias que foram medidas em análise clínica desde há muito tempo estão a glucose, colesterol, e várias enzimas tais como a amilase e a quinase da creatina. Mais recentemente, determinações tais como gravidez, desordens do sangue (testes "QuickC", tempo parcial de tromblastina ou testes "Ptt", etc.), e infecções tornaram-se também rotina no diagnóstico clínico. A preocupação mais pertinente do campo, por exemplo, é a determinação de anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV), como um marcador para o Síndroma da Imunodeficiência Adquirida ("SIDA") ou Complexo Relacionado com a SIDA ("ARC"). Os novos testes para este vírus, no entanto desenvolveram-se numa base vasta e profunda de avanços anteriores nesta área.

Uma grande simplificação que de nenhum modo serve para situar o objecto da invenção num contexto próprio é a divisão da área em "química líquida" e "química seca". A primeira pertence a metodologias em que a reacção ocorre completamente num estado líquido. Exemplificativa de tais químicas é a Patente U.S. No. 1 4 818 692, que descreve um ensaio de alfa amilase. A revisão desta referência mostra que um reagente é adicionado a uma amostra liquida, e, se o analito de interesse (amilase) está presente, o reagente reage com ele, levando ao aparecimento de cor. O desenvolvimento e intensidade da cor são monitorizados como uma determinação da presença e quantidade do analito ("Analito" como utilizado daqui em diante, em qualquer contexto, refere-se a uma substância a ser determinada). A "Química seca", em contraste, envolve a colocação de alguns ou de todos os reagentes que estão envolvidos na determinação de um analito sob consideração num material sólido, tal como uma tira de papel. A amostra é colocada em contacto com o material sólido, e algumas ou todas as reacçóes que são necessárias para a detecção do analito em questão ocorrem in situ. Se forem necessárias reacçóes adicionais envolvendo reagentes que não se encontrem no material sólido, estes podem ser adicionados após terem ocorrido as reacçóes preliminares. A invenção refere-se a química seca, e deste modo não é discutida a química líquida daqui em diante. A técnica está repleta de muitos exemplos de dispositivos de química seca utilizada para análises clínicas. Exemplos de algumas das patentes na área incluem a Patente U.S. No. 4 446 232, de Liotta, 4 361 537 de Deutsch et al., e 4 861 711 de Friesen et al.

Liotta revela um exemplo muito simples de uma tira com uma zona teste útil em imunodiagnóstico. Um suporte tal como uma tira de papel, possui anticorpos ligados a enzima posicionados na tira, assim como um reagente que pode reagir com a enzima ligada. Quando o analito para o qual o anticorpo é específico é colocado em contacto com a tira, os anticorpos ligam-se ao analito e difundem até ao ponto da tira em que o reagente substrato se encontra. Assim, as interacções enzima-substrato ocorrem resultando numa reacção de formação de cor, indicando a presença do analito na amostra.

Se o analito não estiver presente, então o conjugado é 2 7

Ri imobilizado na zona de "fase sólida", evitando a interacção da enzima com o substrato. A patente Alemã revela uma tira de teste que está contida no que é essencialmente um tubo de teste com tampa. A tira de teste possui vários reagentes posicionados ao longo do seu comprimento. Quando o liquido é introduzido numa extremidade da tira, move-se por capilaridade através da tira, e várias reacçóes ocorrem ao longo desta.

Friesen et ai. revela vários dispositivos com zonas onde ocorrem diferentes formas de reacções imunológicas, tais como imunoensaios competitivos e de sanduíche.

Estas três patentes apresentam a eficácia geral de tiras de teste baseadas em materiais fibrosos, tais como papel, em várias formas de diagnósticos. Muitas outras patentes apresentam revelações semelhantes, incluindo as Patentes U.S. N°s 3 888 629 (Bagshawe), 4 366 241 (Tom et al.), 4 517 288 (Giegel et al.), 4 668 619 (Greenquist et al.) , 4 708 932 (Axen et al.), 4 774 174 (Giegel et al.), 4 786 606 (Giegel et al.), 4 824 640 (Hildbrand et al.), e 4 855 240 (Rosenstein et al.). Todas estas patentes apresentam a aplicabilidade geral de tiras de teste sólidas para análises clínicas. Tom et al., por exemplo, nas colunas 19-26, que são aqui incorporadas por referência, fornecem uma lista de alguns dos vários analitos que podem ser ensaiados utilizando química seca. A química seca é também revelada em conexão com a análise de analitos específicos, tais como colesterol (Patente U.S. No. 3 983 005, de Goodhue et al.), gonadotropina coriónica humana (Patente U.S. No. 4 4 96 654 de Katz et al.) , hemoglobina (Patente U.S. No. 4 742 002, de Guadagno) e antigénios do tipo de sangue (Patente U.S. No. 4 851 210, de Hewett).

Embora as tiras de teste analítico do tipo acima descrito sejam populares, não estão isentas de problemas. As tiras fabricadas de material bíbulo, tal como papel, p. ex., estão sujeitas a grandes flutuações na qualidade e propriedades dos materiais utilizados. Adicionalmente, a impregnação ou colocação 3

de reagentes, tais como anticorpos na tira pode requerer processos que levem à degradação do reagente. Por exemplo, se um reagente proteico é aplicado a uma tira teste numa forma liquida deve, certamente ser seco. A secagem pode contudo requerer calor e o calor é um dos mais conhecidos inactivadores de proteínas. Além disso, devido à natureza absorvente inerente dos materiais bíbulos tais como o papel, é difícil, se não impossível, controlar a eventual distribuição dos reagentes nas tiras em que se tenta incorporar reagentes de um modo pré-definido, prescrito, preferido. Mesmo quando são utilizados critérios de controlo de qualidade de severidade extrema, uma vez que a capilaridade do papel, p. ex. pode variar não apenas de tira para tira mas mesmo dentro de uma única tira, a preparação de uma tira acarreta sempre um risco. Adicionalmente, os materiais fibrosos não são inertes. Quando se ensaia para um analito, acontece normalmente que uma certa quantidade deste adere às fibras da tira e não aos reagentes, tais como anticorpos colocados na tira. Como resultado, a interpretação de uma tira de teste pode ser muito difícil.

Dadas as preocupações apresentadas acima, bem como outras que não são aqui repetidas mas que são bem conhecidas na técnica, têm existido tentativas para utilizar outros materiais. Foram utilizados como suporte diferentes materiais fibrosos e gel ou película, mas estes não são totalmente satisfatórios devido a muitas das razões aqui apresentadas. A atenção voltou-se por isso para outros materiais, incluindo matéria particulada tais como contas ou esferas fabricadas de materiais "inertes". "Inerte" como aqui utilizado significa apenas que o material não interfere com reacções que estão envolvidas na aplicação clínica em consideração. Referir que existem muitas patentes relacionadas com a utilização de partículas inertes em ensaios clínicos e imunológicos é subestimar a avaliação do caso. Uma amostragem de algumas das Patentes U.S. nesta área inclui as 4 794 090 (Parham et al.), 4 740 468 (Weng et al.) , 4 680 274 4

(Sakai et al.), 4 657 739 (Yasuda et al.) , 4 478 946 (VanderMerwe et al.), 4 438 239 (Rembaum et al.), 4 340 564 (Harte et al.), 4 338 094 (Elahi), 4 201 763 (Monthony et al.), 4 166 102 (Johnson) e 4 059 658 (Johnson) . Contudo, a vasta maioria da literatura referente à utilização de partículas "activas" ou "carregadas", não é de todo pertinente para esta invenção. De um modo geral, o material particulado é utilizado em sistemas de química húmida, tais como ensaios de aglutinação, ao longo das linhas dos descritos acima. Uma solução contendo partículas possuindo receptores, tais como anticorpos ligados a elas, é adicionada a uma amostra a ser analisada, se o analito em questão está presente na amostra, liga-se ao receptor que está ele próprio ligado à partícula. Como resultado da ligação, as partículas aglutinam por uma variedade de diferentes razões. Tais aplicações da tecnologia de partículas não são pertinentes para esta invenção.

As microparticulas apresentam tanto vantagens como desvantagens quando utilizadas na preparação de dispositivos analíticos. As vantagens incluem o tamanho uniforme. Elas também aumentam a área da superfície na qual as reacções podem ocorrer sem a necessidade de aumentar os volumes das amostras. Como resultado, a velocidade da reacção pode aumentar. As desvantagens incluem a possibilidade de agregação descontrolada indesejável das contas. A ligação não específica também pode resultar em reacções falsas. Quando as partículas são colocadas em matrizes fibrosas elas podem deslocar-se confundindo os resultados através de um efeito de "arrasto".

Algo mais pertinente para esta invenção são os dispositivos em que o material particulado transportando, p. ex. um receptor, está contido num transportador, tal como uma tira de teste. As patentes de Weng et al. e Yasuda et al. são exemplif icativas desses sistemas. Contudo, o problema com a utilização de partículas, tais como as contas em transportadores porosos é que as partículas, deixadas sozinhas, podem deslocar-se na matriz 5

fibrosa, de alguma forma como uma bola ou berlinde a rolar numa carpete. Esta tendência para o deslocamento é exacerbada quando um material fluente, tal como um liquido, é adicionado à matriz. As partículas movem-se então ao longo do dispositivo e mesmo para fora deste com a frente da solução em movimento, tornando a tira de teste inútil.

Uma abordagem diferente no campo do diagnóstico clínico tenta evitar estes problemas não utilizando quaisquer matrizes fibrosas ou utilizando fibra numa camada separada, tal abordagem é exemplificada por, p. ex. Patente U.S. No. 4 258 001, de Pierce. Esta patente revela um sistema de camada dupla, em que uma camada é uma estrutura formada por partículas ligadas por um adesivo. A patente descreve as partículas como contendo possivelmente uma denominada "composição interactiva" tal como um antígénio ou anticorpo. A camada é posicionada num suporte. O analito contendo o líquido passa através da camada de partícula porosa, e o analito reage com a composição interactiva.

Um sistema de acordo com o descrito por Pierce, não está todavia isento de problemas. Os adesivos, por natureza, são aderentes. Mesmo quando secos, está presente uma determinada quantidade de "gomosidade" que, embora pequena, pode não ser insignificante em relação ao analito da amostra. Como resultado pode ocorrer uma falsa ligação ao adesivo, em vez de à "composição interactiva". Adicionalmente, existe alguma dificuldade no fabrico de uma disposição uniforme de contas aderentes, porque a distribuição das contas pode não ser uniforme e a secagem do adesivo pode ocorrer a diferentes velocidades, dependendo de parâmetros tais como a espessura da disposição.

Recentemente, a técnica tem verificado algumas abordagens a este problema. A Patente U.S. No. 4 916 056, de Brown, III et al,, sugere que seleccionando uma matriz fibrosa apropriada e partículas de um tamanho particular se podem imobilizar estas últimas na matriz. Na coluna 8, linhas 60-65 os inventores 6

concedem que a razão para isto é desconhecida e uma revisão da revelação na sua totalidade não fornece informação sobre qualquer tratamento aplicado a estas partículas. 0 Pedido de Patente Europeia Número 200 381 também refere a utilização de contas com anticorpos ligados a estas numa matriz; todavia, esta revelação afirma, embora as contas estejam capturadas na matriz, que apesar disso elas são móveis. Uma tira de teste assim não é completamente satisfatória para utilização em ensaios clínicos.

Uma das consequências dos avanços em campos relacionados com a química clínica, tal como a imunologia, é que muitas aplicações do campo que no passado foram classificadas como sofisticadas tornaram-se agora em verdadeiros lugares comuns. Um resultado deste desenvolvimento tem sido a criação de um mercado de diagnóstico doméstico, i.e., um sub-campo da química clínica no qual um indivíduo realiza um ensaio em casa, em vez de ter um profissional de saúde a realizá-lo. 0 utilizador doméstico não está treinado na interpretação de parâmetros clínicos e como tal os produtos de diagnóstico doméstico estão geralmente restritos ou a sistemas em que é utilizado um tipo de teste de "sim/não", ou a um em que seja fornecida uma resposta não ambígua através do instrumento de teste utilizado. A literatura das patentes apresenta exemplos de dispositivos úteis em diagnósticos domésticos em Brown III et al., Patente U. S. No. 4 916 056, discutida acima, e em Valkirs et ai., Patente U. S. No. 4 632 901. Ambas as revelações são dirigidas em particular a diagnósticos pessoais de gravidez e apontam para a necessidade em tais sistemas de um controlo negativo adequado. De facto, a técnica reconheceu há muito a necessidade e o desejo de controlos "a bordo" em tiras de teste. São exemplos de revelações apresentando isto as 4 649 121 (Ismail et al.), 4 558 013 (Markinovich et al.), 4 541 987 (Guadagno) , 4 540 659 (Litman et al.) , 4 472 353 (Moore) , e 4 099 886 (Olveira) . A utilização de controlos em muitos destes dispositivos demonstra que eles são úteis para o praticante especializado, bem como 7

para o utilizador doméstico. A técnica demonstra que tanto os controlos "negativo" como "positivo" são utilizados. Um teste "negativo" é aquele que informa o utilizador que a amostra teste não contém o analito de interesse. Em contraste, um "controlo" verdadeiramente negativo, como é aqui utilizada a frase, nunca deve fornecer um sinal se os reagentes estão a funcionar adequadamente. Isto é verdade independentemente do facto de o analito de interesse estar presente ou não.

Um controlo positivo essencialmente informa o utilizador que o sistema e o dispositivo estão funcionais. Tais controlos podem conter amostras do analito de interesse e os componentes do reagente que são essenciais para a reacção que deve ocorrer para identificar o analito numa amostra de teste. Os controlos positivos devem originar sempre um sinal quando é utilizado um dispositivo analítico contendo um. Se não é originado um sinal, então o utilizador não tem indicação de que o instrumento já não está funcional. Assim, os controlos positivos podem servir para "datar" uma tira de teste verificando a integridade do sistema ou reagente. Eles também podem indicar quando uma tira de teste ou outra componente do sistema foi armazenada de forma imprópria, ou quando o controlo de qualidade não foi adequado. Dado o crescimento contínuo no mercado de diagnóstico, prevê-se que os controlos positivos venham a ser mais e mais importantes.

Como foi indicado acima, entre as pressões às quais os dispositivos analíticos estão sujeitos encontram-se os longos períodos de armazenamento. Outros incluem a utilização imprópria ou o manuseamento negligente. Tais pressões põem em risco a integridade do instrumento, e podem também danificá-lo. Deve ser claro, na realidade, que as tiras de teste e outros instrumentos analíticos não devem ser expostos ao ambiente antes de se pretender utilizá-los na análise de uma amostra. A exposição ao ambiente, p. ex., pode resultar em dano físico e/ou contaminação química da tira. É por isso claro que estes instrumentos estão protegidos desejavelmente até serem utilizados. 8

0 desejo de proteger a tira deve ser equilibrado pelo custo de o realizar. Dado o enorme volume de tiras de teste utilizadas por laboratórios clínicos, consultórios médicos e afins, o custo deve ser mantido tão baixo quanto possível. Com essa finalidade, muitos desses dispositivos são embalados de forma muito barata, p. ex., com celofane ou plástico, sob a forma de sacos, bolsas, etc. Tal empacotamento fornece uma certa quantidade de protecção, mas não serve nenhuma finalidade útil na relação com a utilização da tira. Dado que muitas tiras de teste na técnica são utilizadas na análise de materiais infecciosos, e em relação a amostras biológicas tais como sangue, urina, expectoração, fezes e afins, é desejável que a protecção utilizada para a tira de teste também sirva para minimizar o contacto entre o indivíduo que utiliza a tira e a amostra. Adicionalmente, dado que é desejável que estas tiras estejam configuradas de modo a que possam ser utilizadas sem qualquer conhecimento sofisticado por parte do utilizador, idealmente o tipo de invólucro para a tira deve tornar fácil a utilização do dispositivo por parte do utilizador. A estrutura de protecção ou de embalagem também deve idealmente ser configurada para actuar com um sistema "à prova de falha", se, p. ex., for adicionada demasiada amostra ao dispositivo. Outras características desejáveis de um tal sistema de embalagem incluem aberturas ou "janelas" de visualização bem como reservatórios de fluido, sendo ambos descritos infra.

Embora a técnica apresente a utilização de suportes de tiras de teste e embalagens que se movimentam na direcção dos objectivos acima citados, nenhuma destas alcança todos esses objectivos. São observados exemplos de embalagens ou suportes para tiras de teste em, p. ex., Patentes U.S. Nos. 4 900 663 (Wie et al.) , 4 851 210 (Hewett) e 4 331 650 (Brewer et al.),

que apresentam o tipo menos robusto de suporte descrito supra. Frequentemente estes dispositivos são referidos como "cartões de teste", dada a natureza da sua configuração. Podem ser observados suportes mais robustos em GB 2204398, EP 306 772, EP 9

323605, ΕΡ 306336 e ΕΡ 183442. Nenhum destes dispositivos possui todas as propriedades desejáveis, p. ex., protecção, baixo custo, e facilidade de utilização. Em resumo da técnica, existem abordagens para construções de tiras de teste que utilizam papel bibulo e/ou tecnologias de partículas. Cada uma delas possui vantagens e/ou problemas. A técnica anterior refere a utilização de controlos, tanto "positivos" como "negativos" para utilização em ensaios de diagnóstico. Estão disponíveis diferentes tipos de configuração. A EP-A 0 389 003 descreve um dispositivo analítico compreendendo uma área de controlo negativo, uma área de ligação do analito e uma área de controlo positivo dentro de um sítio de reacção que está simultaneamente em contacto com o reagente de ligação específica e a amostra a ser investigada. A área de controlo negativo é mantida livre de substâncias que retenham o reagente marcado. Não está descrito como é que isso é realizado. A área de controlo positivo proporciona uma substância, p. ex. o analito, que é capaz de se ligar ao reagente marcado. Fora do contexto e a partir do exemplo 4 é claro que o analito está presente numa forma imobilizada nesta área. A Patente U.S. 4 541 987 refere um dispositivo de teste para detectar sangue oculto. Este dispositivo compreende uma área de teste, uma área de controlo positivo e uma área de controlo negativo. Todas as áreas contêm reagentes solúveis em água que são reagentes químicos clássicos, não reagentes de ligação específica. O dispositivo de teste é colocado na amostra a ser investigada. Isto conduz à activação dos reagentes e às correspondentes reacções químicas.

As tiras e dispositivos de teste aqui descritos estão frequentemente encerrados numa caixa ou invólucro. Estas estruturas permitem que a própria tira seja utilizada de um modo que assegure resultados óptimos. Estas caixas ou invólucros devem ser "inertes", i.e., não devem conter qualquer material que interfira com o ensaio ou teste que é realizado na tira de 10 $Líu teste.

Os aspectos importantes do invólucro da tira de teste incluem a protecção do utilizador do fluido ou amostra a ser testado. Além disso, a caixa deve proteger a própria tira do contacto prematuro com outros fluidos. Esse contacto "prematuro" pode incluir o contacto com um fluido que não está a ser analisado, bem como o contacto de uma zona ou região com a tira antes do tempo de contacto desejado. Assim, quando um conjunto de reacções sequenciais ou passos de reacção deve ocorrer, a caixa ou invólucro pode desempenhar um papel importante na regulação desses passos.

Adicionalmente, o tipo de estrutura aqui descrito, através da colocação apropriada de meios de visualização tais como "portas", "janelas" ou outras aberturas podem facilitar a análise de um fluido de teste. Também, se o invólucro é construído de um modo apropriado, evitará a interferência com a natureza cromatográfica natural da tira de teste através de contacto inapropriado com outras superfícies.

Outras características de um invólucro ou caixa que devem ser consideradas incluem a inércia para com o ensaio. 0 invólucro deve ser fabricado de um material que não interfira com o ensaio, os reagentes ou a amostra. 0 invólucro deve também ser configurado de modo a que facilite a observação do teste, sem causar problemas tais como o surgimento de sombras ou impedindo de outro modo uma visualização adequada da reacção.

Adicionalmente, dado que a quantidade de amostra aplicada à tira de teste varia de utilizador para utilizador, é desejável que o suporte seja configurado de modo a impedir o extravasamento ou a inundação de diferentes secções da tira de teste nas situações em que seja adicionado excesso de fluido.

Assim, é objectivo desta invenção proporcionar um dispositivo analítico útil que possa ser utilizado na determinação de um analito numa amostra, em que o dispositivo contém um controlo negativo, uma área de teste e um controlo 11

positivo, preferencialmente, mas não necessariamente, numa disposição linear de zonas colocadas numa matriz continua. É também um objectivo da invenção proporcionar um processo e metodologia úteis no fabrico desse dispositivo, que combina os benefícios das tecnologias da matriz e de partículas. A obervação de um modo através do qual moléculas tais como proteínas, glicoproteínas e outras substâncias possam ser ligadas a superfícies tais como contas e depois a fibras sem acoplamento químico soluciona muitos dos problemas associados com a combinação de tecnologias de partículas e de fibras. É ainda outro objectivo da invenção proporcionar uma caixa ou suporte para uma tira de teste que proteja a própria tira de teste, simplifique a sua utilização pelo investigador e também, surpreendentemente, auxilie a que sirva como um sistema à prova de falha para facilitar a absorção de um fluido de amostra pela tira de teste de um modo controlado. 0 modo como este, bem como outros aspectos da invenção são alcançados será observado a partir da revelação que se segue.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção baseia-se em várias observações surpreendentes, começando com a observação de que moléculas tais como, mas não se limitando a proteínas, podem ser seguras tanto a um transportador sólido como a uma fibra sem a utilização de um adesivo ligando as partículas umas às outras. De facto, isto deve ser evitado. A molécula de interesse é ligada ao transportador, preferencialmente através de uma ligação covalente, e depois deve ser tratada com uma solução a um pH diferente do ponto isoeléctrico (pi) da molécula a ser ligada ao transportador. Este tratamento transmite uma carga à molécula ligada ao transportador. A matriz, tal como uma matriz de fibra de vidro, ou possui uma carga inerente (no caso de fibras de vidro, esta é negativa) ou pode ser tratada de modo a adquirir 12

uma. Através da escolha de tratamentos e de matrizes de modo a que a molécula ligada ao transportador e a matriz possuam cargas opostas, o complexo pode ser posicionado na matriz, em contraste com dispositivos nos quais é posicionada na matriz uma disposição de partículas aderentes. A invenção compreende inter alia dispositivos analíticos com controlos positivos e negativos incorporados. Verificou-se que a força de atracção entre a molécula ligada ao transportador sólido e a matriz é tão forte que é possível uma colocação extremamente precisa do complexo transportador/molécula na matriz, sem difusão através da matriz porosa. Essencialmente, o transportador permanece exactamente onde é colocado, e como resultado a reacção analítica ocorre numa única posição. Devido a este resultado desejável, é possível colocar tanto o controlo positivo como o controlo negativo no mesmo instrumento, na medida em que não há necessidade para existir qualquer preocupação em relação à mistura dos reagentes na tira uma vez que a amostra nela tenha sido colocada. A colocação dos transportadores ao longo da tira significa que as reacçóes de controlo e de teste ocorrerão sempre numa posição particular do dispositivo. Por isso, pode proporcionar-se um transportador que esteja disposto de modo a que o topo apresente meios de visualização que indiquem especificamente onde devem decorrer as reacçóes de teste e de controlo. Adicionalmente, devido à colocação do reagente ser tão bem definida, pode ser-se menos rigoroso acerca da quantidade de amostra aplicada no instrumento. Isto pode ser uma preocupação porque se a capacidade de absorção da tira de teste é excedida podem resultar problemas com a mistura e a lavagem de reagentes. Assim, o transportador de teste fornecido para suportar a tira é configurado de modo a proporcionar um reservatório para a impregnação do líquido de teste à medida que a tira o pode realizar.

Estas características principais, bem como as 13

características inventivas adicionais não descritas neste Sumário, serão explicadas em maior detalhe no texto que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta uma realização vasta do dispositivo de teste aqui descrito. A Figura 2 apresenta o dispositivo de teste com características adicionais opcionais. A Figura 3a é uma representação do topo de uma realização da caixa do dispositivo. A Figura 3b apresenta uma representação de topo do fundo de uma caixa para o dispositivo. A Figura 4 apresenta os resultados da interacção de papel de microfibra de vidro com látex carregado, apresentando a utilização de fluorescência. A Figura 5 representa o efeito do pH em relação à interacção de transportador de teste e do material carregado. A Figura 6 compara a mobilidade de partículas tratadas e não tratadas. A Figura 7 apresenta dados obtidos numa tira de teste para HIV, em que o receptor é p24. A Figura 8 é o mesmo que a Figura 7, mas apresentando gp41 como receptor. 14

DESCRIÇÃO DETALHADA DE REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Em referência agora às figuras, a Figura 1 apresenta esquematicamente o instrumento analítico da invenção na sua realização mais vasta. Uma tira de teste 10 compreende uma matriz absorvente 11, composta por material tal como papel bíbulo, celulose, ou outro material capaz de absorver uma amostra líquida. A seta horizontal apresenta a direcção do fluxo do fluido no instrumento.

Em referência agora aos itens descritos em "12", "13" e "14" estes apresentam um controlo negativo, região de "leitura" ou "teste", e controlo positivo, respectivamente, posicionados numa disposição linear. Cada uma destas regiões I, II e III contém os reagentes descritos infra. 0 controlo negativo "I" é designado como um marcador para a integridade do sistema de teste. Esta região ou zona nunca deve apresentar um sinal, tal como um alteração de cor. Por exemplo, se a matriz 11 é branca, o papel bíbulo, região 12 deve ser branco tanto antes como depois da análise do teste ser realizada. Se não for, então algo está errado com o instrumento e ou deve ser destruído se existir uma cor presente antes do ensaio ou os resultados do teste devem ser ignorados se surgir uma cor após a realização do teste. Idealmente, esta região contém um reagente semelhante aos utilizados nas outras zonas, mas um que não seja reactivo ou que seja inerte em relação ao analito a ser examinado. Por exemplo, se o analito de interesse for um antigénio, tal como um antigénio de Streptococcus A que será detectado através de uma reacção anticorpo-antigénio em "II", o controlo negativo pode conter imunoglobulinas ou anticorpos inactivados ou não imunes da mesma espécie presente na região II. De forma semelhante, se o teste em questão é um dos anticorpos de HIV em que a região teste contém antigénios virais, então a região deve conter formas inactivas do antigénio, tais como material tratado com calor ou ureia, de 15

modo a que os epitopos aos quais os anticorpos se ligam sejam destruídos. Os materiais adicionais que podem ser considerados para utilização no controlo negativo incluem formas inactivadas de proteína A, complexos biotina-estreptavidina/avidina, e afins. Foi mencionada IgG não imune, na medida em que é exemplificativa de formas não imunoactivas de anticorpos e de imunoglobulinas em geral.

Em referência à Figura 1, e às referências "13" ou "II", isto constitui a região de teste e é onde ocorre o próprio ensaio analítico. Esta região contém um reagente que reagirá com o analito de interesse. Por exemplo, utilizando os dois analitos mencionados supra. Se está a ser ensaiado Streptococcus pyrogenes, esta região pode conter anticorpos, policlonais ou monoclonais que se ligam especificamente ao antigénio específico do grupo Strep A. Os anticorpos contra Strep A são conhecidos a partir da literatura, e não é necessário elaborar aqui sobre eles. Deve ser entendido, obviamente, que "anticorpos" refere-se não apenas à molécula completa, mas também a fragmentos reactivos tais como fragmentos Fab, Fab', Fv e F(ab')2 e afins.

Idealmente, mas não necessariamente, o reagente está ligado a um transportador sólido, como descrito infra, e é colocado na tira de modo a estar imóvel. Esta colocação é também verdadeira se se está a ensaiar por exemplo, anticorpos contra o HIV, e neste caso o reagente em "II" é, por exemplo, uma proteína virai ou fragmento do vírus epitopicamente activos. Muitas destas proteínas e fragmentos são conhecidos e não necessitam de ser aqui nomeados. Num dispositivo útil nos ensaios para o HIV ou outros materiais que possuem muitas moléculas epitópicas reconhecidas, pode ser posicionada uma pluralidade de zonas de teste entre o controlo positivo e o controlo negativo. 0 HIV, por exemplo, pode ser ensaiado posicionado zonas de teste contendo receptores específicos para gpl20, p24, gp41, anticorpos contra estas moléculas, etc. De um modo semelhante, o dispositivo pode ser construído para teste "TORCH" através do 16 -^7

‘J-Λ posicionamento de zonas de teste contendo receptores que se ligam a anticorpos específicos contra o Toxoplasma, Rubella, Herpes e Cytomegalovirus. 0 analito e o reagente em II reagem se o analito está presente na amostra, preferencialmente imobilizando o analito na zona II. A amostra fluida, devido à capilaridade da tira, flui para a terceira zona III ou "14", que é a zona do controlo positivo. Esta zona contém uma amostra solubilizável do analito de interesse bem como uma amostra de reagente idêntico ao disposto na segunda zona. Como resultado, esta zona deve evidenciar sempre uma reacção. Se não o fizer, então o teste não é válido. Assim, a terceira zona também serve como um controlo funcional para os reagentes do ensaio e para a própria tira.

Numa realização especialmente preferida, uma vez que as reacções entre a amostra e os reagentes nas zonas II e III ocorram, é colocado em contacto com estas zonas um novo reagente, de modo a resultar na formação de um sinal detectável, tal como uma cor. Por exemplo, quando a strep A está a ser ensaiada, após imobilização do antigénio específico do grupo por um anticorpo na segunda zona, um segundo anticorpo marcado é colocado em contacto com esta zona, bem como com a terceira, zona positiva. Dado que muitas moléculas do antigénio do grupo strep são multiepitópicas, pode formar-se uma sanduíche de anticorpo-antigénio-anticorpo marcado e forma-se na realidade. 0 marcador pode possuir inerentemente um sinal, tal como uma parte radionucleica ou quimioluminiscente, partículas coradas ou fluorescentes, ouro ou soluções coloidais corantes ou pode ser um que se envolva noutra reacção ou reacções para produzir um sinal. Mais preferencialmente, estes marcadores são enzimas tais como, mas não estando limitadas a peroxidase, fosfatase alcalina ou β-galactosidase. Quando são utilizados estes marcadores, é necessário que sejam adicionados às tiras materiais adicionais, tais como substratos de enzimas. Exemplos destes incluem tetrametilbenzidina (TMB), 4-cloro e 4-metoxi-l-naftol para 17 reacções catalisadas pela peroxidase e fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) ou BCIP e um sal de tetrazólio para as reacções catalisadas por fosfatase alcalina. Estes 2 exemplos não são de forma alguma exaustivos dos substratos disponíveis, e a escolha de substrato dependerá do que estiver disponível e da enzima particular utilizada. Os substratos preferidos são aqueles sobre os quais as acções das enzimas produzem um produto que é insolúvel em meios aquosos.

Tanto o segundo anticorpo marcado como o substrato podem ser aplicados ao instrumento a partir de uma fonte externa, ou podem ser posicionados no próprio dispositivo. Uma segunda camada de suporte, p. ex. por baixo das zonas de teste pode permitir a percolação para o dispositivo, ou o dispositivo pode ser configurado de modo a que o substrato esteja contido numa camada ligada à estrutura 10 através de uma saliência, onde esta camada pode contactar apenas as regiões de teste durante a aplicação de força externa tal como pressão.

Uma realização particularmente preferida da invenção tem o substrato disposto in situ numa estrutura opcional. Isto é apresentado na Figura 2 e é discutido infra.

As três zonas, i.e., as zonas negativa (21), de teste (22) e positiva (23), estão posicionadas numa disposição linear em relação umas ás outras e separadas umas das outras por pelo menos uma quantidade de espaço, de modo a separar e tornar discretos os sinais que possam ser gerados e determinados.

Se nada correr mal no fabrico, armazenamento e utilização do dispositivo, há apenas dois resultados possíveis. Se não estiver presente nenhum analito de interesse, a zona 21 não produzirá nenhum sinal, nem a zona 22. Em contraste, a zona 23 deve produzir um, e o utilizador notará apenas uma banda única no dispositivo. Se o analito estiver presente, tanto as zonas 22 como 23 produzirão um sinal positivo, enquanto que a zona 21 não o fará. Por isso, na avaliação da amostra, é um questão simples de quantas bandas aparecerão na superfície da tira. Duas bandas 18

lX-^7 indicam a presença de analito, enquanto que uma banda indica ausência. Como foi explicado supra, outras considerações em relação à validade do resultado do teste são determinadas também a partir da formação de bandas.

Em dispositivos nos quais devem ser situados e analisados uma quantidade de vários analitos, tais como ensaios "TORCH" descritos supra ou ensaios para o reconhecimento de epitopos diferentes ou múltiplos, tais como na determinação do HIV, estarão presentes uma pluralidade de bandas correspondendo a uma pluralidade de zonas de teste, cada uma das quais corresponde a um teste para um analito diferente.

Na figura 2 é adicionada uma zona de resíduos à extremidade da tira para absorção do fluido após ter atravessado as zonas 21, 22 e 23. A zona de resíduos é preferencialmente construída de material absorvente que é pelo menos tão absorvente como o material a partir do qual é fabricada a matriz 11. Num nível esta característica pode ser observada mais como uma conveniência do como uma necessidade, já que podem ser contempladas outras abordagens para remover o fluido, tal como por contacto com uma esponja absorvente. Pode ser tornada explicitamente funcional através da incorporação de um agente que permita a utilização para determinar se a tira foi exposta a uma humidade de extremos de ácido ou de base. A técnica está familiarizada com substâncias tais como sulfato de cobre anidro, que altera desde branco até azul brilhante na presença de líquido, bem como indicadores de pH que mudam de cor ou formam uma cor quando expostos a condições acídicas ou básicas. Através da incorporação destes na zona de resíduos é possível certificar se a tira esteve exposta a condições indesejáveis antes da utilização. Adicionalmente, tais indicadores também podem servir como monitores visuais em como o dispositivo de tira está a funcionar devidamente em relação ao fluxo cromatográfico. Embora esses indicadores possam ser colocados em qualquer sítio do dispositivo a colocação ao longo da zona de resíduos assegura 19

que não exista interferência potencial com as reacções de teste.

Adicionalmente, esta zona pode incluir os denominados "inibidores de sinal" que impedem a reacção de marcação e a reacção do parceiro para desenvolver um sinal. Tal inibição é desejável porque se é aqui desenvolvido um sinal, uma "contracorrente" pode transportar o sinal para o dispositivo até um ponto em que interferirá com o próprio sinal de reacção.

Tais indicadores podem ser convenientemente colocados na zona de resíduos na posição identificada como 25 na figura 2. Este também pode ser o local para incorporação de um inibidor para o sistema gerador de sinal. Nesses casos é simplesmente incorporada uma "porta" ou "janela" adicional no recinto da caixa para permitir a visualização de reacções do indicador. Exemplos de tais inibidores incluem azida de sódio, que inibe irreversivelmente a acção da peroxidase. Através da incorporação do inibidor na zona de resíduo não ocorre desenvolvimento significativo de cor ou de outro sinal no resíduo ou no reservatório como resultado das interacções entre os componentes do sistema de desenvolvimento de sinal. Por sua vez, isto auxilia na preservação da estabilidade do resultado do teste uma vez que não existe distribuição para a retaguarda de cor para a matriz após o ensaio ter decorrido.

Estão presentes características muito desejáveis no dispositivo apresentado na extremidade oposta à zona de resíduos. A estrutura 26 compreende material absorvente para aplicação de um líquido a essa estrutura. 0 seu papel ficará claro na ligação com os componentes 27-29 apresentados na figura 2, discutidos como se segue. 0 item 27 é uma estrutura, tal como uma almofada que contém uma substância ou substâncias, tais como os substratos referidos supra. Está separada da estrutura 26 sobre a sua posição posterior através de um pedaço de fita adesiva de dupla face 28. Um segundo pedaço de fita adesiva de dupla face 28' separa a almofada de substrato 27 do meio de regulação de fluxo 28, que por sua vez está em contacto de 20

<rP fluido de um só sentido com a tira de teste 11.

Durante a operação, as estruturas 26-29 desempenham o seu papel, p. ex., quando uma amostra já foi adicionada à tira e isso foi seguido pela aplicação de um receptor marcado. Exemplo desta situação é quando um antigénio strep foi ligado a anticorpos numa conta, seguido pela ligação ao antigénio de uma segunda amostra de anticorpos, contendo um marcador enzimático. De modo a determinar a ligação, o receptor marcado não ligado deve ser removido por lavagem e o substrato deve alcançar esta zona. De modo a evitar a necessidade de um fornecimento separado do reagente substrato, na realização da figura 2 está contida uma quantidade do substrato, numa forma removível, na estrutura 27, a "almofada de substrato". 0 substrato não pode ser removido até que seja humedecido, e para essa finalidade é posicionado acima da almofada de substrato um meio absorvente 26. 0 agente de humidificação, ou "tampão de migração" numa realização preferida, é aplicado a 26 no mesmo sítio ao longo do seu comprimento e move-se no sentido descendente para a almofada de substrato. Deste modo, o material 26 serve como um dispositivo de "medição" para a distribuição de fluido para a estrutura 27. De modo a garantir que o líquido vá apenas para a extremidade da frente da almofada de substrato é fornecida fita adesiva de dupla face "28". Isto bloqueia o líquido impedindo-o de avançar, forçando-o a deslocar-se no sentido descendente na direcção da almofada de substrato. Podem ser empregues para esta finalidade tipos adicionais de materiais de bloqueio, tais como adesivos endurecidos por fusão a quente. Na prática, é preferível fita adesiva de dupla face. 0 líquido ou tampão de migração entra na almofada de substrato e dissolve/mobiliza o substrato aí contido. De novo, para dirigir o fluxo de líquido para a parte posterior é fornecido um segundo bloqueio ou pedaço de fita adesiva de dupla face "28". Isto impede que o líquido flua para a retaguarda. Como pode ser observado na figura 2, este segundo bloqueio está 21

posicionado na extremidade da zona do substrato oposta à extremidade onde está posicionado o primeiro bloqueio. No modo descrito, os meios 28 e 28' são utilizados em combinação para estabelecer um canal pré-definido para direccionar o fluxo do fluido através do componente 27. A colocação da fita 28' direcciona o fluxo do substrato solubilizado para a estrutura extremamente útil "29", aqui referida como um regulador de fluxo ou meio de direccionamento de fluxo. A estrutura 29 é um pedaço de material resistente à água que permite apenas o fluxo de liquido no sentido descendente, devido à configuração dos seus poros. Como será observado, a estrutura é caracterizada por poros cónicos ou em forma de "V" invertido. Estes permitem o fluxo no sentido descendente, mas não permitem um fluxo sobre ou através da estrutura. Este direccionador de fluxo 29 está em contacto fluido com a matriz 11, de modo a que o substrato solubilizado/mobilizado se desloque unilateralmente para a matriz.

Adicionalmente às funções acima mencionadas, a estrutura 29 pode ser seleccionada a partir de materiais com tamanhos de poro múltiplos e assim utilizados para controlar a "taxa" de fluxo de fluido do componente 27 para o componente 11. Devido à colocação uniforme dos poros na estrutura 29 é assegurada uma dispersão uniforme do fluido que entra na estrutura 11. A estrutura 29 também pode ser empregue como um dispositivo de distribuição de reagente através da aplicação e secagem dos referidos reagentes nos poros da estrutura 29. Os métodos de aplicação e secagem dos reagentes serão óbvios para os especialistas na técnica e não há necessidade de serem aqui pormenorizados. A escolha sobre que materiais constituem as estruturas "26" e "27" está limitada apenas pela necessidade de serem absorventes e inertes em relação aos reagentes que com eles contactam. De forma semelhante, as estruturas "28" e "28"', descritas como fita adesiva de face dupla, podem ser fabricadas 22 de quaisquer materiais que impeçam o fluxo de liquido. 0 material escolhido para a estrutura 29 deve ser um que direccione o liquido numa única direcção. Um material particularmente preferido para a estrutura 29 é "Vispore", um material utilizado no fabrico de fraldas descartáveis e descrito nas patentes U.S. Nos. 3 929 135 e 4 343 314. A patente '135 descreve a estrutura do material como um "capilar cónico" e de facto, pode ser visualizada a configuração cónica ou de "V" invertido como tal. De aqui em diante, "direccionador de fluxo possuindo uma estrutura de poro capilar cónico" refere-se ao tipo de material apresentado na patente '135. 0 instrumento completo aqui descrito é colocado num suporte inerte 30. Isto serve meramente para fornecer força adicional ao instrumento, e pode ser transparente, se for desejável a leitura a partir do fundo do elemento de tira, ou não. O método de ligação dos componentes da tira ao suporte inerte pode envolver a utilização de fita adesiva de face dupla, adesivos endurecidos por fusão a quente, uma combinação dos dois, e/ou outros materiais com propriedades adesivas adequadas, todos eles conhecidos na técnica.

Podem ser incorporadas no instrumento caracteristicas adicionais. Exemplos não limitativos destas incluem anticorpos específicos contra o analito, inibidores de sinal, tampões e afins. O instrumento proporciona um dispositivo de teste de fluxo horizontal, de peça única, que pode ser utilizado para todos os objectivos de um teste de análise particular. Pode aplicar-se a amostra e os reagentes activos adicionais e interpretar os resultados do teste, tudo no mesmo dispositivo.

Uma característica muito importante das realizações preferidas da invenção é a utilização de um "verdadeiro" controlo positivo. Como discutido supra, numa realização preferida do dispositivo, tanto uma amostra do analito de interesse como um reagente activo, tal como um anticorpo 23

específico para o analito, podem ser incorporados de modo a que reajam se a amostra do analito estiver solubilizada. Um tal controlo é desejável porque assegura que o reagente activo posicionado a um ponto diferente no dispositivo e concebido para reagir com o analito da amostra permanece activo.

Outras vantagens do dispositivo serão evidentes através da revisão desta revelação como um todo.

Uma realização preferida particular das fitas de teste aqui descritas envolve a utilização de um processo através do qual um material receptor é colocado na matriz. Verificou-se que a molécula de interesse incorporada no receptor ou na matriz pode ser aí aplicada sem a utilização de um adesivo ou fixador através da aplicação de uma carga à molécula incorporada na matriz. A molécula transporta então uma carga, e interage com uma carga transportada pela própria matriz. Através da selecção dos materiais como a matriz que possui uma carga oposta à das moléculas de interesse, ou através da aplicação de uma carga à matriz oposta à carga transportada pela molécula, esta última é incorporada seguramente na matriz, sem a utilização de um adesivo ou fixador. Uma vantagem particular da utilização da interacção da carga para colocar o material receptor na matriz é a capacidade para controlar a impregnação ou o posicionamento do receptor nessa matriz. 0 material de interesse, de aqui em diante referido como uma composição de matéria, pode estar sob a forma das próprias moléculas, ou, numa realização preferida, ligada a um transportador sólido.

De modo a aplicar carga à composição de matéria podem ser utilizados vários métodos, incluindo a colocação do material num campo carregado. Contudo, é particularmente preferido aplicar a carga através do tratamento da composição de matéria numa solução que possui um pH que difere do ponto isoeléctrico ("pi") do material, i.e., o receptor, de interesse. Quando é utilizado um pH que difere do pi utilizado, a composição de matéria aceita 24

dai uma carga. A um pH abaixo do pi, a composição de matéria recolhe uma carga positiva, enquanto que a um pH acima do pi, a carga recebida é negativa.

Embora os valores de pi estejam geralmente associados a proteínas, eles são possuídos por todas as moléculas incluindo carbohidratos, lípidos e as várias combinações destes (glicoproteínas, lipoproteínas, glicolípidos, etc.). Assim, quando é utilizado de agora em diante um termo como "contendo proteína" ou "contendo carbohidrato" para descrever uma molécula, ele refere-se à espécie pura da molécula assim como às moléculas de combinação. Por exemplo, um antigénio de glicoproteína significa tanto uma "molécula contendo carbohidrato" como uma "molécula contendo proteína".

Tipos particulares de moléculas de interesse e compreendidas nesta invenção incluem todos os reagentes imunológicos convencionais tais como anticorpos, sejam eles policlonais ou monoclonais e os seus fragmentos e complexos, antigénios, incluindo fragmentos de antigénios que são epitopicamente activos, proteína A, proteína G, biotina, avidina, estreptavidina, e afins.

Quando a composição de matéria consiste num receptor e num material sólido, o primeiro está ligado ao segundo. Entre os materiais que podem ser utilizados para o transportador sólido encontram-se materiais sintéticos, naturais e "semi-sintéticos", que se referem a materiais que podem incorporar no transportador tanto material que ocorre naturalmente como sintético. Podem ser utilizados látex, látex de poliestireno, vidro, dextrano, agarose, sílica, mica, argila, diatomáceas, e outros materiais, sendo particularmente preferidos os polímeros à base de látex. A forma do transportador não é crítica, e pode incluir, p. ex., materiais de forma em bastonete, romboidal e esférica, sendo a última destas particularmente preferida. Embora não seja crítico, é desejável que as partículas do transportador sejam de tamanho uniforme, tais como contas de látex possuindo um 25 /7

diâmetro médio desde cerca de 20 nm até cerca de 20 μιη. As contas preferidas possuem um diâmetro médio desde cerca de 0,3 μπι até cerca de 1,0 pm, e uma realização particularmente preferida emprega contas possuindo um diâmetro médio no intervalo desde cerca de 0,4 μιη até cerca de 0,5 μπι.

Para monitorizar a colocação do material transportador na matriz durante quaisquer processos de fabrico, é desejável utilizar um transportador que seja fluorescente ou colorido, embora não seja essencial.

Como indicado supra, é preferível tratar as composições de matéria com uma solução possuindo um pH que difere do pi do receptor. Geralmente, a solução pode possuir um pH desde cerca de 2,0 até cerca de 12,0, sendo particularmente preferido desde cerca de 3,0 até cerca de 9,0. A escolha do pH para a solução de tratamento variará dependendo da natureza da molécula, do seu pi e de outros factores. 0 material da matriz, como indicado supra, pode possuir uma carga inerente, ou pode ser tratado para possuir uma. A fibra de vidro, por exemplo, possui inerentemente uma carga negativa, por isso se for utilizada uma matriz contendo fibras de vidro a composição de matéria deve ser tratada de modo a transportar uma carga positiva (p. ex., solução de tratamento a um pH abaixo do pi), e a própria matriz não tem que ser tratada. Outros materiais de matriz que não possuem uma carga podem ser tratados para receber uma. As matrizes podem ser tratadas com, p. ex., ácidos ou bases para protonar ou desprotonar grupos funcionais existentes ou através de hidrólise parcial para originar novos grupos funcionais. Podem ser empregues outras modificações tais como oxidação de periodato de funções aldeídicas para grupos carboxilo, succinilação de grupos funcionais amino por tratamento anidrido ou colocação de matrizes em campos eléctricos. Exemplos não limitativos de materiais que podem ser utilizados como matrizes incluem materiais fibrosos ou bíbulos tais como papel de filtro, celulose regenerada ou papéis à base 26 de refugo, combinações contendo celulose, algodão, ou fibras de vidro, bem como outros materiais fibrosos. A poliamida e a poliacrilamida são exemplos de sintéticos fibrosos ou bibulos. Também podem ser utilizados os vários velos utilizados em testes analíticos, assim como filmes, gelatinas, e afins, podendo todos ser incluídos dentro do âmbito desta invenção. Também podem ser empregues materiais de membrana não fibrosos e não trançados. Exemplos de materiais que podem ser utilizados incluem nylon, nitrocelulose, acetato de celulose, e PVDF.

Na preparação de matrizes de teste, a composição de matéria é aplicada à matriz, e qualquer solução na qual a composição está contida é então removida. Isto resulta numa incorporação da composição na matriz do teste. Devido à força da interacção das cargas opostas, a composição liga-se onde está colocada. Adicionalmente, dado que as cargas se repelem uma à outra, o problema da aglomeração associada aos transportadores sólidos tais como contas é eliminado. Utilizando esta invenção, o material de transportador sólido é disperso ao longo da matriz, mas apenas onde é depositado. Isto origina o fabrico de dispositivos zonados, tais como os dispositivos de três zonas descritos acima extremamente simples e permite uma avaliação precisa e sensível de um analito a ser analisado.

As tiras de teste fabricadas de acordo com a dispersão da composição de matéria descritos acima podem também ser sujeitas a tratamento posterior, de modo a resultar em dispositivos analíticos úteis em vários tipos de ensaios. Por exemplo, após a incorporação de um primeiro receptor no instrumento de modo a ser aí incorporado de forma imóvel, pode ser adicionado um segundo receptor que é móvel na presença de um fluido. Se este segundo receptor é marcado, o instrumento resultante é útil num imunoensaio do tipo sanduíche. Quando uma amostra contendo o analito de interesse é adicionada ao instrumento, resulta numa sanduíche de receptor ligado, analito e receptor marcado anteriormente móvel, após o que o marcador pode ser determinado. 27

É óbvio que o segundo receptor, tal como um anticorpo, pode ser adicionado a partir de uma fonte diferente, i.e., não precisa de ser incorporado no dispositivo. 0 especialista na técnica notará certamente que as tiras de teste preparadas de acordo com esta invenção também podem ser adoptadas para utilização em ensaios do tipo competitivo e de deslocamento, com modificações em relação à tira de teste de acordo com os protocolos convencionais para a preparação de tiras de teste para estas categorias de ensaios.

Também é possível preparar tiras de teste de acordo com o processo aqui descrito para realizar ensaios do tipo multianalito ou de concentração. Por sistemas de "multianalito" entende-se que a tira é adaptada para identificar mais do que um analito. Isto é útil, p. ex., quando a necessidade surge para determinar que grupo(s) de Streptococcus está(ão) envolvido(s) numa infecção de doentes ou na resposta de doentes a uma série de antigénios de HIV tais como p24, gp41 e gpl20. Do mesmo modo que o instrumento de tira pode ser configurado para realizar testes "TORCH" quando a zona 2 do elemento 11 foi construída com os antigénios necessários para detectar anticorpos específicos para Toxoplasma, Rubella, Herpes Simplex e Cytomegalovirus para determinar que infecção é que um doente pode possuir. Como um "ensaio de concentração" entende-se um sistema no qual se quer determinar se um analito de interesse está presente em excesso ou em insuficiência numa amostra. No diagnóstico da diabetes, por exemplo, a quantidade de glucose presente numa amostra de fluido corporal é o parâmetro chave que é medido. A tira de teste pode ser estabelecida possuindo uma pluralidade de zonas, como apresentado na Figura 1, mas em que as reacções de coloração em zonas representam uma medição semi-quantitativa da "concentração" do analito na amostra. Por exemplo, se a primeira zona contém uma quantidade de receptor apenas suficiente para reagir com toda a glucose encontrada numa amostra de fluido corporal a partir de um indivíduo normal, podem ser utilizadas 28 /7

as seguintes zonas como um monitor para níveis excessivos ou tóxicos, porque os sinais não se devem registar nas zonas seguintes a menos que esteja presente uma quantidade anormalmente grande do analito. De modo semelhante, em situações nas quais, p. ex., se suspeita de uma deficiência hormonal, pode calibrar-se o dispositivo de modo a que a primeira e a segunda zonas contenham apenas reagente suficiente para reagir com uma quantidade de hormona normal. Utilizando esta abordagem, se não for desenvolvido nenhum sinal ou um sinal muito fraco na segunda zona, isto é indicador de uma quantidade anormalmente baixa do analito.

Os instrumentos de teste do tipo aqui descrito são vantajosamente mantidos numa caixa. Essa caixa pode não apenas proporcionar protecção para a tira de teste e segurança para o utilizador, mas também facilitar a utilização do dispositivo na realização das análises do teste, como será apresentado a partir da discussão que se segue.

Em referência à Figura 3a esta apresenta uma vista de topo de uma caixa 40, utilizada em ligação com o dispositivo de teste. O topo da caixa é uma estrutura alongada fabricada de um material inerte e forte tal como um plástico de poliestireno. É fornecida uma estrutura rectangular com os lados opostos curtos 41 e 41' e os lados opostos mais compridos 42 e 42' . Em referência a 40, da esquerda para a direita, o topo da caixa contém uma porta de aplicação 43, que é discutida de uma forma mais extensa infra. Esta porta desliza para baixo a partir da abertura e proporciona um ponto para aplicação do tampão de migração na tira de teste de modo a libertar quaisquer reagentes nele contidos, como explicado supra. Numa movimentação em direcção à extremidade oposta do dispositivo é fornecida uma segunda porta 44, que também desliza para baixo. Esta porta está posicionada sobre as três zonas do dispositivo de tira, i.e., o controlo negativo (21), leitura (22), e controlo positivo (23) descritos acima. Na prática, a amostra a ser analisada, bem como 29

outros reagentes possíveis, é aqui adicionada. Novamente, a porta desliza para baixo. 0 ângulo segundo o qual as paredes da porta deslizam é seleccionado de modo a minimizar o sombreado, que pode afectar de modo adverso a interpretação dos resultados. Na realização apresentada, a seta 45, "R" 46 e "C" 47 são apresentadas para auxiliar na utilização do dispositivo. A seta indica onde é que a amostra a ser analisada deve ser adicionada e "R" e "C" significam as zonas de "leitura" ou de teste e de "controlo" ou positiva, respectivamente. Em direcção à extremidade do dispositivo a porção sombreada é uma realização de configuração opcional.

Uma pluralidade de meios de projecções ou de juntas 48 saem a partir do lado dorsal do topo da caixa, e estão posicionadas de modo a encaixar em projecções correspondentes (52) na porção do fundo da caixa. As linhas a ponteado 4 9 e 4 9' mostram que o lado de baixo desta porção da caixa é colocada em reentrância para criar aquilo que é com efeito um rectângulo ligeiramente mais pequeno dentro de um maior. A porção do fundo do dispositivo, na figura 3b apresentada infra descreve as paredes interior e exterior dessa porção da estrutura mais claramente, e está presente uma configuração paralela na porção de topo, que encaixa a porção do fundo.

Em referência à Figura 3b, esta é uma vista de topo aberta da porção do fundo 50 da caixa. Esta é feita do mesmo material que a porção de topo e possui a mesma configuração geométrica. Está presente um par de barras longitudinais 51 no fundo da caixa e, juntamente com uma pluralidade de pares de projecções 52 define um guia para o posicionamento da tira de teste nesse local e também serve para suster a tira para fora do fundo da caixa. Pelo menos algumas destas projecções combinam com projecções paralelas na porção do topo da caixa para formar uma estrutura unida quando o topo e o fundo das caixas se encaixam. O fundo possui, à volta do seu perímetro uma parede interior 53 e uma parede exterior 54, que alinham com as estruturas 30

/7 equivalentes 49 e 49' no topo da caixa 40.

Uma caracteristica importante do topo da caixa é que está configurada de modo a que as quatro paredes da porta 44 não tocam exactamente na tira de teste ai posicionada. O resultado é que é criado um pequeno espaço capilar que por sua vez permite que a porta 44 retenha a amostra e outros reagentes e "meça" eficazmente a sua aplicação na tira de teste. Também, dado que o material da caixa não contacta directamente com a tira de teste, não existem efeitos não controlados ou não reconhecidos nas propriedades da própria tira de teste.

Um tipo semelhante de estrutura resulta da interpolação de projecções que saem a partir do topo e do fundo da caixa. Quando estas projecções interagem umas com as outras elas selam eficazmente o elemento de tira fechado, resultando na formação de pelo menos dois reservatórios que retêm o fluido em excesso. Para pormenorizar, é observado na Figura 3b que os espaços vazios 55 e 55' se estendem sobre o comprimento do invólucro ao longo da tira de teste. Estes espaços podem suster liquido e, se for adicionado demasiado em qualquer das portas 43 ou 44, isto pode resultar em extravasamento do dispositivo de tira. A selagem das partes da caixa 40 e 50 cria compartimentos de extravasamento discretos através da interacção das projecções, resultando contudo na retenção do fluido em excesso (tal como a amostra e os reagentes) no compartimento imediatamente adjacente ao ponto de aplicação até que a tira de teste esteja pronta para o absorver. Com efeito, esta interacção resulta noutro meio de medição, assegurando que o líquido aplicado ao dispositivo de tira entre a tira apenas na localização desejada.

As porções de topo e de fundo são ajustadas uma à outra e seladas após o próprio dispositivo ou instrumento estar posicionado na porção do fundo deste. O modo de selagem é da decisão do técnico. Exemplos de vários métodos através dos quais a selagem pode ser conseguida são adesivos, aplicação de calor, encaixe sobre pressão ou através de energia sónica. Também é 31

concebível, embora improvável, que a caixa seja construída de modo a que as porções do topo possam ser separadas e a tira de teste removida. A própria operação da invenção como aqui descrita será agora apresentada através dos exemplos que se seguem.

Exemplo 1

As partículas conjugadas com um anticorpo foram preparadas de acordo com a invenção. Para o fazer foi preparado látex carboxilado fluorescente possuindo um diâmetro médio de partículas nominal de 0,51 μπι como uma suspensão de sólidos a 2,5% (p/v), utilizando azida de sódio a 0,02% (p/v)/timersol a 0,02%. Foi acoplado a estas partículas anticorpo policlonal de coelho anti-strep A através de ligações carbodiimida. O produto final foi uma suspensão de sólidos a 0,5% (p/v), armazenada em glicina a 100 mM/HEPES a 50 mM/cloreto de sódio a 150 mM/albumina de soro bovino a 0,1% (p/v)/azida de sódio a 0,1% (p/v), e timerosal a 0,01% (p/v). A composição total estava a um pH de 7,4.

As amostras foram então preparadas para teste através da diluição de fracções do látex para sólidos a 0,26% (p/v), utilizando fosfato de sódio a 50 mM/cloreto de sódio a 150 mM, a pH 7,2, seguido por transferência para tubos de centrífuga de 15 mL (Corex) , juntamente com tampões de vários tipos e pH, como discutido abaixo. As amostras foram centrifugadas a 9900 rpm (11 700 x g max) durante 15 minutos, e os sobrenadantes foram aspirados e eliminados.

As partículas de látex foram ressuspendidas a 0,27% (p/v) de sólidos em tampão de teste. Cada suspensão foi sonicada antes da diluição para 0,005% (p/v) para a determinação da distribuição do tamanho de partículas. Os resultados estão sumarizados na Tabela 1: 32

Tampão de teste Anticorpo Diâmetro de partícula (nm) CV(%) fosfato de sódio a 50 mM (pH 2) + 472 13,5 fosfato de sódio a 50 mM (pH 3) + 445 24,5 fosfato de sódio a 50 mM (pH 4) + 641 50,5 fosfato a 50 mM/salino (pH 7,2) + 491 20,6 ácido acético a 50 mM (pH 3) + 477 15,7 fosfato a 50 mM/salino (pH 7,2) - 371 17,0

Os anticorpos em partículas provocaram a agregação a um pH de 4, enquanto que a valores de pH acima e abaixo deste produziram partículas com meios de distribuição muito semelhantes, e que são apenas ligeiramente maiores do que o látex não derivado (note-se o coeficiente de variação ou "CV").

Os valores de CV demonstram que a valores de pH de 2, 3 e 7,2 as partículas estavam essencialmente monodispersas.

As várias espécies que constituem a preparação de anticorpo policlonal possuem pontos isoeléctricos ("pis") que variam desde 5 a 8. Uma vez que o anticorpo está a ser acoplado ao látex carboxilado o ponto isoeléctrico do conjugado látex-anticorpo seria um pouco mais baixo do que uma média ponderada dos pontos isoeléctricos das espécies de anticorpo acopladas. A repulsão da carga de superfície é um factor importante na manutenção do conjugado látex-anticorpo num estado de não agregação e é provável que a um pH de 4 uma proporção significativa das partículas anticorpo-látex teria carga de superfície líquida insuficiente para impedir tal agregação. 33

Exemplo 2

Foi estudada a interacção de complexos carregados de anticorpo e de látex com um suporte sólido. 0 processo do Exemplo 1 foi seguido para ligar anticorpos a partículas de látex. Foram preparadas amostras adicionais através da diluição de fracções de látex não derivado para sólidos a 0,5% (p/v) com o mesmo tampão de diluição descrito no Exemplo 1. As fracções separadas do látex não derivado e de conjugados anticorpo-látex foram transferidas para tubos de microcentrífuga de 2 mL juntamente com os vários tampões da Tabela 1. As amostras foram centrifugadas a 14 000 rpm (16 OOOxg max) durante 5 minutos. Os sobrenadantes foram aspirados e removidos, após o que os sedimentos de látex resultantes foram ressuspendidos a 0,2% (p/v) de sólidos no tampão de teste utilizado anteriormente.

Foram então pipetadas três fracções (de 25 μΐ cada) de cada amostra de teste directamente para o lado mais poroso do papel de microfibra de vidro. A interacção foi observada através de fluorescência sob luz UV de comprimento de onda longo. Os locais de fluorescência foram fotografados utilizando transiluminação de UV e uma câmara Polaroid. A Figura 4 apresenta estes resultados.

As amostras de látex foram adicionadas ao papel de microfibra de vidro em fosfato de sódio a 50 mM (pH 2, 4, 6, 8, 10 e 12) com o anticorpo acoplado ao látex (amostras 2, 4, 6, 8, 10 e 12) ou sem o anticorpo acoplado ao látex (amostras 2R, 6R, 8R, 10R e 12R) . Foram também avaliadas amostras adicionais em ácido acético a 50 mM (pH 3) com o anticorpo acoplado ao látex (amostra HAC-3) e sem o anticorpo acoplado ao látex (HACR-3). A figura demonstra que quando o anticorpo está presente no látex a interacção entre o látex e o papel de microfibra de vidro aumenta dramaticamente - i.e., o diâmetro do local diminui, apresentando uma difusão/dispersão no papel muito menor 34

e um posicionamento mais "apertado". Isto permite o fabrico de tiras de teste com as partículas que transportam o receptor em posições precisas, escolhidas.

Os resultados demonstram que a interacção aumentada varia com o pH. Quando o pH do tampão de teste é mais baixo do que os valores do pi do anticorpo (i.e., pH 2-4), o grau de dispersão é diminuído.

Exemplo 3

Foram realizados outros estudos que confirmam uma das conclusões alcançadas a partir das experiências do Exemplo 2 -que a presença de um receptor carregado nas partículas auxiliou na redução da dispersão.

Os anticorpos de coelho anti-strep A, como descrito supra, estavam correctos juntamente com o papel de microfibra de vidro dos exemplos anteriores. Os conjugados dos anticorpos anti-strep A e da peroxidase (POD) foram preparados seguindo de um modo geral Nakane et al., J. Hist. & Cyt. 22(12): 1084-1091 (1974).

Adicionalmente, foi preparado um antigénio de carbohidrato estreptocócico de Grupo A, seguindo de um modo geral Kholy et al., Appl. Microbiol. 28(5): 836-839 (1974).

Foram preparados dispositivos de acordo com a Figura 2. O anticorpo descrito supra foi diluído ou a 250 μg/mL ou a 600 μg/mL em fosfato de sódio a 50 mM, a pHs de 2, 4, 6, 8, 10 ou 12, ou em ácido acético a 50 mM, a pH 3. Foi aplicada uma quantidade de 12 μ]3 de anticorpo a ambas as concentrações e a vários pHs em regiões de teste de microfibra de vidro para proporcionar materiais de avaliação. Cada tira de teste foi preparada em duplicado para ambas as concentrações a todos os pHs listados. As tiras foram secas a 37°C durante uma hora.

Nos testes foi adicionado um volume de 270 pL de tampão a pH neutro a cada dos duplicados de papel de microfibra de vidro das tiras de teste, enquanto que a segunda das tiras receberam 35

2 ng/mL do antigénio do carbohidrato estreptocócico do Grupo A. Este antigénio foi preparado seguindo Kholy et al., App. Microbiol. 28(5): 836-839 (1974). Após a aplicação ou do controlo ou do antigénio, foram aplicados volumes de 35 μΐί de conjugados de anticorpo de coelho anti-strep A marcado com peroxidase a 4 U/mL, e incubados durante um minuto. Após isto, foram aplicadas amostras de 1 mL de tetrahidrato de perborato de sódio em PBS às esponjas das tiras. As tiras foram observadas visualmente, após 15 minutos de reacções de coloração para indicar a ligação do anticorpo anti-strep A ao papel. A Figura 5 apresenta resultados típicos demonstrando o que é referido como um efeito de pH. Foi observada uma reacção corada a pH 4, mas não a pH 10. De um modo geral, quando o valor de pH está abaixo de um valor de pi típico para anticorpos (variando entre 5,6 e 7,7), foram observadas reacções coradas tanto em tampão fosfato como em tampão acetato. Á medida que os pHs aumentam de 6 para 10, a reacção corada diminui gradualmente. Não foi observada reacção corada na ausência do antigénio de carbohidrato estreptocócico do Grupo A, o que sugere especificidade e que a ligação do anticorpo ao papel de microfibra de vidro do modo aqui descrito não impede interacção com o antigénio. Assim, as tiras preparadas do modo aqui descrito podem ser utilizadas em dispositivos de imunoensaio qualitativo.

Exemplo 4 A mobilidade de látex fluorescente não derivado foi comparada com a mobilidade de conjugados látex-anticorpo. Foram preparados os dispositivos e reagentes como descrito supra, bem como o protocolo para a aplicação do reagente. O tampão de teste para a ressuspensão do látex e dos conjugados látex-anticorpo foi ou fosfato de sódio a 50 mM, a pH 2 ou a pH 12, ou ácido acético a 50 mM, a pH 3. A interacção do látex com a tira de 36

papel foi observada através de fluorescência com luz ultravioleta antes e após a revelação da tira. Fotografias exemplificativas são apresentadas na Figura 6. A Figura 6, como observado, apoia a contenda de que quando um anticorpo está presente no látex, ele desempenha um papel essencial na interacção com o suporte de teste (p. ex. , papel de microfibra de vidro). Deve ser notado, p. ex., que existe uma banda menos distinta para o látex bruto antes da revelação da tira, e uma redução na fluorescência da banda para o látex bruto após a tira ter sido revelada.

Exemplo 5

Os exemplos seguintes apresentam a praticabilidade de utilizar anticorpos na invenção aqui descrita. Outras proteínas são também utilizáveis, como é agora apresentado.

Foram obtidas proteínas de HIV-1 recombinantes contendo regiões imunodominantes para as moléculas p24 e gp41, assim como o foram para IgG humana a partir de um doente positivo para o HIV-1 que exibia elevada reactividade anti-gp41. Foram também assegurados anticorpos monoclonais anti-p24 de HIV-1, assim como o foram a IgG de cabra anti-humana e IgG de cabra anti-murganho conjugadas com peroxidase. A proteína p24 foi fornecida em tampão fosfato de sódio a 0,1 M a pH 8,5, e contendo SDS a 1% (p/v) . Isto foi diluído desde 23,9 mg/mL até 4,0 mg/mL, utilizando tampão fosfato de sódio a 0,01 M a pH 7,5. 0 tampão foi trocado contra tampão fosfato de sódio, utilizando uma Centricon Unit de 10 kDa. De forma semelhante, a proteína recombinante gp41 foi trocada em tampão fosfato de sódio a 0,1 M a pH 7,5, em que o tampão continha SDS a 0,1% (p/v) e EDTA a 5 mM.

As amostras das proteínas foram diluídas para 1 mg/mL em fosfato de sódio a 50 mL, a pHs de 2, 4, 6, 8, 10 ou 12, ou em ácido acético a 50 mL, a pH 3. Os protocolos de aplicação foram 37 exactamente como descritos para os anticorpos anti-strep A como discutido no Exemplo 3.

Novamente, após o Exemplo 3, foram aplicados volumes de 270 μΐ, de diluição 1:100 (v/v) de anticorpos monoclonais de murideo anti-p24 de HIV a um dos duplicados das tiras, enquanto que volumes equivalentes de amostras de soro negativo para o HIV foram adicionados à outra tira como controlos. Isto foi seguido por adição de fracções de 30 a 35 μΐϋ de conjugados IgG anti-murganho de cabra peroxidase (diluição de 1:200 (v/v)) e IgG anti-humana de cabra peroxidase (0,1 U/mL) às tiras, e depois 1 mL de solução de PBS contendo tetrahidrato de perborato de sódio. Novamente, como no Exemplo 3, foi observada uma cor visível, desta vez após 10 minutos. A formação de cor indica ou a presença de complexos p24:IgG de murganho, ou complexos p24:IgG de humano. A Figura 7 apresenta estes resultados. A "primeira"’ tira de cada amostra, que utilizou amostras de murideo, demonstrou que quando ocorreu a impregnação de proteína a pH baixo (2 e 3), existiu uma ligação extremamente apertada ao papel de filtro. À medida que os níveis de pH aumentam, a mobilidade aumenta. Embora as amostras negativas tenham apresentado alguma ligação não específica, todas as amostras foram de longe menos reactivas do que as tiras positivas.

Exemplo 6 O protocolo utilizado no Exemplo 5 foi utilizado para testar a gp41, sendo as únicas diferenças o facto de o controlo positivo ser IgG anti-gp41 de HIV humana purificada (62 μ/mL), e ter sido utilizado conjugado de IgG anti-humana de cabra peroxidase (0,1 U/mL) em ambas as tiras. A fotografia da Figura 8 demonstra mais uma vez que existia uma correlação entre a mobilidade e o aumento de pH. 38

Exemplo 7

Os elementos de tira como aqui descritos e como apresentados na Figura 2, foram utilizados para a detecção de estreptococos do Grupo A. A matriz 20 foi primeiro preparada cortando um pedaço de papel de fibra de vidro da Whatman com fibra de álcool polivinilico numa tira de 2,8 cm de comprimento e 0,6 cm de largura. A primeira porção desta tira está impregnada com 6-12 pL de uma suspensão de sólidos a 0,1% (p/v) de 0,4-0,5 pm de látex de poliestireno possuindo IgG de coelho não imune acoplado à sua superfície. A porção do meio desta tira foi impregnada com uma suspensão semelhante de látex acoplado a

IgG anti-Strep do Grupo A de coelho purificada por afinidade. A

porção terminal da matriz foi impregnada com um conjugado de IgG anti-Strep do Grupo A de coelho acoplada a látex e com 6 pL de

uma solução de antigénio de carbohidrato de Strep do Grupo A purificado, a uma concentração de 60-80 ng/mL. A matriz foi seca a 35°C durante aproximadamente 20 minutos. Isto produziu uma matriz completa possuindo uma disposição linear de zonas de fase sólida representando um verdadeiro controlo negativo "21", uma zona de resultado do teste "22" e um verdadeiro controlo positivo "23". Uma extremidade da matriz contactou por baixo em 2 mm com uma tira de 6,5 cm de comprimento e 0,6 cm de largura de papel 320 "24" impregnado no resíduo "25" com aproximadamente

60 pL de uma solução aquosa de azida de sódio a 100 mg/mL. A extremidade oposta da matriz contactou por baixo em 4 mm com uma tira de 1,2 cm de comprimento e 0,6 cm de largura de Vispore X6212. Foi colocada no topo da Vispore uma tira de 1,2 cm de comprimento e 0,6 cm de largura de adesivo de face dupla. Uma tira de papel "27" medindo 1,5 cm de comprimento e 0,6 cm de largura foi posicionada no topo do adesivo de dupla face. A tira de papel tinha sido impregnada com aproximadamente 50 pg de um substrato cromogénico para a peroxidase, i.e., 4-metoxi-l- naftol, e seca durante 15 minutos a 40°C. O papel 39

sobrepôs-se à componente da matriz em 2 mm estabelecendo assim contacto fluido directo com a matriz através do Vispore poroso. Foi colocada no topo do papel 3 uma tira de 1 cm de comprimento e de 0,6 cm de largura de adesivo de face dupla ”28". 0 adesivo foi posicionado de um modo que criou uma "janela" de 0,5 cm na superfície de topo do papel 27 numa posição mais afastada da componente da matriz. Finalmente, uma esponja "26" medindo 4 cm de comprimento e 0,6 cm de largura foi fixada no topo do componente 28. Todos os componentes da tira ficaram sobrepostos como indicado para formar uma tira contínua e foram montados num pedaço de 13 cm de comprimento e 0,6 cm de largura de folha de transportador de poliéster utilizando fusão a quente e/ou adesivos de face dupla.

As tiras construídas como descrito foram utilizadas para a detecção de estreptococos de Grupo A. Culturas de meio sólido repicadas com 0, 2,5 x 104, 5 x 104 e 1 x 105 de unidades formadoras de colónias (CFUs) de estreptococos do Grupo A foram colocadas em tubos de ensaio de vidro pequenos e sujeitas a uma extracção convencional de dois minutos com ácido micronitroso seguindo El-Kholy et al., supra para libertar o antigénio de carbohidrato específico para o grupo da parede celular de estreptococos intactos. Após a extracção, o extracto de ácido nitroso foi neutralizado com uma base fraca e 250 a 300 μΕ do extracto neutralizado foram aplicados gota a gota à componente da matriz do elemento de tira entre os pontos 21 e 22. Seguidamente, foram aplicados à mesma localização da matriz 30-35 μΙ; de uma preparação de conjugado de strep A de coelho marcado com peroxidase a 5 unidades/mL num tampão. Num passo final, foi aplicado à componente 26 do elemento de tira 1,2 mL de uma solução salina tamponada com fosfato contendo tetrahidrato de perborato de sódio. Todas as tiras às quais foram adicionados CF-Js de estreptococos de grupo A extraídos exibiam tiras azuis em ambas as posições 22 e 23 do componente de matriz da tira. As tiras utilizadas com extractos que não 40

continham CFUs de estreptococos do grupo A exibiam uma linha azul apenas na posição 23. A coloração azul na matriz era indicadora da acção da peroxidase no substrato cromogénico 4-metoxi-l-naftol na presença de peróxido de hidrogénio nas zonas representadas por 22 e 23. A inibição irreversível da peroxidase através da interacção com a azida de sódio na zona de resíduos 11 do reservatório absorvente 24 impediu um desenvolvimento substancial de cor neste reservatório. Isto auxiliou a preservar a estabilidade dos resultados do teste na componente da matriz eliminando a possibilidade de retrodifusão da cor para a matriz durante a secagem com evaporação do elemento da tira.

Exemplo 8

Para testar a flexibilidade do dispositivo de tira para utilização com sistemas de criação de sinal alternados enzima/substrato, as tiras foram construídas e ensaiadas de um modo idêntico ao descrito no Exemplo 7 com as seguintes excepções: o componente 27 foi impregnado com aproximadamente 50 pi de uma solução de fosfato de 5-bromo-cloro-3-indolilo (1-2 mg/mL) ("BCIP") e nitrobluetetrazólio (0,25-0,5 mg/mL) (NBT), não foi incorporado inibidor de sinal na componente 11, e o ensaio foi realizado utilizando 40-50 pi de um conjugado anti-strep A de coelho marcado com fosfatase alcalina a 5-10 unidades/mL e 2-amino-2 metil-l-propanol a 50 mM contendo tampão de lavagem. Todas as tiras às quais foram adicionados CFUs de estreptococos do grupo A extraído exibiram bandas púrpuras em ambas as zonas 22 e 23 da componente de matriz da tira. As tiras utilizadas com extractos que não continham CFUs de estreptococos do grupo A exibiram uma linha púrpura apenas na zona 23.

Exemplo 9

Para demonstrar a utilidade do dispositivo de tira com um 41 i

sistema de criação de sinal não enzimático, foi preparado um conjugado de IgG anti-strep do grupo A de coelho marcado com ouro com Aurobeads™ de 30 nm (Janssen) . Os procedimentos e os sistemas de tampão utilizados para a preparação do conjugado foram os recomendados pelo fabricante para a marcação de partículas de 30 nm com anticorpo monoclonal. Foi utilizada para a marcação uma concentração de anticorpo de 5-10 μg/mL de solução coliodal de ouro. O elemento de tira foi construído de um modo idêntico ao descrito no Exemplo 7 com a excepção de os componentes 28 e 27 não terem sido incorporados na tira e não ter sido utilizado inibidor de sinal na zona de resíduo 25 do reservatório absorvente 24. Para avaliar as tiras foram aplicados ao componente de matriz entre as zonas 21 e 23 250- 300 μΐ. de um extracto de ácido nitroso neutralizado contendo ou zero ou 1 x 105 CFUs de estreptococos. Este passo foi seguido pela aplicação de 50 μΙ, de uma suspensão de anticorpo marcado com ouro, ajustado para uma absorvência a 520 nm de 5,0 a 7,0 para a mesma região da matriz. No passo final do ensaio, foi adicionado à componente 2 6 1,2 mL de uma solução de lavagem salina tamponada com fosfato. As tiras às quais foi adicionado extracto neutralizado contendo CFUs estreptocócicos do grupo A exibiam linhas vermelhas nas zonas 22 e 23. As tiras que receberam extracto desprovido de CFUs estreptocócicos do grupo A exibiam uma linha vermelha apenas na zona 23.

Exemplo 10

Para demonstrar a utilidade do dispositivo de tira com um sistema de criação de sinal "incorporado", as tiras foram construídas de um modo idêntico ao descrito no Exemplo 1 com a excepção de o componente 27 conter o anticorpo marcado com ouro utilizado no Exemplo 9 em forma seca. As tiras foram avaliadas através da aplicação de extractos de ácido nitroso neutralizados com ou sem CFRs estreptocócicos à componente da matriz como 42

descrito no Exemplo 9. Após a aplicação da amostra à matriz foi adicionado ao componente 27 1,2 mL de solução de lavagem salina tamponada com fosfato. A IgG de coelho anti-strep A marcada com ouro libertada da almofada de componentes 27 ligou-se ao antigénio do grupo A capturado nas zonas 22 e 23 em tiras expostas à amostra contendo as CFUs estreptocócicos do grupo A. As tiras expostas aos extractos sem CFUs estreptocócicos do grupo A exibiram um vermelho fino apenas na zona 23.

Exemplo 11

Para demonstrar a utilização do dispositivo de tiras numa forma de "pauzinho", as tiras foram preparadas como descrito no Exemplo 1 com a excepção de que o componente 26 não foi incorporado no elemento de tira. A aplicação da amostra e conjugado foi efectuada como descrito no Exemplo 7. No passo final do ensaio, as tiras foram colocadas em tubos de teste de 12 x 75 mm contendo 500 μΐ de salino tamponado com fosfato com um composto produtor de peróxido de modo que o componente 3 fosse posto em contacto com a solução de lavagem. As tiras expostas à amostra contendo estreptococos de grupo A exibiram linhas azuis nas zonas 22 e 23. As tiras expostas à amostra desprovida de estreptococos de grupo A exibiram uma fina apenas na zona 9.

Exemplo 12

Para demonstrar a utilização do dispositivo de tira para a detecçâo de outros analitos, as tiras foram construídas e ensaiadas de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 7 com as seguintes excepções: o componente 20 foi impregnado com 12 μΐ. de uma suspensão sólido a 0,1% (p/v) de látex de poliestireno de 0,4-0,5 pm revestido com os péptidos recombinantes p24 ou gp41 (antigénios de HIV-1) ou uma solução a 1 mg/mL das proteínas 43

purificadas individuais e não sendo incluídas linhas de controlo positivo ou negativo (zonas 21 e 23) em 20. Diferenças adicionais incluíram: (1) ausência de inibidor de sinal incorporado na zona de resíduos 11 do componente 10, (2) foram utilizados como controlos amostras de soro humano positivas e negativas para o HIV-1 (diluições 1:100 v/v) ou anticorpos monoclonais específicos de murídeo (p. ex., p24 anti-HIV-1 de murganho NEN) e (3) foram utilizados como reagentes criadores de sinal conjugados de IgG anti-humana e IgG anti-murganho de cabra com peroxidase. As amostras de soro contendo anticorpo contra p24 ou gp41 quando utilizadas com este dispositivo originaram uma linha visível (22) do tipo descrito no Exemplo 7, enquanto que não foi originado nenhum sinal com amostras de soro negativas.

Exemplo 13

Para demonstrar a utilização do dispositivo de tira para a detecção de outros analitos, as tiras foram construídas e ensaiadas de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 7 com as seguintes excepções: o componente 20 foi impregnado com 12 μΐ de uma suspensão de sólidos a 0,2% (p/v) de látex de poliestireno de 0,4-0,5 fim revestido com anticorpo monoclonal de murganho anti-BhCG (zona 22) e um controlo positivo (zona 23) consistindo em anticorpo policlonal de ovelha anti-IgG de murganho revestido com o látex acima mencionado. Nessas experiências preliminares não foi utilizado nenhum controlo negativo (zona 21). As diferenças_adicionais incluíram: (1) não foi incorporado nenhum inibidor de sinal no componente 24, (2) as amostras de hCG (0, 50 e 500 mIU/mL) tanto em PBS como em urina humana foram utilizados como controlos e (3) foi utilizado como o reagente criador de sinal o conjugado monoclonal de murganho anti-holo hCG-HRP. Um anticorpo anti-holo hCG é aquele que se liga a um epitopo criado pelas cadeias α e β de hCG, e se liga apenas a 44 esse epitopo. As diferenças no formato de ensaio foram relacionadas com o volume; isto é, 150 μΐ, de amostra, 50 μΐί de mAb anti-holo hCG-HRP (12 U/mL) e 850 μύ de tampão de migração.

Foram observados resultados semelhantes com tiras possuindo o conjugado mAb anti-holo hCG-POD seco no componente 20 antes das zonas de teste 22 e 23, que eliminaram a necessidade de adição manual de conjugado liquido.

As amostras de urina contendo hCG quando utilizadas neste dispositivo criaram duas linhas visíveis (zonas 22 e 23), sendo uma a região de teste e sendo outra o controlo positivo. As amostras de urina desprovidas de hCG exibiam uma linha visível única (zona 23) na região do controlo positivo.

Exemplo 14

Foi preparada uma tira de teste e utilizada para analisar hCG em urina. A tira foi idêntica à do Exemplo 15, excepto que o mAb anti-holo hCG foi conjugado com fosfatase alcalina; o componente 27 foi impregnado com BCIP/NBT (0,5 mg/mL de cada em metanol) e foi utilizado um tampão de migração de fosfatase alcalina.

Foram obtidos resultados semelhantes com tiras possuindo o conjugado de mAb anti-holo hCG fosfatase alcalina seco no componente 20 antes das zonas de teste 22 e 23 que eliminou novamente a necessidade de adição manual de conjugado líquido.

As amostras de urina contendo hCG quando utilizadas neste dispositivo criaram duas linhas visíveis (zonas 22 e 23) , sendo uma a região de teste e sendo outra o controlo positivo. As amostras de urina desprovidas de hCG exibiam uma linha visível única (zona 9) na região do controlo positivo.

Os exemplos antecedentes apresentam assim as características da invenção. Essas características incluem, p. ex., um processo útil para fabricar um elemento de teste útil em processos analíticos, tais como o diagnóstico de vários 45

parâmetros. Este processo de fabrico, na sua realização mais lata, requer aplicar uma carga a um receptor especifico para o analito, e depois aplicar esta composição de matéria a um elemento de teste transportando uma carga oposta. A interacção de cargas imobiliza a composição de matéria suficientemente de modo a que não sejam necessários adesivos para tornar o dispositivo resultante útil. A composição de matéria, como a frase é aqui utilizada pode referir-se a algo tão simples quanto uma amostra de receptor especifico para o analito. Alguns receptores específicos de analito potenciais são discutidos infra. Numa realização preferida deste aspecto da invenção a composição de matéria também contém um transportador, ao qual o receptor específico para o analito se liga ou ao qual ele adere. Novamente, os exemplos de transportadors são fornecidos infra.

Numa realização preferida particular, a composição de matéria é tratada para que lhe seja transmitida uma carga colocando-a em contacto com uma solução possuindo um PH diferente do ponto isoeléctrico ("pi") dos receptores específicos para o analito constituindo ou contidos na composição de matéria. 0 modo através do qual este tipo de contacto é realizado, incluindo a determinação do pi dos receptores específicos para o analito, é bem conhecido na técnica e não necessita de ser aqui pormenorizado.

Como indicado, a composição de matéria é aplicada a um elemento de teste que transporta uma carga. Deve ser notado que alguns dos materiais geralmente utilizados para elementos de teste, incluindo papéis, transportam uma carga. Quando tais materiais são utilizados, não é necessário outro tratamento para assegurar a imobilização da composição de matéria no elemento de teste. Contudo, quando o elemento de teste não transporta uma carga, pode ser tratado para transportar uma que seja oposta à transportada pela composição de matéria. Existem muitas maneiras convencionais para realizar esta tarefa, por exemplo, tratando 46

um elemento de teste contendo celulose com periodato, expondo um elemento de teste de nylon a condições acidicas ou sujeitando o material a um campo eléctrico. A natureza do receptor especifico para o analito pode variar. Os receptores comuns incluem anticorpos, tanto policlonais como monoclonais, assim como fragmentos de ligação destes, e anticorpos oligovalentes ou "polimerizados". Os receptores podem ser outras proteínas tais como proteína A ou proteína G, e uma vez que o receptor também pode ser um antigénio quando o ensaio determina anticorpos (ver os ensaios de HIV, supra), qualquer proteína de ligação pode servir como um receptor específico para o analito. De modo semelhante, os receptores tais como lectina podem conter moléculas de carbohidrato, lípido ou ácido nucleico, bem como as proteínas mencionadas anteriormente. A biotina e avidina/estreptavidina bem como derivados destas estão aqui incluídas, uma vez que são receptores que foram tratados de modo que não altera a sua capacidade de ligação ao analito. Exemplos de tais modificações não necessitam de ser aqui fornecidas, na medida em que a técnica está presumivelmente familiarizada com, p. ex., succinilação de proteínas para as tornar mais susceptíveis de ligação em fase sólida.

Os receptores específicos para o analito são escolhidos, certamente, com base no objectivo do ensaio. Os testes típicos incluem, p. ex., ensaios para agentes etiológicos para doenças infecciosas, incluindo, mas não estando limitados a, as doenças sexualmente transmitidas ("STD"). 0 receptor é por isso escolhido para se ligar a um epitopo do agente causador. Adicionalmente aos microrganismos específicos mencionados supra, Chlamydia, Rubella, Cytomegalovirus, Toxoplasma, Neissería, Herpes, e Vírus da Imnunodeficiência Humana são alguns dos organismos que podem ser ensaiados.

Quando são utilizados transportadores em ligação com os receptores aqui descritos, o "transportador" pode ser qualquer 47

dos materiais associados com o instrumento de diagnóstico. Estes incluem, mas não estão limitados a transportadores de uma forma especifica (p. ex., uma conta ou esfera), ou de materiais sintéticos ou naturais específicos, tais como látex, vidro, carbohidratos em ligação cruzada, agarose, poliestireno, dextrano, mica e diatomitos. Estes transportadores podem ser sólidos ou porosos. São especialmente preferidos transportadores que possuem um tamanho uniforme e possuem cerca de 1,0 nm a cerca de 20 μιη em diâmetro. São especialmente preferidas partículas de 0,3 a 1,0 μιη, sendo particularmente preferidas as de 0,4 a 0,5 μπ\ de diâmetro.

Após as partículas terem sido aplicadas ao transportador de teste como indicado, o material resultante pode ser utilizado para fabricar o dispositivo de diagnóstico. Tais instrumentos são outro aspecto da invenção, incluindo materiais multizonados. A característica mais importante do instrumento da invenção inclui a presença de três zonas distintas, cada uma das quais compreendendo material absorvente. Estas zonas estão apresentadas de um modo que o fluido ou amostra a ser analisado se possa deslocar através de cada um destes. A primeira zona é caracterizada por conter um material imobilizado não reactivo, tal como IgG não ligado. Estes materiais são úteis em permitir que o utilizador possa avaliar a integridade do dispositivo particular a ser utilizado. A segunda zona é fabricada de modo a compreender um receptor específico para o analito, que pode, mas não precisa de estar, ligado ao material absorvente de um modo descrito supra. A terceira zona contém tanto o receptor de analito como o analito a ser determinado. Esta combinação assegura que, se o dispositivo estiver funcional, a ligação ocorrerá na terceira zona. O analito na terceira zona pode, mas não precisa de ser dissolvido na amostra a ser testada. A presença do reagente imobilizado assegura que o analito aqui contido seja imobilizado, que esteja dissolvido ou, p. ex., presente em 48

transportadores tais como aqueles descritos supra. É indicado supra que o receptor especifico para o analito do instrumento da invenção pode ser qualquer um dos tipos de receptores discutidos supra. De forma semelhante, estes receptores podem estar posicionados em qualquer dos transportadores descritos supra. 0 suporte utilizado para fazer os transportadores de teste assim como o instrumento podem ser fibrosos (por exemplo, pode conter fibras de vidro), bibulos (por exemplo, contendo papel absorvente ou celulose), e podem também ser membranosos, tais como um gel, filme, tecido, etc.

Existem muitas realizações diferentes do dispositivo e processos da invenção aqui descritos, todos eles são úteis para o técnico da especialidade. Por exemplo, podem aplicar-se princípios básicos de análise de diagnóstico para produzir variantes dos dispositivos aqui descritos. Tal como foi salientado, o método de imobilização descrito leva ao posicionamento de um receptor específico para o analito. Um segundo receptor pode também ser incorporado no transportador de teste ou instrumento. Em tal situação, o segundo receptor pode ligar ou o analito de interesse, criando assim uma estrutura de sanduíche com o primeiro receptor - analito - segundo receptor, ou pode ligar-se directamente ao primeiro receptor, competindo assim com o analito para a ligação. Em qualquer destas realizações, é desejável que o segundo receptor transporte uma marca que proporcione um sinal detectável. A marca escolhida pode ser uma enzima, uma solução coloidal de ouro, uma solução coloidal de corante corante, uma partícula corada, um fluorescente, um quimioluminescente ou uma marca radioactiva. Quando é utilizada uma enzima tal como a B galactosidase, peroxidase, fosfatase alcalina, urease, ou oxidase da glucose, o transportador de teste pode conter também uma substância que reage com a enzima para proporcionar um sinal, geralmente mas não exclusivamente corado. As enzimas listadas devem ser tomadas 49

como exemplo das enzimas que podem ser utilizadas. A lista não é muito vasta. É bem reconhecido que em muitas situações, incluindo, por exemplo, diagnóstico de STDs, é desejável analisar uma amostra para mais do que um analito ao mesmo tempo. A invenção proporciona um método para produzir dispositivos úteis para esta análise polianalito, quando é utilizada uma pluralidade de diferentes composições de matéria, estando estas posicionados em diferentes áreas de um elemento de teste. Várias configurações estão também disponíveis para a construção do dispositivo de teste de acordo com a invenção. A descrição dos dispositivos multizona da invenção supra proporcionados explica como todas as três zonas contêm reagente imobilizado. Como os reagentes tanto das segundas como das terceiras zonas devem ligar o analito de interesse, é desejável algumas vezes, embora não necessário, que estas sejam idênticas. Por exemplo, num ensaio de tiroxina, uma das zonas 2 e 3 pode conter anticorpos anti-tiroxina imobilizados, e a outra proteína que liga tiroxina imobilizada. Ambas as zonas podem também conter um destes. Do mesmo modo, na pesquisa de anticorpos para HIV podem ser utilizados dois péptidos diferentes nas duas zonas, ou pode ser utilizado o mesmo péptido em ambas. Também, como os exemplos mostram, existem anticorpos que se ligam apenas a epitopos criados quando duas cadeias simples se combinam para formar um dímero, e anticorpos que são específicos para apenas uma cadeia. Este tipo de diversidade de anticorpo pode também ser explorado na invenção. A primeira zona, como indicado, contém um reagente activo imobilizado. A escolha do material aqui utilizado pode variar, embora seja preferido utilizar uma forma inactiva do reagente imobilizado em uma ou ambas as segunda e terceira zonas. A inactivação pode ser assegurada por tratamento com calor ou vários agentes químicos, por exemplo.

Na construção do equipamento da invenção, pode ser 50

desejável configurar as zonas de modo a que o fluxo da amostra seja controlado. Isto pode ser conseguido, por exemplo, possuindo duas zonas contíguas posicionadas de modo a que a direcção do fluxo do fluido numa seja perpendicular ao fluxo na outra.

Embora os dispositivos aqui revelados requeiram três zonas, estes não estão limitados a apenas três. Deste modo, pode ser preferido adicionar uma quarta zona, posicionada a jusante da terceira zona. As vantagens práticas da quarta zona incluem a capacidade de absorver o excesso de líquido no dispositivo. Também, a quarta zona, como está posicionada à frente dos sítios das reacções imobilizadas, podem conter vários materiais que permitam ao utilizador determinar se a tira de teste em particular continua funcional, assim como o decurso da reacção. Entre os materiais que podem ser incorporados na quarta zona estão substâncias que mudam de cor na presença de um líquido, indicadores de pH que mudam de cor quando sujeitos a variações de pH, e, numa realização útil em particular, inibidores de sinal. Esta realização é útil porque frequentemente, o excesso de reagente marcado ou produtos corados de uma reacção fluirão para a quarta zona, e então "voltarão atrás em contracorrente" numa ou mais zonas de reacção. A utilização de um inibidor ajuda a evitar que aconteça este tipo de situação.

Uma quinta zona pode também ser utilizada, ou em conjunto com a quarta zona como descrito, ou com apenas da primeira à terceira zonas. Esta quinta zona está posicionada a montante da primeira zona, e contém a química da reacção, tal como um receptor marcado que toma parte na reacção do analito. Este receptor marcado é libertado e flui para as várias zonas e reage da maneira supra descrita. Será utilizado um meio absorvente em ligação com a quinta zona, e está em contacto fluido com esta, assim como a quinta zona está com a primeira zona.

Devido ao contacto da primeira e quinta zonas, pode ser desejável inibir ou regular o fluxo do fluido, e nesse caso 51 podem ser incorporados meios de inibição, de modo a direccionar o líquido para a quinta zona e para além da primeira zona, mas não directamente para a primeira zona. Os meios de regulação aqui descritos, é preferencialmente um que direcciona o fluido para se mover numa direcção vertical. Preferencialmente, quando todas as zonas desejadas estão configuradas na forma desejada, são colocadas num suporte inerte do tipo geralmente utilizado em tiras de teste de diagnóstico. Em particular, é preferido que a primeira, segunda e terceira estejam colocadas num suporte inerte.

Foi supra mencionado, que é possível incorporar um segundo receptor no instrumento desta invenção. A incorporação no dispositivo em si não é necessária, no entanto, uma vez que o segundo receptor pode ser fornecido numa porção externa separada do presente instrumento, mas como parte de um "Kit". Tal "Kit" pode também incluir uma porção separada de um tampão de migração, isto é, um material adicionado directamente ao dispositivo que é geralmente inerte e que ajuda na migração dos vários componentes do ensaio através do dispositivo.

Outras realizações da invenção serão claras para o técnico da especialidade e não necessitam ser aqui apresentadas. Deve ser entendido que a especificação e exemplos são ilustrativos mas não limitativos da presente invenção.

Lisboa, 25 de Junho de 2001

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Claims (28)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Dispositivo analítico útil na determinação de um analito numa amostra, compreendendo um material absorvente possuindo uma pluralidade de zonas, em que: i) uma primeira zona do referido material absorvente contém um reagente imobilizado que não se liga ao analito ii) uma segunda zona do referido material absorvente contém um reagente imobilizado que se liga especificamente ao analito a ser determinado, e iii) uma terceira zona do referido material absorvente contém (a) um reagente imobilizado que se liga especificamente ao analito e (b) um analito solubilizável, de modo a que possa ser formado um produto de reacção detectável independentemente do analito estar presente na amostra, indicando assim o correcto funcionamento do dispositivo.
2. 2. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida segunda zona contém um anticorpo imobilizado ou um fragmento susceptivel de se ligar deste.
3. 3. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, em que o referido reagente imobilizado está ligado a um transportador que está imobilizado na referida segunda zona.
4. 4. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 2, em que o referido transportador compreende látex, vidro, sepharose, agarose, poliestireno, dextrano, mica ou diatomitos.
5. 5. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 2, em 1

   L· que o referido transportador é uma esfera ou conta.
6. 6. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 5, em que a referida esfera ou conta possui um diâmetro desde 1,0 nm a 20 μπ\.
7. 7. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 6, em que a referida esfera ou conta possui um diâmetro desde 0,3 a 1,0 μπ\.
8. 8. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 7, em que a referida esfera ou conta possui um diâmetro desde 0,4 a 0,5 μιη.
9. 9. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida segunda zona contém um antigénio ou um fragmento deste epitopicamente activo.
10. 10. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida segunda zona contém proteína A, proteína G, estreptavidina, avidina ou uma lectina.
11. 11. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, em que os reagentes imobilizados da referida segunda zona e da referida terceira zona são idênticos.
12. 12. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, em que o reagente imobilizado da referida terceira zona e o reagente imobilizado da referida segunda zona são idênticos, e o reagente imobilizado da referida primeira zona é uma forma quimicamente inactiva dos reagentes imobilizados das referidas segunda e terceira zonas.
13. 13. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, em 2

    que o referido reagente imobilizado na referida segunda zona está posicionado perpendicularmente à direcção do fluxo do fluido no referido material absorvente.
14. 14. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, em que o referido reagente imobilizado na referida terceira zona está posicionado perpendicularmente à direcção do fluxo no referido material absorvente.
15. 15. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda uma quarta zona posicionada a jusante da referida terceira zona para absorção do excesso de fluido.
16. 16. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 15, em que a referida quarta zona contém um reagente que muda de cor na presença de um fluido.
17. 17. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 15, em que a referida quarta zona contém um reagente que muda de cor quando sujeito a alteração de pH.
18. 18. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 15, em que a referida quarta zona contém um reagente que inibe a formação de um sinal detectável.
19. 19. "Kit" útil na determinação de um analito numa amostra compreendendo o dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1 e uma porção separada de um segundo, receptor marcado que se liga especificamente ao referido analito.
20. 20. "Kit" de acordo com a reivindicação 19, em que o referido receptor marcado é marcado com uma enzima, ouro, uma 3

    solução coloidal de corante, uma partícula corada, um fluorescente, um quimioluminescente ou um marcador radioactivo.
21. 21. "Kit" de acordo com a reivindicação 19, compreendendo ainda uma porção separada de uma substância que reage com o referido receptor marcado para formar um sinal detectável.
22. 22. "Kit" de acordo com a reivindicação 19, compreendendo ainda uma porção separada de um tampão de migração inerte.
23. 23. "Kit" de acordo com a reivindicação 19, em que o referido segundo, receptor marcado é um anticorpo ou um fragmento susceptível de ligação deste.
24. 24. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda uma quinta zona posicionada a montante da referida primeira zona, contendo a referida quinta zona uma substância que reage com um receptor marcado para proporcionar um sinal detectável, e um meio absorvente posicionado no topo da referida quinta zona e em contacto fluido com esta, em que a referida quinta zona está em contacto fluido com a referida primeira zona.
25. 25. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 24, compreendendo ainda um meio de inibição de fluxo de fluido posicionado de modo a evitar o fluxo de fluido do referido meio absorvente para a referida primeira zona e para direccionar o fluxo de fluido do meio absorvente para a referida quinta zona.
26. 26. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 25, compreendendo ainda um segundo meio de inibição de fluxo de fluido posicionado entre as referidas quinta e primeira 4 zonas e estendendo-se ao longo de toda uma região de contacto de fluido entre elas.
27. 27. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 24, compreendendo ainda um meio de regulação de fluxo de fluido posicionado entre as referidas quinta e primeira zonas que direcciona o fluxo de fluido numa direcção vertical.
28. 28. Dispositivo analítico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda um suporte inerte no qual as referidas primeira, segunda e terceira zonas estão posicionadas.

    Lisboa, 25 de Junho de 2001 (Agente oficial da propriedade industrial 5