JPH06510602A - 可逆的流動クロマトグラフィー結合アッセイ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 可逆的流動クロマトグラフィー結合アッセイ発明の背景 本発明は、特異的結合アッセイを行う、特に流体試料中の分析物の存在を検出す る方法およびそのための装置に関する。

流体試料中の特定の分析物（例えば、病原体またはホルモンまたは一本鎖核酸標 的のごとき抗原）の検出は、種々の結合アッセイ、例えば、イムノアッセイまた はＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いて行うことができる。一般に、 かかるアッセイは、テスト試料と特異的結合試薬（例えば、特異的抗体）との反 応、および該テスト試料中の注目する分析物の量の直接的および間接的定量測定 を容易とする試薬との反応を含む。酵素免疫法またはエライヤ法として公知の１ の特定の例において、酵素（例えば、ホースラディツシュペルオキシダーゼ）に 共有結合した抗体をテスト試料と反応させ、免疫複合体を基質と反応させ、続い て発色した最終生成物を測定することによって分析物の存在を検定する。

コールマン（Ｃｏｌｅ＋ａａｎ）　（米国特許第３．７９９．７４２号、１９７ ４）は、２つの膜を破壊して、特異的結合試薬（例えば、分析物に特異的な抗体 ）を含有するチャンバーへ流体試料が流動するのを可能とすることを含む。分析 物の存在は発色反応によってモニターする。

バラエル（Ｂａｕｅｒ）ら（米国特許第３．８１１．８４０号；１９７１）は、 吸収剤吸上体に固定された特異的結合試薬の使用を報告している。該吸上体は、 分析物を含有する試料に浸漬し、試料が吸上体に移るのを容易とし：分析物の存 在は発色反応によって検出される。

ネレンベルグ（Ｎｅｒｅｍｂｅｒｇ）　（米国特許第３．６４５．６８７号；１ ９７２）は、分析物を含有する試料を毛細管に適用する以外は、バラエル（Ｂａ ｕｅｒ）らのものと同様のイムノアッセイを報告している。

ダフォルン（Ｄａｆｆｏｒｎ）ら（クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ、　Ｃ ｈｅｔ　）　３６　：　１３１２．１９９０）は、ＨＩＶ抗体検出のためのイム ノアッセイを報告している。

抗原をコートしたラテックスマイクロスフイアを吸上体の繊維に埋め込み；該吸 上体に適用されたヒト血清試料は、抗原に接触しつつ（毛細管作用によって）下 流に移動する。基質アンプルを破壊すると、基質が（試料の入口の上流に位置し た）スポンジに放出される。飽和すると、該スポンジは膨張して、該吸上体に接 触し、基質は該吸上体にゆっくりと輸送される。基質の放出と同時に、試料入口 の下流の該吸上体に、蛋白Ａ−酵素複合体溶液を手動にて添加する。スポンジに よる基質のゆっくりとした放出により、該複合体と固定化抗体−抗原複合体との 反応の時間を可能とする。複合体は発色反応によって検出される。

リイ（Ｌｉ）ら（アナリティカル・バイオケミストリー（＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、１６６　：　２７６．１９８７）は、固定化抗体およ び酵素を含有する紙支持体を、基質、発色指示薬、および酵素阻害剤、ならびに 検出されるべき分析物を含有する試料に浸漬する一工程イムノアッセイを報告し ている。毛細管作用は試料を両紙の上方に吸い上げ、（有限量で存在する）阻害 剤は反応ゾーンから外に移動し、発色を検定する。カラーパーの高さは分析物濃 度に比例する。

ズク（Ｚｕｋ）ら（米国特許第４，４３５，５０４号；　１９８４およびクリニ カル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｗ、）旦１：１１４４．１９８５）は 、固定化抗体を含有する乾燥した紙片を用いる競合的イムノアッセイを報告して いる。該紙片をまず分析物および酵素−分析物複合体を共に含有する溶液に浸漬 し、次いで、基質および発色剤を含有する溶液に完全に浸漬する。

ドイチ、　（Ｄｅｕｔｓｃｈ）ら（米国特許第４．０９４．６４７号；１９８０ ）は、試料分析物を吸収剤テスト片にプロットする競合的イムノアッセイを報告 している。

（毛細管作用によって）テスト切片に沿って分析物を輸送させ、まず標識した分 析物、次いで固定化した分析物−特異的抗体との接触を容易とする展開流体に該 テスト片を浸漬する。未結合試薬はテスト片に沿ってさらに輸送される。標識さ れた努析物および試料分析物は固定化抗体に対する結合につき競合し；固定化抗 体のサイトにて測定された標識の量は試料中の分析物の量に反比例する。

コウル（Ｃｏｌｅ）ら（米国特許第３．２４６．３３９号；１９８１）は、アッ セイ装置のテストウェルからの過剰の液体を吸い出すための吸収剤貯蔵器の使用 を開示しており１分析物はテストウェルの多孔性膜表面に捕捉され、検出される 。

バグンヤウエ（Ｂａｇｓｈａｗｅ）　（米国特許第３．８８８．６２９号：１９ ７５）は、乾燥された特異的結合試薬を含有するマトリックスパッドを通しての 流体試料の濾過を促進するための吸収剤貯蔵器の使用を報告している。

トム（Ｔｏａｄ）ら（米国特許第４．３６６．２４１号）は、２つの吸収性ゾー ンを有するイムノアッセイ装置を報告しており、分析物結合の相手方は第１のゾ ーン（「免疫吸着ゾーン」）に拡散しないように固定され、第２のゾーンは、直 接的または間接的に第１のゾーンとの液体を受容する関係にあって、第１のゾー ンを通ってかつそれから液体を引き出す貯蔵器ゾーンである。

ブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ）ら（ＷＯ９０１０５９０６）は、（ｉ）検出可能な アッセイ生成物を保持できる反応ゾーン、（ｉｔ）反応ゾーンを通っての試料ま たは結合試薬の所定の流動を計測する反応ゾーンとの液体移行接触における対照 吸収剤、および（ｊｉｉ）対照吸収剤を通っての流体の流動を速める吸収剤貯蔵 器を含むテスト装置を報告している。

発明の概要 本発明は、まず１の方向に分析物捕捉試薬を輸送し、次いで、細長い毛細管流動 マトリックスに沿って反対方向に輸送する二方向毛細管流動（すなわち、可逆的 流動）を利用する。かかる可逆的流動は、（すなわち、順方向流動の間および逆 方向流動の間における）特異的結合試薬との分析物接触を最大にすることによっ て、利用可能な試料をより効率的に利用する。また、可逆的流動は検出ゾーンか らの未反応試料および未結合試薬の除去を容易とし、検出剤／洗浄試薬はアッセ イ装置に沿いもとの試料の流動へ反対方向に当該装置に沿って流動し、未結合ま たは未反応成分をそれで吸う。これは、非特異的バックグラウンドに寄与する試 薬を除去することによってアッセイの感度を高める。（後記にて詳細に記載する ）かかる利点は、本発明の装置および方法によって提供される。

一般に、本発明の第１の態様は、少なくとも１つの固定化分析物捕捉試薬への分 析物の結合を検出することによって、流体試料中の分析物（例えば、ウィルス抗 原、好ましくはネコ白血病ウィルスまたはヒト免疫不全ウィルス、また、別法と して、イヌ糸条虫抗原、例えば、デイロフイラリア・イミテイス（Ｄｉｒｏｆｉ ｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ）由来の抗原）の存在または量を測定するアッセイを 行うための装置をその要旨とする。検出を容易にするために、未結合物質を固定 化分析物捕捉試薬ゾーンから洗い出す。該装置は、毛細管流体運動を駆動できる 毛細管チャンネルおよび第２の領域に結合した分析物を検出する手段を包含する 細長い固相流動マトリックスを含む。該流動マトリックス自体は、以下の領域、 （ｉ）流体試料を受け入れに適合する第１の領域、（ｉｉ）分析物捕捉試薬をそ れに固定化した第２の領域、（ｉｌｉｌ）未結合物質を第２の領域から除去でき る流体試薬を適用するための第３の領域：および（汁）高容量の吸収能を有する 吸収剤貯蔵器を包含する。第２の領域は第１の領域と第３の領域の中間、および 吸収剤貯蔵器と第３の領域の中間に位置させる。流動マトリックスおよびその諸 領域は、流体試料が、第２の領域に向けておよびそれを通って１の方向に細長い 流動マトリックスに沿ってまず流動し、続いて、液体試薬が、該第１の方向と反 対の第２の方向に、第２の領域を通って、細長い流動マトリックスに沿って吸収 剤貯蔵器へと流動し、それで未結合物質を吸うようなサイズおよび位置とする。

第１の好ましい具体例において、第２の領域に結合した分析物を検出するための 手段は、検出可能な反応を受ける試薬を含み、該液体試薬は、当該反応に参画す る過剰の少なくとも１つの他の試薬と共に、検出可能な反応の所定の限定量の阻 害剤を包含する。本具体例による装置において、液体試薬の流動は、該阻害剤を まず第２の領域まで輸送し、阻害剤および未結合物質が第２の領域から外へ輸送 されると、検出可能な反応が、未結合物質の不存在下で起こる。

第２の好ましい具体例において、当該装置は、シールされた容器中の液体試薬、 および（好ましくは、該容器に穴をあけることによって）液体試薬をマド１ルツ クスの第３の領域に適用させるための手段（好ましくは、ヤリ状体）を包含する 。

第３の好ましい具体例において、吸収剤貯蔵器は、（使用に先立って）流動マト リックスに接触しないように位置させ、該手段は、吸収剤貯蔵器を移動させて流 動マトリックスと流動状態で接触させるための装置に包含される。加えて、液体 試薬を第３の領域に適用するための手段は、吸収剤貯蔵器を移動させて流動マト リックスと接触させるための手段に連結させることができ、操作者が１回の操作 で両機構を作動させることを可能とする。

第４の具体例において、第３の領域に適用される液体試薬は洗浄試薬であり、さ らに流動マトリックスは検出試薬の適用のための第４の領域を包含し；第３の領 域は、検出試薬の配送に先立ち洗浄試薬を第２の領域に配送して（未結合試料お よび未反応液体試薬の除去を容易とするように）、第２の領域と第４の領域の中 間に位置させる。本具体例による装置は、シールされた検出試薬貯蔵容器および 流動マトリックスの第４の領域に隣接して位置させたシールした洗浄試薬貯蔵容 器を包含する。加えて、操作者が１回の操作で両試薬を適用できるように、検出 試薬適用手段は洗浄試薬適用手段（例えば、両容器に穴をあけるよう位置させか つそれに適したヤリ状体（ｌａｎｃｅ））に連結させることができる。

最後に、第５の好ましい具体例において、該装置は、液体試薬（例えば、洗浄試 薬または検出試薬）が吸収剤貯蔵器へと流動するのを阻止するよう位置させた溶 解性部材を包含する少なくとも１つのバリヤー材を包含する。第２の領域を通っ て第１の方向に試料が流動するのを可能とするのに十分であるとして選択された 所定時間の後、固体部材の溶解によって、液体試薬が吸収剤貯蔵器へと第２の方 向に流動するのが可能となる。好ましくは、かかるバリヤー材は、第１の領域と 吸収剤貯蔵器との中間に：第３の領域と第２の領域との間に、あるいはその双方 に位置させる。

第２の態様において、本発明は、前記したごときタイプのア、ノセイを行う方法 をその要旨とする。かかる方法は、（ａ）前記装置の一つを供し：流体試料を該 装置の流動マトリックスに適用し１次いで、流動マトリックスの第２の領域に結 合した分析物を検出することを含む。

本発明の第１の態様の種々の好ましい具体例は、本発明の第２の態様に係る好ま しい方法を行うのに用いる。

最後の態様において、本発明は、前記したごときタイプのアッセイを行うための 装置をその要旨とし、これは、流体試料を受け取るための第１のセグメントを包 含する細長い流体流動マトリックス、分析物捕捉試薬が固定化された第２の領域 、吸収剤貯蔵器、液体試薬の供給手段、および該マトリックスにおいて流動を阻 止するように位置させた溶解性バリヤー材を含む。第２の領域は液体試薬の供給 手段と吸収剤貯蔵器との間に位置させる。溶解性バリヤー材は、試料が第２の領 域を通って第１の領域から流出する後まで、液体試薬が該供給手段から吸収剤貯 蔵器に流動するのを妨げるように位置させる。その時点で、該バリヤー材は、洗 浄試薬が第２の領域を通って吸収剤貯蔵器へと流動するのを可能にすることを解 決する。

好ましい具体例において、バリヤー材は、液体試薬と第２の領域との間；あるい は第１の領域と吸収剤貯蔵器との間；あるいはその双方に位置させる。

「分析物」とは、検出されるべき分子を意味する。例えば、本明細書中で用いる 分析物は、モノ−もしくはポリエピトープ性、抗原性またはノ１ブテン性である リガンドであり得：それは、単一の化合物または少な（とも１つの共通するエピ トープ性部位を共に有する複数の化合物であってもよく：また、それは受容体ま たは抗体であってもよい。

「固定化された分析物捕捉試薬」とは、固体支持体に結合し、注目する分析物に ついての特異的親和性を有する分子を意味する。好ましくは、該親和性は、例え ば、酵素と基質あるいは抗原と抗体の間の関係で見られるように、分析物に対し て相補的三次元構造を保有する試薬によって生じる。所与の対のうちにおいて、 いずれかのメンバーは分析物または捕捉試薬であると考えられる。定義は、装置 または方法に含まれる試薬（すなわち、分析物捕捉試薬）から、試料中の検出さ れるべき成分（すなわち、分析物）を区別するのにのみ役立つ。

分析物：分析物捕捉試薬の対の例は、限定なくして、以下の組合せの全部、病原 体（例えば、細菌、ウィルス、菌類、フイラリア寄生虫、または原生動物）。

溶解性蛋白（例えば、成長因子、リンホカイン、トキシン、またはホルモン）。

または細胞表面の蛋白もしくは炭水化物（例えば、細胞接着分子、ラミニン、フ ィブロネクチン、インテグリン、またはレクチン）および特異的抗体もしくは特 異的受容体を包含する。かかる対は薬物、代謝産物、農薬、または汚染物質およ び各々に対して特異的な受容体を包含する。

「高容量能の吸収剤貯蔵器」とは、試料の合計容量およびすべての添加された液 体試薬（例えば、検出試薬または洗浄試薬）の合計容量の過剰の液体容量を収容 できる吸収剤貯蔵器、例えば、吸収剤パッドを意味する。

「ヤリ状体」とは、液体試薬容器のシールに穴をあけることができる構成要素を 意味する。かかるヤリ状体は、液体試料のその貯蔵容器からの流動および液体試 料の流動マトリックスへの流動を容易にする吸上体を包含し得る。

「液体試薬」とは、未結合物質（例えば、未反応流体試料および未結合特異的結 合試薬）を第２の領域から外に輸送する流体を意味する。該液体試薬は「洗浄試 薬」であってもよく、これは、未結合物質を第２の領域から除去するためにのみ 供されるか、あるいは、それは、「検出試薬」を包含してもよく、これは、未結 合物質を第２の領域から除去するため、また分析物の検出を容易とするために供 される。さらに、該液体試薬には、限定量の「阻害剤」、すなわち、検出可能な 最終生成物の発色を阻止する物質を包含させることができ°る。「限定量」とは 、はとんどまたはすべての過剰の未結合物質が第２の領域から外へ輸送され、そ の時点で検出可能な最終生成物が生成するまで、最終生成物の発色を阻止するの に十分な阻害剤の量を意味する。

本発明の方法および装置は、多数の利点を提供する。例えば、本発明の装置およ び方法は異常に感受性の分析物の検出を容易にする。試料液体は、アッセイの実 質的部分につき、分析物が移動するアッセイ試薬（例えば、酵素標識抗体）と接 触し、また固定化された分析物捕捉試薬との分析物の接触の機会が順方向流動お よび逆方向流動双方に存在するように、装置内を流動する。分析物とアッセイ試 薬との接触を最大化することは、分析物の補足の効率を最大化させ、テスト試料 の少量のみを必要とし、乏しい量の分析物さえの異常感受性検出に供される分析 方法を容易とする。

さらに、可逆的な流動は、それにより、洗浄試薬による未結合試料および未結合 標識特異的結合試薬（例えば、酵素−抗体複合体）の除去の後、検出試薬が反応 ゾーンに侵入できる半自動化方法を提供する。これは、検出試薬（例えば、基質 ）と未結合標識特異的結合試薬との間の接触を最小化し、バックグラウンド（例 えば、バンクグラウンド発色反応）を減少させ、それにより、感度を上昇させる 。加えて、半自動化法は、操作者の必要操作を減少させることによって、実行の 容易性に寄与する。

可逆的免疫クロマトグラフィー法の一般的タイミングは、さらに、マトリックス 物質の適当な選択およびマトリックス内における結合試薬の適当な位置付けによ って自動化できる。例えば、試料液体の流動をまず特異的結合試薬に向ける試料 侵入口の基部に溶解性フィルムを位置させることができ：　（試料侵入カップ中 の残存試料による）フィルムの溶解は、（フィルムの真下に位置する）吸収剤貯 蔵器と流動マトリックスとの間の接触を可能とすることによって、装置を通って の毛細管流動の方向を逆にする。このフィルムの適時の溶解は、１またはそれを 超える試薬の正確に適時の添加を操作者に要求することなく、免疫複合体の形成 に利用できる時間を増大させる。第２の溶解性フィルムは、検出器の基部／洗液 分配カップに位置させることができる。流動マトリックスの長さを進んだ試料に よるこのフィルムの溶解は、検出剤／洗液と流動マトリックスの接触を可能とし 、流体流動を逆向きとし、検出剤／洗液侵入地点における流動マトリックスを空 にするに際し、検出剤／洗液は毛細管作用によって固定化結合試薬の方向に流動 される。

要約すると、本発明の可逆的流動技術は、低バツクグラウンドかつ高特異性のア ッセイを容易とする。加えて、免疫クロマトグラフィー法の自動化される性質は 、本明細書中に記載する結合アッセイを実行する個人に要求される技術素養のレ ベルを低下させ、合理的に訓練されていない実行者が、実験室から離れた環境で 行うこともできるアッセイを容易とする。

詳細な記載 まず、図面につき簡単に記載する。

図１は、本発明の可逆的流動クロマトグラフィー結合アッセイを行うための装置 の平面図である。

図２は、図１の装置の断面図である。装置ハウジングの頂部は、操作者の動作に 先立って位置させて示しく仮想線）、および操作者の動作の後に位置させて示す （実線）。

本発明は、分析物分子が含有されていると疑われる流体試料についての特異的結 合アッセイを行うための方法および装置をその要旨とする。後記するアッセイ方 法の１の特別の形態はサンドイツチ法であり、そこでは、試料分析物を固定化さ れていない標識特異的結合試薬（例えば、酵素−抗体複合体）と接触させる。

分析物捕捉試薬へのその結合の結果（例えば、固体基質、例えば、ラテックスビ ーズまたはアッセイ装置それ自体に結合した分析物−特異的抗体）、分析物が（ 検出ゾーンに）固定化される。検出ゾーンにおける複合体形成を（例えば、放射 性、蛍光、もしくは光吸収標識を用いる場合は）直接的に、あるいは検出試薬（ 例えば、酵素−抗体複合体の酵素成分と反応する色原体基質）との反応の後に検 定する。

一般に、かかる結合アッセイを実行するには、本発明の方法および装置の使用は 、３つの段階を含む。まず、分析物を含有する試料を、試料適用手段を介して装 置に適用し、流動マトリックスに沿って流動させ、結局は飽和させることを可能 とする。次に、吸収剤貯蔵器を（例えば、機械的に、あるいは流動マトリックス から吸収剤貯蔵器を隔てるのに供される溶解性フィルムの溶解によって）飽和し た流動マトリックスと接触させ、それにより、流体の流動を逆にする。最終的に 、検出剤および／または洗浄溶液を（例えば、該溶液を含有する貯蔵容器に穴を あけることによって、あるいは、試料が、液体試薬を流動マトリックスから隔て るのに供される溶解性フィルムを溶解するのを可能とすることによって）流動マ トリックスに配送する。液体試薬は未結合試料および未結合標識特異的結合試薬 を除去し、（固定化された分析物捕捉試薬の位置において）分析物複合体の検出 を容易にする。流動マトリックスと吸収剤貯蔵器との接触および液体試薬の配送 は、好ましくは、同時に行う。

従って、前記工程の全体としての配列は、流動マトリックス内の液体の流動なら びに沈積された標識特異的結合試薬および分析物捕捉試薬の位置に対する試料お よび液体試薬侵入地点の物理的位置決めによって支配される。操作者がしなけれ ばならないのは、一般に、最大３つの工程・試料の適用、貯蔵された液体試薬（ すなわち、基質／洗浄溶液）の一工程放出、および吸収剤貯蔵器と流動マトリッ クスとの機械的接触である。吸収剤貯蔵器の流動マトリックスとの接触および／ または検出剤／洗浄溶液の放出を制御するための溶解性フィルムの使用は、操作 者の必要事項を二工程ないしは単一の工程までさえ減少させる。

可逆的流動タイプの結合アッセイを容易にするために、一般に、本発明の装置は 、以下の要素、試料侵入手段；毛細管液体流動を支持でき、まず順方向（すなわ ち、試料侵入手段から離れる方向）に流動を向ける流動マトリックス、逆方向（ すなわち、試料侵入手段に戻る方向）に液体流動を促進するために、流動マトリ ックスに流動状態でカップリングし得る試料侵入手段に隣接して位置させた吸収 剤貯蔵器：および液体の流動を逆向きとするに際して検出試薬および／または洗 浄試薬の配送を容易とする装置の反対端部に位置する液体試薬侵入手段よりなる 。

さて、本発明の特別のテスト装置を以下に記載する。これらの具体例は本発明を 説明する目的のもので、限定するものではない。

図１および図２は本発明の装置２ｏの１の具体例である。装置の構成要素は、ヒ ンジ１６の手段により相互に枢動可能に配設された、上方ハウジング部１３およ び下方ハウジング部１４内に収容される。かがるハウジングは、所定位置に構成 要素を適切に保持し、試料を内部の流動マトリックスに配送することを可能とし 、ならびに操作者がアッセイの結果を目でモニターするのを可能とするために供 される。枢動連結は、最初に、ハウジングの２つの部分を離して保持する（「順 方向」の流動が可能となる）。操作者の動作は、構成要素１３および１４を一緒 に強（握り、流動マトリックスを吸収剤貯蔵器と接触させ、次いで、液体試薬を （前記したごと（に）放出させ、「逆方向流動」を可能とすることによって達成 される。

かかる装置を用いて結合アッセイを行うには、流体試料を試料侵入カップ１を通 して適用する。流体試料を以下のごとくに流動マトリックス４に吸い込ませる。

まず、試料は、干渉する粒状物を除去する任意の試料前濾過パッド２を通り、次 に、標識特異的結合試薬パッド３を通り、その際、標識特異的結合試薬は沈積さ れ、乾燥される。標識特異的結合試薬パノドと流体試料との接触の結果、標識特 異的結合試薬が試料に８解し、試料分析物が１ｌ識特異的結合試薬１：Ｒ合する の力夷町能となり：標識特異的結合試薬バ・ノドを試料侵入がソプに隣接して位 置させることにより、乾燥された試薬と接触する試料量を増大させる。別の具体 例番；お（飄ては、標識特異的結合試薬を沈積させ、（標識特異的結合試薬ノク ・ソ白こで１まなく）試料侵入カップ１それ自体で乾燥する。もう１つの別の具 体例におし１て｛ま、（溶液中で、あるいは乾燥された試薬として）標識特異的 結合試薬を別の／くイアノレ番二担持さ也装置への適用に先立って流体試料と混 合し，所望なら１ｉ、この混合物を一定時間インキユベートし、再度、試料分析 物：標識結合試薬の接触時間を増大させる。いずれの具体例によっても、毛細管 作用によって、試料および標識特異的結合試薬は次に流動マトリックス４に吸い 込まれ、マトリ・ノクスの物理的構造内で反応ゾーン１０に向けて「順方向」に 輸送され、そこを通過するが、そこには固定化分析物捕捉試薬が流動マトリック スに一体化されている。反応ゾーン１０には、すべての結合種（すなわち、試料 、標識特異的結合試薬および固定化分析物捕捉試薬）が存在する。流体流動は、 添加したすべての試料が吸収されるまで順方向に継続し、その時点で、流体の流 動は実質的に停止する。この時点で、ハウジング要素１３および１４は、操作者 によって（前記したごとくに）一緒番二強く握られ、流動マトリックス４を吸収 剤貯蔵器５と接触状態にする。吸収剤貯蔵器は、流体をマトリックスから吸い、 装置内で流体の流動の方向を逆向きにするようにマトリックス４の一端に向けて 位置させる。

流動を逆にする１；際し、流体試薬を流動マトリ・ソクスに配送する。図１およ び２に示した装置において、かかる液体試薬は洗浄試薬および検出試薬を包含す る。

洗浄試薬は洗浄試薬貯蔵容器７に貯蔵され、洗浄試薬配送吸上体６によって、流 動マトリックス４に配送される。洗浄試薬の目的は、未結合試料および未結合標 識特異的結合試薬を流動マトリックス４に沿って、反応ゾーン１０から外１二輸 送することにある。検出試薬は検出試薬貯蔵容器９に貯蔵され、検出試薬配送吸 上体８によって流動マトリックス４に配送される。検出試薬は分析物の検出を容 易にする。

図１および２に示した装置は、貯蔵容器に穴をあけ、かつ当該試薬を流動マトリ ノクスに配送するために供されたヤリ状体１２内の配送吸上体の物理的連結を示 す。この連結は、一回の動作で、２の貯蔵された液体試薬を放出するのを容８と する。２の試薬、すなわち、洗浄試薬、続いての検出試薬の引き続いての利用は 、洗浄試薬を検出試薬よりも吸収剤貯蔵器５に近付けることによって達成される 。吸収剤貯蔵器に向けての流体の流動は、毛細管力による、洗浄試薬の流動マト リックス４への引込を引き起こす。配送される試薬の容積が流動マトリックスに 吸収され、未結合試料および未結合標識特異的結合試薬を置き換えたら、検出試 薬は毛細管力によって流動マトリックス４に配送される。検出試薬は吸収剤貯蔵 器５の方向に洗浄試薬を置き換える。検出試薬が反応ゾーン１０に流入すると、 複合体形成が検出可能となり、アゾセイ手順は完了する。

この同一の装置は別の具体例で使用できる。特に、放射性、蛍光、または光吸収 分子（例えば、発色したラテックス粒子、金属ゾル、または染色したリポソーム ）に連結した標識特異的結合試薬を利用する場合、その標識した特異的結合試薬 は試薬貯蔵容器７に貯蔵でき、また洗浄溶液は試薬貯蔵容器９に貯蔵できる。

この具体例によると、標識特異的結合試薬は流動マトリックスに放出され、続い て試料が侵入し、前記したごとくに装置が作動され、標識特異的結合試薬は反応 ゾーン１０に固定化された試料分析物に特異的に結合する。（装置作動で同時に 放出された）洗浄溶液は、標識特異的結合試薬の背後の流動マトリックスに配送 され、未結合試料および未結合標識特異的結合試薬を除去し、正確な分析物の検 出を容易とする。

本発明の別の装置において、検出試薬は、反応ゾーンから未結合の試料および試 薬を除去し、分析物の検出を容易とするよう作用する。かかる装置は、当該装置 が単一の試薬貯蔵容器および単一の試薬配送吸上体を包含する（例えば、ヤリ状 体の構成要素として包含する）以外は、実質的に図１および２に示したように設 計できる。前記したごとく、試料を装置に添加し、添加後のある時点で（好まし 《は、試料が流動マトリックスを飽和させた後）、装置を操作者が（前記したご と《に）作動化させる。検出試薬貯蔵容器をヤリ状体（配送吸上体を含有）で穴 をあけ、検出試薬を流動マトリックスに配送する。（やはり前記したごとく）流 体の流動を逆向きとすることにより、毛細管力によって検出試薬が流動マトリッ クスに吸い込まれる。検出試薬が吸収剤貯蔵器に向けて流動するに従い、それは 流動マトリックス中の流体を置き換え、マトリックスを洗浄し、最も重要には、 未結合試料および未結合標識特異的結合試薬を除去する。

放射性、蛍光、または光吸収性分子に連結した標識特異的結合試薬の場合には、 検出試薬は、未結合標識試薬を洗い出すことによって、単に、反応ゾーンにおけ る複合体形成の検出を容易とする洗浄溶液として作用する。

例えば、酵素に連結した特異的結合試薬の場合において、検出試薬は、例えば、 反応ゾーンにおいて酵素一抗体複合体と反応するに際して検出可能なシグナルを 生じる基質を包含する。かかる場合において、有限量の阻害剤試薬を、検出試薬 分配カノブと流動マトリックスとの連結部に位置する阻害剤試薬パッドに取り込 むことができるか、あるいは検出試薬分配カップと反応ゾーンの間の流動マトリ ックス上に直接乾燥できる。有限量の阻害剤が反応ゾーンから外に移動すると、 検出試薬は標識特異的結合試薬との接触に際して検出可能なシグナルを生じる。

適当な操作を確実とするには、本明細書に記載するいずれの装置も、さらに、分 析物捕捉試薬から区別される位置において反応ゾーン１０に固定化された種々の 結合試薬を包含し得る。例えば、標識特異的結合試薬の種一特異的抗体部分また は酵素標識試薬の酵素部分を認識する免疫試薬を、装置内の試薬の活性度を評価 するための陽性対照として包含できる。加えて、試薬、例えば、酵素一抗体複合 体の抗体部分が由来する種の非免疫メンバーから単離した抗体を、免疫複合体形 成の特異性を評価するための陰性対照として包含できる。

自動化を最大化するためには、本明細書に記載するいずれの装置も、さらに、流 動マトリックス４を吸収剤貯蔵器５から隔てる溶解性フイルム１１を包含できる 。試料侵入口１にて流動マトリックスに添加された試料は、それにより、一の方 向に（すなわち、吸収剤貯蔵器から離れる方向に）流動され、反応ゾーン１０を 通過して流動する試料の量を最大化する。該フイルムは流体試料によってゆつ《 りと溶解され、溶解に際し、吸収剤バッド５と流動マトリックス４の間に接触が 起こり、流体の流動の逆同化を促進する。溶解性フィルム１５は、液体試薬貯蔵 容器６および８と流動マトリックスとの間に位置させることができる。マトリッ クスの端部（すなわち、試料侵入口１に対して遠位の端部）に流動した流体によ るフィルムの溶解により、液体試薬の流動マトリックスへの配送が可能となる。

逆向きの流体の流動は、毛細管カにょって、試薬をマトリックスに吸わせる。

本発明の基本的構成要素は、単一のユニットとしてパッケージできるか、あるい は多重試料装置用のいくっがのユニットとして収容できる。液体試薬貯蔵器また は試料侵入地点がいくつかのマトリックス構成要素間で占められる種々の収容パ ッケージオプションも考えられる。１の特別の例において、装置は、反応ゾーン 内に多数の領域を含み、各々は、異なる分析物捕捉試薬を包含し（例えば、１の ものは不コ免疫不全ウィルスに特異的な固定化抗体を包含でき、もう１つのもの はネコ白血病ウィルスに特異的な固定化抗体を包含できる）；単一の生物学的試 料（例えば、ネコ血清の試料）を一方または双方のウィルスの存在について検定 する。

好ましくは、反応ゾーン１ｏは、ハウジングの外部がら観察され、アソセイ結果 の迅速な検出が可能となる。試料侵入カップ１は、好ましくは、該カップの容量 が、アッセイを行うのに必要な試料の合計容量と少なくとも同じ大きさとなるよ うに設計する。加えて、吸収剤パッド５は、好ましくは、試料の合計容量ならび にすべての添加した液体試薬（すなわち、検出試薬および洗浄試薬）を収容する のに十分なサイズとする。

好ましくは、流動マトリックス材料は以下の特性：１　試料物質および標識特異 的結合試薬についての低非特異的親和性、２　毛細管作用により、マトリックス を横切って、持続的液体流動で一定距離にわたって液体を輸送する能力、および ３　（例えば、共有もしくは非共有結合による、あるいは物理的捕捉による）固 定化特異的結合試薬に対する迅速な結合を保有する。これらの特徴を保有する材 料は、合成もしくは天然繊維（ガラスまたはセルロースをベースとする材料ある いはポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリエステルのごとき熱可塑性ポリ マー）からなる繊維マント．特定の材料（例えば、ガラスまたは種々の熱可塑性 ポリマー）からなる焼結構造；あるいはニトロセルロース、ナイロン、ポリスル ホン等（一般的には、性質が合成的）からなるキャスト膜フィルムを包含する。

本発明は、通常多孔性ポリエチレンとして知られているポリエチレンの焼結した 微細な粒子からなる流動マトリックスを利用し、かかる材料は１ｃｍ”当たり０ ．３５および０５５グラムの間の密度、５および４０ミクロンの間のポアサイズ 、および４０および６０パーセントの間のボイド容量を有する。架橋ポリエチレ ンまたは超高分子量ポリエチレンからなる粒状ポリエチレンが好ましい。多孔性 ポリエチレンからなる流動マトリックスは前記にてリストした所望の特徴のすべ てを保有し、加えて、容易に種々のサイズおよび形状に二次加工される。特に好 ましい材料はクロメックス・コーポレイション（Ｃｈｒｏ＋Ｉｅｘ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ）　Ｆ　Ｎ　＃３８−２４４−１　（プルツクリン（Ｂｒｏｏｋｌ ｙｎ）、ニューヨーク州）からの１０〜１５ミクロンの多孔性ポリエチレンであ る。

吸収剤貯蔵器として使用するのに適した材料は、好ましくは、高度に吸収性のも のであり、流体試料＋添加液体試薬の過剰容量能を提供し、２つの材料の間の流 体移行の唯一の手段としての物理的接触によって流動マトリックスから液体を吸 収できるものである。種々の材料および構造が、これらの要件に適合する。セル ロースおよび誘導体化セルロース（例えば、酢酸セルロース）のごとき天然およ び合成繊維の繊維構造がこの使用で好ましい。該材料の繊維は、特定の軸に沿っ て配向したもの（すなわち、配列したもの）でもよく、あるいはランダムであっ てもよい。本発明の好ましい具体例は、０，１ないし０．３グラム／ｃｍ”の密 度範囲であって６０ないし９５パーセントのボイド容量の非配向酢酸セルロース 繊維を用いる。特別に好ましい材料はアメリカン・フイルトロナ・コーポレイシ ョン（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｆｉｌｔｒｏｎａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　Ｒ− １３９４８トランソーブ・リセルボ（Ｔｒａｎｓｏｒｂ　Ｒｅ５ｅｒｖｏｉｒ） 　（リッチモンド、バージニア州）である。

標識した試薬沈積物パッドとして用いるのに適した材料は、好ましくは、以下の 特性を有する・１　標識した結合試薬がそこで乾燥された固体材料への流体試料 の均一な暴露を容易とする、高液体ボイド容量；２　流動マトリックスへの試料 の侵入速度が、標識試薬パッドによって支配されないような急速な流動特性；３ 　沈積した特異的結合試薬の効率に悪影響を及ぼさず、かつ乾燥された試薬の迅 速な復元を可能とする材料表面持性：および４　吸収剤パッドと流動マトリック スとの間の液体流動を確立する能力（例えば、流動特徴を失うことのない圧縮性 ）。一般に、前記特性を有する材料は低密度繊維構成の繊維構造である。ポリエ ステルのごとき合成繊維からなる材料は、不活性表面および低密度構造という利 点を有する。好ましい標識試薬沈積物パッドは、熱−ニードルパンチを施して２ ないし１２オンスポリエステル／ヤード２の材料密度のマット構造としたポリエ ステル繊維のランダム配列からなる。特に好ましい材料はトロイ・ミルズ（Ｔｒ ｏｙ　Ｍｉｌｌｓ）ポリエステルマット＃１−９−１９５　（）ロイ（Ｔｒａｙ ）、ニューヨーク州）である。

ハウジングは、好ましくは、漏れを防止するため水密とし、不活性材料から製造 するが、ポリマー材料が二次加工の容易性のため好ましい。

溶解性フィルムとして用いるのに適した材料は、好ましくは、流体試料によって 溶解され、当該アッセイに必要な特異的結合もしくは化学反応に干渉せず、また 流動マトリックス内の液体の流動特性に悪影響を及ぼさないものとする。一般に 、前記特性を有する材料は、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、 およびメチルセルロースを含めた分子量３０００ないし１０００００００のポリ マーである。本発明で用いるのに好ましい材料は厚さ０．００１６インチのポリ ビニルアルコールであり；かかるフィルムはスペノヤルティ・プロダクツ（Ｓｐ ｅｃｉａｌｔｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　（ｖカドｓ）　−（ＭｃＡｄｏｏ）、ベ ンンルベニア州、カタログ番号５ｐ５５００）から入手できる。− 一般に、シグナル生成系は、例えば、放射性、蛍光、または光吸収分子のため、 検出可能なシグナルの生成を含む。がかる分子は、好ましくは、流動マトリック スを進行する標識特異的結合試薬の能力に干渉しないものとする。加えて、検出 可能な最終生成物が検出試薬との反応に際して生成すれば、最終生成物の溶液か らの沈殿の結果、流動マトリックス全体を伸びる「ラテラルストリーク（ｌａｔ ｅｒａｌｓｔｒｅａｋ）Ｊよりも局在するシグナルとなるのが好ましい。かかる シグナル生成系は、酵素および基質を含む。酵素アルカリ性ホスファターゼとの 反応による不溶性最終生成物を形成する基質の１の例はインドキシルホスフェー トである。酵素るホースラディツシュペルオキシダーゼとの反応により不溶性最 終生成物を生じる基質の例は、ティニスアイ・インコーホレイテッド（ＴＳＩ　 Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）　（ウェルセスター（ｌｏｒｃｅｓｔｅｒ）、マサ チャーセッツ州、カタログ番号ＴＭＩＯＩ）から入手可能なＴＭＢ］　ｕｅであ る。もしシグナル生成系が生成を含むならば。

別法として、シグナル生成系は、光を吸収する最終生成物（例えば、染料）また は刺激または化学反応に際して光を放出する最終生成物、すなわち、各々、蛍光 またはケミルミネッセンス分子を生成する酵素または補酵素を含む。かかる生成 物を供するための多数の酵素および補酵素が米国特許第４．２７５．１４９号お よび米国特許第４．３１８．９８０号に記載されている（出典明示して本明細書 の一部とみなす）。酵素反応の生成物は、通常、染料または蛍光体である。多数 の蛍光体の例がやはり米国特許第４．２７５．１４９号に記載されており、出典 明示して本明細書の一部とみなす。

興味深いものに、基質４−クロロ−１−ナフトールと反応すると有色生成物を生 じる酵素ホースラディツシュペルオキシダーゼがある。１の商業的に入手可能な 基質溶液は、ＴＭ　Ｂｌｕｅと呼ばれ、ティニスアイ・インコーホレイテッド（ ＴＳＩＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）　（ウェルセスタ−（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ） 、マサチューセ・ソツ州）から入手可能である。また、過酸化水素の生成および 染料前駆体を染料まで酸化するための該過酸化水素の使用に関連する酵素も興味 深い。特別の組合せは、染料前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素 、例えば、ペルオキシダーゼ、ミクロベルオキ／ダーゼ、およびチトクロームＣ オキシダーゼと組み合わせた、サツカライドオキシダーゼ、例えば、グルコース およびガラクトースオキシダーゼ、またはウリカーゼおよびキサンチンオキシダ ーゼのごときヘテロサイクリックオキ／ダーゼを包含する。さらなる酵素の組合 せは、出典明示して本明細書の一部とみなす主題に見い出される。

また、検出試薬は限定量の阻害剤を検出溶液に含めることによって、未結合試料 および結合試薬を流動マトリックスから除去するのに供することができ：かかる 阻害剤は目に見える最終生成物の発色を阻止する。一般に、適当な阻害剤は検出 試薬溶液に迅速かつ完全に溶解しなければならない。該阻害剤は、例えば、酵素 複合体の活性を可逆的に阻害することによって、基質分子を化学的に消費するこ とによって、あるいは当該酵素との反応に際して目に見える最終生成物を生成し ない別の基質として作用することによって酵素複合体の活性を阻害する。

特別の例において、酵素アルカリ性ホスファターゼは、ｐＨ６ないしｐＨ７の０ ．０５Ｍリン酸ナトリウム溶液によって阻害され；阻害は（アルカリ性ホスファ ターゼの最適ｐＨの１０よりも低い溶液ｐＨからの）酵素活性の減少による。も う１つの例において、酵素ホースラディノッンユベルオキ７ダーゼは０．０２５ Ｍメタ重亜硫酸ナトリウムによって阻害される。この場合、最終生成物の形成は 、阻害剤が化学的に（すなわち、利用可能な基質を減少させることによって）電 子供与性ベルオキシド基質を消費するゆえに阻止される。また、ホースラディシ ッンユベルオキシダーゼは０．２５Ｍアスコルビン酸によっても阻害され得る。

アスコルビン酸は別のホースラディシッシュペルオキシダーゼ基質として働き、 酵素と反応するが目に見える最終生成物は生じさせない。

添加された阻害剤の量は実験的に決定される。適量の阻害剤は、未結合標識結合 試薬のほとんどまたは全部が反応ゾーンから除去されるまで最終生成物の生成を 阻止し、その時点で、検出可能な最終生成物が生成される。

本発明の方法および装置は、サンドイッチ型または競合型の特異的結合アッセイ を容易とする。サンドイッチアッセイの場合、特異的結合試薬（例えば、抗体） を反応ゾーンに固定化する。試料分析物の結合に続き、該複合体は標識特異的結 合試薬（例えば、酵素−抗体複合体）および検出される分析物（例えば、基質と の反応に際し）と反応する。競合アッセイの場合、反応ゾーンに固定化された特 異的結合試薬（例えば、抗体）は試料分析物および標識分析物（例えば、分析物 −酵素複合体）と同時に接触する。反応ゾーンで検出される標識の量は試料中の 分析物の量に逆比例する。

前記した具体例のいずれかまたは全部はキットとして提供できる。１の特別の例 において、かかるキットは、特異的結合試薬（例えば、非固定化標識特異的結合 試薬および固定化分析物捕捉試薬）および洗浄試薬、ならびに、所望であればあ るいは適当には、検出試薬および陽性および陰性対照試薬で完成する例えば図２ で示される装置を包含する。加えて、安定剤、緩衝剤等の他の添加剤を含めるこ ともできる。当該アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を実 現するために、種々の試薬の相対的量を広範囲で変化させることができる。具体 的には、試薬は、溶解に際して、試料と結合するのに適した濃度を有する試薬溶 液を実現する通常は凍結乾燥した乾燥粉末として供し得る。

さらに、以下の実施例によって本発明を説明する。この実施例は本発明を限定す るものではない。

実施例１ 本実施例は、試料中のネコ白血病ウィルス（Ｆ　ｅ　ＬＶ）の検出のための本発 明方法および装置の使用に関する。

固定化特異的結合試薬は以下のごと（に作製した。ミクロ粒子イムノアッセイ技 術（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ　１ｃｌＩｕｎｏａｓｓａｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ）　（セラジン、インコーホレイテッド（Ｓｅｒａｄｙｎ、　Ｉｎｃ、　 ）、粒子技術部門、インディアナポリス、イリノイ州の出版物）に記載されてい る方法によって、ラテックスマイクロスフイア（０，２６ミクロンニアミジンラ テックス、インターフェイシャル・ダイナミックス・コーポレイション（Ｉｎｔ ｅｒｆａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　、ポートラ ンド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ）、オレゴン州）を、３ｍｇ／ｍｌにて、抗−ＦｅＬＶ 抗体（例えば、ＵＳＳＮ０７／２１，９１００　；　ＩＤＥＸＸコーポレイショ ン、ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ）。

ミドルイースト参照）で−昼夜覆った。具体的には、まず、マイクロスフイアを ０．０１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，２）で洗浄し、次いで、Ｏ，Ｏ１Ｍリン酸 カリウム（ｐＨ７，２）中の１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で覆 った。該マイクロスフイアを２回目洗浄し、次いで、はぼ１％（Ｗ／Ｖ）ラテッ クスマイクロスフイアの濃度にてＯ，Ｏ１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，２）およ び１％（Ｗ／Ｖ）スクロースに再懸濁した。抗−ＦｅＬＶで覆ったマイクロスフ イアの１ないし２マイクロリツトルを、１０〜１５ミクロンの多孔性ポリエチレ ン片（１ｃｍＸ５ｃｍｘ０．１６ｃｍＨクロメックス・コーポレイション（Ｃｈ ｒｏｍｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、プルツクリン（Ｂｒｏｏｋｌｙｎ）、ニ ューヨーク州）にスポットし、３７℃で３０分間乾燥し；この流動マトリックス を乾燥貯蔵した。

標識特異的結合試薬を生成させるために、抗−ＦｅＬＶ　ｐ２４抗体をホースラ ディシュペルオキシターゼ（例えば、ＵＳＳＮ　０７／２１９１００；ＩＤＥＸ Ｘコーポレイション、ポートランド、ミドルイースト参照）に共有結合によって カップリングさせた。この複合体の２ないし１０マイクログラムを含有する溶液 の２５０マイクロリツトルを標識した試薬沈積パッド、すなわち、直径１ｃｍｘ 厚み０．６５３ｃｍのポリエステルパッド（トロイ・ミルズ（Ｔｒｏｙ　Ｍｉｌ ｌｓ）、トロイ（Ｔｒｏｙ）、ニューハンプシャー州、＃ｌ−９−１９５）に添 加した。該パッドを１時間真空乾燥し、乾燥貯蔵した。

多孔性ポリエチレン流動マトリックスおよび標識試薬沈積パッドを、図１および ２に示したものに類似した装置に集合させた。２５０マイクロリツトルの試料を 試料カップに添加した；試料は、ＦｅＬＶの存在について予め陰性であることを テストし、破砕したＦｅＬＶ５〜１０ナノグラムを添加したネコ血清よりなるも のであった。洗浄溶液（すなわち、０．３％Ｔｗｅｅｎ８０．０．３％トリトン Ｘ−１００および５％ウシ血清アルブミン）３００マイクロリツトルおよびホー スラディツシュペルオキシダーゼ基質溶液（すなわち、ホースラディツシュペル オキシダーゼとの反応に際し沈殿する安定な有機ペルオキシド、例えば、Ｔ）Ｉ ＢｌｕｅｓＴＭｌｏｌ、ＴＳＬインコーポレイテッド、ウォルセスター（Ｗｏｒ ｃｅｓｔｅｒ）、マサチューセッツ州）５００マスクロリツトルを、各々、洗浄 試薬貯蔵容器および検出試薬貯蔵容器に貯蔵した。

標識した試薬沈積パッドへの試料の流入により、乾燥した酵素複合体を溶解させ 、試料中のＦｅＬＶ　ｐ２４と抗−ｐ２４抗体−ホースラディツシュペルオキシ ダーゼ複合体との間の複合体形成を容易とした。反応ゾーン（すなわち、抗−ｐ ２４抗体被覆ラテックスマイクロスフイアが沈積した位置）を通っての試料の流 動は、固定化抗−ｐ２４抗体、試料ＦｅＬＶ　ｐ２４、および抗−ｐ２４抗体− ホースラディツシュペルオキシダーゼ複合体の間の免疫複合体形成を容易とし； かかる免疫複合体はマイクロスフイアに固定化された。流動マトリックスが飽和 されたら（すなわち、添加された試料の容量が流動マトリックスと同等のボイド 容量を占めた時）、流動マトリックスを手動で吸収剤貯蔵器に接触させた（すな わち、前記したごとく、当該装置の２つの半分割体を強く握ることによる）。ま た、この操作は、洗浄試薬および検出試薬貯蔵容器をシールするホイルに穴をあ け、続いて洗浄試薬および検出試薬が流動マトリックス＋”−配送されることを 可能とする。未結合試料および未結合抗体−ホースラディツシュペルオキシダー ゼ複合体を洗浄試薬で置き換えた。続いて、検出可能な発色生成物を形成する固 定化ホースラディツシュペルオキシダーゼ複合体によって、ＴＭＢ１ｕｅ検出剤 基質を酸化した。形成された発色生成物の存在ないし量は、試料中に存在するＦ ｅＬＶ抗原のレベルに比例した。

この特別の例において、当該装置は、臨床的に、ＦｅＬＶ　ｐ２４抗原の存在に ついて（すなわち、ネコ白血病ウィルス感染について）ネコを素早（かつ容易に 診断するのに用いた。同様に、当該装置は、選択された他の分析物を検出するの に使用することもできる。かかる分析物は、ネコ免疫不全ウィルスのｇｐ１３０ 蛋白（例えば、ＵＳＳＮ　０７／４４７，８１０参照）、ヒト免疫不全ウィルス のエンベロープ蛋白、またはイヌ糸条虫の抗原（すなわち、ディロフィラリア・ イミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　１ｍｍ１ｔｉｓ）　；例えば、ウニイル （ｆｅｉｌ）、米国特許第４゜８３９．２７５号参照）を包含する。

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つの固定化分析物捕捉試薬への分析物の結合を検出し、次いで 、該固定化分析物捕捉試薬から未結合物質を洗浄することによって流体試料中の 分析物の存在または量を測定するアッセイを行うための装置であって、（ａ）細 長い固相流動マトリックス、および（ｂ）第２の領域に結合した分析物を検出す る手段からなり、該流動マトリックスは毛細管流体運動を駆動できる毛細管チャ ンネルからなり、該流動マトリックスはさらに （ｉ）該流体試料を受け入れるのに適合した第１の領域、（ｉｉ）該分析物捕捉 試薬が固定化された第２の領域、（ｉｉｉ）該第２の領域から未結合物質を除去 できる液体試薬の適用のための第３の領域；および （ｉｖ）高容量能の吸収剤貯蔵器からなり；該第２の領域は、該第１の領域と該 第３の領域との中間、および該吸収剤貯蔵器と該第３の領域との中間に位置し； ここに、該流動マトリックスおよびその該諸領域は、該流体試料を、まず、該細 長い流動マトリックスに沿って該第２の領域に向けておよびそれを通って一の方 向に流動させ、続いて、該液体試薬を、該細長い流動マトリックスに沿って該第 ２の領域を通って該吸収剤貯蔵器へと該第１の方向と反対の方向に流動させ、未 結合物質をそれで吸わせるサイズおよび位置としたことを特徴とする当該装置。
2. ２．該第２の領域に結合した分析物を検出するための該手段が、検出可能な反応 を受ける試薬よりなり、該液体試薬が少なくとも１つの他の試薬の過剰量ととも に該検出可能な反応の阻害剤の所定の限定量よりなり、これにより、該液体試薬 の流動が該阻害剤をまず該第２の領域へ輸送し、該阻害剤および未結合物質が該 第２の領域から外へ輸送されると、該検出可能な反応が該未結合物質の不存在下 で起こる請求の範囲第１項記載の装置。
3. ３．該分析物がウイルス抗原である請求の範囲第１項記載の装置。
4. ４．該ウルイス抗原がヒト免疫不全ウイルスに由来する請求の範囲第３項記載の 装置。
5. ５．該ウイルス抗原がネコ白血病ウイルスに由来する請求の範囲第３項記載の装 置。
6. ６．該抗原がディロフィラリア・イミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　ｉｍｍ ｉｔｉｓ）に由来する請求の範囲第１項記載の装置。
7. ７．該装置の使用に先立って、該流動マトリックスと接触させないように該吸収 剤貯蔵器を位置させ、該装置が、さらに、該吸収剤貯蔵器を移動させて該流動マ トリックスと流動状態で接触させるための手段からなる請求の範囲第１項記載の 装置。
8. ８．該装置が、さらに、該液体試薬のシールした容器および該容器からの該液体 試薬を該マトリックスの該第３の領域に適用するための手段からなる請求の範囲 第１項記載の装置。
9. ９．該液体試薬を該流動マトリックスに適用するための該手段が該容器に穴をあ けるよう位置させかつそれに適合したヤリ状体からなる請求の範囲第８項記載の 装置。
10. １０．該液体試薬のシールした容器および該容器からの該液体試薬を該マトリッ クスの該第３の領域に適用するための手段からなり、該吸収剤貯蔵器を移動させ るための該手段が該液体試薬を適用するための該手段に連結しており、それによ り、操作者により該両手段が一回の操作で作動される請求の範囲第７項記載の装 置。
11. １１．該液体試薬が洗浄試薬であって、該流動マトリックスが、さらに、検出試 薬の適用のための第４の領域からなり、該第３の領域が該第２の領域と該第４の 領域との中間に位置する請求の範囲第１項または第２項記載の装置。
12. １２．さらに、シールした検出試薬貯蔵容器および該流動マトリックスの該第４ の領域に対して基部側に位置させたシールした洗浄試薬貯蔵容器からなる請求の 範囲第１１項記載の装置。
13. １３．該検出試薬を適用するための該手段が該液体試薬を適用するための該手段 に連結し、それにより、両試薬は操作者により一回の操作で適用される請求の範 囲第１２項記載の装置。
14. １４．該検出試薬および該洗浄試薬を適用するための該手段が、該両容器に穴を あけるよう位置しかつそれに適合するヤリ状体からなる請求の範囲第１３項記載 の装置。
15. １５．該装置が、さらに、該液体試薬の該吸収剤貯蔵器への流動を阻止するよう 位置した溶解性部材よりなる少なくとも１つのバリヤー材からなり、それにより 、該固相部材の溶解が、該第２の領域を通っての該第１の方向における試料の流 動を可能とするのに十分なように選択されて所定の時間の後に、該吸収剤貯蔵器 への該第２の方向における該液体試薬の液体流動を可能とする請求の範囲第１項 記載の装置。
16. １６．該バリヤー材を該第１の領域と該吸収剤貯蔵器との間に位置させた訴求の 範囲第１５項記載の装置。
17. １７．該バリヤー材を該第３の領域と該第２の領域との間に位置させた請求の範 囲第１５項記載の装置。
18. １８．２つの該バリヤー材からなり、一方の該バリヤー材は該第１の領域と該吸 収剤貯蔵器との間に位置させ、第２の該バリヤー材は該第３の領域と該第２の領 域との間に位置させた請求の範囲第１５項記載の装置。
19. １９．少なくとも１つの固定化分析物捕捉試薬への分析物の結合を検出し、次い で、該固定化分析物捕捉試薬から未結合物質を洗浄することにようて流体試料中 の分析物の存在または量を測定するアッセイを行う方法であって、（ａ）細長い 固相流動マトリックスを供し、該流動マトリックスは毛細管流体運動を駆動でき る毛細管チャンネルからなり、該流動マトリックスは、さらに、（ｉ）該流体試 料の受け入れに適した第１の領域、（ｉｉ）該分析物捕捉試薬を固定化した第２ の領域、（ｉｉｉ）未結合物質を該第２の領域から除去できる液体試薬の適用の ための第３の領域； （ｉｖ）高容量能の吸収剤貯蔵器からなり；該第２の領域は該第１の領域と該第 ３の領域の中間、および該吸収剤貯蔵器と該第３の領域の間に位置し； （ｂ）該第２の領域に結合した分析物を検出するための手段を供し；これにより 、該流動マトリックスおよびその該諸領域は、該流体試料を、まず、該細長い流 動マトリックスに沿って該第２の領域に向けておよびそれを通って一の方向に流 動させ、続いて、該液体試薬を、該細長い流動マトリックスに沿って該第２の領 域を通って該吸収剤貯蔵器へと該第１の方向と反対の方向に流動させ、未結合物 質をそれで吸すわせ、 （ｃ）該流体試料を該流動マトリックスに適用し；次いで、（ｄ）該第２の領域 に結合した該分析物を検出することを特徴する該方法。
20. ２０．該第２の領域に結合した分析物を検出するための該手段が、検出可能な反 応を受ける試薬よりなり、該液体試薬が少なくとも１つの他の試薬の過剰量とと もに該検出可能な反応の阻害剤の所定の限定量よりなり、これにより、該液体試 薬の流動が該阻害剤をまず該第２の領域へ輸送し、該阻害剤および未結合物質が 該第２の領域から外へ輸送されると、該検出可能な反応が該未結合物質の不存在 下で起こる請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．該分析物がウイルス抗原である請求の範囲第１９項記載の方法。
22. ２２．該ウルイス抗原がヒト免疫不全ウイルスに由来する請求の範囲第２１項記 載の方法。
23. ２３．該ウイルス抗原がネコ白血病ウイルスに由来する請求の範囲第２１項記載 の方法。
24. ２４．該分析物がディロフィラリア・イミティス（Ｄｉｒｏｆｎａｒｉａ　ｉｍ ｍｉｔｉｓ）に由来する請求の範囲第１９項記載の方法。
25. ２５．該方法の使用に先立って、該流動マトリックスと接触させないように該吸 収剤貯蔵器を位置させ、該流体試料が該第２の領域を通って第１の方向に流入し た後、該試料および該液体試薬が該第１の方向に反対の方向にて該第２の領域を 通り、該吸収剤貯蔵器へと流動し、未結合物質をそれで吸わせるように、該吸収 剤貯蔵器を移動させて該流動マトリックスと流動状態で接触させる請求の範囲第 １９項記載の方法。
26. ２６．該液体試薬をシールした容器に含有させ、該容器に穴をあけることによっ て、該流動マトリックスの該第３の領域に適用する請求の範囲第１９項記載の方 法。
27. ２７．該吸収剤貯蔵器を該流動マトリックスと流動状態で接触させ、該液体試薬 が１回の操作動作によって該流動マトリックスに適用される請求の範囲第２５項 記載の方法。
28. ２８．該液体試薬が洗浄試薬であって、該流動マトリックスが、さらに、検出試 薬の連用のための第４の領域よりなり、該第３の領域が該第２の領域と該第４の 領域との中間に位置する請求の範囲第１９項または第２０項記載の方法。
29. ２９．該洗浄試薬および該検出試薬が各々シールされた容器に含有され、同時に ヤリ状体で該容器に穴をあけることによって該流動マトリックスに適用される請 求の範囲第２８項記載の方法。
30. ３０．該方法が、さらに、該液体試薬の該吸収剤貯蔵器への流動を阻止するよう 位置した溶解性部材からなる少なくとも１つのバリヤー材を供することよりなり 、それにより、該固体部材の溶解が、該第２の領域を通っての該第１の方向に試 料が流動するのを可能にするのに十分なように選択された所定の時間の後、該液 体試薬の該第２の方向における該吸収剤貯蔵器への流体流動を可能とする請求の 範囲第１９項記載の方法。
31. ３１．該バリヤー材が該第１の領域と該吸収剤貯蔵器との間に位置する請求の範 囲第３０項記載の方法。
32. ３２．該バリヤー材が該第３の領域と該第２の領域との間に位置する請求の範囲 第３０項記載の方法。
33. ３３．２つの該バリヤー材よりなり、一方の該バリヤー材は該第１の領域と該吸 収剤庁蔵器との間に位置し、第２の該バリヤー材は該第３の領域と該第２の領域 との間に位置する請求の範囲第３０項記載の方法。
34. ３４．少なくとも１つの固定化分析物捕捉試薬への該分析物の結合を検出し、次 いで、未結合物質を該固定化分析物捕捉試薬から洗浄することによって流体試料 中の分析物の存在または量を測定するアッセイを行うための装置であって、流体 試料を受け入れる第１のセグメントからなる細長い流体流動マトリックス、分析 物捕捉試薬を固定化した第２の領域、吸収剤貯蔵器、液体目薬の供給手段、およ び該マトリックスにおいて流動を阻止するように位置させた溶解性バリヤー材よ りなり、 該第２の領域は液体試薬の該供給手段と該吸収剤貯蔵器との中間に位置し、該溶 解性バリヤー材は、該試料が該第１の領域から該第２の領域を通って流動するま で、該供給手段から該液体試薬が該吸収剤貯蔵器へ流動するのを防ぐよう位置し て、その時点で、該バリヤー材が溶解して、該洗浄試薬が該第２の領域を通って 該吸収剤貯蔵器へと流動するのを可能とすることを特徴とする該装置。
35. ３５．該バリヤー材が該液体試薬と該第２の領域との間に位置する請求の範囲第 ３４項記載の装置。
36. ３６．該バリヤー材の１つを該第１の領域と該吸収剤貯蔵器との間に位置させた 請求の範囲第３４項または第３５項記載の装置。