CN101109756A

CN101109756A - 一种用于检测血清中不规则抗体的试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN101109756A
Application number: CNA200710120467XA
Authority: CN
Inventors: 徐华; 鲍国强; 周明非; 张建耕; 郁成雨; 章扬培
Original assignee: Beijing Wangsheng Weiye Sci Develop Co ltd; SHANXI PROVINCIAL BLOOD BANK CENTER; Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Beijing Wangsheng Weiye Sci Develop Co ltd; SHANXI PROVINCIAL BLOOD BANK CENTER; Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2007-08-20
Filing date: 2007-08-20
Publication date: 2008-01-23

Abstract

本发明公开了用于检测血清中不规则抗体的ELISA试剂盒及其制备方法，本试剂盒包含：酶联板，之上已经包被了纯化后的红细胞表面抗原D、E、e、C、c；不与上述抗原反应的人血清，作为阴性对照；和作为阳性对照的人血清，每一种与上述抗原之一特异性反应。本发明的原理是：不用红细胞作为检测试剂，而是提取红细胞表面的抗原，纯化后包被在酶联板上，利用酶联免疫分析(ELISA)方法来检测血清中的不规则抗体，并使用人血清作为其阳性或阴性对照抗体，对针对D、E、e、C、c抗原的IgG型抗体同时检测。本发明的优点：保存期长、高度特异性、高通量、结果易于判定以及检测方法简便易行。

Description

一种用于检测血清中不规则抗体的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种体外诊断试剂，更具体地，本发明涉及酶联免疫吸附测定(以下缩写为ELISA)试剂盒，它能同时检测血清中是否含有针对Rh血型系统中D、E、e、C、c抗原的IgG型不规则抗体。

背景技术

血清中不规则抗体是指不符合ABO血型系统Landsteiner法则的血型抗体，也就是抗A、抗B以外的血型抗体。ABO系中的亚型、变异型抗A1或某种抗B等抗体，也称为不规则抗体，其多为IgG类抗体。这些抗体主要是经输血或妊娠等免疫刺激产生，在盐水介质中不能凝集而只能致敏相应抗原的红细胞，必须通过特殊方法(抗人球蛋白法、凝聚胺法等)检测，才能使致敏红细胞出现凝集反应。临床上通常所称的“同型血”实际上是指ABO血型系统和Rh血型系统D抗原相同，其它红细胞血型系统未必相同。如果交叉配血不仔细，或者只用盐水介质配血，则有可能检查不出ABO血型系统之外的不规则抗体，而此抗体与相应抗原发生免疫反应，可导致溶血性输血反应的发生。

由于有临床意义的不规则抗体会导致溶血性输血反应，破坏输入的不配合的红细胞或缩短其寿命，产生溶血性输血反应，轻则影响治疗效果，重则危机病人生命；此外，对孕妇而言，不规则抗体会引起新生儿溶血病，影响新生儿脏器的发育，并使其智力发育受到伤害，严重者则会危及新生儿的生命安全。因此，不规则抗体筛选是很必要而且必须的。其筛选的意义主要在于三个方面：

1、献血者的血清或血浆进行抗体筛查，可以防止含有不规则抗体的血液输注给病人，避免由于献血者血液中的不规则抗体引起病人红细胞的破坏而引起的溶血性输血反应，同时可以减少血液浪费，可将有不规则抗体的血液制备成抗体血清，用于稀有血型的检测。

2、对需要输血治疗的患者，进行不规则抗体筛查，可以有助于血液选择，从而有充分的时间来选择不含有针对某抗体的响应抗原的血液，从而防止因为输注含有某抗体相应抗原的血液而引起溶血性输血反应，保证输血安全。

3、孕妇进行不规则抗体筛查，可以尽早发现不规则抗体，可以在孕期进行新生儿溶血病的预防和治疗，减少不规则抗体对胎儿或新生儿带来的伤害，减少新生儿溶血病的性病程度，提高胎儿或新生儿的身体素质。

虽然不规则抗体筛选阳性率仅为0.37％，但是该项阳性的患者一旦输入具有相应抗原的红细胞，抗原、抗体发生免疫性结合，在补体的参与下，使输入的红细胞发生溶解，即发生溶血性输血反应。患者出现发热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，严重时甚至危及其生命。因此，在输血中要经常警惕这种输血反应发生的可能性。当不规则抗体筛选阳性时，必须进一步作抗体鉴定，确定其特异性后，再输入无相应抗原的红细胞，才能达到安全输血之目的。

新生儿溶血病(HDN)也是由于母亲体内存在着与其胎儿红细胞不配合的IgG类的不规则抗体，引起的同种被动免疫性疾病。凡是以IgG性质出现的不规则抗体，理论上都可以引起HDN，因为IgG性质抗体能通过胎盘进入胎儿血循环，破坏胎儿红细胞，引发胎儿水肿、黄疸、贫血和肝脾肿大，甚至并发核黄疸。因此对有输血史或妊娠史的孕妇也应作不规则抗体筛选，若检测出不规则抗体，应做出相应的预防和治疗。Rh血型中D抗原的抗原性强于E抗原的抗原性，因此产生抗-D抗体的几率大于抗-E抗体。

不规则抗体产生大多为Rh血型系统，除抗-D外，其他如抗-E、抗-e、抗-C和抗-c检出率占Rh系统67.8％，提示Rh阳性患者输血也可引起溶血反应，且机率较高。根据我国汉族人群Rh抗原分布特点，E抗原阳性比D抗原阳性低，产生抗E抗体的机率高于抗D抗体，故Rh血型系统D抗原阳性E抗原阴性者输血不容忽视。Rh阴性个体免疫后产生抗D的机率为70.9％，产生的抗体其效价在体内会逐渐下降，甚至常规试验会漏检，若以后作为受血者输入Rh(D)阳性血刺激时，会很快出现免疫性回忆反应。抗体效价会在1～2周内达到高峰，引起迟发性血管外溶血，且发生在输血后几天。造成的输血无效以及溶血，易被临床忽视。溶血反应的强度与抗体效价成正比关系，抗体产生的强度增加溶血反应愈严重。抗M、抗Le^a、抗P1均较少见，但抗Le^a抗体可引起严重的溶血性输血反应，所以不能作为供血者，如为受血者时应给LE(a-b-)血液输入。抗-M抗体只有37℃或抗球蛋白试验出现阳性时才具有临床意义。抗P1最理想的反应温度为4℃，偶可在37℃查出。抗P1抗体很少在体内造成溶血，几乎总是IgM型抗体，所以不能通过胎盘，不会造成HDN。冷凝集素在配血时可忽略。自身抗体在自身溶血性贫血时出现较多，一直以来是输血的一大难题，目前无法鉴定出自身抗体以外的不规则抗体，输血只能遵循选择较弱凝集的血液输注的输血原则。

美国、日本、澳大利亚等国家均已将不规则抗体筛查列入常规检测，而我国卫生行政部门目前尚未要求对献血者进行抗体筛选，在临床也只有少数医院对患者进行抗体筛选。我国目前大多数临床医院输血科(或血库)的配血水平比较落后，一直沿用室温盐水方法配血，此方法只能检出不配合的IgM类抗体，不能检出不配合的IgM抗体，而ABO血型系统以外的其他血型系统的绝大多数抗体是IgG性质的抗体，因此，含有不规则抗体(抗-A、抗-B或抗-AB以外的其他抗体，如抗-D)的血液给病人输用后，此不规则抗体会引起急或迟发性输血反应，往往给病人生命带来危险。为提高血液质量，保证输血患者的输血安全，提高输血治疗效果，避免患者输用含有不规则抗体引起的输血反应，使我国输血事业与世界接轨，应该对献血者或输血者进行不规则抗体筛选。

目前检测不规则抗体的主要方法为将O型红细胞与待检血浆(清)混合，用抗人球蛋白法和凝聚胺法检出，不足之处如下：

1、目前检测血清中不规则抗体是利用标准谱细胞来完成的。由于谱细胞的保存期短，如果不及时应用，产品就会过期而浪费；

2、操作复杂，尤其对于样本数较多时，工作量太大，结果判读困难；

3、由于谱细胞的细胞谱有限，目前的谱细胞不能完全区分红细胞血型不规则抗体，所以无法准确检出抗体；

4、不能鉴定某些疾病(如自身免疫性溶血性贫血)体内的不规则抗体组成；

5、检出结果无法保存，不利于实验数据保存；

6、检出费用过高。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述缺点，提供一种能同时对血清中含有的针对D、E、e、C、c抗原的IgG型不规则抗体进行检测的，并且保存期长的试剂盒。

本发明的第二个目的是提供一种用于血清中不规则抗体的试剂盒的制备方法。

为达到上述目的，本发明包括

a)、酶联板，之上已经包被了纯化后的红细胞表面D、E、e、C、c抗原；

b)、不与上述抗原反应的正常人血清，作为阴性对照；

c)、作为阳性对照的人血清，每一种与上述抗原之一特异性反应。

本试剂盒可以进一步包含清洗溶液、第二抗体、底物缓冲液、底物和终止溶液。在优选的实施方案中，清洗溶液包含磷酸盐缓冲液，第二抗体包含辣根过氧化物酶标记的抗人IgG山羊血清，底物是四甲基联苯胺(TMB)，且该试剂盒进一步包含过氧化氢溶液，终止液包含硫酸。

优选地，试剂盒分别包被红细胞表面D、E、e、C、c抗原量分别是1.5-2.5μg蛋白/孔。

用于血清中不规则抗体的试剂盒的制备方法，其中，制备酶联板包括如下步骤：

a)分离纯化红细胞D、E、e、C、c抗原

b)包被红细胞D、E、e、C、c抗原

优选地，分离纯化红细胞D、E、e、C、c抗原的步骤：

a)制备用于纯化红细胞膜蛋白的亲合层析柱；

b)低渗法提取红细胞膜蛋白；

c)从红细胞膜蛋白中纯化特异性的D、E、e、C、c等抗原。

本发明的原理是：不用红细胞作为检测试剂，而是提取红细胞表面的抗原，纯化后包被在酶联板上，利用酶联免疫分析(ELISA)方法来检测血清中的不规则抗体，并使用人血清作为其阳性或阴性对照抗体，对针对D、E、e、C、c抗原的IgG型抗体同时检测。

本发明的优点：保存期长、高度特异性、高通量、结果易于判定以及检测方法简便易行。

具体实施方式

本发明提供了一种能同时对血清中的针对D、E、e、C、c抗原的IgG型抗体进行检测的ELISA试剂盒。本试剂盒包含一块酶标板用来检测针对D、E、e、C、c抗原的IgG型抗体，那就是说，一个96孔或12×8孔酶标板，包被有D、E、e、C、c抗原。然后，受试验者的血清被加上以诊断是否含有针对D、E、e、C、c抗原的IgG型抗体。

本发明的一个实施方案是包含磷酸盐缓冲液的清洗溶液、包含辣根过氧化物酶标记的抗人IgG山羊血清作为第二抗体，四甲基联苯胺(TMB)作为底物的ELISA试剂盒。

试剂盒包含下列内容物：

1、有5种不同Rh抗原包被的的酶标板：96孔板或12×8长条；

2、阴性标准血清：1瓶

3、阳性标准血清：1瓶，是一种混合血清，可以分别与D、E、e、C、c抗原反应

4、清洗溶液：1瓶(PBS缓冲液)

5、第二抗体：1瓶

6、底物缓冲液：1瓶

7、底物(四甲基联苯胺)：1瓶

8、过氧化氢：1瓶

9、终止溶液：1瓶

上述内容物具体描述如下：

1、包被了5种不同纯化血型抗原的酶标板：96孔板或12×8长条

2、阴性标准血清：1瓶

成分：未稀释的不与抗原D、E、e、C、c抗原发生反应的正常人血清500μl，和0.05v/v％的Proclin300

3、阳性标准血清：包含高浓度的特异性抗D、E、e、C、c抗原的抗体的人源血清，未稀释，500μl和0.05v/v％的Proclin300

4、清洗溶液(10倍浓缩的)：1瓶

成分：0.1MPBS 25ml、0.5％的Tween20、0.05v/v％的Proclin300

5、第二抗体溶液：一瓶(使用前稀释100倍)

成分：1v/v％的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG山羊血清、适量牛血清白蛋白PBS、0.05v/v％的Proclin300。

6、底物缓冲液：一瓶

成分：柠檬酸-磷酸缓冲液100ml、0.05v/v％的Proclin300。

7、底物(四甲基联苯胺)：1瓶

8、过氧化氢：1瓶，在使用前稀释在底物缓冲液中至浓度为0.1％

9、终止溶液：1瓶

成分：2N硫酸15ml

在上述试剂盒中，下列情况被认为是阳性(阳性对照和样品的OD450值与阴性对照的比值大于等于40)

本试剂盒的制造方法：

1、抗原覆盖平板的准备

经过纯化的5种抗原包被在96孔平板上，封闭并干燥，然后冷藏。标准血清的制备

2、对照血清的制备

阴性标准血清：取正常人血清，这些血清均经标准普红细胞检测后为阴性的血清；

阳性标准血清：是一种混合血清，其中含有与Rh血型系统各种抗原反应的抗体。

本发明可以通过下面的实施例更好地理解，所描述的具体材料和结果只是例子，不是对权利要求书中的描述进行限制。

用于血清中不规则抗体的试剂盒的制备方法，以D为例，其中，制备酶联板包括如下步骤：

1、首先是分离纯化红细胞D抗原

a)用于纯化红细胞膜蛋白的亲合层的柱的制备：将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(或孔内)即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。我们选择亲合层析柱中的亲合载体为Pharmacia Biotech公司溴化氰(CNBr)活化的Sepharose 4B(一种琼脂糖凝胶)。我们按Pharmacia Biotech公司提供说明书中的方法，制备湿胶(1g干粉可获得3.5mL湿胶)。将溴化氰活化的Sepharose 4B干粉用1mmol/L HCl溶胀，再用偶联缓冲液(pH8.3，0.1mol/L NaHCO₃，0.5mol/L NaCl)洗涤三次，将预先经偶联缓冲液充分透析的红细胞D抗原的单克隆抗体溶液(购自上海血液制品研究所)与上述凝胶混合，混合比例为5mg抗体/ml胶，混合物在室温下缓慢振荡偶联反应4～5小时。凝胶用五倍体积的偶联缓冲液洗涤，然后用pH8.0，1mol/L的乙醇胺溶液封闭过夜。次日凝胶依次用pH4.0 0.1mol/L NaCl，0.1mol/L NaAc/HAc、水和偶联缓冲液轮流洗涤三次后，4℃保存于TSA(Tris/盐/叠氮化合物)缓冲液中备用。以BCA法检测偶联前后偶联液中抗体的浓度，经计算单克隆抗体的结合率为78％。

b)低渗法提取红细胞膜蛋白：本发明所利用的红细胞均符合《中华人民共和国血液质量标准》。向O型红细胞中加入0.01mol/L PBS(pH7.4)，离心3000r/min，20min，弃上清和上清下的白细胞、血小板层。用相当于红细胞压积3倍的预冷PBS(pH7.4)洗涤3次(4℃，5000r/min，15min)。加预冷的0.01mol/L Tric-HCl(pH7.4)与红细胞(V∶V＝40∶1)混合，4℃放置2h。再以9000r/min离心20min，弃上清(重复3-5次)至无肉眼可见的红细胞为止。沉淀物加0.01mol/L PBS(pH7.4)溶解，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定膜蛋白的浓度为0.4mg/mL。

c)从红细胞膜蛋白中纯化特异性的D抗原：将超滤浓缩后的红细胞膜蛋白提取液流过亲和层析柱，流速1mL/min。将流出液循环上样，于4℃过夜。先用平衡液PBS洗去未结合的蛋白，再以洗脱液洗脱。洗脱液是100mmol/L Gly-HCl，pH2.0。收集洗脱峰组分(A280监测，收集管中预装0.1mL pH9.0 NaOH)，每管收集1mL洗脱液，用BCA法测定洗脱峰蛋白的浓度为0.9mg/mL。

2、红细胞D抗原的包被：用包被缓冲液(pH9.6碳酸盐缓冲液)将红细胞膜蛋白稀释为3μg/ml，按每孔100μl加入到酶联板的小孔中，酶联板购自丹麦的COSTAR公司，在4℃条件下孵育18-24小时后去除上清液，封闭并干燥，然后冷藏，至此包被了红细胞D抗原的酶联板制备完毕。

包被缓冲液(PH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液)的配制方法：

Na₂CO₃ 1.59克

NaHCO₃ 2.93克

加蒸馏水至1000ml

图1是8×12条分布：8孔为一个检测单位，分别为阳性对照、阴性对照和空白对照，以及针对各抗原的5个孔，检测阳性可以根据空白对照的OD值计算例如：cutoff＝n×空白对照OD。

Claims

1.一种用于检测血清中不规则抗体的ELISA试剂盒，包含：

a)、酶联板，之上已经包被了纯化后的红细胞表面抗原D、E、e、C、c；

b)、不与上述抗原反应的人血清，作为阴性对照；和

2.根据权利要求1的试剂盒，进一步包含稀释液和清洗溶液、结合物溶液、底物缓冲液、底物和终止溶液。

3.根据权利要求2的试剂盒，其中所述的稀释和清洗溶液包含磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求2的试剂盒，其中所述的结合物溶液包含辣根过氧化物酶标记的抗人IgG山羊血清，底物是四甲基联苯胺，且该试剂盒进一步包含过氧化氢溶液。

5.根据权利要求2的试剂盒，其中所述的终止液包含硫酸。

6.根据权利要求1的试剂盒，其中所述的红细胞表面抗原D、E、e、C、c的量分别是1.5-2.5μg蛋白/孔。

7.根据权利要求1的试剂盒，其中向红细胞表面抗原D、E、e、C、c发生反应的孔中加入25倍稀释的血清。

8.一种制备用于检测血清中不规则抗体的试剂盒的方法，其中制备酶联板的步骤：

a)分离纯化红细胞D抗原；

b)包被红细胞D、E、e、C、c抗原。

9.根据权利要求8的方法，其中分离纯化红细胞D抗原的步骤：

a)制备用于纯化红细胞膜蛋白的亲合层的柱；

b)低渗法提取红细胞膜蛋白；

c)从红细胞膜蛋白中纯化特异性的D、E、e、C、c抗原。