CN103477226A

CN103477226A - 能将不含试样的样品确定为不当操作样品的免疫层析检测方法及其使用的测试条

Info

Publication number: CN103477226A
Application number: CN2012800162397A
Authority: CN
Inventors: 森田元喜; 小林幸司; 伊藤佐智子
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2013-12-25
Also published as: JP6061843B2; JP6247741B2; WO2012133615A1; JPWO2012133615A1; EP2693213A1; US20140087365A1; JP2017049270A; EP2693213A4; EP2693213B1

Abstract

本发明的一个目的是提供包含检测未加入试样情形的步骤的免疫层析检测方法以及包含检测未加入试样情形的工具的免疫层析测试条。本发明人提供了在检测通过稀释试样获得的样品中的分析物的免疫层析检测方法中，能通过使用固相化在不溶膜上的抗体捕获试样中所包含的不同于分析物的组分(对照组分)和固定有该组分的抗体的标记物的复合物以检测对照组分是否存在的步骤和工具来检测未加入试样情形的免疫层析检测方法和免疫层析测试条。

Description

能将不含试样的样品确定为不当操作样品的免疫层析检测方法及其使用的测试条

技术领域

本发明涉及检测通过稀释试样获得的样品中的分析物的免疫层析方法。特别地，本发明涉及能通过检测试样中所包含的且不同于分析物的组分是否存在来识别未加入试样的情形的免疫层析检测方法，以及所使用的测试条和检测试剂盒。

背景技术

近来诊所和小医院对于“在患者检查中进行多种检测”的需求日趋增加，而且检测越来越多地以床边检测(point-of-care testing,POCT)代替传统的外包检查进行。POCT试剂的代表性实例包括侧流免疫层析测试条(专利文献1)。典型的免疫层析测试条具有用于检测分析物的检测线和表明反应完成的对照线(相当于本发明下文所述的第二对照线；“背景技术”的以下描述中与此相同)。分析物与固定有分析物的抗体的标记物的复合物被固定在不溶膜上的抗体捕获，形成检测线，同时检测线上未被捕获的剩余标记物被对照线上的抗免疫球蛋白抗体捕获，形成对照线。

使用免疫层析检测方法的测定方法包括在视觉上确定检测线颜色的定性方法和通过专用设备测定检测线颜色强度的定量方法，在诊所和小医院的检查中使用相应于各自方法的免疫层析测试条和装置。

对于通过专用设备测定免疫层析测试条上检测线颜色强度的定量方法，可以进行不同的预处理，这取决于试样的类型、所使用试样的数量和试剂的测定原理。因此，例如可以通过直接滴加试样、滴加用专用稀释液稀释的试样、或在滴加专用稀释液之前滴加少量试样的方法，将样品施加到测试条或装置上。在这些情况下，例如，在试样来自婴儿或儿童因此难以获得大量试样时，或者当试样中分析物为高浓度且要将分析物浓度调整至适合于检测的浓度时，用专用稀释液对试样进行稀释。

如果稀释的是包括红细胞的血液试样，则稀释试样获得的样品中显现血红蛋白的颜色，因此，可以在视觉上确定样品是否包含试样。然而，如果以高稀释倍数稀释颜色相对浅的试样例如血浆、血清和尿，则难以用裸眼区分稀释的样品溶液和试样稀释液本身。因此，可能忘记加入试样而仅将试样稀释液作为样品滴加在测试条上。

然而，由于典型的免疫层析测试条的对照线是通过捕获在与检测线的反应中没有使用的标记物所形成的，因此即使在测试条上仅滴加专用稀释液，也会出现对照线。因此，在由于未加入试样而导致样品仅由稀释液组成的情况下，检测视为完成，得到阴性结果或者浓度确定为“零”。因此，这导致不正确的诊断。

如上所述，从未报道过包含检测未加入试样情形的步骤的免疫层析检测方法以及包含检测未加入试样情形的工具的免疫层析测试条。

引用文件列表

专利文献

专利文献1：日本未审专利申请公开号(PCT申请的翻译)No.2007-524813

发明概述

技术问题

本发明的一个目的是提供包含检测未加入试样情形的步骤的免疫层析检测方法以及包含检测未加入试样情形的工具的免疫层析测试条。因此本发明的一个目的是提供：检测通过稀释浅色试样例如血浆、血清和尿获得的样品中的分析物的免疫层析检测方法，其中如果测定的是未加入试样的样品，则样品被确定为不当操作样品以使得能够检测到未向稀释液加入试样的情形；以及使用的免疫层析测试条。

解决问题的技术方案

本发明人发现，在检测通过稀释试样获得的样品中的分析物的免疫层析检测方法中，可以通过用固相化在不溶膜上的抗体捕获试样所包含的不同于分析物的组分(对照组分)与标记物（所述标记物固定有该组分的抗体）的复合物，检测对照组分是否存在来检测未加入试样的情形，从而完成本发明。

因此，本发明如下所述。

[1]一种检测通过稀释试样获得的样品中的分析物的免疫层析检测方法，包含以下步骤：

1)向免疫层析测试条的样品垫提供样品，其中免疫层析测试条包含：

a)样品垫，

b)设置在相对于所述样品垫的下游的偶联物垫，所述偶联物垫包括：

固定有分析物的第一抗体的标记物，和

固定有对照组分的第一抗体的标记物，所述对照组分包含于试样中且不同于所述分析物，以及

c)设置在相对于所述偶联物垫的下游的不溶膜，其上固定有分析物的第二抗体和对照组分的第二抗体；

2)在不溶膜上检测分析物与分析物的第一和第二抗体的复合物是否存在；

3)在不溶膜上检测对照组分与对照组分的第一和第二抗体的复合物是否存在；以及

4)如果在3)的检测步骤中未能检测到复合物，则确定所述样品中不包含试样。

[2]上述[1]的检测方法，其中试样是血浆或血清。

[3]上述[1]或[2]的检测方法，其中对照组分是血红蛋白。

[4]上述[1]至[3]任一项的检测方法，其中免疫层析测试条的(b)项进一步包含样品中不包含的第二对照组分，其中免疫层析测试条的(c)项进一步包含第二对照组分的检测试剂，且其中所述方法进一步包含以下步骤：

5)在不溶膜上检测第二对照组分是否存在。

[5]一种免疫层析测试条，包含：

a)样品垫；

固定有分析物的第一抗体的标记物，和

固定有对照组分的第一抗体的标记物，所述对照组分包含于试样中且不同于所述分析物；以及

c)设置在相对于所述偶联物垫的下游的不溶膜，其上固定有分析物的第二抗体和对照组分的第二抗体。

[6]上述[5]的免疫层析测试条，其中(b)项，偶联物垫，进一步包含样品中不包含的第二对照组分，且其中(c)项，不溶膜，包含第二对照组分的检测试剂。

[7]上述[5]或[6]的免疫层析测试条，其中对照组分是血红蛋白，且其中对照组分的抗体是抗血红蛋白抗体。

[8]一种用于免疫层析检测的成套试剂盒(kit of parts)，包括：试样稀释液和上述[5]至[7]任一项的免疫层析测试条。

发明的有益效果

本发明提供了一种检测通过稀释血浆、血清、尿等获得的样品中的分析物的免疫层析检测方法，以及所使用的测试条。所述方法和测试条能够检测忘记将试样加入稀释液中的样品并将这样的样品确定为不当操作样品。因此，可以通过将由于对检查不熟悉的医务工作者忘记加入试样导致的假阴性和假低值(低于检测限的浓度)确定为不当操作样品，从而减少错误的测定。

附图简述

[图1]图1是本发明一个实例的测试条的结构示意图。

实施方案描述

(检测方法)

本发明的免疫层析检测方法是一种检测通过稀释试样获得的样品中的分析物的方法，包括下述步骤1)至4)：

1)向免疫层析测试条的样品垫提供样品的步骤，其中免疫层析测试条包括下述a)、b)、和c)，即，

a)样品垫，

b)设置于相对于样品垫的下游的偶联物垫，所述偶联物垫包含：

固定有分析物的第一抗体的标记物，和

2)在不溶膜上检测分析物与分析物的第一和第二抗体的复合物是否存在的步骤；

3)在不溶膜上检测对照组分与对照组分的第一和第二抗体的复合物是否存在的步骤；以及

4)如果在3)的检测步骤中未能检测到复合物，则确定样品中不包含试样的步骤。

1)的步骤是使用免疫层析测试条的步骤。尽管典型的测试条仅包括用于检测分析物的检测试剂，然而本发明的特征在于还包括用于检测试样中所包含的且不同于分析物的组分(对照组分)的检测试剂。

通过使用这种包含用于检测对照组分的工具的测试条，可以通过检测样品中的分析物的步骤2)和检测样品中对照组分的步骤3)来确定样品中是否包含试样。因此，如果在步骤3)未检测到对照组分，则可以在步骤4)确定样品中不包含试样。如果检测到对照组分，则即使当在步骤2)中未检测到分析物时，也可以确定样品中包含试样。为了能够检测样品本身的提供是否存在，可以自然地将检测对照组分的常规方法与本测试条相结合(下文所述的第二对照组分)。

在本发明的免疫层析检测方法中，分析物和固定有针对分析物的抗体的标记物的复合物被固定在测试条的不溶膜上的针对分析物的抗体捕获，从而形成检测线。对照组分和固定有针对对照组分的抗体的标记物的复合物被固定在同一个不溶膜上的针对对照组分的抗体捕获并形成对照线。如果既没有形成检测线也没有形成对照线，则可以确定样品中不含有试样本身，即所述样品是未加入试样的样品(不当操作样品)，而不是试样中不包含分析物。如果检测线和对照线均形成，则可以确定试样中包含分析物。如果没有形成检测线但形成了对照线，则可以确定试样中不包含分析物。因此，如果步骤2)未检测到分析物，则可以通过判断是试样中确实不包含分析物(即指示阴性结果)还是忘记将试样加入到稀释液中来完成测定。

本发明可以提供能依据对照组分的检测是否存在来检测是否忘记将试样加入到稀释液中并将忘记将试样加入其中的样品确定为不当操作样品的方法和试剂。

(分析物)

本发明的分析物是存在于血液、血浆、血清、脊髓液、和尿中的物质，其代表性的例子为，例如，C反应蛋白(CRP)，炎症相关标志物例如IgA、IgG、和IgM，凝固/纤溶标志物例如纤维蛋白降解产物(如D-二聚体)、可溶性纤维蛋白、凝血酶/抗凝血酶复合物(TAT)、和纤溶酶/纤溶酶抑制剂复合物(PIC)，循环相关标志物例如氧化LDL和脑钠尿肽(BNP)，代谢相关标志物例如脂联素(adiponectin)，肿瘤标志物例如癌胚抗原(CEA)、α-甲胎蛋白(AFP)、CA19-9、CA125、和前列腺特异性抗原(PSA)，感染相关标志物例如乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)、沙眼衣原体、和淋球菌，过敏原特异性免疫球蛋白E(IgE)，激素，和药物。

(对照组分)

本发明的对照组分可以是试样中包含的且不同于分析物的任何组分，理想的是试样中必定包含的组分。特别地，对照组分可以是血液中的蛋白质例如白蛋白、球蛋白、和血红蛋白，以及尿中的蛋白例如尿白蛋白。

本发明人发现由于血浆和血清试样中包含微量的血红蛋白，如果将血浆或血清试样稀释进行测定，则可以使用血红蛋白作为对照组分形成对照线。

本发明的免疫层析测试条使得可以在等于或大于10pg/mL的浓度下检测，不过这取决于分析物和针对分析物的抗体的性质。因此，不管是否存在疾病，任何在血液中以1μg/mL或更高浓度总是存在的物质都可以作为被检测线捕获的分析物进行检测，且可以作为被对照线捕获的对照组分进行检测。

(试样和样品)

本发明的试样指生物流体例如血液、血浆、血清、脊髓液、和尿，用试样稀释液稀释的试样被称为样品。

试样的稀释将会以分析物是C反应蛋白(CRP)而对照组分是血红蛋白(Hb)为例详细描述。在考虑适合于分析物测定的浓度的情况下进行试样的稀释，稀释倍数通常为2至10,000。

对于本发明下文作为实例所述的用于CRP测定的测试条，婴儿和儿童被定义为测定受试者，试样量定为1至10μL。为了确保免疫层析检测所必需的样品量，因此试样必须用试样稀释液以20至200的倍数稀释。

本发明的免疫层析测试条和检测试剂盒将会详细描述。

(本发明中使用的分析物的抗体)

本发明中使用的分析物的抗体可以是与分析物特异性反应的任何抗体，在任何情况下不受抗体产生方法的限制，且可以是多克隆抗体或单克隆抗体。例如，如果分析物是人CRP，抗人CRP抗体可以是与人CRP特异性反应的任何抗体，在任何情况下不受抗体产生方法的限制，且可以是多克隆抗体或单克隆抗体。通常可以按照Kohler和Milstein的方法(参见Nature,Vol.256,p.495,1975)，通过人CRP免疫的动物的脾细胞和来自同一种属的骨髓瘤细胞之间的细胞融合，制备产生抗体的杂交瘤细胞。

如果本发明中使用的抗体是单克隆抗体，则固定于标记物上的抗体(第一抗体)与固定于不溶膜上的抗体(第二抗体)之间的关系如下。如果第一抗体的表位是单价的，那么第二抗体的表位应当与第一抗体不同，和如果第一抗体的表位是多价的，那么第二抗体的表位可以与第一抗体相同，或者第一抗体可以与第二抗体是同一个抗体。

当使用如上所述以20-200的倍数稀释的试样作为样品时，理想地是使用抗体的组合以使得可以以大约100的稀释倍数进行0.2到20mg/dL的CRP浓度的测定。例如可以使用保藏号为FERM BP-11344的杂交瘤产生的单克隆抗体和保藏号为FERM BP-11345的杂交瘤产生的单克隆抗体作为CRP测定抗体的组合：前者作为固定于标记物上的抗体，后者作为固定于不溶膜上的抗体。

(对照组分的抗体)

本发明中使用的对照组分的抗体可以是与对照组分特异性反应的任何抗体，在任何情况下不受抗体产生方法的限制，且可以是多克隆抗体或单克隆抗体。例如，如果对照组分是人Hb，则抗人Hb抗体可以是与人Hb特异性反应的任何抗体，在任何情况下不受抗体产生方法的限制，且可以是多克隆抗体或单克隆抗体。其他细节例如单克隆抗体的制造方法、与抗体组合有关的条件等，符合有关抗-CRP抗体的描述。

抗人Hb抗体的组合可以是例如由本发明人用常用方法用人Hb免疫小鼠产生的两个杂交瘤#69202和#69209获得的抗人Hb单克隆抗体的组合，或者可以是根据需要选自商业可获得的抗人Hb抗体的合适的组合。

(样品垫)

在本发明中，“样品垫”是接收样品的部分，其成型为垫以吸收液体样品，并且包含任何材料和形式，只要能让液体和分析物通过。适合于样品垫的材料的具体实例包括但不限于：玻璃纤维、丙烯酸纤维、亲水聚乙烯材料、干燥的纸、纸浆和纤维织物。优选使用玻璃纤维垫。样品垫还可以另外具有下面所述的偶联物垫的功能。为了在抗体固定化膜上防止和抑制非特异性反应(吸收)，样品垫可以包含常用的封闭剂。

至于封闭剂，对于特异性反应本身没有不良影响的试剂可以适当地选自，例如，NEO PROTEIN SAVER(由TOYOBO制造)，丝胶蛋白，ImmunoBlock^TM(由Dainippon Pharmaceutical制造)，Applie Block(由Seikagaku Biobusiness Corporation制造)，SEA BLOCK^TM/EIA/WB(由PIERCE制造)，Blocking One(由NACALAI TESQUE制造)，BSA，BlockingPeptide Fragment(由TOYOBO制造)，Starting Block^TM(PBS)BlockingBuffer(由PIERCE制造)，Smart Block^TM(由CANDOR bioscience GmbH制造)，和HeteroBlock(由Omega Biologicals制造)。

(标记物)

通常已知在免疫层析检测中可用作固定抗体的载体的已知材料可用作标记物。例如，优选胶体金颗粒，胶体铂颗粒，彩色乳胶颗粒，和磁性颗粒，特别优选胶体金颗粒。

已知胶体金颗粒的粒径显著影响基于免疫层析的测定的敏感度，本发明的胶体金颗粒的粒径优选为20-60nm，特别优选为30-40nm。胶体金可以用众所周知的方法制造，例如将柠檬酸三钠水溶液滴加到加热的四氯金酸(III)(tetrachloroauric(III)acid)水溶液中并搅拌。

下文中将会详细描述使用胶体金颗粒的情况。

(抗体对标记物的敏化)

针对分析物或对照组分的抗体在胶体金上的固定化，例如，CRP或Hb抗体在胶体金上的固定化，通常可以通过物理吸附实现。在这种情况下，抗体浓度优选制备为0.5μg/mL至5μg/mL，缓冲液和pH优选为2mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6-7)或者2mmol/L硼酸盐缓冲液(pH8-9)，最优选为2mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)。胶体金上未连接抗体的区域优选通过与BSA等结合来封闭。用这种方法产生的胶体金标记的抗体分散并保存在包含抑制变性的组分(变性抑制剂)的保存试剂中。使用蛋白质例如BSA、甘油、糖等作为这种变性抑制剂。

在本说明书中，“偶联物”指固定有抗体的标记物，例如抗CRP单克隆抗体，即上文所述的分析物的抗体，抗Hb单克隆抗体，即对照组分的抗体，等等。

(检测试剂)

在本发明中，特别地，“检测试剂”是包含至少一种偶联物的溶液。

检测试剂可以包含，例如，一种或多种稳定剂、增溶剂等，其目的是使偶联物保持稳定状态以便于在固定于偶联物的抗体和分析物(如CRP)或对照组分(如Hb)之间发生特异性反应或者使偶联物在与样品混合时迅速且有效地溶解并流态化。稳定剂、增溶剂等可以包括例如牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、酪蛋白、和氨基酸。

本文使用的术语“检测”或“测定”应当理解为其最宽泛的含义，包括对分析物如CRP和对照组分如Hb验证其存在和/或对其进行定量，而不应当理解为在任何意义上加以限制的方式。

(偶联物垫)

在本发明中，“偶联物垫”指将适合于下文所述的偶联物垫的材料与和分析物特异性反应的检测试剂，例如与CPR特异性反应的检测试剂，和/或与对照组分特异性反应的检测试剂，例如与Hb特异性反应的检测试剂浸渍后并干燥获得的垫。偶联物垫具有使检测试剂和CRP或Hb在样品通过偶联物垫时形成复合物的功能。偶联物垫可以设置为其本身与抗CRP抗体-和抗Hb抗体-固定化膜相接触。或者，偶联物垫可以设置为与样品垫相接触，以接收通过样品垫的样品毛细流并随后将样品毛细流转送到另一个垫(下文称为“第三垫”)上与不同于样品垫的接触表面的表面进行接触。样品垫和偶联物垫的一个或多个部分的选择以及所选择的部分在抗体固定化膜上如何设置可以视情况而改变。

适合于偶联物垫的材料包括但不限于纸、纤维素混合物、硝酸纤维素、聚酯、丙烯腈共聚物、玻璃纤维、和无纺布纤维例如人造丝。优选使用玻璃纤维。

偶联物垫可以包含，例如，一种或多种稳定剂、增溶剂等，其目的是使检测试剂保持稳定状态以便于当检测试剂与样品接触时检测试剂和样品中的分析物(例如CRP)或对照组分(例如Hb)之间发生特异性反应或者实现迅速且有效的溶解和流态化。稳定剂、增溶剂等可以包括例如牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、酪蛋白、和氨基酸。特别地，抗CRP抗体在存在和不存在Ca²⁺离子时可以具有不同的反应性，偶联物垫可以视情况包含Ca²⁺离子的螯合剂例如EDTA和EGTA以控制反应性，或者相反地，可以加入钙盐例如CaCl₂以增加Ca²⁺离子。

(第三垫)

在本发明中，可以设置第三垫以从样品和检测试剂的反应组分中除去检测分析物(如CRP)和对照组分(如Hb)所不需要的组分，从而使反应所必需的组分能够顺利地在抗体固定化膜上展开/扩散。例如，希望除去血细胞、不溶的血细胞碎片等CRP或Hb检测所不需要的组分。第三垫还可以具有在抗原抗体反应产生的凝集作用中初步去除其尺寸大到阻碍向抗体固定化膜的移动以及在抗体固定膜上的顺利展开/扩散的凝集物的附加效果。第三垫包括让液体和样品组分通过的任何材料或形式。具体的实例包括但不限于玻璃纤维、丙烯酸纤维、亲水聚乙烯材料、干燥的纸、纸浆、纤维等。优选使用血细胞分离膜或类似的膜。

(抗体在不溶膜上的固定化)

在本发明的免疫层析测试条中，分析物(如CRP)或对照组分(如Hb)的抗体可以用公知的方法固定在不溶膜上。例如，在直流形式(flow-throughformat)的情况下，以预定浓度制备抗体并将其特定量的溶液以点状或特定符号如“+”的形状施加到不溶膜上。在侧流形式(lateral flow format)的情况下，以预定浓度制备抗体并通过使用具有能水平移动同时以恒定速度从喷嘴排放溶液的机构的装置将其溶液以线形施加到不溶膜上。

在这种情况下，抗体的浓度优选为0.1mg/mL至5mg/mL，更优选为0.5mg/mL至2mg/mL。不溶膜上的固定化抗体的量在直流形式的情况下可以通过调整滴加到不溶膜上的施加量进行优化，在侧流形式的情况下可以通过调整所述装置喷嘴的排放速度进行优化。特别地，在侧流形式的情况下，优选0.5μL/cm至2μL/cm。在本发明中，“直流膜检测”指样品液体等扩散以垂直通过不溶膜的形式，“侧流膜检测”指试样液体等扩散以平行于不溶膜移动的形式。

在本发明中，在侧流形式的情况下，分析物(如CRP)或对照组分(如Hb)在不溶膜上施加的位置可以设置为检测试剂从偶联物垫通过毛细作用扩散并顺序通过施加各个抗体的线。优选地，施加抗CRP抗体的线位于上游，而施加抗Hb抗体的线位于其下游。在这种情况下，最好在各个线之间设置足够的距离以便能够检测到标记物信号。在直流形式下，CRP或Hb抗体的施加位置可以设置为能够检测到标记物信号。

通常可以使用预定缓冲液制备施加到不溶膜上的抗体溶液。缓冲液的类型包括常用的缓冲液例如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、和Good’s缓冲液。缓冲液优选具有6.0-9.5范围的pH值，更优选为6.5-8.5，更优选为7.0-8.0。缓冲液可以包含盐例如NaCl、稳定剂和防腐剂例如蔗糖、以及防腐剂例如ProClin。盐包括那些用于调节离子强度的那些，例如NaCl，以及那些在调节缓冲液pH步骤加入的那些，例如氢氧化钠。

将抗体固定到不溶膜上以后，可以使用常用的溶液形式或喷雾形式的封闭剂覆盖没有固定抗体的部分以进行封闭。在本说明书中，上述的固定有抗体的不溶膜也称为“抗体固定化膜”。

(不溶膜)

在本发明中，不溶膜(以下也简称为膜)可以是任何材料。例如，所述材料包括但不限于聚乙烯、聚乙烯对苯二甲酸酯、尼龙、玻璃、多糖例如纤维素和纤维素衍生物、或陶瓷。特定的实例包括Millipore Corporation,Toyo Roshi Kaisha,Ltd.,和Whatman^TM的玻璃纤维滤纸和纤维素滤纸。可以通过恰当选择不溶膜的孔径、结构等控制胶体金标记抗体和分析物(如CRP)的免疫复合物流过膜的速度。由于可以通过控制流过膜的速度调整固定在膜上的抗体所带有的标记抗体的量，所以理想的是在考虑与本发明的免疫层析测试条的其它组分材料的相容性的情况下优化膜的孔径和结构。

(吸收垫)

在本发明中，“吸收垫”指吸收迁移或通过不溶膜的样品以控制样品扩散的液体吸收部分。例如，在侧流形式中，吸收垫可以设置在测试条结构的最下游部分，在直流形式中，吸收垫可以设置在抗体固定化膜的下部。例如，吸收垫可以是但不限于滤纸。优选使用Whatman^TM的740-E等。

(测试条)

在本发明中，“测试条”可以是包括至少一个固定有分析物的抗体的不溶膜并根据需要进一步包含试剂组分和其它膜等的任何试条。其它膜可以是样品垫、偶联物垫、吸收垫等。测试条通常放置在固相支撑物例如塑料胶粘片上。显然固相支撑物由不妨碍样品毛细流动的材料制成且粘合剂组分由不妨碍样品毛细流动的材料制成。可以使用聚酯膜等层叠以增加抗体固定化膜的机械强度并防止检测过程中的水分蒸发(干燥)。

可以将测试条保存在容器(外壳)中或安装在其上之后使用，这种保存或安装形态被称为“装置”，所述容器(外壳)相对于试条的尺寸、样品加入的方式和位置、抗体在抗体固定化膜上固定化的位置、信号检测方法等而言是合适的。

(同一个测试条)

用于检测分析物的试条与用于检测对照组分的试条可以是同一个试条或是不同的单独的试条。因此，在同一个试条的情况下，试条由同一个包含固定有对照组分的第一抗体的标记物以及固定有分析物的第一抗体的标记物的偶联物垫，和同一个固定有对照组分的第二抗体和分析物的第二抗体的不溶膜组成，如前所述。如果使用不同的单独的试条，同一个样品使用由包含固定有分析物的第一抗体的标记物的偶联物垫和固定有分析物的第二抗体的不溶膜组成的用于测定分析物的试条，和由包含固定有对照组分的第一抗体的标记物的偶联物垫和固定有对照组分的第二抗体的不溶膜组成的用于检测对照组分的试条测定。当使用同一个试条时，可以减小尺寸并且可以容易地进行测定。另一方面，如果使用分开的试条，则可以根据需要组合使用用于不同分析物的多个试条，因此，认为这样能提高单个试条的通用性。即使当试条是单独的时，显然试条也可以放在同一个外壳中形成一个装置。

在本说明书中，“不溶膜”也称为“固相”，使不溶膜能够以物理或化学方式支持抗原或抗体或使之处于这样的状态可以表达为“固定化”、“固定”、“固相化”、“敏化”、或“吸附”。

(试样稀释液)

本发明中可以使用任何组成的试样稀释液，只要所述稀释液不显著抑制分析物或对照组分与各自的抗体之间的抗原抗体反应，或者，相反地，不显著促进能导致标记物的过量凝集从而破坏毛细扩散的反应，并且使得能够进行依赖于抗原浓度的抗原抗体反应信号的检测。这样的稀释液可以是例如纯水或pH6.0-10.0的低浓度缓冲液，低浓度缓冲液可以是例如10-20mmol/L磷酸盐缓冲液、10-20mmol/L Tris-HCl缓冲液、和10-20mmol/L甘氨酸-HCl缓冲液。

可以向这些稀释液中加入表面活性剂以控制样品液体在试纸条上的扩散速度。特别地，在测定作为分析物实例的CRP的系统中，如果使用保藏号为FERM BP-11344的杂交瘤产生的单克隆抗体作为标记物固定化抗体，并使用保藏号为FERM BP-11345的杂交瘤产生的单克隆抗体作为不溶膜固定化抗体，则稀释液可以包含由通式CH₃(CH₂)_nOSO₃Na(n=5-10)表示的烷基硫酸钠，以调节测定的范围。优选地，由于获得了优选的浓度-反应曲线，所以合适的是加入0.05-0.3%的己基硫酸钠、辛基硫酸钠等。在这种情况下，理想的稀释倍数是50-200。稀释液可以进一步包含Ca²⁺离子的螯合剂例如EDTA和EGTA。

(第二对照组分)

在本发明的免疫层析检测方法中，显然可以使用所谓的常规对照组分(在本发明中称为第二对照组分)。因此，可以通过使用进一步包含样品中所不包含的组分（第二对照组分）的偶联物垫和进一步包含检测第二对照组分的试剂的不溶膜，实现免疫层析测试条的设置。

偶联物垫中包含的第二对照组分可以是，例如，用标记物标记的且不与分析物反应的抗体，和用标记物标记的高抗原性蛋白例如KLH(钥孔戚血蓝素)。这些第二对照组分是不可能存在于样品中的组分(物质)且可以恰当地选择以适当对应于对照组分的抗体(对照组分捕获抗体)。

对于固定于不溶膜上用于检测第二对照组分的试剂，例如，如果在偶联物垫中包含标记的KLH作为第二对照组分，则抗KLH抗体等对应于第二对照组分的检测试剂。虽然可以适当选择检测试剂在膜上的固定化位置，但是优选检测试剂设置在相对于分析物的检测试剂的下游。

在这种设置下，如果没有检测到第二对照组分，则也可以确定没有向测试条提供样品。

实施例

本发明通过检测作为分析物的CRP和作为对照组分的Hb的实施例而被具体描述；但是，本发明的范围不限于实施例。

1.本发明的免疫层析测试条的制备实施例

1)胶体金标记的抗CRP抗体和胶体金标记的抗Hb抗体(偶联物)的制备

按照下述i)和ii)的缓冲液条件和抗体浓度制备抗CRP单克隆抗体(克隆:FERM BP-11344)和抗人Hb单克隆抗体(克隆:#69202)，将1mL的每种抗体溶液加入到20mL1OD/mL的胶体金溶液(粒径：40nm)中，室温搅拌10分钟。将2mL10%的牛血清白蛋白(BSA)水溶液加入到每种胶体金/抗体混合物中，进一步搅拌5分钟，将混合物在10℃10,000rpm离心45分钟获得沉淀(偶联物)。为了获得偶联物，加入1.2mL偶联物稀释缓冲液（Conjugate Dilution Buffer）(由Scripps Laboratories制造)使偶联物悬浮。在最大吸收波长测定偶联物的吸收值。

i)FERM BP-11344(20μg/mL)，2mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)

ii)#69202(80μg/mL)，2mmol/L硼酸盐缓冲液(pH9.0)(为方便起见，将抗体描述为产生抗体的杂交瘤的克隆名)

2)偶联物垫的制备

将上述(1)中产生的抗CRP单克隆抗体敏化的偶联物和抗Hb单克隆抗体敏化的偶联物用包含1.33%酪蛋白和4%蔗糖的20mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)分别稀释至20OD/mL和10OD/mL以制备偶联物溶液。将具有一定体积的玻璃纤维垫(由Pall Corporation制造的No.8964)用相对于垫体积而言1.2倍体积的偶联物溶液浸渍。在干燥炉中在70℃将所述垫干燥30分钟，获得偶联物垫。如果根据需要加入添加剂例如敏化剂，则可以在进行该操作之前向偶联物溶液中加入必需的量。

3)抗CRP抗体和抗Hb抗体固定化膜的制备

用包含2.5%蔗糖的10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)将抗CRP单克隆抗体(克隆:FERM BP-11345)和抗Hb单克隆抗体(克隆:#69209)制备为1mg/mL，使用设置为0.75μL/cm的免疫层析分配器“XYZ3050”(BIODOT)，以线形将抗CRP单克隆抗体施加到硝酸纤维素膜(Millipore,HF240或HF180)上短边的一端内侧的位置并且施加的抗Hb单克隆抗体与其的间隔约为5mm。在干燥炉中70℃将所述膜干燥45分钟，获得抗体固定化膜。

4)样品垫的制备

将切割成一定体积的玻璃纤维垫(Lydall)用相对于垫体积而言1.15倍体积的包含24mmol/L NaCl、0.5%蔗糖、和30mmol/L乙二胺四乙酸的20mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.2)浸渍。在干燥炉中在70℃将所述垫干燥45分钟，获得样品垫。

5)测试条的制备

将抗体固定化膜(b)固定在塑料胶粘片(a)上，将抗CRP抗体(c)和抗Hb抗体(d)的施加部分安排为使前者位于展开/扩散的上游侧，进一步安装由玻璃纤维垫组成的第三垫(i)。然后设置并安装2)中制备的偶联物垫(e)，设置并安装4)中制备的样品垫(f)使之与偶联物垫重叠，同时将吸收垫(g)设置并安装在另一侧的末端。最后，设置和安装聚酯膜(h)使之叠合在上表面以覆盖抗体固定化膜和吸收垫。切割如上所述的通过重叠各组成元件形成的结构，制备测试条。在检测的时候将测试条保存于专用的塑料外壳(具有图1中未示出的加样窗口和检测窗口)中或安装于其上以实现免疫层析检测装置。图1是测试条的结构示意图。

6)稀释液的制备

在包含己基硫酸钠的10mmol/L磷酸盐缓冲液中加入防腐剂，防腐剂终浓度为0.1%，使用通过0.45μm过滤器过滤获得的液体作为试剂的稀释液。

[实施例1]使用夹心免疫层析的CRP检测方法

(1)试样

用EDTA-2K真空采血管从一个同意进行血液采集的健康个体采集5mL血液，通过离心将血浆分级。使分级的血浆通过抗CRP抗体柱以除去CRP后，向1mL除去CRP的血浆中加入重组CRP，制备相当于3.0mg/dL的含CRP血浆，将其定义为试样1。不加入重组CRP的一(1)mL的除去CRP的血浆定义为试样2。对于重组CRP，使用rCRP-C-反应蛋白(重组)(由Oriental Yeast Co.,Ltd.制造)。

(2)样品制备

将部分试样1和2用稀释液以倍数101稀释，用作正常操作样品。使用稀释液本身作为忘记加入试样的不当操作样品。

(3)检验方法

向免疫层析测试条的样品垫窗口分别加入120μL正常操作样品和不当操作样品，5分钟后使用免疫层析读出器ICA-1000(HamamatsuPhotonics K.K.)测定测试条检测窗口的检测线(CRP测定)和对照线(Hb捕获)的反射光密度。

(4)结果

在正常操作样品的情况下，试样1导致在用于测定CRP浓度的检测线和用于捕获Hb-标记物复合物的对照线上有可识别的颜色，试样2仅在对照线上有可识别的颜色。因此，可以确定每个样品中含有试样。另一方面，不当操作样品在检测线或对照线上都没有可识别的颜色，将该样品确定为忘记加入试样的样品(表1)。

[表1]

参考符号列表

(a)塑料胶粘片

(b)抗体固定化膜

(c)抗CRP抗体

(d)抗血红蛋白抗体

(e)偶联物垫

(f)样品垫

(g)吸收垫

(h)聚酯膜

(i)第三垫

FERM BP-11344

FERM BP-11345

[关于保藏的生物材料]

1)FERM BP-11344

i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址

独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心（IPOD）

（International Patent Organism Depositary,National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology）

Tsukuba Central6,1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki305-8566,日本

ii)在i)的保藏机构保藏生物材料的日期

2009年11月26日

iii)由i)的保藏机构指定的保藏号

FERM BP-11344

(2)FERM BP-11345

i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址

独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心（IPOD）

Tsukuba Central6,1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki305-8566,日本

ii)在i)的保藏机构保藏生物材料的日期

2009年11月26日

iii)由i)的保藏机构指定的保藏号

FERM BP-11345

Claims

1.一种检测通过稀释试样获得的样品中的分析物的免疫层析检测方法，所述方法包含以下步骤：

1)向免疫层析测试条的样品垫提供样品，其中所述免疫层析测试条包含：

a)样品垫，

固定有分析物的第一抗体的标记物，和

固定有对照组分的第一抗体的标记物，所述对照组分包含于所述试样中且不同于所述分析物，以及

c)设置在相对于所述偶联物垫的下游的不溶膜，其上固定有所述分析物的第二抗体和所述对照组分的第二抗体；

2)在所述不溶膜上检测所述分析物与所述分析物的第一和第二抗体的复合物是否存在；

3)在所述不溶膜上检测所述对照组分与所述对照组分的第一和第二抗体的复合物是否存在；以及

2.权利要求1的检测方法，其中所述试样是血浆或血清。

3.权利要求1或2的检测方法，其中所述对照组分是血红蛋白。

4.权利要求1-3任一项的检测方法，其中所述免疫层析测试条的(b)项进一步包含所述样品中不包含的第二对照组分，其中所述免疫层析测试条的(c)项进一步包含所述第二对照组分的检测试剂，且其中所述方法进一步包含以下步骤：

5)在所述不溶膜上检测所述第二对照组分是否存在。

5.一种免疫层析测试条，包含：

a)样品垫；

固定有分析物的第一抗体的标记物，和

c)设置在相对于所述偶联物垫的下游的不溶膜，其上固定有所述分析物的第二抗体和所述对照组分的第二抗体。

6.权利要求5的免疫层析测试条，其中(b)项，所述偶联物垫，进一步包含所述样品中不包含的第二对照组分，且其中(c)项，所述不溶膜，包含所述第二对照组分的检测试剂。

7.权利要求5或6的免疫层析测试条，其中所述对照组分是血红蛋白，且其中所述对照组分的抗体是抗血红蛋白抗体。

8.一种用于免疫层析检测的成套试剂盒，包括：试样稀释液和权利要求5-7任一项的免疫层析测试条。