CN111896755A - 一种脱氢表雄酮快速检测试纸条以及脱氢表雄酮检测方法 - Google Patents
一种脱氢表雄酮快速检测试纸条以及脱氢表雄酮检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种脱氢表雄酮快速检测试纸条以及脱氢表雄酮检测方法。本发明公开了一种脱氢表雄酮快速检测试纸条，将铂纳米花应用于试纸条，用于脱氢表雄酮的检测，利用试纸条来检测脱氢表雄酮，使得检测过程简单方便，检测时间更短，灵敏度高，检测限低，可实现实际样品中脱氢表雄酮的快速检测。该试纸条的检测成本低，具有极大的应用价值，市场前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种脱氢表雄酮快速检测试纸条以及脱氢表雄酮检测方法。
背景技术
脱氢表雄酮是肾上腺皮质癌灵敏和可信赖的生物标记物，因为当肿瘤用成像的方法还不能确定时，而脱氢表雄酮的含量会有显著的提高。因此，在临床上检测脱氢表雄酮对肾上腺皮质癌的诊断有一定的实际运用。因此，针对脱氢表雄酮的检测，进行初步筛选肾上腺皮质癌患者，建立灵敏度高、成本低、快速的免疫分析方法用于辅助肾上腺皮质癌的诊断，做到早发现、早治疗是十分有意义的。
临床上检测脱氢表雄酮的方法有是放射免疫分析方法，虽然其具有灵敏度高，操作简单的优点，但是放射性物质危害操作人员健康。近年来放射免疫分析方法逐渐被其他非放射性测定技术所取代。临床上检测脱氢表雄酮的方法还有利用仪器的方法，例如HPLC、HPLC-MS/MS、GC-MS和LC-MS/MS。虽然使用这些仪器的检测，灵敏度较高，但是需要训练有素的专业人员、复杂的操作以及高成本。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种脱氢表雄酮快速检测试纸条以及脱氢表雄酮检测方法，该试纸条检测过程简单方便，成本低、检测时间更短，灵敏度高，检测限低，可实现实际样品中脱氢表雄酮的快速检测。
其具体技术方案如下：
本发明提供一种脱氢表雄酮快速检测试纸条，包括：底板；
所述底板上依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
所述结合垫上包被上述铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上依次划有包被抗原的检测线和羊抗兔IgG抗体的质控线。
本发明将铂纳米花应用于试纸条，用于脱氢表雄酮的检测，利用试纸条来检测脱氢表雄酮，使得检测过程简单方便，检测时间更短，灵敏度高，检测限低，可实现实际样品中脱氢表雄酮的快速检测。该试纸条的检测成本低，具有极大的应用价值，市场前景广阔。
本发明中，所述吸水纸的长度为20～40mm，优选为30mm；硝酸纤维素膜的长度为15～25mm；结合垫的长度为5～15mm，优选为10mm；样品垫的长度为15～25mm，优选为20mm；脱氢表雄酮快速检测试纸条的宽度为3～5mm；
所述包被抗原的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL，喷涂量为1μL/cm，所述羊抗兔IgG抗体的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL，喷涂量为1μL/cm，所述铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体的浓度为50-100μg/mL，优选为80μg/mL，喷涂量为6～10μL/cm，优选为1μL/cm；
本发明中，所述底板为塑胶条；所样品垫优选用玻璃棉制成；所述结合垫为结合物释放层，包被有铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体的纤维层；抗原抗体反应发生在硝酸纤维素膜层，，其上划有测试线和质控线；所述吸水纸为吸水材料，优选用吸水滤纸制成；检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水纸，检测线与质控线之间平行且间隔5cm。将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸从左至右依次粘贴固定在底板上，各层交界处纤维互相交叉渗透。
本发明中，脱氢表雄酮多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫原；
步骤2：使用免疫原免疫兔子，取血离心，取上清即为脱氢表雄酮多克隆抗体。
本发明采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮和牛血清蛋白偶联得到免疫原，通过对兔子免疫，得到效价高，特异性好的脱氢表雄酮多克隆抗体。
本发明步骤1具体为：将脱氢表雄酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺溶于DMF中反应，得到反应液，将反应液加入含牛血清蛋白的缓冲液中反应，离心，收集上清得到免疫原。
本发明中，脱氢表雄酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺的摩尔比优选为0.1：0.15：0.15；
脱氢表雄酮半抗原与牛血清蛋白的用量比为(0.1-0.2)mmol：(100-200)mg，优选为0.1mmol：113mg；
所述含牛血清蛋白(BSA)的缓冲液的制备具体为：将BSA充分溶解在PBS中，得到含牛血清蛋白的PBS缓冲液，其中，PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4，BSA的浓度为28.25mg/mL；
所述纯化优选将反应得到的反应液于PBS缓冲液中透析三天，其中，PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4。
本发明步骤2中，免疫原免疫兔子前还包括：使用弗氏完全佐剂对免疫原进行乳化；免疫原与弗氏完全佐剂的用量比优选为1mg：1mL；
所述免疫的周期为两周，共免疫五次；
所述取血的位置优选为在免疫兔耳缘静脉取血。
本发明中，铂纳米花和脱氢表雄酮多克隆抗体通过异性电荷间的范德华力相结合。
本发明中，铂纳米花标记的脱氰表雄酮多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
a)将聚乙烯比咯烷酮和甘氨酸加入水中，再加入H2PtCl6·6H2O混合，得到混合液，将所述混合液进行水热反应，得到所述铂纳米花；
b)将所述铂纳米花水溶液、碱溶液、脱氢表雄酮多克隆抗体进行混合，加入封闭液进行封闭，得到铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体。
本发明步骤a)中，所述聚乙烯比咯烷酮、甘氨酸和H2PtCl6·6H2O的质量体积比为(400～405)mg：(75～80)mg：1.0mL，优选为400mg：75mg：1.0mL；
所述H2PtCl6·6H2O的浓度为40mM；
所述聚乙烯比咯烷酮的分子量为10000；
所述混合液优选采用磁力搅拌器进行搅拌，直至得到澄清的淡黄色溶液。
所述水热反应的温度为180～200℃，时间为6～7h，优选在200℃下反应6h；
所述水热反应结束后，还包括：冷却至室温后，离心收集暗棕色沉淀，采用超纯水和乙醇多次清洗后得到的沉淀即为铂纳米花；
得到铂纳米花后，优选将所述铂纳米花分散在超纯水中。
本发明铂纳米花制备简单，制得的铂纳米花，成本低廉，可用于脱氢表雄酮浓度的检测。
本发明步骤b)中，所述碱溶液中的碱性试剂优选为K2CO3，碱溶液起调节pH作用，使铂纳米花水溶液的pH达到抗体偶联的等电点，便于铂纳米花水溶液与抗体的静电结合；
所述封闭液优选为牛血清白蛋白；
所述混合采用搅拌的方式进行混合，所述搅拌的温度为室温，时间为1～2h；
所述加入封闭液后采用搅拌的方式进行混合，所述搅拌的温度为室温，时间为1～2h；
所述加入封闭液进行封闭后，还包括：离心除去未结合的脱氢表雄酮抗体，收集沉淀，即为铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体。得到铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体沉淀后，优选将沉淀用重悬液重悬，备用；所述重悬液为含的5％蔗糖，2％海藻糖，1％PEG 20000，1％BSA和0.25％Tween-20的PBS缓冲液；
所述铂纳米花水溶液：碱溶液：脱氢表雄酮抗体：封闭液：重悬液的体积比为1000：6：2：100：30；
所述铂纳米花水溶液的浓度为1mg/mL；所述碱溶液的浓度为1mg/mL，所述封闭液的浓度为100mg/mL。
本发明中，所述包被抗原由脱氢表雄酮半抗原和卵清蛋白通过混合酸酐法制得，具体为：
将脱氢表雄酮半抗原用甲酰胺溶解后冷却，加入氯甲酸异丁酯和三正丁胺进行反应，得到反应液，将反应液加入含卵清蛋白的缓冲液中反应，纯化，得到包被抗原。
本发明中，所述脱氢表雄酮半抗原、氯甲酸异丁酯和三正丁胺的用量比为0.11mol：26μL：13μL；
脱氢表雄酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺优选在4℃下搅拌反应30min；
所述脱氢表雄酮半抗原与所述卵清蛋白的用量比为(0.1-0.2)mmol:(100-150)mg，优选为0.11mmol:121mg；
所述含牛血清蛋白缓冲液制备具体为：将卵清蛋白溶解在含有DMF的碳酸盐缓冲液中，得到含牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液，其中，碳酸盐缓冲液的浓度为0.1M，pH值为9.6，牛血清蛋白的浓度为17.3mg/mL；
所述纯化优选将反应得到的反应液于PBS缓冲液中透析三天，其中，PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4。
本发明还提供了一种脱氢表雄酮快速检测方法，包括以下步骤：
向上述脱氢表雄酮快速检测试纸条的样品垫滴入待测样品，若检测线和质控线均显色，则待测样品不含脱氢表雄酮，若检测线不显色，质控线显色，则待测样品含脱氢表雄酮。
所述待测样品的用量为60～100μL。
本发明中，脱氢表雄酮快速检测试纸条的检测原理为：
当待测样品溶液滴入试纸条样品垫后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过铂纳米花颗粒的颜色显示出来。如果待测样品溶液中含有脱氢表雄酮，脱氢表雄酮先和结合垫是铂纳米花颗粒上的脱氢表雄酮多克隆抗体反应，因此当铂纳米花颗粒随样品溶液扩散至检测线时，铂纳米花颗粒上抗体的活性位点因被待测样品溶液中的脱氢表雄酮占据而无法与检测线上脱氢表雄酮包被抗原结合，不能显示检测印迹，而羊抗兔IgG抗体则可与铂标抗体结合，质控区显色，形成一条棕色线，呈一条棕色线为阳性；相反待测样品溶液中无脱氢表雄酮，则不能阻止铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体与纤维素膜上脱氢表雄酮包被抗原相结合，检测区显示棕色线，同样羊抗兔IgG抗体也能与铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体结合，质控线也能形成一条棕色线，呈两条棕色线为阴性；如果纤维素膜上的质控线上没有棕色线显示，则该试纸条无效。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种脱氢表雄酮快速检测试纸条，将铂纳米花应用于试纸条，用于脱氢表雄酮的检测，利用试纸条来检测脱氢表雄酮，使得检测过程简单方便，检测时间更短，灵敏度高，检测限低，可实现实际样品中脱氢表雄酮的快速检测。该试纸条的检测成本低，具有极大的应用价值，市场前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例4提供的脱氢表雄酮快速检测试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例5提供的脱氢表雄酮快速检测试纸条的测试图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，脱氢表雄酮购自上海阿拉丁股份有限公司，雌性新西兰大白兔购自广东省医学实验动物中心。
实施例1脱氢表雄酮与载体蛋白的偶联
采用混合酸酐法将脱氢表雄酮半抗原和卵清蛋白偶联得到包被原(用于固定在测试线上)，采用碳化二亚胺法将脱氢表雄酮和牛血清白蛋白偶联免疫原(用于制备多克隆抗体)。
(1)包被原的制备：
①将0.11mmol脱氢表雄酮半抗原用1.5mL甲酰胺(DMF)溶解，冷却至10℃，加入26μL氯甲酸异丁酯和13μL三正丁胺，4℃搅拌反应30min，即得A液；
②称取卵清蛋白(OVA)121mg，使之充分溶解在7mL含有770μL DMF的碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中，即可得到B液；
③将A液逐滴缓慢滴加到该B液中，4℃过夜搅拌反应。取最终反应物于磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH 7.4)中透析纯化三天，10000g离心10min，收集上清液，即得到包被原。
(2)免疫原的制备：
①将0.1mmol脱氢表雄酮半抗原、0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，以及0.15mmol碳化二亚胺(DCC)充分溶解于1.5mL DMF中，于室温下搅拌14h，即可得到A液；
②称取牛血清白蛋白(BSA)113mg，使之充分溶解在4mL PBS(0.01M，pH 7.4)中，即得到B液；
③将A液逐滴缓慢滴加到B液中，并于4℃搅拌过夜。取最终反应物于磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH 7.4)中透析纯化三天，10000g离心10min，收集上清液，即得到免疫原。
实施例2脱氢表雄酮多克隆抗体的制备
(1)将一只雌性新西兰大白兔在动物房适应饲养2周；
(2)取约1mg实施例1制得的免疫原，加入PBS至1mL，加入1mL弗氏完全佐剂，进行蛋白乳化；
(3)用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的免疫原，对新西兰大白兔背部分多个位点进行皮下注射(注射位点需先用75％酒精棉消毒)；
(4)两周后，进行加强免疫，以初始免疫等量的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，对新西兰大白兔进行背部皮下多位点注射，共加强免疫4次，每次间隔时间均为2周；
(5)最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰大白兔进行耳缘静脉采血，室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心10min后小心吸取上层血清即为脱氢表雄酮多克隆抗体，分装后-20℃保存。
经测定，本实施例制得的脱氢表雄酮多克隆抗体的效价为256 000。
将本实施例制得的脱氢表雄酮多克隆抗体进行特异性鉴定，结果如表1所示。表1的结果脱氢表雄酮多克隆抗体相比于与脱氢表雄酮结构类似的甾体化合物交叉反应小、特异性好。
表1
实施例3铂纳米花和铂纳米花标记抗体，即铂标抗体的制备
(1)制备铂纳米花：将400mg聚乙烯比咯烷酮和75mg甘氨酸加入7.0mL水中，再加入1.0mL H2PtCl6·6H2O，该混合溶液用磁力搅拌器搅拌5分钟得到澄清的淡黄色溶液，然后全部转移至Teflon-lined高温反应釜中，在高温反应器中200℃反应6h。反应结束后，冷却至室温，通过离心收集暗棕色沉淀并用超纯水和乙醇多次清洗，最后将沉淀分散到8mL超纯水中，室温储存，备用。
(2)在试管中依次加入1mL铂纳米花水溶液、6μL K2CO3溶液，然后将混合溶液用磁力搅拌器搅拌2分钟。然后，往其中加入2μL实施例2制得的脱氢表雄酮的多克隆抗体，在室温下搅拌1小时。然后，在其中加入100μL BSA(100mg/mL)溶液再搅拌1小时后，离心去除未结合抗体，收集沉淀，并将沉淀用30μL含5％蔗糖，2％海藻糖，1％PEG 2 0000，1％BSA和0.25％Tween-20的PBS缓冲液重悬，备用。
实施例4脱氢表雄酮快速检测试纸条的制备与操作
(1)脱氢表雄酮快速检测试纸条的结构，如图1所示。图1中样品垫，用玻璃棉制成；结合垫为结合物释放垫层，吸附有脱氢表雄酮多克隆抗体的铂标抗体纤维层；抗原抗体在硝酸纤维素膜层，其上有测试线和质控线；吸水纸为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸各层从左至右依次粘贴固定在塑胶条上，各层交界处纤维互相交叉渗透。检测线为包被抗原溶液，质控线为用羊抗兔IgG溶液，检测线与质控线之间平行且间隔5cm，两线分布在硝酸纤维素膜中间且检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水纸。吸水纸的长度为30mm，样品垫的长度为20mm，结合垫的长度为10mm，包被抗原的浓度和用量为1mg/mL,1μL/cm，羊抗兔IgG抗体的浓度和用量为1mg/mL,1μL/cm，铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体的浓度和用量为80μg/mL,1μL/cm。
试纸条反应原理：当待测样品溶液滴入试纸条样品垫后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过铂纳米花颗粒的颜色显示出来。如果待测样品溶液含有脱氢表雄酮，脱氢表雄酮先和结合垫是铂纳米花颗粒上的抗体反应，因此当铂纳米花颗粒随样品溶液扩散至检测线时，铂纳米花颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的脱氢表雄酮占据而无法与检测线上脱氢表雄酮包被抗原结合，不能显示检测印迹，而羊抗兔IgG抗体则可与铂标抗体结合，质控区显色，形成一条棕色线，呈一条棕色线为阳性；相反样本溶液中无脱氢表雄酮则不能阻止铂标抗体与纤维素膜上脱氢表雄酮包被抗原相结合，检测区显示棕色线，同样羊抗兔IgG抗体也能与铂标抗体结合，质控线也能形成一条棕色线，呈两条棕色线为阴性；如果纤维素膜上的质控线上没有棕色线显示，则该试纸条无效。
(2)试纸条检测操作方法：从包装袋中取出试纸条，用移液枪吸取待检溶液，在样品垫滴入70μL待测样品，加样后开始计时，结果应在3～5分钟读取，其他时间判读无效。
(3)试纸条检测结果判断:如果在硝酸纤维素膜上有一条棕色线显示(T线)，检侧结果呈阳性，表示在被检测样品中含脱氢表雄酮；如果试纸条上的硝酸纤维素膜上出现两条棕色线，检测结果呈阴性，表示待检样品中不含脱氢表雄酮；如未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。
实施例5检测样品中的脱氢表雄酮含量
(1)配制浓度为105、104、103、102、10、1、0.1、0ng/mL的脱氢表雄酮溶液，作为标准溶液；
(2)从包装袋中取出试纸条，用移液枪分别吸取70μL脱氢表雄酮标准溶液滴在样品垫上，加样后开始计时，5分钟后可进行观察判读，其他时间判读无效；
(3)判读结果如图2所示，试纸条用于检测脱氢表雄酮的cut-off值为10ng/mL，vLOD值为1000ng/mL。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种脱氢表雄酮快速检测试纸条，其特征在于，包括：底板；
所述底板上依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
所述结合垫上包被有铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上依次划有包被抗原的检测线和羊抗兔IgG抗体的质控线；
所述脱氢表雄酮多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
步骤1：采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫原；
步骤2：使用所述免疫原免疫兔子，取血离心，取上清即为脱氢表雄酮多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的脱氢表雄酮快速检测试纸条，其特征在于，步骤2所述免疫的周期为两周，共免疫五次。
3.根据权利要求1所述的脱氢表雄酮快速检测试纸条，其特征在于，步骤1具体为：
将脱氢表雄酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺溶于DMF中反应，得到反应液，将反应液加入含牛血清蛋白的缓冲液中反应，纯化，得到免疫原。
4.根据权利要求1所述的脱氢表雄酮快速检测试纸条，其特征在于，所述铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
步骤1：将聚乙烯比咯烷酮和甘氨酸加入水中，再加入H2PtCl6·6H2O混合，进行水热反应，得到所述铂纳米花；
步骤2：将所述铂纳米花的水溶液、碱溶液、脱氢表雄酮多克隆抗体进行混合，加入封闭液进行封闭，得到铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的脱氢表雄酮快速检测试纸条，其特征在于，步骤2所述铂纳米花水溶液：碱溶液：脱氢表雄酮多克隆抗体：封闭液的体积比为1000：6：2：100；
所述铂纳米花水溶液的浓度为1mg/mL，所述碱溶液的浓度为1mg/mL，所述封闭液的浓度为100mg/mL。
6.根据权利要求1所述的脱氢表雄酮快速检测试纸条，其特征在于，所述包被抗原由脱氢表雄酮和卵清蛋白通过混合酸酐法制得。
7.根据权利要求1所述的脱氢表雄酮快速检测试纸条，其特征在于，所述包被抗原的制备方法具体为：
将脱氢表雄酮半抗原用甲酰胺溶解后冷却，加入氯甲酸异丁酯和三正丁胺进行反应，得到反应液，将反应液加入含卵清蛋白的缓冲液中反应，纯化，得到包被抗原。
8.根据权利要求7所述的脱氢表雄酮快速检测试纸条，其特征在于，所述包被抗原的浓度为0.5～2mg/mL，喷涂量为1μL/cm；
所述羊抗兔IgG抗体的浓度为0.5～2mg/mL，喷涂量为1μL/cm；
所述铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体的浓度为50-100μg/mL，喷涂量为6～10μL/cm。
9.一种脱氢表雄酮快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
向权利要求1至8任意一项所述的脱氢表雄酮快速检测试纸条的样品垫滴入待测样品，若检测线和质控线均显色，则待测样品不含脱氢表雄酮，若检测线不显色，质控线显色，则待测样品含脱氢表雄酮。
10.根据权利要求9所述的脱氢表雄酮快速检测方法，其特征在于，所述待测样品的用量为60～100μL。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201106 |