CN114137230A - 一种血型不规则抗体的检测方法及其应用 - Google Patents

一种血型不规则抗体的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗原多肽、一种编码抗原多肽的核酸、一种包含核酸的载体。所述的抗原多肽为C抗原多肽、small c抗原多肽、E抗原多肽和/或small e抗原多肽。本发明所述的抗原多肽具有抗原活性，可以用于血型不规则抗体的检测。

Description

一种血型不规则抗体的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及不规则抗体检测技术领域，具体涉及Rh血型系统中C、small c、E或small e抗原多肽的IgG型不规则抗体的检测。
背景技术
Rh血型不配合的血液输入受血者体内会刺激受血者的免疫系统产生同种抗体，这种抗体在受血者再次输血时有可能造成血管外溶血，因此，在输血前，对输血对象，尤其是对于一些需要反复输血的病人进行血清中不规则抗体的检测变得越来越重要。
目前，检测不规则抗体的的主要方法为将O型抗筛细胞与待检血浆（清）混合，用抗人球蛋白法和凝聚胺法检出，例如CN110174518A、CN110174519A公开了一种基于固相凝集技术的红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法。进一步的，专利文献CN104950114A公开了基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法以及筛查检测试剂盒的制备，该方法选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，滤膜的周边包围有吸水材料，检测时，将待检血清或血浆滴加到滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。但是，这种采用标准谱细胞会出现保存期短，不及时使用过期浪费，以及操作复杂，结果判读困难，目前的谱细胞不能完全区分红细胞血型不规则抗体等缺陷。
发明内容
本申请发明人经过长期对C、small c、E或small e抗原具体序列进行钻研，从全长序列中选取特定片段，且该片段具有很强的抗原性，实现了采用仅仅十几个氨基酸残基的短肽进行针对C、small c、E或small e不规则抗体的检测。该抗原多肽可以用于血型不规则抗体的检测，最重要的是，不需要红细胞也不需要从细胞膜中提取抗原，操作简便，结果准确。
本发明的第一方面，提供了一种血型不规则抗体的检测方法，所述的检测方法包括将待测物与抗原多肽混合，所述的抗原多肽为C抗原多肽、small c抗原多肽、E抗原多肽和/或small e抗原多肽。
优选的，所述的血型为Rh血型。
优选的，所述的抗原多肽长度为10-25aa。
所述的C抗原多肽包含与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述的small c抗原多肽包含与SEQ ID NO：4具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述的E抗原多肽包含与SEQ ID NO：6具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述的small e抗原多肽包含与SEQ IDNO：8具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的C抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的small c抗原多肽的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的E抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的small e抗原多肽的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。
所述的血型不规则抗体为C抗体、small c抗体、E抗体和/或small e抗体。
所述的待测物为全血、血清、血浆或待测血型不规则抗体。
所述的检测方法检测血型不规则抗体的有无或含量。
所述的检测方法包括但不限于沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定、免疫印迹法或快速测定法。优选的，所述的标记免疫测定选自酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定，所述的快速测定法选自快速斑点免疫结合试验、液相芯片法。
本发明的第二方面，提供了一种抗原多肽，所述的抗原多肽为C抗原多肽、small c抗原多肽、E抗原多肽和/或small e抗原多肽。
所述的C抗原多肽包含与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述的small c抗原多肽包含与SEQ ID NO：4具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述的E抗原多肽包含与SEQ ID NO：6具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述的small e抗原多肽包含与SEQ IDNO：8具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的C抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的small c抗原多肽的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的E抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的small e抗原多肽的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。
本发明的第三方面，提供了一种上述抗原多肽的制备方法，所述的制备方法包括化学合成或生物合成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法为化学合成，优选为固相合成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法为生物合成，例如将编码抗原多肽的核酸导入宿主细胞，并诱导其表达。
本发明的第四方面，提供了一种编码上述抗原多肽的核酸。
本发明的第五方面，提供了一种包含上述编码抗原多肽核酸的载体。
优选的，所述的载体可以为任何适于表达上述抗原多肽的表达载体，包括真核表达载体或原核表达载体。
本发明的第六方面，提供了一种包含上述载体的细胞。
本发明的第七方面，提供了一种上述抗原多肽、编码抗原多肽核酸、包含编码抗原多肽的核酸的载体或包含载体的细胞在血型不规则抗体的检测中的应用。
本发明的第八方面，提供了一种血型不规则抗体的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含上述的抗原多肽、上述的核酸或上述的载体。
所述的检测试剂盒选自免疫磁珠检测试剂盒、凝集检测试剂盒、液相芯片检测试剂盒、酶联免疫试剂盒、荧光免疫检测试剂盒，所述的试剂盒优选为液相芯片检测试剂盒。
所述的检测试剂盒还包含偶联抗原多肽的微球、探针分子或报告分子，其中，所述的微球为聚苯乙烯微球或磁性微球，所述的探针分子是可以和微球表面的羧基等基团偶联并能与被检测物特异性结合的生物分子，所述的报告分子可以是一种能与被检测物特异性结合的荧光染料，也可以是标记有荧光的、能与被检测物结合的其他物质(如抗体、抗原、核酸等)。
所述的检测试剂盒还可以包含固相载体、补体、酶标记的抗体或抗补体和显色液，固相载体材质可以为聚苯乙烯、聚氯乙烯，优选为聚苯乙烯，进一步优选的，本发明所述的固相载体为微量滴定板或微孔板，包括8孔板、48孔板或96孔板；优选的，所述的补体能够与抗原抗体复合物反应，并且不与单独的抗原和抗体反应，所述的抗体可以与待测抗体结合。
所述的检测试剂盒还可以包含磁珠。
所述的检测试剂盒还可以包含荧光物质，进一步所述的荧光物质包括酶、接受体或抗体。
所述的检测试剂盒还包括稀释液、清洗溶液、缓冲液、底物和/或终止溶液。
所述的检测试剂盒还包括阴性对照和/或阳性对照。
本发明的第九方面，提供了一种上述的抗原多肽、核酸、载体、细胞或检测试剂盒在诊断和/或治疗寄生虫病、免疫性疾病、肿瘤或炎性疾病中的应用。
本发明中的抗原多肽，无论后续采用何种免疫学方法进行抗体鉴定均需使用。其中，所述的免疫学方法包括但不限于微柱凝胶法、沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)、免疫印迹法、快速测定法(如快速斑点免疫结合试验、液相芯片法等)。
本发明所述的“包含”在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。
本发明所述的“寄生虫病”包括但不限于蛔虫病、鞭虫病、蛲虫病、阿米巴病、钩虫病、姜片虫病、弓形虫病、疟疾病或阴道毛滴虫病等，其中疟疾病中包括间日疟原虫。
本发明所述的“免疫性疾病”包括但不限于溶血性输血反应、新生儿溶血症、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、重症肌无力、多发性硬化、荨麻疹、牛皮癣、皮肌炎、干燥综合症、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“炎性疾病”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症、增生性炎症、特异性炎症等，包括但不限于重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析、过敏性休克、哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎、胰腺炎、肠炎、血管炎、不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂变态反应等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同源性，例如“与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性”包括比SEQ ID NO：2更短的序列或者更长的序列或者一个或多个位点突变的序列，其与SEQ ID NO：2具有80%以上同一性。
本申请所述的“2-Chlorotrityl Chloride Resin”代表2-氯三苯甲基氯树脂。
本申请所述的“DCM”代表二氯甲烷。
本申请所述的“DMF”代表二甲基甲酰胺。
本申请所述的“DIEA”代表N,N-二异丙基乙胺。
本申请所述的“HBTU”代表苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
本申请所述的“TFA”代表三氟乙酸。
本申请所述的“EDT”代表1,2-乙二硫醇。
本申请所述的“TIS”代表三异丙基硅烷。
本申请所述的“ESI”代表电喷雾离子源。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：HPLC分析C抗原多肽的结果图。
图2：C抗原多肽的MS结果图。
图3：HPLC分析small c抗原多肽的结果图。
图4：small c抗原多肽的MS结果图。
图5：small e抗原多肽高效液相色谱图。
图6：small e抗原多肽质谱图。
图7：E抗原多肽高效液相色谱图。
图8：E抗原多肽质谱图。
图9：C抗原多肽的凝集抑制实验结果。
图10：small c抗原多肽的凝集抑制实验结果。
图11：small e抗原多肽凝集抑制结果。
图12：E抗原多肽凝集抑制结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中使用的试剂来源：
C抗体，购自sanquin，货号8000451856。
small c抗体，购自sanquin，货号8000450371。
small e抗体，购自sanquin，货号8000451611。
E抗体，购自sanquin，货号8000258204。
实施例1抗原多肽的合成
1、抗原多肽序列如下：
C抗原的全长序列如SEQ ID NO：1所示，本实施例设计合成的C抗原多肽如SEQ IDNO：2所示。
small c抗原的全长序列如SEQ ID NO：3所示，本实施例设计合成的small c抗原多肽如SEQ ID NO：4所示。
E抗原的全长序列如SEQ ID NO：5所示，本实施例设计合成的E抗原多肽如SEQ IDNO：6所示。
small e抗原的全长序列如SEQ ID NO：7所示，本实施例设计合成的small e抗原多肽如SEQ ID NO：8所示。
C抗原的全长序列（SEQ ID NO：1）：MSSKYPRSVRRCLPLCALTLEAALILLFYFFTHYDASLEDQKGLVASYQVGQDLTVMAAI
GLGFLTSSFRRHSWSSVAFNLFMLALGVQWAILLDGFLSQFPSGKVVITLFSIRLATMSA
MSVLISAGAVLGKVNLAQLVVMVLVEVTALGTLRMVISNIFNTDYHMNLRHFYVFAAYFG
LTVAWCLPKPLPKGTEDNDQRATIPSLSAMLGALFLWMFWPSVNSPLLRSPIQRKNAMFN
TYYALAVSVVTAISGSSLAHPQRKISMTYVHSAVLAGGVAVGTSCHLIPSPWLAMVLGLV
AGLISIGGAKCLPVCCNRVLGIHHISVMHSIFSLLGLLGEITYIVLLVLHTVWNGNGMIG
FQVLLSIGELSLAIVIALTSGLLTGLLLNLKIWKAPHVAKYFDDQVFWKFPHLAVGF
C抗原多肽（SEQ ID NO：2）：
SQFPSGKVVITLFSIRLAT
small c抗原的全长序列（SEQ ID NO：3）：MSSKYPRSVRRCLPLWALTLEAALILLFYFFTHYDASLEDQKGLVASYQVGQDLTVMAAL
GLGFLTSNFRRHSWSSVAFNLFMLALGVQWAILLDGFLSQFPPGKVVITLFSIRLATMSA
MSVLISAGAVLGKVNLAQLVVMVLVEVTALGTLRMVISNIFNTDYHMNLRHFYVFAAYFG
LTVAWCLPKPLPKGTEDNDQRATIPSLSAMLGALFLWMFWPSVNSPLLRSPIQRKNAMFN
TYYALAVSVVTAISGSSLAHPQRKISMTYVHSAVLAGGVAVGTSCHLIPSPWLAMVLGLV
AGLISIGGAKCLPVCCNRVLGIHHISVMHSIFSLLGLLGEITYIVLLVLHTVWNGNGMIG
FQVLLSIGELSLAIVIALTSGLLTGLLLNLKIWKAPHVAKYFDDQVFWKFPHLAVGF
small c抗原多肽（SEQ ID NO：4）：
SQFPPGKVVITLFSIRLAT
E抗原的全长序列（SEQ ID NO：5）
MSSKYPRSVRRCLPLCALTLEAALILLFYFFTHYDASLEDQKGLVASYQVGQDLTVMAAI
GLGFLTSSFRRHSWSSVAFNLFMLALGVQWAILLDGFLSQFPSGKVVITLFSIRLATMSA
MSVLISAGAVLGKVNLAQLVVMVLVEVTALGTLRMVISNIFNTDYHMNLRHFYVFAAYFG
LTVAWCLPKPLPKGTEDNDQRATIPSLSAMLGALFLWMFWPSVNSPLLRSPIQRKNAMFN
TYYALAVSVVTAISGSSLAHPQRKISMTYVHSAVLAGGVAVGTSCHLIPSPWLAMVLGLV
AGLISIGGAKCLPVCCNRVLGIHHISVMHSIFSLLGLLGEITYIVLLVLHTVWNGNGMIG
FQVLLSIGELSLAIVIALTSGLLTGLLLNLKIWKAPHVAKYFDDQVFWKFPHLAVGF
E抗原多肽（SEQ ID NO：6）
NSPLLRSPIQRKN
small e抗原的全长序列（SEQ ID NO：7）
MSSKYPRSVRRCLPLCALTLEAALILLFYFFTHYDASLEDQKGLVASYQVGQDLTVMAAI
GLGFLTSSFRRHSWSSVAFNLFMLALGVQWAILLDGFLSQFPSGKVVITLFSIRLATMSA
MSVLISAGAVLGKVNLAQLVVMVLVEVTALGTLRMVISNIFNTDYHMNLRHFYVFAAYFG
LTVAWCLPKPLPKGTEDNDQRATIPSLSAMLGALFLWMFWPSVNSALLRSPIQRKNAMFN
TYYALAVSVVTAISGSSLAHPQRKISMTYVHSAVLAGGVAVGTSCHLIPSPWLAMVLGLV
AGLISIGGAKCLPVCCNRVLGIHHISVMHSIFSLLGLLGEITYIVLLVLHTVWNGNGMIG
FQVLLSIGELSLAIVIALTSGLLTGLLLNLKIWKAPHVAKYFDDQVFWKFPHLAVGF
small e抗原多肽（SEQ ID NO：8）
NSALLRSPIQRKN
2、抗原多肽合成步骤如下：
合成顺序：从C端到N端
1）树脂溶涨
将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DCM(15mL/g)，振荡30min。
2）接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Met-OH氨基酸，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min。用甲醇封闭。
3）脱保护
去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液(15mL/g)，5min，去掉再加20%哌啶DMF溶液(15mL/g)，15min。
4）检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
5）洗
DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。
6）缩合
保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量．反应30min。
7）检测
取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应。
8）洗
DMF(10mL/g)一次，DCM(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。
9）重复3）至6）步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
10）抽干，按照下列方法洗树脂。
DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，抽干10min。
11）从树脂上切割多肽
配制切割液（10/g）：TFA 95%；水1%；EDT 2%；TIS 2%；
切割时间：120min。
12）吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
3、分析提纯：
用高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）将粗品提纯。
1）C抗原多肽和small c抗原多肽
HPLC的操作条件如下：
检测峰面积
运行时间：20min；波长：220nm；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；色谱柱：Kromasil100-5C18，4.6mmX250mm，5μm；柱温：25℃；缓冲液A：0.1%TFA的乙腈；缓冲液B：0.1%TFA的水溶液。
流动相梯度见表1。
表1：HPLC流动相梯度
Figure 284412DEST_PATH_IMAGE001
其中，MS的操作条件如下：
离子源：ESI；雾化气（NEB）：12.00；气帘气（CUR）：6.00；喷雾电压（IS）：±4500；温度：0.00℃；运行时间：0.5-1min。
2）E抗原多肽及small e抗原多肽
HPLC参数如下：
运行时间：20min；色谱柱：Kromasil 100-5C18，4.6mmX250mm，5μm；流速：1.0mL/min；波长：220nm；温度：30℃；进样量：10µL；
流动相A：含0.1%TFA的乙腈，流动相B：含0.1%TFA的水溶液。
smalle抗原多肽检测的流动相梯度见表2。
表2：smalle抗原多肽检测的流动相梯度
Figure 723222DEST_PATH_IMAGE002
E抗原多肽检测的流动相梯度见表3。
表3：E抗原多肽检测的流动相梯度
Figure 449869DEST_PATH_IMAGE003
small e抗原多肽多肽检测的质谱参数如下：
离子源：ESI；雾化气Nebulizer gas：12.00，气帘气curtain gas：6.00；离子喷雾电压：±4500V；时间：0.5-1min；温度：0.00℃。
E抗原多肽检测的质谱参数如下：
离子源：ESI；毛细管电压capillary(KV)：±(2500~3000)；脱溶剂气流量Desolvation(L/hr)：800；脱溶剂气温度DesoLvation Temp:450℃；锥孔电压Cone（V）：30~50；运行时间：1min。
4、试验结果
分离纯化C抗原多肽结果如图1-2和表4所示。
表4：HPLC分离纯化C抗原多肽
Figure 348555DEST_PATH_IMAGE004
分离纯化small c抗原多肽结果如图3-4和表5所示。
表5：HPLC分离纯化small c抗原多肽
Figure 793443DEST_PATH_IMAGE005
分离纯化small e抗原多肽结果如图5-6和表6所示。
表6 HPLC分离纯化small e抗原多肽
Figure 537408DEST_PATH_IMAGE006
分离纯化E抗原多肽结果如图7-8和表7所示。
表7：HPLC分离纯化E抗原多肽
Figure 384141DEST_PATH_IMAGE007
实施例2 C抗原多肽的抗原性验证
采用凝集抑制实验验证C抗原多肽的抗原性，步骤如下：
将C抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取6管25μL标化的C抗体，分别加入C抗原多肽（如SEQ ID NO：2所示）、E抗原多肽（如SEQ ID NO：6所示）、small c抗原多肽（如SEQ ID NO：4所示）、D1多肽（如SEQ ID NO：9所示）、D2多肽（如SEQ ID NO：10所示）和10μL生理盐水，室温放置15min。取25μL上述混合液和相应标准试剂红细胞50μL加入到抗人球蛋白卡中，离心10min，观察凝集强度。
结果如图9所示，只有C抗原多肽与C抗体反应，其他多肽与C抗体均未反应，说明C多肽具有良好的抗原性，且无交叉反应。
实施例3 small c抗原多肽的抗原性验证
采用凝集抑制实验验证small c抗原多肽的抗原性，步骤如下：
将small c抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取5管25μL标化的smallc抗体，分别加入E抗原多肽（如SEQ ID NO：6所示）、small c抗原多肽（如SEQ ID NO：4所示）、D1多肽（如SEQ ID NO：9所示）、D2多肽（如SEQ ID NO：10所示）和10μL生理盐水，室温放置15min。取25μL上述混合液和相应标准试剂红细胞50μL加入到抗人球蛋白卡中，离心10min，观察凝集强度。
结果如图10所示，只有small c多肽与small c抗体反应，其他多肽与small c抗体均未反应，说明small c多肽具有良好的抗原性，且无交叉反应。
实施例4 small e抗原多肽效果验证
采用凝集抑制试验检测smalle抗原多肽的抗原性。步骤如下：
将small e抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25μL标化的smalle抗体，分别加入smalle抗原多肽和10μL生理盐水，室温放置15min。取25μL上述混合液和相应标准试剂红细胞50μL加入到抗人球蛋白卡中，离心10min，观察凝集强度。
如图11所示，smalle抗原多肽与small e抗体反应，说明smalle抗原多肽具有良好的抗原性。
实施例5 E抗原多肽效果验证
采用凝集抑制试验检测E抗原多肽的抗原性。步骤如下：
将E抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取4管25μL标化的E抗体，分别加入E抗原多肽、smallc抗原多肽（如SEQ ID NO：4所示）、D1（如SEQ ID NO：9所示）多肽和10μL生理盐水，室温放置15min。取25μL上述混合液和相应标准试剂红细胞50μL加入到抗人球蛋白卡中，离心10min，观察凝集强度。
如图12所示，E抗体多肽与E抗体反应，说明E抗体多肽具有良好的抗原性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 北京大有天弘科技有限公司
<120> 一种血型不规则抗体的检测方法及其应用
<130> P0102021090700Y
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 417
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 1
Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Cys
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr
20 25 30
His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr
35 40 45
Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Ile Gly Leu Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Ser Ser Phe Arg Arg His Ser Trp Ser Ser Val Ala Phe Asn
65 70 75 80
Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly
85 90 95
Phe Leu Ser Gln Phe Pro Ser Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser
100 105 110
Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Met Ser Val Leu Ile Ser Ala Gly
115 120 125
Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu
130 135 140
Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Thr Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile
145 150 155 160
Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Leu Arg His Phe Tyr Val Phe Ala
165 170 175
Ala Tyr Phe Gly Leu Thr Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro
180 185 190
Lys Gly Thr Glu Asp Asn Asp Gln Arg Ala Thr Ile Pro Ser Leu Ser
195 200 205
Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Val Asn
210 215 220
Ser Pro Leu Leu Arg Ser Pro Ile Gln Arg Lys Asn Ala Met Phe Asn
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Ala Leu Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser
245 250 255
Ser Leu Ala His Pro Gln Arg Lys Ile Ser Met Thr Tyr Val His Ser
260 265 270
Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile
275 280 285
Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile
290 295 300
Ser Ile Gly Gly Ala Lys Cys Leu Pro Val Cys Cys Asn Arg Val Leu
305 310 315 320
Gly Ile His His Ile Ser Val Met His Ser Ile Phe Ser Leu Leu Gly
325 330 335
Leu Leu Gly Glu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Leu Val Leu His Thr Val
340 345 350
Trp Asn Gly Asn Gly Met Ile Gly Phe Gln Val Leu Leu Ser Ile Gly
355 360 365
Glu Leu Ser Leu Ala Ile Val Ile Ala Leu Thr Ser Gly Leu Leu Thr
370 375 380
Gly Leu Leu Leu Asn Leu Lys Ile Trp Lys Ala Pro His Val Ala Lys
385 390 395 400
Tyr Phe Asp Asp Gln Val Phe Trp Lys Phe Pro His Leu Ala Val Gly
405 410 415
Phe
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Gln Phe Pro Ser Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser Ile Arg
1 5 10 15
Leu Ala Thr
<210> 3
<211> 417
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 3
Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Trp
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr
20 25 30
His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr
35 40 45
Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Leu Gly Leu Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Ser Asn Phe Arg Arg His Ser Trp Ser Ser Val Ala Phe Asn
65 70 75 80
Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly
85 90 95
Phe Leu Ser Gln Phe Pro Pro Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser
100 105 110
Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Met Ser Val Leu Ile Ser Ala Gly
115 120 125
Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu
130 135 140
Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Thr Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile
145 150 155 160
Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Leu Arg His Phe Tyr Val Phe Ala
165 170 175
Ala Tyr Phe Gly Leu Thr Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro
180 185 190
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195 200 205
Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Val Asn
210 215 220
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225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Ala Leu Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser
245 250 255
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260 265 270
Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile
275 280 285
Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile
290 295 300
Ser Ile Gly Gly Ala Lys Cys Leu Pro Val Cys Cys Asn Arg Val Leu
305 310 315 320
Gly Ile His His Ile Ser Val Met His Ser Ile Phe Ser Leu Leu Gly
325 330 335
Leu Leu Gly Glu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Leu Val Leu His Thr Val
340 345 350
Trp Asn Gly Asn Gly Met Ile Gly Phe Gln Val Leu Leu Ser Ile Gly
355 360 365
Glu Leu Ser Leu Ala Ile Val Ile Ala Leu Thr Ser Gly Leu Leu Thr
370 375 380
Gly Leu Leu Leu Asn Leu Lys Ile Trp Lys Ala Pro His Val Ala Lys
385 390 395 400
Tyr Phe Asp Asp Gln Val Phe Trp Lys Phe Pro His Leu Ala Val Gly
405 410 415
Phe
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Gln Phe Pro Pro Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser Ile Arg
1 5 10 15
Leu Ala Thr
<210> 5
<211> 417
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 5
Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Cys
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr
20 25 30
His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr
35 40 45
Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Ile Gly Leu Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Ser Ser Phe Arg Arg His Ser Trp Ser Ser Val Ala Phe Asn
65 70 75 80
Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly
85 90 95
Phe Leu Ser Gln Phe Pro Ser Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser
100 105 110
Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Met Ser Val Leu Ile Ser Ala Gly
115 120 125
Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu
130 135 140
Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Thr Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile
145 150 155 160
Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Leu Arg His Phe Tyr Val Phe Ala
165 170 175
Ala Tyr Phe Gly Leu Thr Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro
180 185 190
Lys Gly Thr Glu Asp Asn Asp Gln Arg Ala Thr Ile Pro Ser Leu Ser
195 200 205
Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Val Asn
210 215 220
Ser Pro Leu Leu Arg Ser Pro Ile Gln Arg Lys Asn Ala Met Phe Asn
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Ala Leu Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser
245 250 255
Ser Leu Ala His Pro Gln Arg Lys Ile Ser Met Thr Tyr Val His Ser
260 265 270
Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile
275 280 285
Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile
290 295 300
Ser Ile Gly Gly Ala Lys Cys Leu Pro Val Cys Cys Asn Arg Val Leu
305 310 315 320
Gly Ile His His Ile Ser Val Met His Ser Ile Phe Ser Leu Leu Gly
325 330 335
Leu Leu Gly Glu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Leu Val Leu His Thr Val
340 345 350
Trp Asn Gly Asn Gly Met Ile Gly Phe Gln Val Leu Leu Ser Ile Gly
355 360 365
Glu Leu Ser Leu Ala Ile Val Ile Ala Leu Thr Ser Gly Leu Leu Thr
370 375 380
Gly Leu Leu Leu Asn Leu Lys Ile Trp Lys Ala Pro His Val Ala Lys
385 390 395 400
Tyr Phe Asp Asp Gln Val Phe Trp Lys Phe Pro His Leu Ala Val Gly
405 410 415
Phe
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asn Ser Pro Leu Leu Arg Ser Pro Ile Gln Arg Lys Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 417
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 7
Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Cys
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr
20 25 30
His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr
35 40 45
Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Ile Gly Leu Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Ser Ser Phe Arg Arg His Ser Trp Ser Ser Val Ala Phe Asn
65 70 75 80
Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly
85 90 95
Phe Leu Ser Gln Phe Pro Ser Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser
100 105 110
Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Met Ser Val Leu Ile Ser Ala Gly
115 120 125
Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu
130 135 140
Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Thr Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile
145 150 155 160
Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Leu Arg His Phe Tyr Val Phe Ala
165 170 175
Ala Tyr Phe Gly Leu Thr Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro
180 185 190
Lys Gly Thr Glu Asp Asn Asp Gln Arg Ala Thr Ile Pro Ser Leu Ser
195 200 205
Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Val Asn
210 215 220
Ser Ala Leu Leu Arg Ser Pro Ile Gln Arg Lys Asn Ala Met Phe Asn
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Ala Leu Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser
245 250 255
Ser Leu Ala His Pro Gln Arg Lys Ile Ser Met Thr Tyr Val His Ser
260 265 270
Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile
275 280 285
Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile
290 295 300
Ser Ile Gly Gly Ala Lys Cys Leu Pro Val Cys Cys Asn Arg Val Leu
305 310 315 320
Gly Ile His His Ile Ser Val Met His Ser Ile Phe Ser Leu Leu Gly
325 330 335
Leu Leu Gly Glu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Leu Val Leu His Thr Val
340 345 350
Trp Asn Gly Asn Gly Met Ile Gly Phe Gln Val Leu Leu Ser Ile Gly
355 360 365
Glu Leu Ser Leu Ala Ile Val Ile Ala Leu Thr Ser Gly Leu Leu Thr
370 375 380
Gly Leu Leu Leu Asn Leu Lys Ile Trp Lys Ala Pro His Val Ala Lys
385 390 395 400
Tyr Phe Asp Asp Gln Val Phe Trp Lys Phe Pro His Leu Ala Val Gly
405 410 415
Phe
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asn Ser Ala Leu Leu Arg Ser Pro Ile Gln Arg Lys Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Pro Ser Gln Gly Tyr Val Ile Leu Leu Asp Glu Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Thr Met Leu Asn Ala His Asp Phe Ser Glu Cys
1 5 10

Claims (10)

1.一种血型不规则抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括将待测物与抗原多肽混合，所述的抗原多肽为C抗原多肽、small c抗原多肽、E抗原多肽和/或small e抗原多肽；
所述的C抗原多肽包含与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
所述的small c抗原多肽包含与SEQ ID NO：4具有80%以上的同源性或者包含SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列；
所述的E抗原多肽包含与SEQ ID NO：6具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
所述的small e抗原多肽包含与SEQ ID NO：8具有80%以上的同源性或者包含SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的血型不规则抗体为C抗体、small c抗体、E抗体和/或small e抗体。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的待测物为全血、血清、血浆或待测血型不规则抗体。
4.根据权利要求1-3任一所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法检测血型不规则抗体的有无或含量。
5.根据权利要求1-3任一所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法选自沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定、免疫印迹法或快速测定法，所述的标记免疫测定选自酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定，所述的快速测定法选自快速斑点免疫结合试验、液相芯片法。
6.一种抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽为C抗原多肽、small c抗原多肽、E抗原多肽和/或small e抗原多肽；
所述的C抗原多肽包含与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
所述的small c抗原多肽包含与SEQ ID NO：4具有80%以上的同源性或者包含SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列；
所述的E抗原多肽包含与SEQ ID NO：6具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
所述的small e抗原多肽包含与SEQ ID NO：8具有80%以上的同源性或者包含SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列。
7.一种编码权利要求6所述抗原多肽的核酸。
8.一种包含权利要求7所述核酸的载体。
9.一种血型不规则抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包含权利要求6所述的抗原多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包含偶联抗原多肽的微球、探针分子、报告分子、固相载体、补体、酶标记的抗体或抗补体、显色液、磁珠或荧光物质。
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