CN114137231B

CN114137231B - 一种血型不规则抗体的检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114137231B
Application number: CN202210110784.8A
Authority: CN
Inventors: 朱思原
Original assignee: Beijing Dayou Tianhong Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Dayou Tianhong Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-29
Filing date: 2022-01-29
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2042-01-29
Also published as: CN114137231A

Abstract

本发明提供了一种血型不规则抗体的检测方法，所述的检测方法包括将待测物与血型抗体结合蛋白混合。本发明所述的血型抗体结合蛋白具有很好的抗原活性，可以用于血型不规则抗体的检测。

Description

一种血型不规则抗体的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及不规则抗体检测技术领域，具体涉及一种血型不规则抗体的检测试剂盒及其应用。

背景技术

红细胞血型是经典的人类遗传标记，在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域均占据重要地位。目前已知红细胞有43个血型系统，Lutheran、Kell血型是典型的血型系统。输血过程中，抗K、抗small k或抗Lu^a都会引起溶血性输血反应。因此，对Lutheran、Kell血型进行检测十分重要。

发明内容

本申请发明人经过长期对Kell抗原和Lutheran抗原具体序列进行钻研，从全长序列中选取特定片段，且该片段具有很强的抗原性，可以用于不规则抗体的检测，解决了红细胞保存时间短，结果不易判读等缺陷。同时，本申请提供的使用血型抗体结合蛋白进行Kell血型和Lutheran血型不规则抗体的检测操作简便、成本低且结果精确。

本发明的第一方面，提供了一种血型抗体结合蛋白，所述的血型抗体结合蛋白为K血型抗体结合蛋白、small k血型抗体结合蛋白和/或Lu^a血型抗体结合蛋白。

所述的K血型抗体结合蛋白为全长K抗原氨基酸序列中的一部分。优选的，其长度至少665aa。优选的，其长度小于732aa。

所述的K血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的K血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

所述的small k血型抗体结合蛋白为全长small k抗原氨基酸序列中的一部分。优选的，其长度至少665aa。优选的，其长度小于732aa。

所述的small k血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：4具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的small k血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

所述的Lu^a血型抗体结合蛋白为全长Lu^a抗原氨基酸序列中的一部分。优选的，其长度至少547aa。优选的，其长度小于628aa。

所述的Lu^a血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：6具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的Lu^a血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明的第二方面，提供了一种血型抗体结合蛋白的制备方法。

优选的，所述的制备方法包括将包含编码血型抗体结合蛋白的核酸的载体导入细胞，诱导其表达。

优选的，所述的血型抗体结合蛋白为上述的K血型抗体结合蛋白、small k血型抗体结合蛋白和/或Lu^a血型抗体结合蛋白。

本发明的第三方面，提供了一种编码上述血型抗体结合蛋白的核酸。

本发明的第四方面，提供了一种包含上述核酸的载体。

本发明的第五方面，提供了一种包含上述的血型抗体结合蛋白、上述的核酸或上述的载体的细胞。

本发明的第六方面，提供了一种上述的血型抗体结合蛋白、上述的核酸、上述的载体或上述的细胞在血型不规则抗体的检测中的应用。

本发明的第七方面，提供了一种血型不规则抗体的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含上述的血型抗体结合蛋白、上述的核酸、上述的载体或上述的细胞。

优选的，所述的检测试剂盒还包含偶联血型抗体结合蛋白的微球、探针分子、报告分子、固相载体、补体、酶标记的抗体或抗补体、显色液、磁珠和/或荧光物质。

所述的检测试剂盒选自免疫磁珠检测试剂盒、凝集检测试剂盒、液相芯片检测试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫检测试剂盒，所述的试剂盒优选为液相芯片检测试剂盒。

所述的检测试剂盒还包含偶联血型抗体结合蛋白的微球、探针分子和/或报告分子，其中，所述的微球为聚苯乙烯微球或磁性微球，所述的探针分子是可以和微球表面的羧基等基团偶联并能与被检测物特异性结合的生物分子，所述的报告分子可以是一种能与被检测物特异性结合的荧光染料，也可以是标记有荧光的、能与被检测物结合的其他物质(如抗体、抗原、核酸等)。

所述的检测试剂盒还可以包含固相载体、补体、酶标记的抗体或抗补体和/或显色液，固相载体材质可以为聚苯乙烯、聚氯乙烯，优选为聚苯乙烯，进一步优选的，本发明所述的固相载体为微量滴定板或微孔板，包括8孔板、48孔板或96孔板；优选的，所述的补体能够与抗原抗体复合物反应，并且不与单独的抗原和抗体反应，所述的抗体可以与待测抗体结合。

所述的检测试剂盒还可以包含磁珠。

所述的检测试剂盒还可以包含荧光物质，进一步所述的荧光物质包括酶、接受体或抗体。

所述的检测试剂盒还包括稀释液、清洗溶液、缓冲液、底物和/或终止溶液。

所述的检测试剂盒还包括阴性对照和/或阳性对照。

本发明的第八方面，提供了一种血型不规则抗体的检测方法，所述的检测方法包括将待测物与上述的血型抗体结合蛋白混合。

优选的，所述的血型不规则抗体为K抗体、small k抗体和/或Lu^a抗体。

优选的，所述的待测物为全血、血清、血浆或待测血型不规则抗体。

优选的，所述的血型抗体结合蛋白通过将包含编码血型抗体结合蛋白的核酸的载体导入细胞，诱导其表达获得。

优选的，所述的检测方法检测血型不规则抗体的有无或含量。

优选的，所述的检测方法包括但不限于微柱凝胶法、沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定、免疫印迹法或快速测定法，优选的，所述的标记免疫测定选自酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定，所述的快速测定法选自快速斑点免疫结合试验、液相芯片法。

本发明的第九方面，提供了一种上述的血型抗体结合蛋白、核酸、载体、细胞或检测试剂盒在诊断和/或治疗寄生虫病、免疫性疾病、肿瘤或炎性疾病中的应用。

本发明中的血型抗体结合蛋白，无论后续采用何种免疫学方法进行抗体鉴定均需使用。其中，所述的免疫学方法包括但不限于微柱凝胶法、沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)、免疫印迹法、快速测定法(如快速斑点免疫结合试验、液相芯片法等)。

本发明所述的“寄生虫病”包括但不限于蛔虫病、鞭虫病、蛲虫病、阿米巴病、钩虫病、姜片虫病、弓形虫病、疟疾病或阴道毛滴虫病等，其中疟疾病中包括间日疟原虫。

本发明所述的“免疫性疾病”包括但不限于溶血性输血反应、新生儿溶血症、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、重症肌无力、多发性硬化、荨麻疹、牛皮癣、皮肌炎、干燥综合症、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“炎性疾病”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症、增生性炎症、特异性炎症等，包括但不限于重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析、过敏性休克、哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎、胰腺炎、肠炎、血管炎、不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂变态反应等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、皮肤癌、脑癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。

本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。

本发明所述的“包含”在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同源性，例如“与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性”包括比SEQ ID NO：2更短的序列或者更长的序列或者一个或多个位点突变的序列，其与SEQ ID NO：2具有80%以上同一性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：K血型抗体结合蛋白纯化结果图。

图2：small k血型抗体结合蛋白纯化结果图。

图3：Lu^a血型抗体结合蛋白纯化结果图。

图4：K血型抗体结合蛋白凝集抑制实验结果。

图5：small k血型抗体结合蛋白凝集抑制实验结果。

图6：Lu^a血型抗体结合蛋白凝集抑制实验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例中所用试剂来源：

K抗体购自sanquin，批号：8000450634；

small k抗体购自sanquin，批号：8000451443；

Lu^a抗体购买自CE-IMMUNDIAGNOSTIKA GmbH，批号：MLuaM087-1。

实施例1 表达与纯化

一、序列设计

K抗原的全长序列如SEQ ID NO：1所示，本实施例设计合成的K血型抗体结合蛋白如SEQ ID NO：2所示。

small k抗原的全长序列如SEQ ID NO：3所示，本实施例设计合成的small k血型抗体结合蛋白如SEQ ID NO：4所示。

Lu^a抗原的全长序列如SEQ ID NO：5所示，本实施例设计合成的Lu^a血型抗体结合蛋白如SEQ ID NO：6所示。

K抗原的全长序列（SEQ ID NO：1）：

MEGGDQSEEEPRERSQAGGMGTLWSQESTPEERLPVEGSRPWAVARRVLTAILILGLLLCFSVLLFYNFQNCGPRPCETSVCLDLRDHYLASGNTSVAPCTDFFSFACGRAKETNNSFQELATKNKNRLRRILEVQNSWHPGSGEEKAFQFYNSCMDTLAIEAAGTGPLRQVIEELGGWRISGKWTSLNFNRMLRLLMSQYGHFPFFRAYLGPHPASPHTPVIQIDQPEFDVPLKQDQEQKIYAQIFREYLTYLNQLGTLLGGDPSKVQEHSSLSISITSRLFQFLRPLEQRRAQGKLFQMVTIDQLKEMAPAIDWLSCLQATFTPMSLSPSQSLVVHDVEYLKNMSQLVEEMLLKQRDFLQSHMILGLVVTLSPALDSQFQEARRKLSQKLRELTEQPPMPARPRWMKCVEETGTFFEPTLAALFVREAFGPSTRSAAMKLFTAIRDALITRLRNLPWMNEETQNMAQDKVAQLQVEMGASEWALKPELARQEYNDIQLGSSFLQSVLSCVRSLRARIVQSFLQPHPQHRWKVSPWDVNAYYSVSDHVVVFPAGLLQPPFFHPGYPRAVNFGAAGSIMAHELLHIFYQLLLPGGCLACDNHALQEAHLCLKRHYAAFPLPSRTSFNDSLTFLENAADVGGLAIALQAYSKRLLRHHGETVLPSLDLSPQQIFFRSYAQVMCRKPSPQDSHDTHSPPHLRVHGPLSSTPAFARYFRCARGALLNPSSRCQLW

K血型抗体结合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：2）：

NFQNCGPRPCETSVCLDLRDHYLASGNTSVAPCTDFFSFACGRAKETNNSFQELATKNKNRLRRILEVQNSWHPGSGEEKAFQFYNSCMDTLAIEAAGTGPLRQVIEELGGWRISGKWTSLNFNRMLRLLMSQYGHFPFFRAYLGPHPASPHTPVIQIDQPEFDVPLKQDQEQKIYAQIFREYLTYLNQLGTLLGGDPSKVQEHSSLSISITSRLFQFLRPLEQRRAQGKLFQMVTIDQLKEMAPAIDWLSCLQATFTPMSLSPSQSLVVHDVEYLKNMSQLVEEMLLKQRDFLQSHMILGLVVTLSPALDSQFQEARRKLSQKLRELTEQPPMPARPRWMKCVEETGTFFEPTLAALFVREAFGPSTRSAAMKLFTAIRDALITRLRNLPWMNEETQNMAQDKVAQLQVEMGASEWALKPELARQEYNDIQLGSSFLQSVLSCVRSLRARIVQSFLQPHPQHRWKVSPWDVNAYYSVSDHVVVFPAGLLQPPFFHPGYPRAVNFGAAGSIMAHELLHIFYQLLLPGGCLACDNHALQEAHLCLKRHYAAFPLPSRTSFNDSLTFLENAADVGGLAIALQAYSKRLLRHHGETVLPSLDLSPQQIFFRSYAQVMCRKPSPQDSHDTHSPPHLRVHGPLSSTPAFARYFRCARGALLNPSSRCQLW

small k抗原的全长序列（SEQ ID NO：3）：

meggdqseeeprersqaggmgtlwsqestpeerlpvegsrpwavarrvltaililglllcfsvllfynfqncgprpcetsvcldlrdhylasgntsvapctdffsfacgraketnnsfqelatknknrlrrilevqnswhpgsgeekafqfynscmdtlaieaagtgplrqvieelggwrisgkwtslnfnrtlrllmsqyghfpffraylgphpasphtpviqidqpefdvplkqdqeqkiyaqifreyltylnqlgtllggdpskvqehsslsisitsrlfqflrpleqrraqgklfqmvtidqlkemapaidwlsclqatftpmslspsqslvvhdveylknmsqlveemllkqrdflqshmilglvvtlspaldsqfqearrklsqklrelteqppmparprwmkcveetgtffeptlaalfvreafgpstrsaamklftairdalitrlrnlpwmneetqnmaqdkvaqlqvemgasewalkpelarqeyndiqlgssflqsvlscvrslrarivqsflqphpqhrwkvspwdvnayysvsdhvvvfpagllqppffhpgypravnfgaagsimahellhifyqlllpggclacdnhalqeahlclkrhyaafplpsrtsfndsltflenaadvgglaialqayskrllrhhgetvlpsldlspqqiffrsyaqvmcrkpspqdshdthspphlrvhgplsstpafaryfrcargallnpssrcqlw

small k血型抗体结合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：4）：

NFQNCGPRPCETSVCLDLRDHYLASGNTSVAPCTDFFSFACGRAKETNNSFQELATKNKNRLRRILEVQNSWHPGSGEEKAFQFYNSCMDTLAIEAAGTGPLRQVIEELGGWRISGKWTSLNFNRTLRLLMSQYGHFPFFRAYLGPHPASPHTPVIQIDQPEFDVPLKQDQEQKIYAQIFREYLTYLNQLGTLLGGDPSKVQEHSSLSISITSRLFQFLRPLEQRRAQGKLFQMVTIDQLKEMAPAIDWLSCLQATFTPMSLSPSQSLVVHDVEYLKNMSQLVEEMLLKQRDFLQSHMILGLVVTLSPALDSQFQEARRKLSQKLRELTEQPPMPARPRWMKCVEETGTFFEPTLAALFVREAFGPSTRSAAMKLFTAIRDALITRLRNLPWMNEETQNMAQDKVAQLQVEMGASEWALKPELARQEYNDIQLGSSFLQSVLSCVRSLRARIVQSFLQPHPQHRWKVSPWDVNAYYSVSDHVVVFPAGLLQPPFFHPGYPRAVNFGAAGSIMAHELLHIFYQLLLPGGCLACDNHALQEAHLCLKRHYAAFPLPSRTSFNDSLTFLENAADVGGLAIALQAYSKRLLRHHGETVLPSLDLSPQQIFFRSYAQVMCRKPSPQDSHDTHSPPHLRVHGPLSSTPAFARYFRCARGALLNPSSRCQLW

Lu^a抗原全长序列（SEQ ID NO：5）：

MEPPDAPAQARGAPRLLLLAVLLAAHPDAQAEVRLSVPPLVEVMRGKSVILDCTPTGTHDHYMLEWFLTDRSGARPHLASAEMQGSELQVTMHDTRGRSPPYQLDSQGRLVLAEAQVGDERDYVCVVRAGAAGTAEATARLNVFAKPEATEVSPNKGTLSVMEDSAQEIATCNSRNGNPAPKITWYRNGQRLEVPVEMNPEGYMTSRTVREASGLLSLTSTLYLRLRKDDRDASFHCAAHYSLPEGRHGRLDSPTFHLTLHYPTEHVQFWVGSPSTPAGWVREGDTVQLLCRGDGSPSPEYTLFRLQDEQEEVLNVNLEGNLTLEGVTRGQSGTYGCRVEDYDAADDVQLSKTLELRVAYLDPLELSEGKVLSLPLNSSAVVNCSVHGLPTPALRWTKDSTPLGDGPMLSLSSITFDSNGTYVCEASLPTVPVLSRTQNFTLLVQGSPELKTAEIEPKADGSWREGDEVTLICSARGHPDPKLSWSQLGGSPAEPIPGRQGWVSSSLTLKVTSALSRDGISCEASNPHGNKRHVFHFGTVSPQTSQAGVAVMAVAVSVGLLLLVVAVFYCVRRKGGPCCRQRREKGAPPPGEPGLSHSGSEQPEQTGLLMGGASGGARGGSGGFGDEC

Lu^a血型抗体结合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：6）：

MEPPDAPAQARGAPRLLLLAVLLAAHPDAQAEVRLSVPPLVEVMRGKSVILDCTPTGTHDHYMLEWFLTDRSGARPHLASAEMQGSELQVTMHDTRGRSPPYQLDSQGRLVLAEAQVGDERDYVCVVRAGAAGTAEATARLNVFAKPEATEVSPNKGTLSVMEDSAQEIATCNSRNGNPAPKITWYRNGQRLEVPVEMNPEGYMTSRTVREASGLLSLTSTLYLRLRKDDRDASFHCAAHYSLPEGRHGRLDSPTFHLTLHYPTEHVQFWVGSPSTPAGWVREGDTVQLLCRGDGSPSPEYTLFRLQDEQEEVLNVNLEGNLTLEGVTRGQSGTYGCRVEDYDAADDVQLSKTLELRVAYLDPLELSEGKVLSLPLNSSAVVNCSVHGLPTPALRWTKDSTPLGDGPMLSLSSITFDSNGTYVCEASLPTVPVLSRTQNFTLLVQGSPELKTAEIEPKADGSWREGDEVTLICSARGHPDPKLSWSQLGGSPAEPIPGRQGWVSSSLTLKVTSALSRDGISCEASNPHGNKRHVFHFGTVSPQTSQA

二、表达合成血型抗体结合蛋白

1、表达载体构建

合成目的基因序列；将目的基因插入载体骨架；测序得到含有正确序列的质粒；放大生产传递下游表达。

2、细胞培养与蛋白表达

使用293无血清CD培养基（货号SMM 293-TI）传代培养HEK293细胞，将包含目的基因的质粒与转染试剂TF1混合后加入HEK293细胞中，转染后第1，3和5天分别添加293无血清加料液（货号: M293-SUPI-100）。细胞培养7天后进行蛋白纯化。

3、蛋白纯化

1）培养料液离心后，收集细胞，破碎后离心去除细胞碎片，取上清。

2）金属螯合亲和层析纯化：将Ni-离子亲和层析柱使用上样缓冲液平衡后将步骤1）获得的上清上样至层析柱，待杂蛋白流穿后使用咪唑梯度洗脱目标蛋白。将纯化后的目标蛋白进行换液后标定蛋白浓度并进行纯度检测。

4、质量检测

获取的蛋白样本采取SDS-PAGE和UV OD280的方法对蛋白表达过程进行监控以及对产品进行浓度和纯度的检测。

结果如图1-3所示，图1结果显示采用上述方法获得了纯化的K血型抗体结合蛋白，图2显示获得了纯化的small k血型抗体结合蛋白，图3显示获得了纯化的Lu^a血型抗体结合蛋白。

实施例2 K血型抗体结合蛋白的抗原性及交叉反应验证

采用凝集抑制实验验证K血型抗体结合蛋白的抗原性，步骤如下：

将K抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25μL标化的K抗体，分别加入3μL实施例1制备的K血型抗体结合蛋白和3μL生理盐水，室温放置15min。取25μL上述室温放置15min后的混合液和相应标准试剂红细胞50μL加入到抗人球蛋白卡中，离心10min，观察凝集强度。

结果如图4所示，K血型抗体结合蛋白具有抗原性，可以用于K血型不规则抗体的检测。

实施例3 small k血型抗体结合蛋白的抗原性及交叉反应验证

采用凝集抑制实验验证small k血型抗体结合蛋白的抗原性，步骤如下：

将small k抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25μL标化的smallk抗体，分别加入3μL实施例1制备的small k血型抗体结合蛋白和3μL生理盐水，室温放置15min。取25μL上述室温放置15min后的混合液和相应标准试剂红细胞50μL加入到抗人球蛋白卡中，离心10min，观察凝集强度。

结果如图5所示，small k血型抗体结合蛋白具有抗原性，可以用于small k血型不规则抗体的检测。

实施例4 Lu^a血型抗体结合蛋白的抗原性及交叉反应验证

采用凝集抑制实验验证Lu^a血型抗体结合蛋白的抗原性，步骤如下：

将Lu^a抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25μL标化的Lu^a抗体，分别加入3μL实施例1制备的Lu^a血型抗体结合蛋白和3μL生理盐水，室温放置15min。取25μL上述室温放置15min后的混合液和相应标准试剂红细胞50μL加入到抗人球蛋白卡中，孵育15min，离心10min，观察凝集强度。

结果如图6所示，Lu^a血型抗体结合蛋白具有抗原性，可以用于Lu^a血型不规则抗体的检测。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 北京大有天弘科技有限公司

<120> 一种血型不规则抗体的检测试剂盒及其应用

<130> 1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 732

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 1

Met Glu Gly Gly Asp Gln Ser Glu Glu Glu Pro Arg Glu Arg Ser Gln

1 5 10 15

Ala Gly Gly Met Gly Thr Leu Trp Ser Gln Glu Ser Thr Pro Glu Glu

20 25 30

Arg Leu Pro Val Glu Gly Ser Arg Pro Trp Ala Val Ala Arg Arg Val

35 40 45

Leu Thr Ala Ile Leu Ile Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Ser Val Leu

50 55 60

Leu Phe Tyr Asn Phe Gln Asn Cys Gly Pro Arg Pro Cys Glu Thr Ser

65 70 75 80

Val Cys Leu Asp Leu Arg Asp His Tyr Leu Ala Ser Gly Asn Thr Ser

85 90 95

Val Ala Pro Cys Thr Asp Phe Phe Ser Phe Ala Cys Gly Arg Ala Lys

100 105 110

Glu Thr Asn Asn Ser Phe Gln Glu Leu Ala Thr Lys Asn Lys Asn Arg

115 120 125

Leu Arg Arg Ile Leu Glu Val Gln Asn Ser Trp His Pro Gly Ser Gly

130 135 140

Glu Glu Lys Ala Phe Gln Phe Tyr Asn Ser Cys Met Asp Thr Leu Ala

145 150 155 160

Ile Glu Ala Ala Gly Thr Gly Pro Leu Arg Gln Val Ile Glu Glu Leu

165 170 175

Gly Gly Trp Arg Ile Ser Gly Lys Trp Thr Ser Leu Asn Phe Asn Arg

180 185 190

Met Leu Arg Leu Leu Met Ser Gln Tyr Gly His Phe Pro Phe Phe Arg

195 200 205

Ala Tyr Leu Gly Pro His Pro Ala Ser Pro His Thr Pro Val Ile Gln

210 215 220

Ile Asp Gln Pro Glu Phe Asp Val Pro Leu Lys Gln Asp Gln Glu Gln

225 230 235 240

Lys Ile Tyr Ala Gln Ile Phe Arg Glu Tyr Leu Thr Tyr Leu Asn Gln

245 250 255

Leu Gly Thr Leu Leu Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Gln Glu His Ser

260 265 270

Ser Leu Ser Ile Ser Ile Thr Ser Arg Leu Phe Gln Phe Leu Arg Pro

275 280 285

Leu Glu Gln Arg Arg Ala Gln Gly Lys Leu Phe Gln Met Val Thr Ile

290 295 300

Asp Gln Leu Lys Glu Met Ala Pro Ala Ile Asp Trp Leu Ser Cys Leu

305 310 315 320

Gln Ala Thr Phe Thr Pro Met Ser Leu Ser Pro Ser Gln Ser Leu Val

325 330 335

Val His Asp Val Glu Tyr Leu Lys Asn Met Ser Gln Leu Val Glu Glu

340 345 350

Met Leu Leu Lys Gln Arg Asp Phe Leu Gln Ser His Met Ile Leu Gly

355 360 365

Leu Val Val Thr Leu Ser Pro Ala Leu Asp Ser Gln Phe Gln Glu Ala

370 375 380

Arg Arg Lys Leu Ser Gln Lys Leu Arg Glu Leu Thr Glu Gln Pro Pro

385 390 395 400

Met Pro Ala Arg Pro Arg Trp Met Lys Cys Val Glu Glu Thr Gly Thr

405 410 415

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Ser Gln Ala

545

Claims

1.一种血型不规则抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括将待测物与血型抗体结合蛋白混合，所述的血型抗体结合蛋白为K血型抗体结合蛋白、small k血型抗体结合蛋白和/或Lu^a血型抗体结合蛋白，所述的K血型抗体结合蛋白如SEQ ID NO：2所示，所述的small k血型抗体结合蛋白如SEQ ID NO：4所示，所述的Lu^a血型抗体结合蛋白如SEQID NO：6所示，所述的检测方法为非疾病的诊断和治疗方法。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的血型不规则抗体为K抗体、small k抗体和/或Lu^a抗体。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的待测物为全血、血清、血浆或待测血型不规则抗体。

4.根据权利要求1-3任一所述的检测方法，其特征在于，所述的血型抗体结合蛋白通过将包含编码血型抗体结合蛋白的核酸的载体导入细胞，诱导其表达获得。

5.一种血型不规则抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包含血型抗体结合蛋白，所述的血型抗体结合蛋白为K血型抗体结合蛋白、small k血型抗体结合蛋白和/或Lu^a血型抗体结合蛋白，所述的K血型抗体结合蛋白如SEQ ID NO：2所示，所述的small k血型抗体结合蛋白如SEQ ID NO：4所示，所述的Lu^a血型抗体结合蛋白如SEQ ID NO：6所示。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包含偶联血型抗体结合蛋白的微球、探针分子和/或报告分子。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的微球为聚苯乙烯微球或磁性微球。

8.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包含固相载体、补体、酶标记的抗体、酶标记的抗补体、显色液和/或荧光物质。