CN108603884A - 富集无细胞核小体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组蛋白H1结合剂用于从生物样品中检测、分离和/或纯化肿瘤来源的无细胞核小体的用途。本发明还描述了使用组蛋白H1结合剂进行负或正选择以便富集样品中肿瘤来源的无细胞核小体的方法。

Description

富集无细胞核小体的方法
发明领域
本发明涉及从血液、血清或血浆纯化或富集肿瘤来源的无细胞核小体和相关肿瘤DNA的方法。
发明背景
细胞DNA作为称为染色质的蛋白-核酸复合物存在。核小体是染色质结构的基本单位，由缠绕蛋白复合物周围的双链DNA(dsDNA)组成。DNA在通常被称为类似于“串上的珠(beadson a string)”的结构中缠绕连续核小体周围，并且这形成了开放或常染色质的基本结构。在致密或异染色质中，该串以封闭和复杂的结构盘绕并超级盘绕。
染色质中的每个核小体由8个高度保守的核心组蛋白(包含各组蛋白H2A、H2B、H3和H4的一对)的蛋白复合物组成。在该复合物周围包裹着约146个碱基对(bp)的DNA。另一组蛋白H1或H5，位于核心组蛋白外部的核小体中，作为接头并参与染色质致密化。据报道，无细胞核小体主要包含单核小体以及通过在细胞死亡时消化染色质而作为染色质片段产生的相关DNA。
成年人的正常细胞更新涉及通过细胞分裂每天约1011个细胞的产生并且主要由细胞凋亡导致类似数量的死亡。在细胞凋亡过程中，染色质被分解成单核小体和寡核小体，其中一些可能在循环中发现。据报道，在正常情况下，健康受试者中存在的循环核小体水平较低。在具有各种病况包括许多癌症、自身免疫疾病、炎性病况、中风和心肌梗塞的受试者中发现水平升高(Holdenreider & Stieber, 2009)。来自死细胞的核小体也可能流入其它体液如尿液、粪便或痰中。
DNA异常是所有癌症疾病的特征。癌细胞的DNA在许多方面与健康细胞的DNA不同，包括但不限于点突变、易位、基因拷贝数、微卫星异常、DNA链完整性和核苷酸修饰(例如胞嘧啶在5位的甲基化)。DNA结构或序列的这些肿瘤相关的改变常规在活检或手术时取出的癌细胞或组织中进行研究，用于临床诊断、预后和治疗选择目的。肿瘤遗传和表观遗传特征在不同肿瘤类型之间以及具有相同肿瘤疾病的不同患者之间不同。此外，这些特征随着时间的推移在同一患者的相同癌症中随着疾病的进展以及在获得的对药物或其它疗法的抗性的发展中而变化。因此，在手术或活检时取出的细胞中的肿瘤DNA的系列研究可以帮助临床医师监测疾病进展并且在早期(可能比放射学检测早许多个月)检测到任何复发或获得的治疗抗性，并且允许潜在地成功改变治疗过程。
然而，组织DNA测试具有局限性，因为为了监测目的，侵入性活检程序不能在患者中重复进行。对于某些患者，根本不可能使用活检。活检操作昂贵，对患者不舒服，会给患者带来风险，并可能导致手术并发症。此外，患者的肿瘤可由位于相同肿瘤的不同区域内或不同转移灶(转移性癌症)内的多个肿瘤克隆组成，并非所有肿瘤克隆都可在活检中取样。因此，组织活检DNA研究提供在特定的时刻在位于肿瘤的不同区域内的不同肿瘤克隆之中，在时间和空间上的肿瘤快照。
癌症患者的血液含有循环肿瘤DNA (ctDNA)，它被认为源于染色质片段或核小体从濒死或死亡的癌细胞释放到循环中。对来自癌症患者的匹配血液和组织样品的研究显示，存在于患者肿瘤中(但不在其健康细胞中)的癌症相关突变也出现在获自同一患者的血液样品的ctDNA中(Newman et al, 2014)。类似地，在癌细胞中差异甲基化(通过胞嘧啶残基的甲基化而表观遗传学改变)的DNA序列也可以作为循环ctDNA中的甲基化序列进行检测。另外，由ctDNA构成的无细胞循环DNA (cfDNA)的比例与肿瘤负荷相关，因此可以通过存在的ctDNA的比例定量以及通过其遗传和/或表观遗传组成定性两者监测疾病进展。ctDNA的分析可以产生高度有用和临床准确的数据，其与源自肿瘤内全部或许多不同克隆的DNA有关，并因此在空间上整合肿瘤克隆。而且，随着时间的推移重复采样是更实际和更经济的选择。(ctDNA)的分析有可能彻底改革肿瘤的检测和监测，以及早期检测复发和获得性药物抗性，以通过肿瘤DNA的研究选择肿瘤治疗，而无需侵入性组织活检程序。此类ctDNA测试可用于研究所有类型的癌症相关DNA异常(例如点突变、核苷酸修饰状态、易位、基因拷贝数、微卫星异常和DNA链完整性)，并可应用于常规癌症筛查、定期和更频繁的监测和定期检查最佳治疗方案(Zhou et al, 2012)。
血液、血浆或血清可以用作ctDNA测定的底物，并且可以使用任何DNA分析方法，包括但不限于DNA测序、表观遗传学DNA测序分析(例如对于含有5-甲基胞嘧啶的序列)、PCR、BEAMing、NGS(靶向或全基因组)、数字PCR、冷PCR(在较低变性温度-PCR下共扩增)、MAP(MIDI-激活的焦磷酸解)、PARE(重排末端的个性化分析)和质谱。
由于DNA异常是所有癌症疾病的特征，并且对于ctDNA已经被研究的所有癌症疾病，已经观察到ctDNA，因此ctDNA测试适用于所有癌症疾病。所研究的癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌、淋巴瘤、口腔癌、白血病、头颈癌和骨肉瘤(Crowley et al, 2013; Zhou et al, 2012; Junget al, 2010)。现在将通过概述三种(非限制性)示例方法来说明ctDNA测试的性质。
第一个实例涉及检测ctDNA中的癌症相关基因序列突变。涉及检测ctDNA中单个基因突变的血液测试通常具有低的临床敏感性。对此有两个原因。首先，虽然所有的癌症都具有突变，但特定癌症疾病的任何特定突变的频率通常很低。例如，尽管K-ras和p53突变被认为是两种较常见的癌症突变，并且已经在包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌在内的多种癌症中进行了研究，但它们分别在23％-64％和17％-54％的癌症组织样品中检测到。其次，即使患者的癌症组织确实含有突变，存在于患者血液中的突变ctDNA的水平或浓度可能很低并且难以检测到。例如，K-ras和p53突变可以在0％-75％的K-ras和p53组织阳性患者的ctDNA中检测到。这两种效应的总和意味着在少于40％的癌症患者血液中检测到K-ras或p53突变(Jung et al, 2010)。
第二个实例涉及检测ctDNA中的多个癌症相关基因序列突变。虽然任何特定基因例如K-ras或p53的突变可能仅存在于少数癌症中，但所有癌症均含有突变，因此原则上研究足够大的突变组应该有助于检测大多数或甚至全部肿瘤。因此，增加这种测试的临床敏感性的一种方式是测试许多基因中的广泛突变。Newman等人将这种方法用于非小细胞肺癌(NSCLC)，并研究了来自139个复发突变基因的521个外显子和13个内含子序列。所研究的突变涵盖多类癌症相关基因改变，包括单核苷酸变异(SNV)和融合基因。通过这种方式，作者报道了在ctDNA血液测试中检测到超过95％的II-IV期肿瘤和50％的I期肿瘤，具有96％特异性(Newman et al, 2014)。
第三个实例涉及检测ctDNA中特定基因序列的癌症相关表观遗传学改变。这种方法可以应用于任何DNA或核苷酸修饰。这种方法的一个最佳实例是检测某些癌症中胞嘧啶残基差异甲基化的基因。在许多癌症中为此目的已经研究了大量基因。其中一些是在膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、卵巢癌和前列腺癌中研究的SEPTIN-9、APC、DAPK、GSTP1、MGMT、p16、RASSF1A、T1G1、BRCA1、ERα、PRB、TMS1、MLH1、HLTF、CDKN2A、SOCS1、SOCS2、PAX5、PGR、PTGS2和RARβ2。该方法的说明性实例是用于检测结肠直肠癌(CRC)的ctDNA中甲基化的SEPTIN-9的检测，据报道其检测到68％的CRC病例，具有89％的临床特异性(Grutzmann et al, 2008)。
cfDNA的肿瘤衍生的ctDNA部分以小于200bp的小DNA片段循环，其长度与以单核小体形式循环的DNA片段所预期的一致(Newman et al, 2014)。据报道癌症患者的cfDNA水平高于健康受试者。该领域的工作人员报道了对于健康受试者的cfDNA范围为0-100ng/ml(平均30ng/ml)，癌症受试者的cfDNA范围为0-1000ng/ml (平均180ng/ml)(Schwarzenbach et al, 2011)。循环cfDNA由长度至多20,000个碱基对的各种大小的DNA分子组成(Zhou et al, 2012)。与ctDNA主要作为单核小体循环的假设相一致，循环中无细胞核小体的测量水平，与DNA水平一样，在癌症患者中高于健康受试者(Holdenrieder et al, 2001)。然而，循环核小体本身的水平升高并未在临床上用作癌症的生物标志物，因为核小体是细胞死亡的非特异性产物，并且在包括急性创伤在内的涉及升高细胞死亡的许多病况中观察到升高的水平(Holdenrieder和Stieber, 2009)。作为细胞死亡的产物，用细胞毒性药物或放射疗法治疗时，循环核小体水平可显著升高。然而，核小体也从循环中被清除，所以水平可能随治疗而达到峰值然后下降(Holdenrieder et al, 2001)。
尽管循环无细胞核小体本身的水平在临床实践中尚未被用作癌症中的基于血液的生物标志物，但是就其组蛋白修饰、组蛋白变体、DNA修饰和加合物含量而言，循环无细胞核小体的表观遗传组成已被作为癌症中基于血液的生物标志物进行研究(WO 2005/019826; WO 2013/030577; WO 2013/030579; WO 2013/084002)。
cDNA的生物学来源尚未充分了解。染色质片段化而产生单核小体和寡核小体是凋亡细胞死亡的特征。认为坏死细胞产生长度为数千碱基对的较大DNA分子，但是在一些坏死情况下也可能发生DNA片段化。此外，常见的DNA重复序列(例如ALU或LINE1序列)可以从经历非凋亡或坏死细胞死亡的细胞中作为200-400个碱基对DNA片段释放(Schwarzenbach et al, 2011)。DNA片段也可以作为细胞间通讯的形式被细胞分泌。ctDNA的来源被认为与癌细胞的死亡有关。DNA片段可以作为核小体从坏死和/或凋亡肿瘤细胞释放。然而，坏死和凋亡细胞通常被巨噬细胞或其它清道夫细胞吞噬，并且DNA可能由吞噬坏死或凋亡细胞的巨噬细胞释放(Schwarzenbach et al, 2011)。
有多种方法可用于从血液、血清或血浆中提取cfDNA，并且已经比较了它们提取的DNA的产量和提取不同长度的DNA片段的效率。苯酚-氯仿和碘化钠提取法提供了最高的产量，并提取了长度小于200bp的小DNA片段。据报道，其它测试方法(包括商业上可用的方法)具有较低的DNA提取产量和不能提取长度小于200bp的小DNA片段(Fong et al, 2009)。
从血液、血清或血浆中提取cfDNA以分析ctDNA通常使用市售DNA提取产品进行。此类提取方法声称循环DNA的回收率高(>50％)，并声称某些产品(例如由Qiagen生产的QIAamp循环核酸试剂盒)提取小尺寸的DNA片段。使用的典型样品体积为1-5mL范围的血清或血浆。
由于许多限制，目前在用于临床肿瘤学目的的常规使用中没有基于ctDNA的测试。主要的方法学限制是对高质量DNA的要求。由于样品的性质，目前的ctDNA采样方法产生质量差的ctDNA样品。主要困难在于循环中存在大量非肿瘤cfDNA，这使ctDNA的任何分析变得复杂。来自不同工作人员的估值不同，但循环中存在的ctDNA部分可能太低而不能检测或超过cfDNA的50％。然而，对于大多数癌症患者，ctDNA部分是cfDNA的一小部分。例如，最近的研究报道，治疗前肺癌患者的ctDNA部分随肿瘤尺寸而增加。在肿瘤负荷大的患者中发现的最高水平是3.2％，但是发现大多数患者的ctDNA部分低于0.1％ (Newman et al, 2014)。这意味着对于许多患者样品，必须在存在水平高得多的非肿瘤衍生DNA时分析非常低水平的ctDNA。此外，该DNA来自相同的受试者，因此具有相似的序列，并会干扰定量或分析ctDNA的任何方法。
对于测量循环无细胞的核小体和/或循环核小体的表观遗传组成作为癌症的生物标志物，产生类似问题，因为核小体本身是细胞死亡的非特异性指示物，并作为身体正常细胞更新过程的一部分以及在与细胞死亡水平升高相关的病况中被释放，例如自体免疫疾病、中风、败血症、创伤后、烧伤、心肌梗塞、脑中风、器官移植后的移植排斥期间以及严重运动后。因此，肿瘤来源的核小体与各种细胞和组织来源的其它非肿瘤核小体一起循环。这些非肿瘤核小体将干扰任何用于肿瘤来源核小体的定量或表观遗传学分析的方法。其它体液中也可出现类似的效应。例如，粪便可含有结肠直肠癌细胞来源的核小体和相关DNA以及来源于健康结肠或直肠细胞的核小体。痰可含有肺癌细胞来源的核小体和相关DNA以及来源于健康肺细胞的核小体。其它体液中也会出现类似的效应。
因此，非常需要从血液、血清或血浆样品和其它体液样品中富集肿瘤来源的核小体和DNA的方法。类似地，需要用于循环无细胞核小体的分析方法，其能够区分肿瘤和非肿瘤来源的那些核小体，以改进癌症疾病状态的检测。
发明简述
根据本发明的第一方面，提供了通过亲和纯化从生物样品中分析肿瘤来源的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)从样品中分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体；和
(iii)通过免疫测定或质谱分析分离的核小体。
根据本发明的另一方面，提供了从生物样品中分离纯化的肿瘤DNA的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体；
(iii)从步骤(ii)分离的核小体样品中提取DNA；和
(iv)分析提取的DNA。
根据本发明的另一方面，提供了用于检测生物样品中肿瘤衍生的核小体的表观遗传表位的免疫测定方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含组蛋白H1结合剂的第一结合剂接触；
(ii)分离未与第一结合剂结合的核小体；
(iii)使核小体与结合所述表位的第二结合剂接触；
(iv)检测和/或定量所述第二结合剂与所述表位的结合；和
(v)使用这种结合的存在或程度作为样品中肿瘤衍生的核小体的特定表位的存在的量度。
根据本发明的另一方面，提供了用于检测动物或人受试者中的癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)通过使用两种结合剂的免疫测定分析样品中的含有表观遗传特征且还含有组蛋白H1的无细胞核小体，其中一种结合剂涉及与特定的表观遗传特征结合，另一种涉及与组蛋白H1结合；
(iii)通过使用两种结合剂的免疫测定分析样品中的含有特定表观遗传特征以及具有和不具有组蛋白H1的循环无细胞核小体，其中一种结合剂涉及与表观遗传特征结合，另一种结合剂涉及与共同核心核小体表位结合，所述共同核心核小体表位包括任何组蛋白H2、H3或H4表位、任何DNA表位或存在于染色质片段中的并非组蛋白H1表位的任何其它表位；和
(iv)使用步骤(ii)和(iii)中获得的免疫测定结果的组合作为指示受试者中存在所述癌症的组合生物标志物。
根据本发明的另一方面，提供了组蛋白H1结合剂用于从生物样品中检测、分离和/或纯化肿瘤来源的无细胞核小体的用途。
根据本发明的另一方面，提供了包含组蛋白H1结合剂的试剂盒在本文描述的方法中的用途。
附图简述
图1：OD比率(OD2:OD1)，指示69个人受试者中[肿瘤衍生的和非肿瘤衍生的核小体]：[主要是非肿瘤衍生的核小体]的相对比例。
发明详述
与健康细胞相比，癌细胞中核小体的结构就其表观遗传信号组成而言可变化。采用涉及结合在癌细胞中比健康细胞更常见或反之亦然的表观遗传信号的抗体或其它结合剂，允许在获自受试者的含有混合细胞来源的无细胞核小体的生物样品中分离肿瘤来源的无细胞核小体(即通过正或负选择)。
核小体核心由8种组蛋白组成，包括各H2A、H2B、H3和H4组蛋白的一对。组蛋白H1(H1)不是核心组蛋白，而是位于核心外侧并充当接头。具体而言，H1涉及将“串上的珠”子结构包装成高级结构。不受理论束缚，本发明人已经确定源自肿瘤的无细胞核小体比源自健康细胞的核小体较不频繁地包含组蛋白H1。因此肿瘤来源的核小体更可能仅由8种核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4(加上DNA和任何加合分子)组成。具有肿瘤或非肿瘤来源的血液中的循环无细胞核小体因此可以被认为是性质上不同的，因为大多数肿瘤来源的核小体包含8种组蛋白的核心核小体结构以及相关DNA片段，而大多数非肿瘤来源的核小体包含相似的核心核小体结构加上另外的组蛋白H1蛋白部分和相关DNA片段。这种性质差异可以用作在从受试者或患者采集的体液样品中富集肿瘤来源的无细胞核小体的负选择方法的基础。
我们先前报道了用于血液和其它体液中无细胞核小体的表观遗传学分析的方法(WO2013/030577, WO2013/030578, WO2013/030579, WO2013/084002)。如上所述，肿瘤来源的无细胞核小体被释放到患有肿瘤的受试者的循环中，但它们由于正常的细胞更新而被稀释到循环中已存在的无细胞核小体中。任何这种非肿瘤来源的核小体都会干扰肿瘤核小体的遗传或表观遗传学分析。从体液样品中除去非肿瘤来源的无细胞核小体将导致肿瘤来源的无细胞核小体的更高纯度，导致样品中肿瘤核小体或染色质片段的遗传或表观遗传学分析的结果改善。
在本发明的优选方面，纯化疾病来源的循环无细胞核小体并通过免疫测定或质谱分析表观遗传特征。在这方面，从受试者获取血液、血清、血浆或其它体液样品，并通过除去含有组蛋白H1组分的无细胞核小体，使样品富集疾病来源的无细胞核小体。使用免疫测定或质谱分光光度法分析剩余的无细胞核小体的指示疾病的表观遗传特征。可以分析的核小体表观遗传特征包括任何以下或全部：特定的组蛋白翻译后修饰、特定的组蛋白同种型、特定的核苷酸或修饰的核苷酸(例如甲基化、羟基甲基化或其它核苷酸修饰)。免疫测定和质谱方法的优点包括低成本、高分析灵敏度和特异性以及高通量。
在一个实施方案中，提供了对来自生物样品的疾病来源的无细胞核小体通过亲和纯化分离和表观遗传学分析的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)从样品中分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体(即未结合的核小体)；和
(iii)使用包括涉及结合修饰的核苷酸的抗体或其它结合剂的免疫测定方法分析分离的核小体部分中修饰的核苷酸的包含。
在另一个实施方案中，提供了对来自生物样品的疾病来源的无细胞核小体通过亲和纯化分离和表观遗传学分析的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使所述样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)从样品中分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体(即未结合的核小体)；和
(iii)使用包括涉及结合翻译后修饰的组蛋白的抗体或其它结合剂的免疫测定方法分析分离的核小体部分中翻译后修饰的组蛋白的包含。
在另一个实施方案中，提供了对来自生物样品的疾病来源的无细胞核小体通过亲和纯化分离和表观遗传学分析的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)从样品中分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体(即未结合的核小体)；和
(iii)使用包括涉及结合组蛋白同种型的抗体或其它结合剂的免疫测定方法分析分离的核小体部分中组蛋白同种型的包含。
在另一个实施方案中，提供了对来自生物样品的疾病来源的无细胞核小体通过亲和纯化分离和表观遗传学分析的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)从样品中分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体(即未结合的核小体)；和
(iii)使用包括涉及结合非组蛋白蛋白质的抗体或其它结合剂的免疫测定方法分析分离的核小体部分与加合的非组蛋白蛋白质的附着。
在另一个实施方案中，提供了对来自获自患者的生物样品的疾病来源的无细胞核小体通过亲和纯化分离和检测的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)从样品中分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体(即未结合的核小体)；
(iii)通过免疫测定定量分离的核小体；和
(iv)使用不含组蛋白H1部分的无细胞核小体的存在或水平作为受试者疾病状态的指示物。
在本发明的优选分析方面，样品中存在的循环无细胞核小体的表观遗传特征在(i)含有组蛋白H1的核小体和在(ii)含有和不含组蛋白H1的所有核小体中分析或测量。测量含有组蛋白H1的核小体(即主要是非肿瘤核小体)的表观遗传特征可通过本领域已知的方法进行，包括但不限于质谱或通过使用两种抗体(或其它结合剂)的免疫测定，其中一种抗体涉及结合目的表观遗传特征，另一种抗体涉及结合组蛋白H1。直接测量不含组蛋白H1的核小体(即主要是肿瘤核小体)的表观遗传特征最好通过使用本文所述的亲和纯化方法除去H1相关核小体进行富集后进行。然而，可以通过质谱或通过使用两种抗体(或其它结合剂)的免疫测定来分析或测量含有和不含组蛋白H1的(全部)循环无细胞的核小体(即肿瘤和非肿瘤核小体)，其中一种抗体涉及与目的表观遗传特征结合，另一种抗体涉及与共同核心核小体表位结合，所述共同核心核小体表位包含任何组蛋白H2、H3或H4表位、任何DNA表位或存在于染色质片段中除组蛋白H1表位之外的任何其它表位。在本发明的这个方面，可以测量含有表观遗传特征且还掺入组蛋白H1的循环无细胞核小体(即非肿瘤核小体)，以及含有表观遗传特征的所有循环无细胞核小体，包括具有和不具有组蛋白H1的核小体(即肿瘤和非肿瘤核小体)。这两种分析或测量可以一起用作样品中存在的含有与组蛋白H1不相关的特定表观遗传特征的循环无细胞核小体的量或比例的指示。这是可能具有肿瘤来源的那些核小体的量或比例。例如，可以使用两次测量之间的差异或者可以使用两次测量的比率。
在本发明的该分析方面的优选实施方案中，提供了在获自具有肿瘤来源的受试者的生物样品中测量含表观遗传表位的循环无细胞核小体的比例的方法，包括以下步骤：
(i)从受试者获得体液样品，
(ii)进行第一免疫测定，包括以下步骤：
(1A)将样品与结合所述表观遗传表位的第一结合剂接触；
(1B)使核小体或样品与结合组蛋白H1的第二结合剂接触；和
(1C)检测或定量所述第二结合剂与样品中核小体的结合；
(iii)进行第二免疫测定，包括以下步骤：
(2A)将样品与结合所述表观遗传表位的第一结合剂接触；
(2B)使核小体或样品与结合非组蛋白H1核小体或染色质片段表位的第三结合剂接触；和
(2C)检测或定量所述第三结合剂与样品中核小体的结合；
(iv)合并步骤(1C)和(2C)的测量结果作为含有所述表观遗传表位并且具有肿瘤来源的样品中无细胞核小体的量或比例的指示物。
在本发明的该分析方面的另一个实施方案中，提供了在获自具有肿瘤来源的受试者的生物样品中测量含表观遗传表位的循环无细胞核小体的比例的方法，包括以下步骤：
(i)从受试者获得体液样品，
(ii)进行第一免疫测定，包括以下步骤：
(1A)使样品与结合组蛋白H1的第一结合剂接触；
(1B)使核小体或样品与结合所述表观遗传表位的第二结合剂接触；和
(1C)检测或定量所述第二结合剂与样品中核小体的结合；
(iii)进行第二免疫测定，包括以下步骤：
(2A)使样品与结合非组蛋白H1核小体或染色质片段表位的第一结合剂接触；
(2B)使核小体或样品与结合所述表观遗传表位的第三结合剂接触；和
(2C)检测或定量所述第三结合剂与样品中核小体的结合；
(iv)合并步骤(1C)和(2C)的测量结果作为含有所述表观遗传表位并且具有肿瘤来源的样品中无细胞核小体的量或比例的指示物。
对于本领域技术人员清楚的是，上文提及的“第一”和“第二”免疫测定可以以任何顺序或并行或以多重形式进行。同样清楚的是，如上所述，用于两种免疫测定中的第一和第二或第一和第三结合剂的置换不需要是对称的。
在优选实施方案中，表观遗传表位或特征选自(i)组蛋白H2、H3或H4的同种型，(ii)存在于组蛋白H2、H3或H4中的翻译后修饰，(iii)包含修饰核苷酸的核苷酸，(iv)掺入或加合至无细胞染色质片段的非组蛋白蛋白质。在另一个实施方案中，表观遗传表位是存在于核小体本身中的共同表位，并且两种免疫测定提供肿瘤核小体本身的存在的指示。
在本发明此方面的优选实施方案中，具有疾病来源的包含特定表观遗传表位的无细胞核小体的量或比例可用作受试者中疾病存在的生物标志物或用于评估受试者的疾病状态或对于治疗方案的适用性。
如上所述并且在实施例15中，我们已经成功开发了分析程序，其中通过两种免疫测定测量非组蛋白蛋白质的核小体加合物，并且得出[含有非组蛋白蛋白质的核小体本身]：[含有组蛋白H1和非组蛋白蛋白质的核小体]的比率。因此，所得比率是[全部核小体蛋白加合物]：[非肿瘤核小体蛋白加合物]的指示。因此，对于从受试者获得的血液、血清或血浆样品，对于样品得出的比率越大，一些核小体具有肿瘤来源的可能性越大。在29名健康受试者中，发现平均免疫测定输出(光密度)比率为8.7。在29名诊断为结直肠癌的受试者中，平均比率为15.9。在11名诊断为胰腺癌的受试者中，平均比率为17.1。这表明增加的比率确实与癌症来源的核小体有关。
此外，每个受试者的个体结果以递增的截止水平被用作癌症的生物标志物。在12的截止时；该比率对于诊断为胰腺癌的受试者中的73％(8/11)和诊断为结肠直肠癌的受试者中的41％(12/29)提供阳性结果，具有79％的临床特异性(29个健康受试者中的6个假阳性结果)。在22的截止时；该比率对于诊断为胰腺癌的受试者中的36％(4/11)和诊断为结肠直肠癌的受试者中的34％(10/29)提供阳性结果，具有93％的临床特异性(29个健康受试者中的2个假阳性结果)。这些结果表明，本文所述的比率可以用作癌症疾病的生物标志物。
应该理解，本文提及“组蛋白H1结合剂”(例如在负选择方法中)一般指结合组蛋白H1蛋白的结合剂，包括任何组蛋白H1变体、同种型或其修饰。因此，在一个实施方案中，组蛋白H1结合剂选自：与组蛋白H1蛋白、变体、同种型或其修饰结合的结合剂。
在上述实施方案中，疾病来源的富集无细胞核小体的存在或水平本身，或含有检测到的修饰的核苷酸、翻译后组蛋白修饰、组蛋白同种型或核小体-蛋白加合物的疾病来源的富集无细胞核小体的存在或水平可用作疾病状态、疾病预后、疾病监测、治疗监测或对特定治疗的疾病易感性或用于其它临床应用的指示。
我们先前已报道了适用于本发明的核小体免疫测定方法，包括WO2005/019826,WO2013/030577, WO2013/030578, WO2013/030579, WO2013/084002。这些方法中的任何一种都可以不受限制地用于本发明。
此外，发明人已经确定当源自肿瘤的核小体与H1相关时，与源自健康细胞的核小体中存在的那些相比，核小体相关的H1经历进一步修饰和/或可以含有不同的H1变体或H1同种型。
主要组蛋白H1变体或同种型包括但不限于在增殖和静息体细胞中表达的H1.0、H1.10和H1X以及在分裂细胞中以高水平表达的H1变体H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5和H1.6。此外，还有种系特异性变体，包括主要在睾丸中表达的H1.8和主要在卵母细胞中表达的H1.7。染色质的组蛋白变异组成在癌细胞中发生改变，据报道，在常见H1同种型中，组蛋白H1.0同种型表达在癌细胞中下调，而组蛋白同种型H1.1、H1.2、H1.3、H1.4和H1.5在癌细胞中以高水平表达(Scaffidi; 2015)。
组蛋白H1可以在位于蛋白的N-和C-末端尾巴以及球状结构域内的氨基酸残基进行翻译后修饰，这些修饰可能与癌症有关(Izzo和Schneider; 2015)。应该理解，本文提及“组蛋白H1修饰”是指H1翻译后修饰(PTM)，其可包括乙酰化、甲基化(其可以是单甲基化、二甲基化或三甲基化)、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、瓜氨酸化、羟基化、糖基化、亚硝基化、谷氨酰胺化和/或异构化。具有修饰的组蛋白氨基酸残基可以是组蛋白氨基酸序列内的任何Ser、Lys、Arg、His、Glu、Pro或Thr残基。
例如，核心组蛋白序列内的赖氨酸残基可以被单甲基化、二甲基化或三甲基化、乙酰化或泛素化，核心组蛋白序列内的精氨酸残基可以被单甲基化、对称或不对称二甲基化或转化为瓜氨酸，核心组蛋白序列内的丝氨酸或苏氨酸残基可被磷酸化和/或核心序列内的脯氨酸残基可被异构化。
本领域技术人员将理解，用于描述特定组蛋白修饰的符号指示哪个组蛋白已被修饰，已被修饰的特定氨基酸和已发生修饰的类型。例如，H1K64(Ac)表示组氨酸H1在赖氨酸64处的乙酰化。
在一个实施方案中，用于本发明的结合剂涉及与无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰。在进一步的实施方案中，组蛋白H1修饰选自磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和/或甲酰化。H1修饰可包括：磷酸化位点：S2、T4、T11、S/T18、S27、T31、S36、S37、T39、S41、S44、S107、T138、T142、T146、T147、T154、T155、T165、S172、S173、T180、S/T187、S189；乙酰化位点：S2、K17、K26、K34、K46、K49、K52、K63、K64、K85、K88、K90、K93、K97、K109、K168、K169、K192、K209；甲基化位点：K26、K27、K34、K52、K64、K97、K106、K119、K148、K168、K169、K187；泛素化位点：K17、K21、K34、K46、K47、K64、K65、K75、K76、K85、K86、K90、K91、K97、K98、K106、K107；甲酰化位点：K17、K34、K46、K63、K64、K67、K75、K85、K88、K90、K97、K110、K140、K141、K160。因此，在一个实施方案中，与无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰包含至少一种如本文所列的组蛋白H1修饰。
在一个实施方案中，用于本发明的结合剂涉及结合与无细胞核小体相关的组蛋白H1变体或同种型。H1变体和同种型可包括H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5或H1.6，其被认为在有丝分裂过程中表达，以及在静息体细胞中表达的H1.0、H1.10和H1X。额外的H1变体也在特定组织(例如睾丸中的变体H1t、H1T2、H1LS)以及特定细胞类型(例如终末分化细胞中的变体H1.0)中被鉴定。因此，在一个实施方案中，与无细胞核小体相关的组蛋白H1变体或同种型包含至少一种如本文所列的组蛋白H1变体或同种型。
本领域技术人员将清楚，基于其定量H1关联或基于其定性H1同种型和/或H1 PTM修饰组合物富集获自人或动物受试者患者的生物样品中的肿瘤来源的核小体，将可能改善使用核小体或DNA生物标志物的差异诊断的区分。因此，在一个实施方案中，健康或肿瘤来源的核小体的免疫分离利用涉及结合与无细胞核小体相关的至少一种组蛋白H1修饰和/或变体和/或同种型的结合剂。
在一个实施方案中，生物流体样品获自受试者并且样品中的无细胞核小体基于核小体组蛋白H1组成富集肿瘤来源的核小体。流体样品可以是获自受试者的任何生物流体样品，包括但不限于脑脊液(CSF)、全血、血清、血浆、经血、子宫内膜液、尿液、唾液或其它体液(大便、泪液流体、滑液、痰)、呼气，例如作为凝聚的呼气、或从其中的提取物或纯化物、或其稀释物。生物样品还包括来自活体受试者的标本，或者在死后获取的标本。可以制备样品，例如适当时经稀释或浓缩，并以常规方式储存。
在一个实施方案中，肿瘤来源的无细胞核小体源自选自以下的癌症：乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肠癌、肝癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、口腔癌、头颈癌、白血病和骨肉瘤。
在一个实施方案中，核小体是无细胞单核小体或寡核小体。
方法
负选择
本领域技术人员将清楚，在含有肿瘤细胞和健康细胞来源的核小体的血液样品中，基于组蛋白H1同种型或组蛋白H1翻译后修饰模式，通过肿瘤来源的无细胞核小体的亲和结合进行阳性筛选仅在肿瘤来源的无细胞核小体保留并包括H1蛋白部分时才可能。然而，大多数肿瘤来源的循环无细胞核小体不包含H1部分。出于这样的原因；负选择是富集肿瘤来源的循环无细胞的核小体的优选方法。
根据本发明的第一方面，提供了通过亲和纯化从生物样品中分离/分析肿瘤来源的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂(包括任何组蛋白H1变体、同种型或其修饰)接触；
(ii)从样品中分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体(即未结合的核小体)；和
(iii)分析分离的核小体和/或相关的DNA。
根据本发明的该方面，提供了通过负选择含有组蛋白H1蛋白、或一种或多种特定组蛋白H1变体、或一种或多种特定组蛋白H1修饰的无细胞核小体，来富集生物样品的肿瘤来源核小体的方法。在一个实施方案中，涉及结合组蛋白H1或组蛋白H1变体H1.0、H1.10或H1X(或针对这些的任何组合的任何结合剂)的抗体或其它结合子用于选择和分离含有H1变体的核小体和从而与健康细胞来源的核小体结合。因此，该方法从样品中除去健康细胞来源的核小体，因此富含肿瘤来源的核小体。在一个优选的实施方案中，结合剂是固定在固相上用于免疫提取健康来源的核小体的抗体。可以分析保留在液相中的核小体和/或相关DNA的基因序列、表观遗传信号结构或其它特征。
因此，根据本发明的一个方面，提供了用于通过亲和纯化从生物样品中分离/分析肿瘤来源的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与结合组蛋白H1蛋白本身或选自H1.0、H1.10或H1.X的组蛋白H1变体的组蛋白1结合剂接触；
(ii)从样品中分离未与结合剂结合的核小体(即未结合的核小体)；和
(iii)分析分离的核小体和/或相关的DNA。
在一个实施方案中，通过免疫测定或质谱分析分离的核小体。肿瘤来源的核小体的存在水平或量和/或肿瘤来源的核小体的任何分子遗传或表观遗传特征可用于检测受试者的癌症或评估受试者的癌症以用于任何临床目的。在另一个实施方案中，通过免疫测定或质谱分析分离的核小体中表观遗传特征的包含。在又一个实施方案中，表观遗传特征包含翻译后组蛋白修饰、组蛋白同种型、修饰核苷酸或加合非组蛋白。在另一个实施方案中，分析分离的核小体的DNA组分的DNA碱基序列。
在本文所述的负选择方法中对“组蛋白H1蛋白”的提及包括天然或野生型组蛋白H1蛋白。如先前所解释的，源自肿瘤的无细胞核小体比源自健康细胞的核小体较不频繁地含有组蛋白H1，因此该实施方案能够通过检测天然/野生型组蛋白H1蛋白的存在或不存在来分离肿瘤来源的无细胞核小体。
正选择
在本发明中，正选择方法基于使用亲和结合剂，所述亲和结合剂涉及结合经翻译后修饰的组蛋白H1蛋白分子或结合如上所述的分裂或增殖细胞相关的H1蛋白同种型。特别地，用于正选择的翻译后修饰的组蛋白H1蛋白结合靶包括选自上文列出的任何一种。用于正选择的H1同种型包括选自H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5或H1.6的组蛋白H1同种型或变体。
根据本发明的一个方面，提供了通过亲和纯化从生物样品中分离/分析肿瘤来源的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与癌症来源的核小体中普遍存在的组蛋白H1变体、同种型或其修饰的结合剂接触；
(ii)从样品中分离与组蛋白H1结合剂结合的核小体；和
(iii)分析分离的核小体和/或相关DNA。
根据本发明的该方面，提供了通过正选择含有组蛋白H1蛋白、或一种或多种特定组蛋白H1变体、或在癌症来源核小体中普遍存在的一种或多种特定组蛋白H1修饰的无细胞核小体来富集生物样品中的肿瘤来源核小体的方法。在一个优选实施方案中，涉及结合H1变体H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5或H1.6的抗体或其它结合剂(或任何涉及结合任何这些组合的结合剂)用于选择和分离含有H1变体的核小体，从而富集肿瘤来源的核小体，而健康细胞来源的许多核小体保持未结合并可以分离。在另一个优选的实施方案中，涉及结合H1修饰的抗体或其它结合剂(或任何涉及结合修饰组合的结合剂)用于选择和分离含有H1修饰的核小体，从而富集肿瘤来源的核小体，而健康细胞来源的许多核小体保持未结合并可以分离。在优选的实施方案中，结合剂是固定在固相上用于免疫提取肿瘤来源的核小体的抗体。可以分析与固相结合的核小体和/或相关DNA的基因序列、表观遗传信号结构或其它特征。
因此，根据本发明的一个方面，提供了用于通过亲和纯化从生物样品中分离/分析肿瘤来源的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与结合选自H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5或H1.6的组蛋白H1变体或组蛋白H1修饰的结合剂接触；
(ii)从样品中分离与结合剂结合的核小体；和
(iii)分析分离的核小体和/或相关DNA。
在一个实施方案中，通过免疫测定或质谱分析分离的核小体。在另一个实施方案中，通过免疫测定或质谱分析分离的核小体中表观遗传特征的包含。在又一个实施方案中，表观遗传特征包含翻译后组蛋白修饰、组蛋白同种型、修饰核苷酸或加合非组蛋白。在另一个实施方案中，分析分离的核小体的DNA组分的DNA碱基序列。
肿瘤来源的无细胞核小体作为具有各种来源的核小体混合物的一部分存在于生物流体中并且仅占一部分存在的无细胞核小体。令人惊讶的是，已经发现可以通过使用如本文所述的亲和纯化分离方法的正或负选择来进行肿瘤来源的核小体的富集或分离。
细胞死亡突然增加后2-5天，循环核小体水平可以明显增加，所述细胞死亡由许多不同的原因导致，包括创伤、中风或用细胞毒性药物或放射疗法治疗。然后在2-3天时期内水平下降(Holdenrieder et al, 2001)。这种效应是由于细胞死亡的诱导，然后从循环中清除(Holdenrieder & Stieber, 2009)。
清楚的是，释放到没有肿瘤疾病(包括例如由于手术创伤引起的)患者的循环中的核小体不可能具有肿瘤来源。这些核小体将促成cfDNA，但不会含有ctDNA。
将清楚的是，如本文所使用的术语“核小体”旨在包括可在流体介质中分析的单核小体和寡核小体以及任何这样的染色质片段。在另一个实施方案中，无细胞核小体是单核小体、寡核小体或其它染色体片段。
本领域技术人员将清楚，作为存在的一部分核小体的分离的肿瘤核小体的水平可以用作样品中构成肿瘤DNA的DNA比例的量度。此外，相反的水平是样品中健康来源DNA的比例。因此，本文所述的方法可用于检测样品中ctDNA的水平/比例。这样的量度类似于ctDNA中癌症相关突变的等位基因频率量度，并且可以用作肿瘤负荷和对疗法反应的量度。
在本发明的一个实施方案中，从生物流体样品中分离完全或部分纯化的肿瘤核小体制备物。在一个实施方案中，纯化方法包括通过使用与所述表观遗传表位结合的结合剂亲和分离无细胞核小体，所述无细胞核小体含有健康组织特有的组蛋白或DNA表观遗传信号表位。因此洗出物含有肿瘤核小体制备物和/或其相关ctDNA，然后可以对其进行分析。
根据需要接触和分离来自样品的核小体的方法在本领域中是公知的，并且可以使用任何合适的分离方法。例如，分离方法可以包括亲和层析或磁性抗体珠。例如，如果使用亲和柱层析设置，将会理解，样品可以通过包含H1结合剂的亲和柱。取决于是否采用本文所述的正或负选择方法，可以收集固相结合的核小体或穿流物(即，未结合的核小体)用于ctDNA的分析。
在一个优选实施方案中，肿瘤核小体和ctDNA分离通过采用组蛋白H1结合剂的免疫亲和纯化方法进行。本领域技术人员将清楚，能够与组蛋白H1特异性结合的任何结合剂可用于本发明的亲和纯化方法。此类结合剂可包括但不限于抗体、适体或结合蛋白(例如核小体结合蛋白)。
可以通过本领域已知的多种方法产生抗体，包括免疫和文库方法例如噬菌体展示。可以针对目的部分或抗原诱导免疫应答，或者可以针对结合目的部分或抗原来选择文库。涉及结合组蛋白H1的抗体可以针对包括整个H1蛋白氨基酸序列并且可以任选含有翻译后组蛋白修饰的多种此类部分产生。蛋白可以从活细胞中纯化或合成产生。或者，可以使用代表H1氨基酸序列的一部分的肽序列，并且这也可以任选含有翻译后组蛋白修饰。也可以使用含有组蛋白H1的核小体或其它染色质部分。
本领域技术人员将清楚，涉及结合组蛋白H1的任何部分或全部的结合剂可用于本发明的方法。
对肿瘤来源的分离的核小体的分析可涉及任何合适的分析方法，其中许多是本领域已知的。这些方法包括但不限于通过使用第二抗体或针对共同核小体表位例如dsDNA或针对包括组蛋白修饰、组蛋白变体、DNA修饰或另一种与核小体加合的分子的目的表观遗传结构的其它结合剂的免疫测定进行分析。这些方法在本文通过引用包括在2005/019826、WO2013/030577、WO 2013/030579和WO 2013/084002中描述的所有方法，其中使用组蛋白H1结合剂代替通用的抗核小体表位结合剂。这些方法还包括用于分析存在于肿瘤来源的循环核小体中的多个表位的多重方法。
通过本发明的方法分离的肿瘤来源的核小体的分析还可以涉及本领域已知的任何蛋白组学方法，包括但不限于电泳方法、层析方法和涉及质谱的任何方法，包括涉及层析和质谱和/或稳定同位素标记质谱的方法和/或涉及蛋白消化以产生用于通过质谱或任何组合质谱与任何其它方法鉴定和/或定量的肽的方法。
在本发明的一个优选实施方案中，通过对获自癌症患者的血液、血清或血浆样品中的循环核小体进行亲和纯化来制备富集肿瘤来源的核小体的循环核小体制备物，并且通过涉及质谱的方法研究核小体制备物的表观遗传学组成。因此，在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)分离游离或结合组蛋白H1结合剂的核小体部分并分离其中一个部分；和
(iii)使用包含质谱的方法分析步骤(ii)中分离的核小体。
本领域技术人员将理解，取决于使用本文所述的正还是负选择方法，将确定分离哪个核小体部分(即正选择方法的结合部分或负选择方法的游离/洗脱部分)。
根据本发明的另一方面，提供了从生物样品中分离纯化的肿瘤DNA的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)分离未与结合剂结合的核小体；
(iii)从步骤(ii)分离的核小体样品中提取DNA；和
(iv)分析提取的DNA。
根据本发明的另一方面，提供了从生物样品中分离纯化的肿瘤DNA的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与结合选自H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5或H1.6的组蛋白H1变体或组蛋白H1修饰的结合剂接触；
(ii)分离与结合剂结合的核小体；
(iii)从步骤(ii)分离的核小体样品中提取DNA；
(iv)分析提取的DNA。
纯化或分离的肿瘤DNA的研究可涉及分析任何或所有类型的癌症相关DNA异常，包括但不限于表观遗传学分析，包括DNA序列的甲基化、点突变、易位、基因拷贝数量、微卫星异常和DNA链完整性。此外，可以使用任何DNA分析方法，包括但不限于DNA测序、甲基化DNA测序分析、PCR、BEAMing、NGS(靶向或全基因组)、数字PCR、冷PCR(在较低变性温度-PCR下的共扩增)、MAP(MIDI-激活的焦磷酸解)、PARE(重排末端的个性化分析)和质谱。
在本发明方法的一个实施方案中，生物样品是全血、血清、血浆、脑脊液、尿、粪便、痰、唾液或其它体液、或呼气、凝聚的呼气、或从其中的提取物或纯化物、或其稀释物。在另一个实施方案中、生物样品是血液、血清或血浆。在又一个实施方案中，生物样品是血清。
生物样品收集的方法在本领域中是众所周知的，并且应该理解，任何这样的收集方法都适用于本文所述的方法。
另外的表观遗传标志物
一旦已经分离出富集肿瘤来源的核小体，则可以分析其另外的表观遗传标志物(“表观遗传表位”)或对其进行进一步富集方法。
因此，根据本发明的一个方面，提供了用于检测生物样品中肿瘤衍生的核小体的表观遗传表位的免疫测定方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与结合组蛋白H1或选自H1.0、H1.10或H1.X的组蛋白H1变体的第一结合剂接触；
(ii)分离未与第一结合剂结合的核小体(即未结合的核小体)；
(iii)使步骤(ii)中获得的核小体与结合所述表位的第二结合剂接触；
(iv)检测和/或定量所述第二结合剂与所述表位的结合；和
(v)使用这种结合的存在或程度作为样品中肿瘤衍生的核小体的特定表位的存在的量度。
根据本发明的另一个方面，提供了用于检测生物样品中肿瘤衍生的核小体的表观遗传表位的免疫测定方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与结合选自H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5或H1.6的组蛋白H1变体或组蛋白H1修饰的第一结合剂接触；
(ii)分离与第一结合剂结合的核小体；
(iii)使步骤(ii)中获得的核小体与结合所述表位的第二结合剂接触；
(iv)检测和/或定量所述第二结合剂与所述表位的结合；和
(v)使用这种结合的存在或程度作为样品中肿瘤衍生的核小体的特定表位的存在的量度。
在一个实施方案中，所述表位选自组蛋白修饰、修饰的核苷酸、组蛋白变体或同种型、或核小体加合物或其变体。在另一个实施方案中，表位包含组蛋白修饰。在另一个实施方案中，组蛋白修饰包含H3K27Ac和/或5-甲基胞嘧啶。
文献中已经描述了多种表观遗传学修饰的核苷酸，并且已知DNA和/或DNA核苷酸残基中的表观遗传修饰模式在癌症中发生改变。其中最充分描述的包括5位胞嘧啶的甲基化。含有5-甲基胞嘧啶的DNA通常称为“甲基化DNA”。与健康细胞的DNA相比，估计癌细胞中DNA的甲基化减少约50％ (Guerrero-Preston et al, 2007; Soares et al, 1999)。然而，据报道，癌症相关的循环核小体水平增加平均为970％ (Holdenrieder et al, 2001)，并且cfDNA增加为约600％(Schwarzenbach et al, 2011)。
另外的表观遗传表位的测定可以分离进行或作为测定组的一部分进行。
在一个实施方案中，对从本文所述方法获得的分离的核小体样品进行进一步的富集步骤。因此，在一个实施方案中，本发明的方法还包括使分离的核小体与组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t结合剂接触。先前已显示组蛋白3变体H3.1、H3.2和H3t可用于ctDNA富集。
在该实施方案中，方法步骤可包括：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)分离游离或结合组蛋白H1结合剂的核小体部分并分离其中一个部分；
(iii)使分离的部分与组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t结合剂接触；
(iv)从样品中分离结合的核小体；和
(v)分析分离的核小体和/或相关DNA。
应该理解的是，任何上述方法可以作为独立方法使用，或与现有测试组合使用。
诊断方法
可以结合诊断方法使用本文描述的方法。例如，可以使用本文所述的方法富集样品以分离肿瘤来源的DNA或无细胞核小体，然后可以通过检测与疾病相关的另外表观遗传标志物将所述富集的样品用于诊断方法中。
因此，根据根据本发明的另一方面，提供了诊断或检测动物或人受试者中的癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(iii)分离游离或结合组蛋白H1结合剂的核小体部分并分离其中一个部分；
(iv)使步骤(iii)中获得的分离的核小体与第二结合剂接触，所述第二结合剂结合肿瘤衍生的核小体的表观遗传表位；
(v)检测和/或定量所述第二结合剂与所述表位的结合；和
(vi)使用所测量的生物标志物水平作为在受试者中存在所述疾病的指示。
检测和/或定量可以直接在纯化或富集的核小体样品上进行，或间接在其提取物上进行，或间接在其稀释物上进行。定量样品中存在的生物标志物的量可以包括确定样品中存在的生物标志物的浓度。本文描述的根据本发明的检测、监测和诊断的用途和方法可用于确认疾病的存在，通过评估疾病的发作和进展来监测疾病的发展，或评估疾病的改善或消退。检测、监测和诊断的用途和方法也可用于评估临床筛选、预后、疗法选择、治疗益处的评估，即用于药物筛选和药物开发的方法中。
本文描述的诊断方法可以进一步包括将生物样品中存在的第二结合剂的水平与一种或多种对照比较。在一个实施方案中，来自一种或多种对照的生物样品获自健康(或“正常”)患者和/或具有相关良性疾病的患者。在另一个实施方案中，来自一种或多种对照的生物样品获自健康患者。
如本文所述，本发明的方法可以组合使用两种免疫测定。因此，根据本发明的另一方面，提供了用于诊断或检测动物或人受试者中的癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)通过使用两种结合剂的免疫测定分析样品中的含有表观遗传特征且还含有组蛋白H1的无细胞核小体，其中一种结合剂涉及与特定的表观遗传特征结合，另一种涉及与组蛋白H1结合；
(iii)通过使用两种结合剂的免疫测定分析样品中的含有特定表观遗传特征以及具有和不具有组蛋白H1的无细胞核小体，其中一种结合剂涉及与表观遗传特征结合，另一种结合剂涉及与包括任何组蛋白H2、H3或H4表位，任何DNA表位或存在于染色质片段中的组蛋白H1表位以外的任何其它表位的共同核心核小体表位结合；和
(iv)使用步骤(ii)和(iii)中获得的免疫测定结果的组合作为指示受试者中存在所述癌症的组合生物标志物。
治疗方法
根据本发明的另一方面，提供了在动物或人受试者中治疗癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)将从受试者获得的生物样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)分离游离或结合组蛋白H1结合剂的核小体部分并分离其中一个部分；
(iii)将步骤(ii)中获得的分离的核小体与结合肿瘤衍生的核小体的表位的第二结合剂接触；
(iv)检测和/或测量所述第二结合剂与所述表位的结合水平；
(v)使用步骤(iv)中测量的生物标志物水平作为在受试者中存在所述疾病的指示；和
(vi)手术治疗步骤(v)中诊断为患有所述疾病的患者的受试者或给予其治疗剂。
如本文所述，将清楚的是，根据所使用的组蛋白H1结合剂以及是否需要负或正选择方法，哪个部分被分离。
如本文所述，本发明的方法可以组合使用两种免疫测定。因此，根据本发明的另一方面，提供了用于治疗动物或人受试者中的癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)通过使用两种结合剂的免疫测定分析样品中的含有表观遗传特征且还含有组蛋白H1的无细胞核小体，其中一种结合剂涉及与特定的表观遗传特征结合，另一种涉及与组蛋白H1结合；
(iii)通过使用两种结合剂的免疫测定分析样品中的含有特定表观遗传特征以及具有和不具有组蛋白H1的无细胞核小体，其中一种结合剂涉及与表观遗传特征结合，另一种结合剂涉及与包括任何组蛋白H2、H3或H4表位，任何DNA表位或存在于染色质片段中的组蛋白H1表位以外的任何其它表位的共同核心核小体表位结合；和
(iv)使用步骤(ii)和(iii)中测量的生物标志物水平作为所述受试者中存在所述癌症的指示；和
(v)手术治疗步骤(iv)中诊断为患有所述癌症的患者的受试者或给予其治疗剂。
本文所述的方法可以进一步包括将生物样品中存在的生物标志物的水平与一种或多种对照比较。在一个实施方案中，来自一种或多种对照的生物样品获自健康(或“正常”)患者和/或具有相关良性疾病的患者。在另一个实施方案中，来自一种或多种对照的生物样品获自健康患者。
因此，根据本发明的另一方面，提供了在有需要的个体中治疗癌症的方法，其包括向在生物样品中如本文定义的被鉴定为具有不同水平的生物标志物(当与从对照受试者获得的生物样品中的所述生物标志物的水平相比时)的患者给予治疗剂的步骤。
在一个实施方案中，癌症选自：乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肠癌、肝癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、口腔癌、头颈癌、白血病和骨肉瘤。
用于治疗所述疾病的治疗剂和手术方法是本领域技术人员熟知的。治疗癌症的方法包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法或其它治疗剂(例如药物或生物疗法，例如单克隆抗体)。
用途
根据本发明的另一方面，提供了组蛋白H1结合剂用于从生物样品中检测、分离和/或纯化肿瘤来源的无细胞核小体的用途。或者，根据本发明的另一方面，提供了组蛋白H1结合剂用于从生物样品的健康组织中检测、分离和/或纯化无细胞核小体的用途。如本文所述，组蛋白H1的存在或不存在或某些组蛋白H1变体和修饰的存在与源自肿瘤或健康组织的无细胞核小体有关，因此组蛋白H1结合剂可用作生物标志物来检测所述核小体。
在一个实施方案中，无细胞核小体是分离的和/或纯化的。
试剂盒
根据本发明的另一方面，提供了包含组蛋白H1结合剂的试剂盒在本文所述的任何方法中的用途。
应理解的是，本文所述的实施方案可以应用于本发明的所有方面。此外，本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都通过引用并入本文，如同完全阐述的那样。
本发明现在将参照以下非限制性实施例进行说明。
实施例1
涉及特异性结合组蛋白H1变体H1.0、H1.10或H1.X的抗体通过生产商推荐的方法生物素化并固定在链霉亲和素包被的磁珠(Dynal)上。使用磁力分离系统用上样缓冲液将珠洗涤数次。获自癌症患者的血清或血浆在上样缓冲液中稀释并加入到珠中。含有组蛋白H1变体的源自健康细胞的核小体被吸附到珠上。肿瘤来源的核小体(其不含组蛋白H1变体)保留在溶液中。通过磁力分离除去珠，留下肿瘤来源的核小体溶液。通过苯酚/氯仿法或其它标准提取方法提取核小体相关的ctDNA。可以分析提取DNA的癌症的遗传或表观遗传特征。
实施例2
涉及特异性结合组蛋白H1变体H1.0、H1.10或H1.X的抗体通过固相生产商推荐的方法固定在固体支持物上以产生亲和纯化层析柱。获自癌症患者的血清或血浆在上样缓冲液中稀释并加入到柱中。含有组蛋白H1变体的源自健康细胞的核小体被吸附到柱上。肿瘤来源的核小体(不含组蛋白H1变体)保留在溶液中并通过柱并作为洗出液收集。通过苯酚/氯仿法或其它标准提取方法提取核小体相关的ctDNA。可以分析提取DNA的癌症的遗传或表观遗传特征。
实施例3
使用如实施例1或实施例2的固相固定的抗H1变体抗体，分离肿瘤来源的核小体溶液。溶液中存在的分离的核小体通过免疫测定或通过蛋白组学方法包括质谱进行分析。
实施例4
涉及特异性结合组蛋白H1变体H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5或H1.6的抗体通过生产商推荐的方法生物素化并固定在链霉亲和素包被的磁珠(Dynal)上。使用磁力分离系统用上样缓冲液将珠洗涤数次。获自癌症患者的血清或血浆在上样缓冲液中稀释并加入到珠中。含有组蛋白H1变体的肿瘤来源的核小体被吸附到珠上。通过磁力分离将珠从溶液中分离出来。通过苯酚/氯仿法或其它标准提取方法从固相珠提取核小体相关的ctDNA。可以分析提取DNA的癌症的遗传或表观遗传特征。
实施例5
涉及特异性结合组蛋白H1变体H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5或H1.6的抗体通过固相生产商推荐的方法固定在固体支持物上以产生亲和纯化层析柱。获自癌症患者的血清或血浆在上样缓冲液中稀释并加入到柱中。含有组蛋白H1变体的肿瘤来源的核小体被吸附到柱上。健康细胞来源的核小体(不含组蛋白H1变体)保留在溶液中并通过柱。洗涤柱并通过苯酚/氯仿法或其它标准提取方法提取核小体相关的ctDNA。可以分析提取DNA的癌症的遗传或表观遗传特征。
实施例6
如实施例4或实施例5使用固相抗H1变体分离肿瘤来源的固相结合核小体的制备物。通过免疫测定或通过蛋白组学方法包括质谱分析分离的核小体。
实施例7
涉及特异性结合组蛋白H1本身的抗体通过生产商推荐的方法生物素化并固定在链霉亲和素包被的磁珠(Dynal)上。使用磁力分离系统用上样缓冲液将珠洗涤数次。获自癌症患者的血清或血浆在上样缓冲液中稀释并加入到珠中。含有组蛋白H1的核小体被吸附到珠上。肿瘤来源的核小体(不含组蛋白H1)保留在溶液中。通过磁力分离将珠从溶液中分离出来。一旦珠被除去，存在于溶液中的分离的核小体通过免疫测定或通过蛋白组学方法包括质谱进行分析。
实施例8
涉及特异性结合组蛋白H1本身的抗体通过固相生产商推荐的方法固定在固体支持物上以产生亲和纯化层析柱。获自癌症患者的血清或血浆在上样缓冲液中稀释并加入到柱中。含有组蛋白H1的核小体被吸附到柱上。肿瘤来源的核小体(不含组蛋白H1)保留在溶液中并穿过柱。收集肿瘤来源的核小体溶液作为洗出液。存在于溶液中的分离的核小体通过ELISA或通过包括蛋白组学方法质谱进行分析。
实施例9
如实施例7或实施例8制备肿瘤来源的核小体溶液。通过苯酚/氯仿法或其它标准提取方法从溶液中提取核小体相关的ctDNA。可以分析提取DNA的癌症的遗传或表观遗传特征。
实施例10
如实施例1-9中任一实施例使用固相固定的抗H1抗体分离获自受试者的体液样品中的肿瘤来源的核小体。存在于溶液中的分离的核小体和/或相关DNA通过本领域已知的方法分析。
实施例11
通过生产商推荐的方法将涉及特异性结合组蛋白H1本身或组蛋白H1变体的抗体生物素化并固定在链霉亲和素包被的磁珠(Dynal)上。使用磁力分离系统用上样缓冲液将珠洗涤数次。获自癌症患者的血清或血浆在上样缓冲液中稀释并加入到珠中。含有组蛋白H1变体的源自健康细胞的核小体被吸附到珠上。肿瘤来源的核小体(其不含组蛋白H1变体)保留在溶液中。通过磁力分离除去珠，留下主要为肿瘤来源的核小体溶液。然后使用结合完整核小体的固相抗组蛋白H2、H3和/或H4表位或抗核小体捕获抗体和生物素化单克隆抗5-甲基胞嘧啶检测抗体，使用用于核小体相关的核苷酸5-甲基胞嘧啶的ELISA方法，如下测定肿瘤核小体溶液中的甲基化DNA：将抗组蛋白H2、H3或H4抗体在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的溶液加入到微量滴定孔(100 µL/孔)中并在4℃孵育过夜以用捕获抗体包被孔。倾析过量的抗组蛋白抗体。将牛血清白蛋白(20g/L)溶液加入孔中(200 µL/孔)并在室温下孵育30分钟以封闭孔上过量的蛋白结合位点。倾析过量的牛血清白蛋白溶液，并用洗涤缓冲液(200 µL/孔，含1％吐温20的0.05M TRIS/HCl缓冲液pH7.5)洗涤孔三次。将样品(10 µL/孔)和测定缓冲液(50 µL/孔, 0.05M TRIS/HCl pH 7.5，含有0.9% NaCl, 0.05%脱氧胆酸钠和1%Nonidet P40替代物)加入到孔中，在室温在轻微搅拌下孵育90分钟。将样品和测定缓冲液混合物倾析，并用洗涤缓冲液(200μL/孔)将孔洗涤三次。加入生物素化的抗5-甲基胞嘧啶检测抗体的溶液(50μL/孔)并在室温下在轻微搅拌下孵育90分钟。倾析过量的检测抗体，再次用洗涤缓冲液(200 µL/孔)洗涤孔三次。加入含有链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物的溶液(50 µL/孔)并在室温在轻微搅拌下孵育30分钟。倾析过量的缀合物，再次用洗涤缓冲液(200 µL/孔)洗涤孔三次。加入有色底物溶液(100 µL/孔，2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)，并在室温下在轻微搅拌下孵育20分钟。使用标准微量滴定板读取仪在405nm的波长处测量孔的光密度(OD)。观察到随着核小体相关的抗5-甲基胞嘧啶浓度的增加，颜色增加的剂量反应曲线，且在不存在5-甲基胞嘧啶(胎牛血清)的情况下观察到低背景信号。阳性ELISA信号表明通过ELISA检测到的5-甲基胞嘧啶掺入包含组蛋白(但不是组蛋白H1)和DNA二者的完整核小体中，因为(i)含有组蛋白H1的核小体已通过亲和纯化除去，(ii)捕获抗体结合样品中的组蛋白H2、H3和/或H4表位，并且(iii)检测抗体结合DNA的5-甲基胞嘧啶组分。
实施例12
获自受试者的体液样品中的肿瘤来源的核小体使用固相固定的抗-H1抗体如实施例11分离。分离的核小体通过实施例11所述的ELISA方法分析，但使用生物素化的单克隆抗修饰的组蛋白检测抗体；例如涉及结合H3K9(Me)3的抗体。
实施例13
如实施例11采用固相固定的抗-H1抗体分离获自受试者的体液样品中的肿瘤来源的核小体。分离的核小体通过实施例11中所述的ELISA方法分析，但使用生物素化的单克隆抗组蛋白同种型检测抗体；例如涉及结合H2AZ的抗体。
实施例14
如实施例11采用固相固定的抗-H1抗体分离获自受试者的体液样品中的肿瘤来源的核小体。分离的核小体通过实施例11中所述的ELISA方法分析，但使用涉及结合与分离的循环无细胞核小体加合的非组蛋白蛋白质的生物素化单克隆抗体；例如涉及结合雄激素受体的抗体。结果显示，与所关注的蛋白加合的肿瘤来源的无细胞核小体存在于受试者的血液循环(或其它体液)中。
实施例15
血清样品获自29名健康受试者、29名诊断为结肠直肠癌的受试者和11名诊断为胰腺癌的受试者。
根据标准程序，用涉及结合非组蛋白染色质蛋白的抗体包被塑料微量滴定孔并封闭。通过生物素化标记涉及结合组蛋白H1本身的抗体和涉及结合存在于所有或大多数核小体上的共同核心组蛋白的抗体。对每个样品进行两次免疫测定。
在第一免疫测定中；将样品(10 µL/孔)和测定缓冲液(50 µL/孔, 0.05M TRIS/HCl pH 7.5，含有0.9% NaCl, 0.05%脱氧胆酸钠和1% Nonidet P40替代物)加入到孔中并在室温在轻微搅拌下孵育90分钟。将样品和测定缓冲液混合物倾析并用洗涤缓冲液(200 µL/孔)将孔洗涤三次。加入生物素化的抗组蛋白H1检测抗体的溶液(50 µL/孔)并在室温下在轻微搅拌下孵育90分钟。倾析过量的检测抗体，并再次用洗涤缓冲液(200 µL/孔)洗涤孔三次。加入含有链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物的溶液(50 µL/孔)并在室温在轻微搅拌下孵育30分钟。倾析过量的缀合物，再次用洗涤缓冲液(200 µL/孔)洗涤孔三次。加入有色底物溶液(100 µL/孔，2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)，并在室温在轻微搅拌下孵育20分钟。使用标准微量滴定板读取仪在405nm的波长下测量孔的免疫测定1的光密度(OD1)。所有测量均一式两份进行，并使用平均结果。
在第二免疫测定中；将样品(10 µL/孔)和测定缓冲液(50 µL/孔, 0.05M TRIS/HCl pH 7.5，含有0.9% NaCl, 0.05%脱氧胆酸钠和1% Nonidet P40替代物)加入到孔中并在室温在轻微搅拌下孵育90分钟。将样品和测定缓冲液混合物倾析并用洗涤缓冲液(200 µL/孔)将孔洗涤三次。加入生物素化的抗核心核小体检测抗体溶液(50 µL/孔)并在室温在轻微搅拌下孵育90分钟。倾析过量的检测抗体，并再次用洗涤缓冲液(200 µL/孔)洗涤孔三次。加入含有链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物的溶液(50 µL/孔)并在室温在轻微搅拌下孵育30分钟。倾析过量的缀合物，再次用洗涤缓冲液(200 µL/孔)洗涤孔三次。加入有色底物溶液(100 µL/孔，2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)，并在室温在轻微搅拌下孵育20分钟。使用标准微量滴定板读取仪在405nm的波长下测量孔的免疫测定2的光密度(OD2)。所有测量均一式两份进行，并使用平均结果。
对于每个样品计算比率OD2：OD1。所有69名受试者的OD2：OD1比率结果显示于图1中。对于29名健康受试者，发现的平均免疫测定比率为8.7。对于诊断为结肠直肠癌的29名受试者，平均比率为15.9。对于诊断为胰腺癌的11名受试者，平均比率为17.1。这表明增加的比例与癌症来源的核小体有关。
此外，每个受试者的个体结果以递增的截止水平被用作癌症的生物标志物。在12的截止时；该比率对于诊断为胰腺癌的受试者中的73％(8/11)和诊断为结肠直肠癌的受试者中的41％(12/29)提供阳性结果，具有79％的临床特异性(29位健康受试者中的6个假阳性结果)。在22的截止时；该比率对于诊断为胰腺癌的受试者中的36％(4/11)和诊断为结肠直肠癌的受试者中的34％(10/29)提供阳性结果，具有93％的临床特异性(29个健康受试者中的2个假阳性结果)。图1中的结果显示本文所述的方法可用于检测癌症。这些结果还表明，本文所述的组合免疫测定结果可以用作癌症疾病的组合生物标志物。
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Claims (21)

1.通过亲和纯化从生物样品中分析肿瘤来源的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)从样品中分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体；和
(iii)通过免疫测定或质谱分析分离的核小体。
2.权利要求1的方法，其中所述组蛋白H1结合剂选自：结合组蛋白H1蛋白、其变体、同种型或修饰的结合剂。
3.权利要求1或2的方法，其中所述组蛋白H1结合剂选自：结合组蛋白H1蛋白或选自H1.0、H1.10或H1.X的组蛋白H1变体的结合剂。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中通过免疫测定或质谱分析分离的核小体中选自以下的表观遗传特征的包含：翻译后组蛋白修饰、组蛋白同种型、修饰核苷酸或加合的非组蛋白蛋白质。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中分析分离的核小体的步骤包括免疫测定。
6.权利要求1至4中任一项的方法，其中分析分离的核小体的步骤包括质谱。
7.一种从生物样品中分离纯化的肿瘤DNA的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与组蛋白H1结合剂接触；
(ii)分离未与组蛋白H1结合剂结合的核小体；
(iii)从步骤(ii)分离的核小体样品中提取DNA；和
(iv)分析提取的DNA。
8. 权利要求7的方法，其中分析提取的DNA的步骤包括：DNA测序、甲基化DNA测序分析、PCR、BEAMing、NGS(靶向或全基因组)、数字PCR、冷PCR(在较低变性温度-PCR下共扩增)、MAP(MIDI-激活的焦磷酸解)、PARE(重排末端的个性化分析)或质谱。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其还包括使分离的核小体与组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t结合剂接触。
10.一种用于检测生物样品中肿瘤衍生的核小体的表观遗传表位的免疫测定方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与包含组蛋白H1结合剂的第一结合剂接触；
(ii)分离未与第一结合剂结合的核小体；
(iii)使核小体与结合所述表位的第二结合剂接触；
(iv)检测和/或定量所述第二结合剂与所述表位的结合；和
(v)使用这种结合的存在或程度作为样品中肿瘤衍生的核小体的特定表位的存在的量度。
11.权利要求10的方法，其中所述表位包含组蛋白修饰。
12.权利要求11的方法，其中所述组蛋白修饰包含H3K27Ac和/或5-甲基胞嘧啶。
13.权利要求10的方法，其中所述表位包含修饰的核苷酸。
14.权利要求10的方法，其中所述表位包含组蛋白H2A、H2B、H3或H4变体或同种型。
15.权利要求10的方法，其中所述表位包含核小体加合物或其变体。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中所述生物样品包括血液、血清、血浆、经血、脑脊液(CSF)、子宫内膜液、尿液、唾液或其它体液(粪便、泪液、滑液、痰)、呼气，例如作为凝聚的呼气、或从其中的提取物或纯化物、或其稀释物。
17.权利要求16的方法，其中所述生物样品包含血液、血清或血浆样品。
18.一种用于检测动物或人受试者中的癌症的方法，其包括以下步骤：
(v)从受试者获得生物样品；
(vi)通过使用两种结合剂的免疫测定分析样品中的含有表观遗传特征且还含有组蛋白H1的无细胞核小体，其中一种结合剂涉及与特定的表观遗传特征结合，另一种涉及与组蛋白H1结合；
(vii)通过使用两种结合剂的免疫测定分析样品中的含有特定表观遗传特征以及具有和不具有组蛋白H1的循环无细胞核小体，其中一种结合剂涉及与表观遗传特征结合，另一种结合剂涉及与共同核心核小体表位结合，所述共同核心核小体表位包括任何组蛋白H2、H3或H4表位、任何DNA表位或存在于染色质片段中的并非组蛋白H1表位的任何其它表位；和
(viii)使用步骤(ii)和(iii)中获得的免疫测定结果的组合作为指示受试者中存在所述癌症的组合生物标志物。
19.权利要求18的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肠癌、肝癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、口腔癌、头颈癌、白血病和骨肉瘤。
20.组蛋白H1结合剂用于从生物样品中检测、分离和/或纯化肿瘤来源的无细胞核小体的用途。
21.包含组蛋白H1结合剂的试剂盒在权利要求1至19中任一项描述的方法中的用途。
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