RU2685936C2 - Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров - Google Patents
Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров Download PDFInfo
- Publication number
- RU2685936C2 RU2685936C2 RU2017136513A RU2017136513A RU2685936C2 RU 2685936 C2 RU2685936 C2 RU 2685936C2 RU 2017136513 A RU2017136513 A RU 2017136513A RU 2017136513 A RU2017136513 A RU 2017136513A RU 2685936 C2 RU2685936 C2 RU 2685936C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solid phase
- aptamer
- dna
- blood
- conjugate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 6
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 21
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 9
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 5
- 241001421711 Mithras Species 0.000 description 4
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 4-pentoxyphenol Chemical compound CCCCCOC1=CC=C(O)C=C1 JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 241001455930 Obelia longissima Species 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000886 photobiology Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом. Обрабатывают твердую фазу биоспецифическими реагентами, отделяют непрореагировавшую жидкую фазу, инкубируют с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом. Далее обрабатывают твердую фазу репортером, разделяют жидкую и твердую фазы. Проводят анализ твердой фазы. В качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Вio, комплементарным константному концевому участку ДНК-аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный конъюгатом того же олигонуклеотида с Са-регулируемым фотопротеином обелином. Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного, универсального, экспрессного и технологичного биолюминесцентного способа выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов. 3 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способу выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, путем иммобилизации биоспецифического ДНК-аптамера (группы биоспецифических ДНК-аптамеров) на поверхности магнитных частиц, последовательных процедур промывки и инкубации анализируемого образца, промывки и инкубации универсального репортера - конъюгата Са2+-регулируемого фотопротеина обелина с олигонуклеотидом, комплементарным константной концевой последовательности ДНК-аптамера (группы биоспецифических ДНК-аптамеров). Биолюминесцентный сигнал репортера регистрируется при добавлении раствора CaCl2.
Известен микроскопический способ выявления циркулирующих опухолевых клеток (микроэмбол и апоптотических телец) в крови больных раком легкого человека с помощью пары аптамеров, меченных флуоресцентными метками [патент РФ №2571821, МПК G01N 33/18 (2006.01), опубл. 20.12.2015].
Недостатками способа являются низкая производительность и высокая стоимость флуоресцентной микроскопии.
Известен способ биолюминесцентного микроанализа с использованием специфических конъюгатов Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его производных с иммуноглобулинами и олигонуклеотидами [патент РФ №2497128, МПК G01N 33/532 (2006.01), опубл. 17.10.2013].
Недостатком способа является необходимость синтезировать биоспецифические конъюгаты в зависимости от природы выявляемой мишени.
В качестве прототипа взята диагностическая тест-система на основе аптамеров [патент РФ №117150, МПК С12М 1/18 (2006.01), опубл. 06.06.2012], включающая n-луночный планшет, лунки которого покрыты слоем немеченых аптамеров, специфичных к заданной биологической мишени. Выявление мишени в образце проводилось после серии процедур последовательной инкубации исследуемого образца, раствора другого аптамера, меченного флуоресцентным красителем, (репортера) и промывки. Регистрация проводилась с помощью планшетного спектрофлуориметра.
Недостатками системы является использование поверхности пластиковых планшет, обладающих ограниченной поверхностной активностью, низкая чувствительность флуоресцентной метки, а также высокая стоимость планшетного спектрофлуориметра.
Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного, экспрессного и технологичного биолюминесцентного способа выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов.
Технический результат достигается тем, что в способе выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров, включающем обработку твердой фазы биоспецифическими реагентами, отделение непрореагировавшей жидкой фазы, инкубацию с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом, дальнейшую обработку твердой фазы репортером, разделение жидкой и твердой фаз и анализ твердой фазы, новым является то, что в качестве твердой фазы для анализа используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, обладающие более высокой площадью по сравнению с поверхностью лунок пластиковых планшетов, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio, комплементарным константному концевому участку аптамера, а в качестве репортера -другой ДНК-аптамер, меченный коньюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином.
Отличие заявляемого способа от прототипа заключается в том, что в заявляемом изобретении в качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio, комплементарным константному концевому участку аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный коньюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином.
Перечисленные выше отличительные от прототипа признаки позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».
Признаки, отличающие заявляемые технические решения от прототипа, не выявлены в других технических решениях и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень»
Заявленный способ диагностики иллюстрируется примерами, описывающими предел обнаружения биолюминесцентной метки для выявления мишеней, ассоциированных с раком легкого, и результаты анализа образцов крови пациентов с диагнозом рак легкого, другими заболеваниями легкого, а также здоровых доноров.
В настоящее время для диагностики рака легкого применяют иммуноферментный анализ ряда белковых онкомаркеров с использованием моноклональных антител. Как правило, эти онкомаркеры могут выявляться при различных типах рака [Sung, H.J., Cho, J.Y. Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics // В MB Reports. - 2008. - V. 41. - №9. - P. 615-625], и потому остается актуальным поиск новых способов специфичной лабораторной диагностики рака легкого. В данном подходе в качестве альтернативы антителам предлагается использовать аптамеры.
Аптамеры - короткие одноцепочечные рибо- либо дезоксирибо-олигонуклеотиды, обладающие определенной пространственной структурой благодаря образованию внутримолекулярных локальных дуплексов и стэкинг-взаимодействий. С помощью технологии SELEX получают высокоспецифичные аптамеры практически к любой мишени. По сравнению с антителами аптамеры как биоспецифические аффинные молекулы имеют ряд определенных преимуществ, главными из которых являются возможность их химического синтеза и модификации, а также стабильность при хранении.
К постоперационной ткани аденокарциномы легкого была получена группа ДНК-аптамеров, характеризующихся высоким связыванием с элементами опухолевой ткани и отрицательным связыванием со здоровой тканью легкого и клетками крови [Zamay, G.S. Aptamers selected to postoperative lung adenocarcinoma detect circulating tumor cells in human blood / O.S. Kolovskaya, T.N. Zamay, Y.E. Glazyrin, A.V. Krat, O. Zubkova, E. Spivak, M. Wehbe, A. Gargaun, D. Muharemagic, M. Komarova, V. Grigorieva, A. Savchenko, A.A. Modestov, M.V. Berezovski, A.S. Zamay // Molecular Therapy. - 2015. - V. 23. - №9. - P. 1486-1496].
Данные аптамеры длинной в 80 нуклеотидных оснований (н.о) имеют константные участки с 5' и 3'- концов (20 н.о) и вариабельную часть (40 н.о), отвечающую за специфическое связывание аптамера со своими мишенями.
Для обеспечения высокой чувствительности анализа в качестве репортера в работе использовали новый, полученный сайт-направленным мутагенезом вариант рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина (22,2 кДа) гидроидного полипа Obelia longissima А6С, имеющего цистеиновый остаток на доступном для синтеза NH2-конце молекулы. Это позволило увеличить выход целевого конъюгата до 83% [Krasitskaya V.V. Mutants of Ca2+-regulated photoprotein obelin for site-specific conjugation / V.V. Krasitskaya, L.P. Burakova, A.A. Komarova, E.E. Bashmakova, L.A. Frank // Photochemistry and Photobiology. - 2017. - V. 93. - №2. - P. 553-557]. Биолюминесцентный сигнал этого белка инициируется присоединением Са2+, не зависит от дополнительных субстратов, кислорода и пр. и всегда пропорционален количеству белка.
На основе данного белка был получен конъюгат с олигонуклеотидом, комплементарным 5'-константному участку аптамеров, который может быть использован для выявления всей группы аптамеров, полученных к аденокарциноме легкого. Предел обнаружения конъюгата - около 20 амоль, обеспечивает высокую чувствительность биолюминесцентного анализа с использованием данного конъюгата в качестве метки.
Ранее был описан конъюгат обелина с РНК-аптамером [Vorobjeva М. A. RNA aptamer against autoantibodies associated with multiple sclerosis and bioluminescent detection probe on its basis / M.A. Vorobjeva V.V. Krasitskaya, A.A. Fokina, V.V. Timoshenko, G.A. Nevinsky, A.G. Venyaminova, L.A. Frank // Analytical Chemistry. -2014. - V. 86. - №5. - P. 2590-2594], обладающий специфичностью к единственной мишени - патогенному аутоантителу при рассеянном склерозе. В заявленном способе предлагается использовать конъюгат обелина с олигонуклеотидом, комплементарным константному участку группы аптамеров связанными с одним диагнозом. Например, в работе [Zamay, G.S. Aptamers selected to postoperative lung adenocarcinoma detect circulating tumor cells in human blood / O.S. Kolovskaya, T.N. Zamay, Y.E. Glazyrin, A.V. Krat, O. Zubkova, E. Spivak, M. Wehbe, A. Gargaun, D. Muharemagic, M. Komarova, V. Grigorieva, A. Savchenko, A.A. Modestov, M.V. Berezovski, A.S. Zamay // Molecular Therapy. - 2015. -V. 23. - №9. - P. 1486 - 1496] описано 10 аптамеров, полученных на мишени, ассоциированной с раком легкого, и все они имеют одинаковые концевые участки. Таким образом, предложенный нами способ пригоден для выявления не только одной мишени (при использовании одной пары аптамеров), но и группы мишеней, ассоциированных с данным заболеванием (при использовании смеси аптамеров).
Получение конъюгата фотопротеина обелина с олигонуклеотидом, комплементарным константным участкам на 5' концах ДНК-аптамеров, проводили химическим синтезом с небольшими модификациями способа, разработанного ранее для РНК-аптамера [Vorobjeva М.A. RNA aptamer against autoantibodies associated with multiple sclerosis and bioluminescent detection probe on its basis / M.A. Vorobjeva V.V. Krasitskaya, A.A. Fokina, V.V. Timoshenko, G.A. Nevinsky, A.G. Venyaminova, L.A. Frank // Analytical Chemistry. - 2014. - V. 86. - №5. - P. 2590-2594].
Олигонуклеотид 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-(CH2)6-NH2, комплементарный 5'-константным участкам аптамеров, несущий свободную NH2-группу (10 нмоль), модифицировали 50-кратным молярным избытком сукцинимидного эфира 4-(N-малеимидометил-) циклогексановой кислоты (SMCC) (Thermo Scientific, США) (свежеприготовленный раствор в диметилсульфоксиде) в течение 1,5 часов при комнатной температуре в 0,1 М NaHCO3. Избыток реагентов удаляли с помощью гель-фильтрации на колонке HiTrap Desalting Columns (GE Healthcare, Великобритания), уравновешенной буфером 20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), на хроматографической системе АKТА purifier (GE Healthcare, Великобритания). SMCC-активированный олигонуклеотид инкубировали с 3-х кратным молярным избытком мутантного варианта фотопротеина обелина с заменой Ala6→Cys в течение 12-14 часов при 4°С.
Полученный конъюгат выделяли анион-обменной хроматографией на колонке Mono Q (GE Healthcare, Великобритания), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА. Элюцию полученного конъюгата проводили линейным градиентом NaCl (0-1 М), выход целевого конъюгата - 71±12%.
Для определения предела обнаружения конъюгата в лунки планшета вносили раствор конъюгата разной концентрации (по 100 мкл в 20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА и 0,1% бычьего сывороточного альбумина) и измеряли биолюминесцентный сигнал сразу после быстрого добавления раствора СаС12 (100 мкл, 0,1 М в 0,1 М Tris-HCl, рН 8.8) с помощью планшетного люминометра LB 940 Multimode Reader Mithras (Berthold, Германия). Сигнал интегрировали 5 с. В контрольную лунку вносили буфер без конъюгата. Все измерения проводили в трех параллелях. Предел обнаружения определяли, как количество конъюгата, при котором отношение сигнала к контролю составляет 3. Предел обнаружения конъюгата составил 20,8 амоль (фиг. 1).
Для осуществления заявляемого способа растворы ДНК-аптамеров перед использованием прогревали при температуре 95°С в течение 5 минут и охлаждали 5 минут на льду. Образцы плазмы крови человека перед исследованием инкубировали с маскирующей дрожжевой РНК (0,1 нг/мкл), встряхивая 30 мин при комнатной температуре.
Полученную плазму инкубировали с магнитными микрочастицами с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина (Promega, США) (30 мкг/анализ), эквимолярной смесью ДНК- аптамера и биотинилированным олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio в течение 30 мин при встряхивании, при комнатной температуре (конечная концентрация аптамера и олигонуклеотида 250 нМ).
Частицы промывали трижды, суспендируя в растворе 20 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА, фиксируя частицы магнитом на стенке пробирки и удаляя надосадочную жидкость. К частицам добавляли раствор аптамера в конечной концентрации 250 нМ, инкубировали и промывали аналогичным образом. Далее к частицам добавляли конъюгат обелина с олигонуклеотидом, комплементарным 5'-константным участкам аптамеров. Инкубировали и промывали.
Суспензию частиц в 60 мкл буфера (20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА) переносили в лунки непрозрачного 96-луночного микропланшета (Costar, США) и биолюминесцентный сигнал образовавшихся комплексов на их поверхности измеряли с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 Multimode Reader (Berthold, Германия) сразу после добавления 0,1 М СаСl2, в 0,1 М Tris-HCl рН 7,0 в течение 5 с.
Пример 1.
Образцы плазмы крови человека перед исследованием инкубировали с маскирующей дрожжевой РНК (0,1 нг/мкл) при встряхивании 30 мин.
Перед использованием растворы ДНК-аптамеров LC-17 и LC-18, прогревали при 95°С в течение 5 мин и охлаждали 5 мин на льду.
240 мл полученной плазмы инкубировали с магнитными микрочастицами с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина (Promega, США) (30 мкг/анализ), эквимолярной смесью аптамера LC-18 и биотинилированным олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio (конечная концентрация аптамера и олигонуклеотида 250 нМ) в течение 30 мин при встряхивании, при комнатной температуре.
Частицы промывали трижды, суспендируя в растворе 20 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА, фиксируя частицы магнитом на стенке пробирки и удаляя надосадочную жидкость. К частицам добавляли раствор ДНК-аптамера LC-17 в конечной концентрации 250 нМ, инкубировали и промывали аналогичным образом. Далее к частицам добавляли конъюгат обелина с олигонуклеотидом, который связывался с константной областью ДНК-аптамера LC-17. Инкубировали и промывали.
Суспензию частиц в 60 мкл буфера (20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА) переносили в лунки непрозрачного 96-луночного микропланшета (Costar, США) и биолюминесцентный сигнал образовавшихся комплексов на их поверхности измеряли с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 Multimode Reader (Berthold, Германия) сразу после добавления 0,1 М СаСl2, в 0,1 М Tris-HCl рН 7,0 в течение 5 с.
Пример 2.
Образцы плазмы крови человека перед исследованием инкубировали с маскирующей дрожжевой РНК (0,1 нг/мкл) при встряхивании 30 мин.
Перед использованием раствор ДНК-аптамера LC-17 и LC-18 прогревали при 95°С в течение 5 мин и охлаждали 5 мин на льду.
240 мл полученной плазмы инкубировали с магнитными микрочастицами с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина (Promega, США) (30 мкг/анализ), эквимолярной смесью ДНК-аптамера LC-17 и биотинилированным олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio (конечная концентрация аптамера и олигонуклеотида 250 нМ) в течение 30 мин при встряхивании, при комнатной температуре.
Частицы промывали трижды, суспендируя в растворе 20 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА, фиксируя частицы магнитом на стенке пробирки и удаляя надосадочную жидкость. К частицам добавляли раствор ДНК-аптамера LC-18 в конечной концентрации 250 нМ, инкубировали и промывали аналогичным образом. Далее к частицам добавляли конъюгат обелина с олигонуклеотидом, который связывался с константной областью аптамера LC-18. Инкубировали и промывали.
Суспензию частиц в 60 мкл буфера (20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА) переносили в лунки непрозрачного 96-луночного микропланшета (Costar, США) и биолюминесцентный сигнал образовавшихся комплексов на их поверхности измеряли с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 Multimode Reader (Berthold, Германия) сразу после добавления 0,1 М CaCl2, в 0,1 М Tris-HCl рН 7,0 в течение 5 с. Схема проведения анализа приведена на фигуре 2.
Представленные исследования выполнены в соответствии с документами, регламентирующими этические нормы проведения исследований с использованием биологического материала человеческого происхождения (решение Локального этического комитета КККОД №8/2011 от 16.03.2011).
Венозная кровь пациентов, перенесших полную резекцию опухоли, отобрана до операций и предоставлена сотрудниками КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского». Образцы плазмы крови 56 пациентов взяты перед проведением операции по удалению образований в легких. Диагнозы пациентов были верифицированы морфологически. В эксперименте использовали образцы пациентов без диагноза рак легкого (здоровые доноры), а также с другими заболеваниями легких и видами рака.
Сигналы, полученные от образцов крови здоровых доноров, достоверно отличались от сигналов остальных пациентов (р<0,05).
Результаты проведенных исследований образцов плазмы крови по примеру 1 представлены на фигуре 3, где 1, 2, 3 - среднее значение сигнала в группе с железистоклеточным (n=22), плоскоклеточным (n=23) раком легкого и в контрольной группе ± SD (n=19), соответственно, 4 - метастазы в легкое (n=3); 5 - туберкулез (n=2); 6 - хондрогамартома (n=1); отн.свет.ед. - относительные световые единицы.
Преимущества заявляемого способа заключаются в том, что в качестве твердой фазы используются магнитные частицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, обладающие более высокой площадью поверхности по сравнению с поверхностью лунок пластиковых планшетов, и в использовании высокочувствительного биолюминесцентного репортера - конъюгата Са2+-регулируемого фотопротеина обелина с олигонуклеотидом, позволяющего выявлять одновременно несколько мишеней, связанных с диагностикой данного заболевания, при использовании группы ДНК-аптамеров со специфичностью к разным мишеням, но одинаковой константой концевой областью.
Claims (1)
- Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров, включающий обработку твердой фазы биоспецифическими реагентами, отделение непрореагировавшей жидкой фазы, инкубацию с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом, дальнейшую обработку твердой фазы репортером, разделение жидкой и твердой фаз и анализ твердой фазы, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio, комплементарным константному концевому участку ДНК-аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный конъюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136513A RU2685936C2 (ru) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136513A RU2685936C2 (ru) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017136513A RU2017136513A (ru) | 2019-04-17 |
| RU2017136513A3 RU2017136513A3 (ru) | 2019-04-17 |
| RU2685936C2 true RU2685936C2 (ru) | 2019-04-23 |
Family
ID=66168126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017136513A RU2685936C2 (ru) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2685936C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140342918A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-20 | University Of Ottawa | Method For Affinity Purification |
-
2017
- 2017-10-16 RU RU2017136513A patent/RU2685936C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140342918A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-20 | University Of Ottawa | Method For Affinity Purification |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| E. Smith, Colin D. Medley et.al. Aptamer-Conjugated Nanoparticles for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells Anal. Chem., 2007, 79 (8), pp 3075-3082. * |
| Jwa-Min Nam, Nanoparticle-Based Bio-Bar Codes for the Ultrasensitive Detection of Proteins, Science 26.09.2003: Vol. 301, Issue 5641, pp. 1884-1886. * |
| Jwa-Min Nam, Nanoparticle-Based Bio-Bar Codes for the Ultrasensitive Detection of Proteins, Science 26.09.2003: Vol. 301, Issue 5641, pp. 1884-1886. Р.Р. Гарафутдинов. Твердофазная полимеразная цепная реакция, Вестник Башкирского университета, 2012, стр. 1745-1748. * |
| Р.Р. Гарафутдинов. Твердофазная полимеразная цепная реакция, Вестник Башкирского университета, 2012, стр. 1745-1748. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017136513A (ru) | 2019-04-17 |
| RU2017136513A3 (ru) | 2019-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104067124B (zh) | 用于检测含核苷酸的核小体的方法 | |
| Nilsson et al. | Quantitative phosphoproteomic analysis of the STAT3/IL-6/HIF1α signaling network: an initial study in GSC11 glioblastoma stem cells | |
| RU2716494C2 (ru) | Способ детекции нуклеосом, содержащих гистоновые варианты | |
| KR20210093266A (ko) | 엑소좀 막단백질과 mRNA를 동시에 검출하는 방법 | |
| JP2016533752A (ja) | オリゴヌクレオチドプローブおよびその使用 | |
| US9983203B2 (en) | Method for protein analysis | |
| CN108603884A (zh) | 富集无细胞核小体的方法 | |
| US20210318310A1 (en) | Methods for monitoring polymorphonuclear myeloid derived suppressor cells | |
| EP3365681A1 (en) | Method for detecting nucleosomes containing histone modifications and variants | |
| Lukic et al. | An integrated approach for comparative proteomic analysis of human bile reveals overexpressed cancer-associated proteins in malignant biliary stenosis | |
| US20200362349A1 (en) | Application of aptamer in recognition and binding of alkaline phosphatase heterodimer or tumor detection | |
| JP6645981B2 (ja) | サーマルシフトアッセイを使用して薬物反応の減少の指標となるバイオマーカーを識別するための方法 | |
| Bashmakova et al. | Bioluminescent aptamer-based solid-phase microassay to detect lung tumor cells in plasma | |
| US20220127677A1 (en) | Preparation device and preparation method for exosome liquid biopsy sample and method for analyzing exosome liquid biopsy sample prepared thereby | |
| CA3029178C (en) | Double-stranded nucleic acid signal probe and method for detecting target molecule using same | |
| CN106011142B (zh) | 一种特异识别psa蛋白的寡核苷酸配基p7-26的序列和应用 | |
| KR101995189B1 (ko) | 비침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| RU2685936C2 (ru) | Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров | |
| CN112251507A (zh) | 一种脑卒中诊疗效果评价相关微生物 | |
| US20100120033A1 (en) | Method for measuring dna methylation | |
| SK282091B6 (sk) | Spôsob imunomagnetického oddeľovania buniek | |
| CN110088629A (zh) | 通过识别对fgfr抑制剂治疗敏感的患者来治疗癌症的改进方法 | |
| KR102498862B1 (ko) | 엑소좀 액체생검 샘플 분석방법 | |
| Kotani et al. | Proximity Labeling and Proteomics: Get to Know Neighbors | |
| Xu et al. | Detection of Cancer-Derived Exosomes Using a Sensitive Colorimetric Aptasensor |