CN114829939A

CN114829939A - 无细胞核小体作为生物标志物的用途

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Publication number: CN114829939A
Application number: CN202080083887.9A
Authority: CN
Inventors: J·V·米卡莱夫; H·威尔逊-罗布尔斯; M·E·埃克莱斯顿; M·C·A·赫尔措; J·B·特雷尔
Original assignee: Belgian Volition SPRL
Current assignee: Belgian Volition SPRL
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2022-07-29
Also published as: US20230003735A1; IL293342A; AU2020395504A1; BR112022010774A2; KR20220110794A; TW202134654A; MX2022006655A; EP4070111A1; WO2021110776A1; CA3163181A1; JP2023503379A

Abstract

本发明涉及作为血管癌或血液癌的血浆样品中的生物标志物的无细胞核小体。

Description

无细胞核小体作为生物标志物的用途

技术领域

背景技术

血液癌是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症类型。它们根据受影响的细胞类型被称为白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。白血病是血细胞的癌症，通常从骨髓开始并通过血流传播。在白血病中，骨髓产生突变细胞并将它们散布到血液中，它们在血液中生长并排挤健康的血细胞。淋巴瘤疾病影响淋巴系统中的细胞。在淋巴瘤中，称为淋巴细胞的免疫细胞生长失控并聚集在淋巴结、脾脏、其它淋巴组织或邻近器官中。骨髓瘤，也称为多发性骨髓瘤，在骨髓中发展并影响浆细胞，从而产生攻击感染和疾病的抗体。血癌的实例包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

提到“急性白血病”意指癌症进展迅速且具有侵略性，通常需要立即治疗。ALL牵涉大量无法抵抗感染的未成熟淋巴细胞的发育。这会导致患者在循环中具有较小空间用于健康的白细胞、红细胞和血小板。因此，患者通常会遭受免疫系统减弱和贫血症状，诸如疲倦、呼吸困难和大量出血的风险增加。小于5岁的儿童发展ALL的风险最高并且它是影响儿童的最常见的白血病类型。直到20岁中期，风险才缓慢下降，而50岁后再次开始缓慢上升。总体而言，每10例ALL病例中约有4例为成人。

AML影响成髓细胞，导致异常单核细胞和粒细胞在骨髓中积聚。AML也可影响髓样干细胞，产生异常的红细胞或血小板。与ALL一样，这会导致患者循环中的健康白细胞、红细胞和血小板水平较低。AML是成人中最常见的白血病类型之一且诊断时的平均年龄为68岁。

HL和NHL是淋巴瘤的两种主要类型。HL在显微镜下具有特殊的外观且含有称为Reed-Sternberg细胞(一种已癌变的B淋巴细胞类型)的细胞，而NHL在显微镜下看起来不同且不含Reed-Sternberg细胞。大多数淋巴瘤是NHL且只有约1/5是HL。NHL是一种影响淋巴细胞的癌症且通常始于淋巴结或淋巴组织。它是儿童、青少年和年轻人中更常见的癌症之一。

目前诊断白血病和骨髓瘤的方法牵涉进行全血计数(CBC)检验，以鉴定相对于红细胞和血小板的白细胞异常水平。然而，升高白细胞计数(WBC)并不是血液系统恶性肿瘤患者特有的；它也可能是对感染或其它炎症过程的持续反应的结果。对于淋巴瘤，可以使用X射线、CT或PET扫描来检测淋巴结肿大，然而这也是非特异性的。

为了确认血液癌的诊断，需要进行骨髓或淋巴结活检。因此，在诊断过程的早期过度诊断血液癌可导致不必要的活检，这些活检对医疗保健提供者来说是侵入性的，具有潜在危险性且相对昂贵。细胞遗传学分析和/或免疫表型分析也可用于确认血液癌诊断，然而这些方法执行成本高，因此通常仅在诊断过程的后期使用。

人类血管性肉瘤是一种罕见的血管癌，会影响血管内衬的内皮细胞。犬类血管肉瘤同样是一种牵涉血管内皮或血管壁增殖的癌症并且是一种也难以诊断的常见犬类癌症。犬类癌症比人类癌症更常见，这通常是由于近亲繁殖的遗传影响，并且因为狗的寿命比人类短并且通常在8岁或以上时患上癌症。在动物受试者中检测和诊断癌症比诊断人类癌症带来了额外的困难。非人类动物的癌症检测常常牵涉扫描，例如通过磁共振成像或MRI扫描，但动物不会在扫描所需的时间内保持静止，因此必须进行麻醉。宠物健康保险罕见并且可能不覆盖癌症诊断或治疗，这使得这些测试对于许多宠物主人而言在经济上遥不可及。另外，癌症标志蛋白的人体血液检测通常不检测动物蛋白，因此兽医肿瘤学中可用的血液检测较少。

Holdenrieder等人(2001)Int J Cancer 95:114–120先前描述了检测良性疾病和恶性疾病患者血清样品中的核小体水平。然而，血清样品所呈现的结果并不暗示与测试的其它癌症类型相比，血液癌(诸如淋巴瘤)的水平之间存在任何区别。就其组蛋白修饰、组蛋白变体、DNA修饰和加合物含量而言，循环的无细胞核小体的表观遗传组成也已作为癌症中基于血液的生物标志物进行了研究，参见WO 2005/019826、WO 2013/030577、WO 2013/030579和WO 2013/084002。

本领域仍然需要为血管癌或血液癌提供简单、成本有效的诊断方法，尤其是那些能够与患有其它类型的疾病或非血管癌或非血液癌但可能呈现类似症状的患者区分开的方法。

发明内容

根据第一方面，提供了无细胞核小体作为血浆样品中的生物标志物用于诊断或检测血管癌或血液癌的用途。

根据另一方面，提供了无细胞核小体作为血浆样品中的生物标志物用于诊断或检测血液癌的用途。

根据另一方面，提供了无细胞核小体作为血浆样品中的生物标志物用于诊断或检测血管癌的用途。

根据另一方面，提供了一种用于诊断或检测血管癌或血液癌的方法，其包括以下步骤：

(i)使获自受试者的血浆样品与结合剂接触以检测或测量无细胞核小体；以及

(ii)使用检测到的无细胞核小体的水平来诊断患有血管癌或血液癌的受试者。

根据另一方面，提供了一种用于确定患有血管癌或血液癌的受试者的预后的方法，其包括以下步骤：

(ii)使用检测到的无细胞核小体的水平作为血管癌或血液癌的预后指示。

根据另一方面，提供了一种用于监测疗法在患有、疑似患有或易患血管癌或血液癌的受试者中的功效的方法，其包括以下步骤：

(ii)将检测到的无细胞核小体的水平与取自受试者的早期血浆样品进行比较，以确定疗法的功效。

附图简述

图1：从健康的人类受试者和患有急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)和非霍奇金淋巴瘤(NHLym)的人类受试者获得的血浆样品中含有H3.1的无细胞核小体的浓度。

图2：从患有不同类型癌症的人类受试者获得的血浆样品中含有H3.1的无细胞核小体的浓度。

图3：在来自健康的人类受试者的血浆样品中的含有H3瓜氨酸化(H3cit)的无细胞核小体的ELISA光密度(OD)结果与(A)来自测试的所有类型的血液癌的结果和(B)来自患有ALL、AML和NHL的人类受试者的结果的比较。

图4：在来自健康的人类受试者的血浆样品中的含有H3K27Me3的无细胞核小体的ELISA OD结果与(A)来自测试的所有类型的血液癌的结果和(B)来自患有ALL、AML和NHL的人类受试者的结果的比较。

图5：在来自健康的人类受试者的血浆样品中的含有H4泛乙酰化(H4panAc)的无细胞核小体的ELISA相对光单位(RLU)结果与(A)来自测试的所有类型的血液癌的结果和(B)来自患有ALL、AML和NHL的人类受试者的结果的比较。

图6：(A)与诊断患有淋巴瘤的犬类受试者相比，取自健康的犬类受试者的血浆样品中含有组蛋白同种型H3.1(ng/ml)的无细胞核小体的ELISA结果，和(B)显示使用H3.1结果进行的犬类淋巴瘤检测的ROC曲线。

图7：(A)与诊断患有血管肉瘤的犬类受试者相比，取自健康的犬类受试者的血浆样品中含有组蛋白同种型H3.1(ng/ml)的无细胞核小体的ELISA结果，和(B)显示使用H3.1结果进行的犬类血管肉瘤检测的ROC曲线。

图8：从2只接受血管肉瘤治疗的犬类动物连续取得的血浆样品中含有组蛋白同种型H3.1(ng/ml)和CRP(μg/ml)的无细胞核小体的ELISA结果。

图9：从2只接受淋巴瘤治疗的犬类动物连续取得的血浆样品中含有组蛋白同种型H3.1(ng/ml)和CRP(μg/ml)的无细胞核小体的ELISA结果。

具体实施方式

根据第一方面，提供了无细胞核小体作为血浆样品中的生物标志物用于诊断或检测血管癌或血液癌的用途。具体而言，癌症是血液癌。

核小体是染色质结构的基本单位并且由八个高度保守的核心组蛋白的蛋白质复合物组成(由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对)组成。在该复合物周围包裹着大约146个碱基对的DNA。另一种组蛋白H1或H5充当接头并参与染色质压缩。DNA缠绕在连续的核小体周围，其结构通常被称为类似于“绳珠”并且这形成了开放或常染色质的基本结构。在压实或异染色质中，该绳盘绕和超盘绕成闭合且复杂的结构(Herranz和Esteller(2007)MethodsMol.Biol.361:25-62)。

当在体液样品中检测到时，提到“核小体”可以指“无细胞核小体”。应当理解，贯穿本文件的术语无细胞核小体旨在包括任何包括一个或多个核小体的无细胞染色质片段。如本文所指的无细胞核小体的“表观遗传特征”、“表观遗传信号特征”或“表观遗传信号结构”可以包括但不限于一种或多种组蛋白翻译后修饰、组蛋白同种型、经修饰的核苷酸和/或结合至核小体-蛋白质加合物中的核小体的蛋白质。

应当理解，无细胞核小体可以通过与其组分结合来检测。如本文所用，术语“其组分”是指核小体的一部分，即不需要检测整个核小体。无细胞核小体的组分可以选自由以下组成的组：组蛋白(即组蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4)、组蛋白翻译后修饰、组蛋白变体或同种型、结合至核小体的蛋白质(即核小体-蛋白质加合物)、与核小体缔合的DNA片段和/或与核小体缔合的经修饰的核苷酸。例如，其组分可以是组蛋白(同种型)H3.1或组蛋白H1或DNA。

本发明的方法和用途可以测量(无细胞)核小体本身的水平。提到“核小体本身”是指样品中存在的总核小体水平或浓度，无论核小体可能包括或不包括任何表观遗传特征。总核小体水平的检测通常牵涉检测所有核小体共有的组蛋白，诸如组蛋白H4。因此，核小体本身可以通过检测核心组蛋白(诸如组蛋白H4)来测量。如本文所述，组蛋白形成称为核小体的结构单元，其用于在真核细胞中包装DNA。如先前在WO 2016/067029(通过引用并入本文)中报道的，特定的组蛋白变体，诸如组蛋白H3.1、H3.2或H3t，可用于分离源于肿瘤细胞的无细胞核小体。因此，可以检测肿瘤来源的无细胞核小体的总水平。

成人中的正常细胞更新牵涉每天通过细胞分裂产生大约10¹¹个细胞以及主要通过细胞凋亡引起的类似数目的细胞死亡。在细胞凋亡过程中，染色质分解成单核小体和寡核小体，单核小体和寡核小体从细胞中释放出来。据报道在正常情况下，在健康受试者中发现的循环核小体水平较低。在患有多种病状的受试者中发现升高的水平，所述病状包括许多癌症、自身免疫性疾病、炎性病状、中风和心肌梗塞(Holdenreider和Stieber(2009)CritRev Clin Lab Sci,46(1):1–24)。

当前的核小体ELISA方法主要用于细胞培养中，通常作为检测细胞凋亡的方法(Salgame等人(1997)Nucleic Acids Res,25(3):680-681；Holdenrieder等人(2001)同上；van Nieuwenhuijze等人(2003)Ann Rheum Dis,62:10–14)，但也用于测量血清和血浆中的循环无细胞核小体(Holdenrieder等人(2001))。在许多不同癌症的研究中，已经通过ELISA方法测量了死亡细胞释放到循环中的无细胞血清和血浆核小体水平，以评价它们作为潜在生物标志物的用途。据报道，在研究的大多数但不是所有癌症中，平均循环核小体水平都很高。然而，据报道患有恶性肿瘤的患者的血清核小体浓度变化很大并且发现一些患有晚期肿瘤疾病的患者具有在健康受试者测量的范围内低循环核小体水平(Holdenrieder等人(2001))。

无细胞核小体可以是单核小体或寡核小体，或其混合物。

单核小体和寡核小体可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测，并且已经报道了几种方法(例如Salgame等人(1997)；Holdenrieder等人(2001)；van Nieuwenhuijze等人(2003))。这些测定通常采用抗组蛋白抗体(例如抗H2B、抗H3或抗H1、抗H2A、抗H2B、抗H3和抗H4)作为捕获抗体和抗DNA或抗H2A-H2B-DNA复合物抗体作为检测抗体。

循环核小体不是一组同质的蛋白质-核酸复合物。相反，它们是一组源于细胞死亡时染色质的消化的异质染色质片段并且包括种类繁多的表观遗传结构，包括特定的组蛋白同种型(或变体)、翻译后组蛋白修饰、核苷酸或经修饰的核苷酸以及蛋白质加合物。本领域技术人员将清楚，核小体水平的升高将与一些含有特定表观遗传信号的循环核小体亚群的升高相关，所述核小体亚群包括含有特定组蛋白同种型(或变体)，包括特定的翻译后组蛋白修饰，包括特定的核苷酸或经修饰的核苷酸和包含特定的蛋白质加合物的核小体。这些类型的染色质片段的测定是本领域已知的(例如，参见WO 2005/019826、WO2013/030579、WO2013/030578、WO 2013/084002，其通过引用并入本文)。

在本发明的用途和方法中使用的生物标志物可以是无细胞核小体本身的水平和/或无细胞核小体的表观遗传特征。应当理解，术语“表观遗传信号结构”和“表观遗传特征”在本文中可互换使用。它们是指可以检测到的核小体的特定特征。在一个实施方案中，核小体的表观遗传特征选自由以下组成的组：翻译后组蛋白修饰、组蛋白变体、特定核苷酸和蛋白质加合物。

在一个实施方案中，核小体的表观遗传特征包括一种或多种组蛋白变体或同种型。无细胞核小体的表观遗传特征可以是组蛋白同种型，诸如核心核小体的组蛋白同种型，尤其是组蛋白H3同种型。术语“组蛋白变体”和“组蛋白同种型”在本文中可以互换使用。核小体的结构也可以因包含作为不同的基因或剪接产物并具有不同的氨基酸序列的替代组蛋白同种型或变体而变化。许多组蛋白同种型是本领域已知的。组蛋白变体可以分为多个家族，这些家族又细分为单独的类型。大量组蛋白变体的核苷酸序列是已知的并且例如在国家人类基因组研究所NHGRI组蛋白数据库(

-Ramírez等人The Histone Database:an integrated resource for histones and histone fold-containin gproteins.Database2011卷和http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank(NIH基因序列)数据库、EMBL核苷酸序列数据库和日本DNA数据库(DDBJ)可公开获得。例如，组蛋白H2的变体包括H2A1、H2A2、mH2A1、mH2A2、H2AX和H2AZ。在另一个实例中，H3的组蛋白同种型包括H3.1、H3.2和H3t。

在一个实施方案中，组蛋白同种型是H3.1。如本文呈现的实例所示，H3.1可有效区分患有血管癌或血液癌的受试者与健康受试者。H3.1在鉴定淋巴瘤患者方面特别有效，因为以90％的特异性将84％的NHL患者与健康受试者区分开(参见表1)。

核小体的结构可因组蛋白的翻译后修饰(PTM)而变化。组蛋白的PTM通常发生在核心组蛋白的尾部且常见的修饰包括赖氨酸残基的乙酰化、甲基化或泛素化以及精氨酸残基的甲基化和丝氨酸残基的磷酸化等。许多组蛋白修饰在本领域中是已知的并且数目随着新修饰的鉴定而增加(Zhao和Garcia,2015Cold Spring Harb Perspect Biol,7:a025064)。因此，在一个实施方案中，无细胞核小体的表观遗传特征可以是组蛋白翻译后修饰(PTM)。组蛋白PTM可以是核心核小体的组蛋白PTM，例如H3、H2A、H2B或H4，尤其是H3、H2A或H2B。具体而言，组蛋白PTM是组蛋白H3 PTM。此类PTM的实例在WO2005/019826中有描述。

例如，翻译后修饰可以包括乙酰化、甲基化(其可以是单甲基化、二甲基化或三甲基化)、磷酸化、核糖基化、瓜氨酸化、泛素化、羟基化、糖基化、亚硝基化、谷氨酰胺化和/或异构化(参见Ausio(2001)Biochem Cell Bio 79:693)。在一个实施方案中，组蛋白PTM选自甲基化或瓜氨酸化。在另一实施方案中，组蛋白PTM是H3K27me3或H3瓜氨酸(H3cit)。在又一个实施方案中，组蛋白PTM是H3cit。如本文呈现的实例所示，H3cit是区分患有血管癌或血液癌的受试者与健康受试者最有效的组蛋白PTM。

还可以检测一组或一类相关的组蛋白翻译后修饰(而不是单个修饰)。一个典型的实例，但不限于，将牵涉采用定向结合至核小体的一种抗体或其它选择性结合剂和定向结合所讨论的组蛋白修饰基团的一种抗体或其它选择性结合剂的2位点免疫测定。定向结合至组蛋白修饰基团的此类抗体的实例将包括，出于说明性目的但不限于，抗泛乙酰化抗体(例如泛乙酰H4抗体[H4panAc])、抗瓜氨酸化抗体或抗泛素抗体。

在一个实施方案中，核小体的表观遗传特征包括一种或多种DNA修饰。除了由核小体组蛋白同种型和PTM组成介导的表观遗传信号传导外，核小体的核苷酸和经修饰的核苷酸组成也不同。全局DNA低甲基化是癌细胞的标志并且一些核小体可能包含比其它核小体更多的5-甲基胞嘧啶残基(或5-羟甲基胞嘧啶残基或其它核苷酸或经修饰的核苷酸)。在一个实施方案中，DNA修饰选自5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。

在一个实施方案中，核小体的表观遗传特征包括一种或多种蛋白质-核小体加合物或复合物。另一种类型的循环核小体亚群是核小体蛋白质加合物。多年来已知染色质包含大量与其组成DNA和/或组蛋白结合的非组蛋白。这些染色质相关蛋白类型多种多样并且具有多种功能，包括转录因子、转录增强因子、转录抑制因子、组蛋白修饰酶、DNA损伤修复蛋白等等。本领域描述了这些染色质片段，包括核小体和其它非组蛋白染色质蛋白或DNA和其它非组蛋白染色质蛋白。

在一个实施方案中，与核小体加合(因此可用作生物标志物)的蛋白质选自：转录因子、高迁移率族蛋白质或染色质修饰酶。提到“转录因子”是指与DNA结合并通过促进(即激活物)或阻抑(即阻遏物)转录来调控基因表达的蛋白质。转录因子含有一个或多个DNA结合结构域(DBD)，它们附着在与它们所调控的基因相邻的特定DNA序列上。

本文描述的所有循环核小体和核小体部分、类型或亚组均可用于本发明。

应当理解，在本发明的方法和用途中可以检测到无细胞核小体的多于一种的表观遗传特征。多种生物标志物可用作组合生物标志物。因此，在一个实施方案中，该用途包括作为组合生物标志物的无细胞核小体的多于一种的表观遗传特征。表观遗传特征可以是同一类型(例如PTM、组蛋白同种型、核苷酸或蛋白质加合物)或不同类型(例如PTM与组蛋白同种型的组合)。例如，可以检测翻译后组蛋白修饰和组蛋白变体(即，检测多于一种类型的表观遗传特征)。可替代地或另外，检测多于一种类型的翻译后组蛋白修饰，或检测到多于一种类型的组蛋白同种型。一方面，该用途包括翻译后组蛋白修饰和组蛋白同种型作为血浆样品中的组合生物标志物，用于诊断或检测血管癌或血液癌。在一个实施方案中，组合生物标志物是H3.1和H3cit。在一个替代实施方案中，组合生物标志物是H3.1和H3K27Me3。

术语“生物标志物”意指过程、事件或条件的区别性生物学或生物学衍生指标。生物标志物可用于诊断方法，例如临床筛查和预后评估，以及用于监测治疗结果，鉴定最有可能对特定治疗、药物筛选和开发产生反应的患者。生物标志物及其用途对于鉴定新的药物治疗和发现药物治疗的新靶标是有价值的。

本文描述的方法和用途可以在体液样品，尤其是血液、血清或血浆样品中进行测试。优选地，使用血浆样品。可以将血浆样品收集在含有一种或多种抗凝剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素或柠檬酸钠，尤其是EDTA的收集管中。

血液癌

血液癌是血液的癌症，因此也可以称为“血癌”。有3种主要类型的血液癌：白血病，由异常白细胞的快速产生引起；淋巴瘤，由异常淋巴瘤细胞引起；和骨髓瘤，是一种浆细胞癌。

在一个实施方案中，血液癌选自淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、意义不确定的单克隆丙种球蛋白病、骨髓增生异常综合征和淀粉样变性。在另一实施方案中，血液癌选自白血病或淋巴瘤。

白血病影响白细胞并且可以根据受影响的白细胞类型(骨髓细胞或淋巴细胞)和疾病进展的方式(急性或慢性)进行分类。已经鉴定了几种类型的白血病，包括但不限于：急性成淋巴细胞性白血病(ALL；也可以称为急性淋巴细胞白血病)、急性髓性白血病(AML)、急性巨核细胞白血病(AMKL)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、儿童急性髓性白血病(C-AML)、儿童急性淋巴细胞白血病(C-ALL)、慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、慢性中性粒细胞白血病、毛细胞白血病、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGLL)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病和早幼粒细胞白血病。

在一个实施方案中，白血病是急性白血病，诸如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性巨核细胞白血病(AMKL)或急性早幼粒细胞白血病(APL)。在另一实施方案中，白血病选自急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓性白血病(AML)。可替代地，在一个实施方案中，白血病是慢性白血病，诸如慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)或慢性中性粒细胞白血病。

霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)都是淋巴瘤。大多数NHL患者首次诊出时年龄超过55岁，而诊出霍奇金淋巴瘤的中位年龄为39岁。在一个实施方案中，淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。NHL可出现在身体任何部位的淋巴结中，而HL通常始于上半身，诸如颈部、胸部或腋窝。

霍奇金淋巴瘤常常在早期被诊出，因此被认为是最可治疗的癌症之一。非霍奇金淋巴瘤通常直至达到更晚期才被诊出，因此本发明的方法在NHL的诊断中特别有用，其中需要在疾病的早期检测患者以改善治疗结果。

其它血癌

血管性肉瘤(Angiosarcoma)和血管肉瘤(Hemangiosarcoma)是牵涉血管系统内衬细胞增殖的软组织癌，因此可称为“血管癌”。与造血系统癌症一样，这些癌症与脉管系统密切相关并且受影响的细胞与血液循环液直接接触。我们已经证实，这些血癌与极高水平的循环核小体相关，这与在淋巴瘤中观察到的水平相似。

检测和诊断方法

本发明提供了可用于检测或诊断患有血管癌或血液癌的患者的方法。因此，根据另一方面，提供了一种用于诊断或检测血管癌或血液癌的方法，其包括以下步骤：

根据另一方面，提供了一种用于诊断或检测血液癌的方法，其包括以下步骤：

(ii)使用检测到的无细胞核小体的水平来诊断患有血液癌的受试者。

可替代地，根据另一方面，提供了一种用于诊断或检测血管癌的方法，其包括以下步骤：

(ii)使用检测到的无细胞核小体的水平来诊断患有血管癌的受试者。

(ii)使用检测到的无细胞核小体的水平作为所述血管癌或血液癌的预后指示。

如果确定受试者未患血管癌或血液癌，则本发明仍可用于监测疾病进展的目的。例如，如果该用途包括来自确定未患血管癌或血液癌的受试者的样品，则可以在另一个时间点重复生物标志物水平测量以确立生物标志物水平是否已经变化。

(ii)将检测到的无细胞核小体的水平与取自所述受试者的早期血浆样品进行比较，以确定所述疗法的功效。

检测和/或定量可直接对纯化或富集的核小体样品进行，或间接对其提取物或其稀释物进行。量化样品中存在的生物标志物的量可以包括确定样品中存在的生物标志物的浓度。根据本文描述的本发明的检测、监测和诊断的用途和方法可用于确认疾病的存在，通过评估发作和进展来监测疾病的发展，或评估疾病的改善或消退。检测、监测和诊断的用途和方法也可用于评估临床筛查、预后、疗法选择、治疗益处评价的方法中，即用于药物筛选和药物开发。

检测或测量可以包括免疫测定法、免疫化学法、质谱法、色谱法、染色质免疫沉淀法或生物传感器法。具体而言，检测和/或测量可以包括核小体部分的2位点免疫测定法。此类方法优选用于采用两种抗核小体结合剂或抗核小体结合剂与抗组蛋白修饰或抗组蛋白变体或抗DNA修饰或抗加合蛋白检测结合剂组合来原位测量核小体或核小体并入的表观遗传特征。同样，检测和/或测量可包括采用标记的抗核小体检测结合剂与固定化抗组蛋白修饰或抗组蛋白变体或抗DNA修饰或抗加合蛋白结合剂组合的2位点免疫测定。

可以使用一种或多种试剂诸如合适的结合剂来检测或测量生物标志物的水平。例如，一种或多种结合剂可包含对所需生物标志物，例如核小体或其组分、核小体的表观遗传特征、核小体或其组分的结构/形状模拟物有特异性的配体或结合剂，任选地与一种或多种白细胞介素组合。

本领域技术人员将清楚，如本文所用的术语“抗体”、“结合剂”或“配体”不是限制性的，而是旨在包括能够与特定分子或实体结合的任何结合剂，并且任何合适的结合剂都可以用于本发明的方法中。还将清楚的是，术语“核小体”旨在包括单核小体和寡核小体以及可以在流体介质中分析的任何蛋白质-DNA染色质片段。

检测生物标志物的方法是本领域已知的。试剂可以包含能够与所需靶标特异性结合的一种或多种配体或结合剂，例如天然存在的或化学合成的化合物。配体或结合剂可包括能够与所需靶标特异性结合的肽、抗体或其片段，或合成配体，诸如塑性抗体，或适体或寡核苷酸。抗体可以是单克隆抗体或其片段。应当理解，如果使用抗体片段，则它保留结合生物标志物的能力，从而可以检测生物标志物(根据本发明)。配体/结合剂可以用可检测标志物诸如发光、荧光、酶或放射性标志物进行标记；可替代地或另外，根据本发明的配体可以用亲和标签例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或His(例如六-His)标签标记。可替代地，可以使用无标记技术，例如ForteBio Inc.的技术确定配体结合。

如本文所用，术语“检测”或“诊断”涵盖疾病状态的鉴定、确认和/或表征。根据本发明的检测、监测和诊断的方法可用于确认疾病的存在，通过评估发作和进展来监测疾病的发展，或评估疾病的改善或消退。检测、监测和诊断的方法也可用于评估临床筛查、预后、疗法选择、治疗益处评价的方法中，即用于药物筛选和药物开发。

在一个实施方案中，多次重复本文描述的方法。该实施方案提供了允许在一段时间内监测检测结果的优点。此类布置将提供监测或评估疾病状态的治疗功效的益处。本发明的此类监测方法可用于监测发作、进展、稳定、改善、复发和/或缓解。

在监测方法中，可能抽取试样两次或更多次。该方法可以还包括将试样中存在的生物标志物的水平与一种或多种对照和/或与例如在疗法开始之前早前取自同一试验受试者，和/或在疗法早期阶段取自同一试验受试者的一种或多种先前试样进行比较。该方法可以包括检测不同次采集的试样中生物标志物的性质或量的变化。

试样中生物标志物水平相对于早前取自同一试验受试者的先前试样中的水平的变化可以指示所述疗法对病症或疑似病症的有益效果，例如稳定或改善。此外，一旦治疗完成，就可以定期重复本发明的方法以监测疾病的复发。

监测疗法功效的方法可用于监测现有疗法和新疗法在人类受试者和非人类动物中(例如在动物模型中)的治疗有效性。这些监测方法可以并入到新原料药和物质组合的筛选中。

在另一实施方案中，可以以更短的数小时或数天的间隔进行对由于快速作用疗法引起的更快变化的监测。

提供了用于进行本发明方法的诊断或监测试剂盒(或小组)。此类试剂盒将适当地包含一种或多种用于检测和/或量化根据本发明的生物标志物的配体，和/或生物传感器，和/或如本文所述的阵列，任选地连同试剂盒的使用说明。

本发明的另一方面是用于检测疾病状态的存在的试剂盒，其包含能够检测和/或量化如本文定义的一种或多种生物标志物的生物传感器。如本文所用，术语“生物传感器”意指能够检测生物标志物的存在的任何事物。本文描述了生物传感器的实例。生物传感器可以包含能够与生物标志物特异性结合的如本文所述的配体结合剂或配体。此类生物传感器可用于检测和/或量化本发明的生物标志物。

合适地，用于检测一种或多种生物标志物的生物传感器将生物分子识别与适当的手段相结合以将样品中生物标志物的存在的检测或定量转化为信号。生物传感器可适用于“替代点”诊断测试，例如在病房、门诊部、诊疗室、家庭、现场和工作场所。检测本发明的一种或多种生物标志物的生物传感器包括声学传感器、等离子体共振传感器、全息传感器、生物层干涉(BLI)传感器和微工程传感器。印迹识别元件、薄膜晶体管技术、磁声谐振器装置和其它新型声电系统可用于生物传感器中以检测所述一种或多种生物标志物。

用于检测疾病的存在的生物标志物是用于发现阻碍或阻止病症进展的新型靶标和药物分子的必需靶标。由于生物标志物的水平指示病症和药物反应，因此生物标志物可用于在体外和/或体内测定中鉴定新型治疗化合物。本文所述的生物标志物可用于筛选调节生物标志物活性的化合物的方法中。

因此，在本发明的另一方面，提供了如所述的结合剂或配体用于鉴定能够促进和/或阻抑生物标志物生成的物质的用途，所述结合剂或配体可以是针对根据本发明的生物标志物的肽、抗体或其片段或适体或寡核苷酸；或提供了根据本发明的生物传感器、或阵列或试剂盒用于鉴定能够促进和/或阻抑生物标志物生成的物质的用途。

本文所述的免疫测定包括采用一种或多种抗体或定向结合至本文定义的生物标志物的其它特异性结合剂的任何方法。免疫测定包括2位点免疫测定或采用酶检测方法的免疫测定(例如ELISA)、荧光标记免疫测定、时间分辨荧光标记免疫计量测定、化学发光免疫计量测定、免疫比浊测定、微粒标记免疫计量测定和免疫放射测定以及单位点免疫测定、试剂限制免疫测定、竞争性免疫测定法，包括具有多种标记类型(包括放射性、酶、荧光、时间分辨荧光和微粒标记)的标记抗原和标记抗体的单抗体免疫测定法。所有所述免疫测定方法在本领域中都是众所周知的，例如参见Salgame等人(1997)和van Nieuwenhuijze等人(2003)。

鉴定、检测和/或量化可以通过适合鉴定来自受试者的生物样品或生物样品的纯化物或提取物或其稀释物中特定蛋白质的存在和/或量的任何方法进行。具体而言，可以通过测量一个或多个样品中靶标的浓度来进行量化。可以在本发明的方法中测试的生物样品包括上文定义的那些。可以制备样品，例如在适当的情况下稀释或浓缩，并以通常的方式储存。本发明特别适用于可以从受试者获得的血浆样品。

生物标志物的鉴定、检测和/或量化可以通过检测生物标志物或其片段，例如具有C端截短或N端截短的片段来进行。片段的长度适当地大于4个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。特别要注意的是，与组蛋白尾序列相同或相关的序列的肽是特别有用的组蛋白片段。

例如，检测和/或量化可以通过一种或多种选自由以下组成的组的方法进行：SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、1-D基于凝胶的分析、2-D基于凝胶的分析、质谱法(MS)、反相(RP)LC、尺寸渗透(凝胶过滤)、离子交换、亲和、HPLC、UPLC和其它基于LC或LC MS的技术。适当的LC MS技术包括

(Applied Biosystems,CA,USA)或

(AppliedBiosystems,CA,USA)。也可以使用液相色谱法(例如高压液相色谱法(HPLC)或低压液相色谱法(LPLC))、薄层色谱法、NMR(核磁共振)光谱法。

牵涉本发明的一种或多种生物标志物的检测和/或量化的方法可以在台式仪器上进行，或者可以并入到可用于非实验室环境(例如医师办公室或受试者床边)的一次性、诊断或监测平台上。用于进行本发明方法的合适生物传感器包括具有光学或声学读取器的“信用”卡。生物传感器可以配置为允许将收集的数据以电子方式传输给医师进行解释，从而形成数字医学的基础。

疾病状态的生物标志物的鉴定容许整合诊断程序和治疗方案。生物标志物提供了指示治疗反应、未能反应、不利的副作用概况、药物依从性程度和达到足够血清药物水平的手段。生物标志物可用于提供药物不良反应的警告。生物标志物可用于个性化疗法的开发，因为反应评估可用于微调剂量，最将处方药的数目减到最少，减少获得有效疗法的延迟并避免药物不良反应。因此通过监测本发明的生物标志物，可以精确地定制受试者护理以匹配由受试者的病症和药物基因组学概况决定的需要，因此生物标志物可以用于滴定最佳剂量、预测阳性治疗反应并鉴定那些处于严重副作用高风险的受试者。

基于生物标志物的测试提供了对‘新’受试者的第一线评估，并为准确和快速的诊断提供了客观措施，这是使用当前措施无法实现的。

生物标志物监测方法、生物传感器和试剂盒作为受试者监测工具也是至关重要的，以使医师能够确定复发是否是由于病症的恶化。如果评估药物治疗不充分，则可以恢复或增加疗法；如果适当，可以改变疗法。由于生物标志物对病症状态敏感，所以它们提供了药物疗法影响的指示。

提到“受试者”或“患者”在本文中可互换使用。受试者可以是人或动物受试者。在一个实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是(非人)动物。在一个实施方案中，受试者是非人类哺乳动物，诸如狗、小鼠、大鼠或马，尤其是狗。本文描述的用途、小组和方法可以在体外、体内或离体进行。

在一个实施方案中，受试者疑似血管癌或血液癌复发。微小残留病(MRD)是给予在治疗期间或治疗之后患者处于缓解期时(即患者没有疾病症状或体征)时留在人体内的少量白血病细胞(来自骨髓的癌细胞)的名称。然而，MRD是癌症和白血病复发的主要原因。因此本发明的方法可用于监测疑似复发的患者，特别是处于癌症缓解期的患者。

使用本文描述的方法测试的受试者可出现指示血液癌的症状，例如贫血、白细胞增多和/或淋巴结肿大。在一个实施方案中，受试者具有高水平的白细胞增多。这也可以称为“高白细胞计数”。血液癌通常会导致异常白细胞或红细胞增殖增加，从而导致高白细胞计数。然而，白细胞增多不足以诊断患有血液癌(尤其是白血病)的患者，因为它经常是炎症反应的体征，最常见的是感染的结果。因此，本发明的方法能够提供更具体的方法来检测可能患有血液癌的患者。

检测和/或量化可以与截止水平进行比较。可以通过分析来自多个患者和对照的结果并确定用于将受试者分类为患有疾病或未患疾病的合适值来预先确定截止值。例如，对于患有该疾病的患者中生物标志物水平较高的疾病，如果检测到的水平高于截止值，则指示该患者患有该疾病。可替代地，对于患有该疾病的患者中生物标志物水平较高的疾病，如果检测到的水平低于截止值，则指示该患者患有该疾病。使用简单截止值的优点包括临床医生能够容易理解测试以及消除在解释测试结果时对任何软件或其它辅助工具的需要。可以使用本领域中的方法确定截止水平。

也可以将检测和/或量化与对照进行比较。本领域技术人员将清楚，对照受试者可以在多种基础上选择，可以包括例如已知没有疾病的受试者或者可以是患有不同疾病的受试者(例如，用于鉴别诊断的调查)。“对照”可以包括健康受试者、未患病受试者和/或未患血管癌或血液癌的受试者。与对照的比较在诊断领域是众所周知的。

因此，在一个实施方案中，该方法另外包括将所述血浆样品中的所述无细胞核小体的水平与一种或多种对照进行比较。例如，方法可以包括比较从受试者获得的血浆样品中存在的无细胞核小体的水平与从正常受试者获得的血浆样品中存在的无细胞核小体的水平。对照可以是健康受试者。可替代地，对照可以是患病受试者，诸如感染受试者。

可替代地，对照是患有不是血管癌或血液癌的癌症的受试者，即对照受试者患有影响身体中不同器官的癌症。本文提供的数据显示，与患有其它形式癌症的患者相比，本发明的生物标志物在血癌患者中显著升高，因此它们可用于鉴别诊断患有血管癌或血液癌的患者与患有其它形式癌症的患者。因此，一方面，诊断包括血管癌或血液癌与非血管或非血液癌的鉴别诊断。“非血管癌或非血液癌”是并非血癌且不牵涉血细胞或血管细胞增殖的癌症，诸如膀胱癌、骨癌、脑癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌(诸如黑色素瘤)、甲状腺癌、舌癌、子宫癌和/或宫颈癌。

对照可以是具有高水平白细胞增多的受试者。如本文所讨论的，白细胞增多不是白血病特有的症状。因此，本发明的方法可用于比较具有不是血管癌或血液癌的结果的高水平白细胞增多的对照，例如具有炎症、感染和/或服用药物的对照。

在一个实施方案中，与对照相比，无细胞核小体的水平升高。

将理解，没有必要每次都为了比较的目的而测量对照水平。例如，对于健康/未患病的对照，一旦确立了“正常范围”，就可以将其用作后续所有测试的基准。可以通过从多个未患血管癌或血液癌的对照受试者中获得样品并测试生物标志物的水平来确立正常范围。然后可以检查疑似患有血管癌或血液癌的受试者的结果(即生物标志物水平)以查看它们是落在相应的正常范围之内还是之外。使用“正常范围”是检测疾病的标准做法。

在一个实施方案中，该方法另外包括确定患者的至少一个临床参数。该参数可用于解释结果。临床参数可以包括任何相关的临床信息，例如但不限于性别、体重、体重指数(BMI)、吸烟状况和饮食习惯。因此，在一个实施方案中，临床参数选自由以下组成的组：年龄、性别和体重指数(BMI)。

在一个实施方案中，进行本发明的方法以鉴定处于患血管癌或血液癌的高风险并因此需要进一步测试(即进一步的癌症调查)的受试者。进一步的测试可牵涉以下一项或多项：活检(诸如骨髓活检或淋巴结活检)、细胞遗传学测试、免疫表型分析、CT扫描、X射线(尤其是胸部X射线以鉴定肿大的淋巴结)和/或腰椎穿刺。

本文描述的方法和生物标志物可用于鉴定患者是否需要活检，尤其是骨髓或淋巴结活检。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种鉴定需要活检的患者的方法，其包括从所述患者获得血浆样品，检测血浆样品中无细胞核小体的水平，并使用从小组测试获得的结果鉴定患者是否需要活检。

根据本发明的另一方面，提供了一种鉴定需要活检的患者的方法，其包括从所述患者获得血浆样品，将该样品应用于本文定义的小组测试，并使用从组测试获得的结果以鉴定患者是否需要活检。

其它生物标志物

可以检测或测量无细胞核小体的水平作为小组测量之一。该小组可以包含如上文所述的核小体的不同表观遗传特征(例如组蛋白同种型和PTM)。在一个实施方案中，该小组包含一种或多种细胞因子，诸如一种或多种白细胞介素。

白细胞介素(IL)是一类细胞因子，通常由白细胞分泌，充当信号分子。它们在刺激免疫反应和炎症方面具有关键作用。它们在20世纪70年代首次被鉴定并且随着更多白介素类型的发现而用数字命名。白细胞介素的实例包括但不限于：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15。

在一个实施方案中，所述一种或多种白细胞介素选自由以下组成的组：白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素1β(IL-1β)。

白细胞介素可以是IL-6。白细胞介素6(IL-6)是一种具有多种生物学功能的细胞因子。它是发热和急性期反应的强效诱导剂。人IL-6的序列是本领域已知的并且描述于UniProt登录号P05231。在一个特定实施方案中，白细胞介素可以是IL-6并且该小组测量可以包括组蛋白同工型H3.1和IL-6的测量。

可替代地或另外，白细胞介素可以是IL-10。白细胞介素10(IL-10)是一种具有多种生物学功能的抗炎细胞因子。人IL-10的序列是本领域已知的并且描述于UniProt登录号P22301。在一个特定实施方案中，白细胞介素可以是IL-10，并且该小组测量可以包括组蛋白翻译后修饰H3cit和IL-10的测量。

可替代地或另外，白细胞介素可以是IL-1β。白细胞介素-1β(IL-1β)是一种促炎细胞因子并且牵涉多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。在一个特定实施方案中，白细胞介素可以是IL-1β并且该小组测量可以包括组蛋白同工型H3.1和IL-1β的测量。更具体地，该小组可以包括组蛋白同种型H3.1和IL-1β的测量，其中血管癌或血液癌是淋巴瘤，诸如NHL。

在一个实施方案中，该小组包括无细胞核小体的表观遗传特征和一种白细胞介素。在另一个实施方案中，该小组包括无细胞核小体的表观遗传特征和两种白细胞介素。例如，无细胞核小体测量可以与一种以上的白细胞介素测量，诸如IL-6和IL-1β或IL-10和IL-1β或IL-6和IL-10组合。在另一个实施方案中，无细胞核小体的表观遗传特征选自组蛋白同种型，诸如H3.1，和翻译后修饰的组蛋白，诸如H3cit。在又一个实施方案中，该小组测量是H3.1、IL-6和IL-1β。在一个替代实施方案中，该小组测量是H3cit、IL-10和IL-1β。

可以使用本发明的生物标志物推导模型。用于推导模型或算法的方法，诸如实施例的表5和表6中的那些在本领域中是众所周知的并且合适的软件包是可用的。用于此目的的典型软件工具包括SPSS(社会科学统计软件包)和“R”。这些软件包提供临床数据的线性和非线性数据建模。

本领域技术人员将清楚，本文公开的生物标志物的任何组合可用于检测血管癌或血液癌的小组和算法中，并且可将其它标志物添加到包括这些标志物的小组中。

根据本发明的一个方面，提供了小组测试在检测患有血管癌或血液癌的患者中的用途，其中小组测试包括用于检测从患者获得的血浆样品中核小体或其组分和一种或多种白细胞介素的测量的试剂。

治疗方法

根据另一方面，提供了一种治疗受试者的血管癌或血液癌的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量从受试者获得的血浆样品中无细胞核小体的水平；

(ii)使用步骤(i)中测量的水平作为受试者中存在所述血管癌或血液癌的指示；并且

(iii)如果在步骤(ii)中确定受试者患有所述血管癌或血液癌，则进行手术治疗或施用治疗剂。

根据另一方面，提供了一种治疗有需要的受试者的血管癌或血液癌的方法，其包括对鉴定为与从对照受试者获得的血浆样品中无细胞核小体的水平相比时从所述受试者获得的血浆样品中具有不同的无细胞核小体水平的受试者进行手术治疗或施用治疗剂的步骤。

在一个实施方案中，所述治疗选自：化学疗法、免疫疗法、激素疗法、生物疗法、放射疗法、白细胞去除术和干细胞移植中的一种或多种。

所述方法可包括：

(i)测量从受试者获得的血浆样品中无细胞核小体的水平(任选与一种或多种白细胞介素的水平组合)；

(ii)基于与对照相比更高的无细胞核小体的水平鉴定受试者患有血管癌或血液癌；并且

(iii)向受试者施用治疗。

根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗血管癌或血液癌的方法，其包括使用小组测试鉴定需要治疗血管癌或血液癌的患者并提供所述治疗，其中小组测试包括检测核小体或其组分和一种或多种白细胞介素的测量的试剂。与对照相比，预计患有血管癌或血液癌的患者具有更高的无细胞核小体水平。

应当理解，本文描述的实施方案可以应用于本发明的所有方面，即针对用途描述的实施方案同样可以应用于要求保护的方法等等。

本发明现将参考以下非限制性实施例加以说明。

实施例

实施例1

从116名人类受试者的队列取得血浆样品。对于每个受试者，将抽取的全血收集在EDTA真空采血管中，并将管轻轻倒置10次。抽血2小时内将全血以1500g离心15分钟。将血浆转移至低温管并立即冷冻。在该队列中，62名受试者健康，25名受试者患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)，22名受试者患有急性髓性白血病(AML)且7名受试者患有急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。患有白血病或淋巴瘤的受试者可进一步分类为诊断时患有癌症的患者(总共31名受试者；16名受试者诊断时患有NHL，15名受试者诊断时患有白血病)，或有癌症复发的患者(总共15名受试者；6名受试者NHL复发，9名受试者白血病复发)。

通过ELISA分析样品中含有H3.1的核小体。简而言之，含有组蛋白同种型H3.1的核小体的测量如下进行：将80μl测定缓冲液和20μl血浆样品或标准核小体制剂添加到包被有定向与组蛋白H3.1结合的抗体的微量滴定孔中。将微量滴定板盖上并在室温下轻轻振荡孵育2.5小时。弃去微量滴定孔的内容物。将孔用200μl洗涤液洗涤三次并添加100μl生物素化抗核小体抗体。再次盖上微量滴定板并在室温下轻轻振荡孵育1.5小时。弃去微量滴定孔的内容物。将孔用200μl洗涤液洗涤三次并添加100μl链霉亲和素-HRP溶液。再次盖上微量滴定板并在室温下轻轻振荡孵育0.5小时。弃去微量滴定孔的内容物。将孔用200μl洗涤液洗涤三次并添加100μl的HRP(辣根过氧化物酶)底物溶液。将微量滴定板盖上并在黑暗中在室温下轻轻振荡孵育20分钟。在405nm下测量孔的吸光度(OD)。直接使用OD水平或从标准曲线进行含有组蛋白H3.1的核小体的血浆水平插值。

将OD结果绘制为接收者操作特征(ROC)曲线。对所有癌症患者与健康者以及所有淋巴瘤患者与健康者和所有白血病(即包括ALL和AML)患者与健康者的结果进行分组。曲线下面积(AUC)结果如表1至表3所示。

表1：血浆中H3.1 OD的Roc曲线—所有患者

表2：血浆中H3.1 OD的Roc曲线—诊断时的患者

表3：血浆中H3.1 OD的Roc曲线—复发患者

如表1所示，含有H3.1的无细胞核小体的水平能够以90％的特异性将75％以上的血癌患者与健康供体区分开。这对于诊断时患有癌症的患者能够以90％的特异性提高到80％以上，如表2所示。结果还指示，该生物标志物在鉴定淋巴瘤患者方面特别有效，因为84％的NHL患者以90％的特异性与健康受试者区分开(参见表1)。

与健康患者的水平相比，使用标准曲线插值从OD值推导的所有AML、ALL和NHL患者的血浆样品中的H3.1浓度示于图1。与健康受试者相比，血液癌患者的H3.1水平明显升高。

结果显示，核小体水平，特别是含有H3.1的核小体，可用于血液癌的检测。

实施例2

进一步将实施例1中测试的人血浆样品中含有H3.1的无细胞核小体的水平与同样如实施例1中所述收集的从患有其它形式癌症的人类患者获得的血浆样品中的H3.1水平进行比较。

结果示于图2。令人惊讶的是，发现H3.1水平可用于区分患有血液癌的受试者与患有其它形式癌症的患者。与来自患有膀胱癌、骨癌、脑癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、舌癌、子宫癌、宫颈癌和黑色素瘤的患者的血浆样品中的H3.1水平相比，在每种类型的血癌(ALL、AML和NHL)患者中H3.1水平显著升高。

实施例3

对实施例1中描述的人血浆样品测试具有翻译后修饰的无细胞核小体的水平。ELISA方法以与实施例1中描述的用于H3.1的ELISA方法类似的方式运行，除了用针对选自H3cit、H3K27Me3和H4panAc的翻译后组蛋白修饰的抗体替换定向与组蛋白H3.1结合的抗体外。结果汇总在表4中。还以图形方式呈现了所有血癌和每种血癌类型的结果(参见图3-5)。

表4：血浆中PTM核小体的Roc曲线—所有血癌

与健康对照相比，在血癌患者中测试的所有核小体翻译后修饰均显示显著升高。即使按类型(ALL、AML、NHL)区别血癌时，与健康对照相比，血浆样品中H3cit、H3K27Me3和H4panAc无细胞核小体的水平也显著升高(参见图3B、图4B和图5B)。在从ALL患者获得的血浆样品中，翻译后修饰的核小体水平升高最多。

实施例4

将两种最佳的无细胞核小体标志物(H3.1和H3cit)组合在一起或与不同白细胞介素的测量组合。如前所述测量无细胞核小体水平，并使用市售的ELISA方法测量血浆白细胞介素水平。

通过逻辑回归分析对测定结果进行建模，以训练具有最高AUC的模型或算法，以将患有血癌的人类患者与正常人类供体进行比较。结果汇总在表5中。

表5：血浆中组合生物标志物小组的Roc曲线—所有血癌

队列大小：54名癌症患者与62名健康者

如表5所示，所有模型都能够以90％的特异性将75％以上的血癌患者与健康供体区分开来。结果显示，核小体水平可以与白细胞介素水平组合，作为具有用于血液癌检测的相关算法的有效测定小组。

实施例5

仅来自那些患有NHL的人类患者的血浆样品如实施例4中所述通过逻辑回归分析建模。结果汇总在表6中。

表6：血浆中组合生物标志物小组的Roc曲线—NHL癌症

队列大小：25名NHL患者与62名健康者

如表6所示，所有模型都能够以90％的特异性将80％或更多的NHL患者与健康供体区分开来。具体而言，组合H3.1和IL-1β能够以80％的特异性区分100％的NHL患者。结果显示，核小体和白细胞介素水平可用作具有用于NHL检测的相关算法的有效测定小组。

实施例6

从73只诊断患有犬类血管肉瘤的狗、127只诊断患有犬类淋巴瘤的狗和134只未患癌症的对照狗取血浆样品。通过ELISA分析样品中含有H3.1的核小体。

发现健康的狗具有低于67.4ng/ml(平均值32ng/ml，中位数31ng/ml)的含有组蛋白同种型H3.1的循环核小体的均匀低浓度。

发现诊断患有淋巴瘤的狗具有高度升高的含有组蛋白同种型H3.1的循环核小体水平(平均值570ng/ml，中位数211ng/ml)。针对犬类淋巴瘤获得的结果的点图和ROC曲线分别以图形方式显示在图6A和图6B中。检测淋巴瘤的AUC为87％。使用67.4ng/ml的截止值，该测定的特异性为100％，灵敏度为74％。使用48.1ng/ml的较低截止值，得到灵敏度为81％，特异性为90％。

发现诊断患有血管肉瘤的狗具有高度升高的含有组蛋白同种型H3.1的循环核小体水平(平均值513ng/ml，中位数361ng/ml)。针对犬类血管肉瘤获得的结果的点图和ROC曲线分别以图形方式显示在图7A和图7B中。检测血管肉瘤的AUC为97.6％。使用67.4ng/ml的截止值，该测定的特异性为100％，灵敏度为89％。使用48.1ng/ml的较低截止值，得到灵敏度为95％，特异性为90％。

正如我们在人类疾病中发现的那样，对于诊断患有淋巴瘤或血管肉瘤的狗所观察到的循环核小体的水平也远高于对于所研究的其它犬类肿瘤所观察到的水平。

大多数人类蛋白质的测定不能转移到其它动物。然而，核小体的结构在物种间甚至在门间是高度保守的。我们已经证实，这意味着对人H3.1核小体的这种测定可转移到包括狗和马在内的其它物种。而且，我们在犬类受试者中观察到的血管癌和血液癌的结果与在人类受试者中观察到的结果非常相似。我们得出结论，本发明的方法是用于检测人和动物血管癌和血液癌的高效方法。

实施例7

从2只正在接受血管肉瘤治疗的狗和2只正在接受淋巴瘤治疗的狗取连续血浆样品。收集来自4只狗的所有样品，稍后在图8中治疗的最后一天之后分析含有组蛋白同种型H3.1的核小体，使得该信息不会为临床治疗决策提供信息，临床治疗决策是基于临床论据做出的。

C-反应蛋白(CRP)是一种众所周知的炎症生物标志物并且这也在样品中作为对照进行测量，以确定核小体水平是仅反映炎症反应还是提供有关受试者状态、预后和治疗反应的额外信息。

1号狗(图8A)经诊断患有血管肉瘤，从第1天到第129天开始用称为CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)的4种药物的化疗方案进行治疗。治疗是成功的并且在第160天，根据临床论据确定1号狗处于缓解期。CHOP治疗的成功反映在核小体水平在治疗过程中的下降趋势中，并且通过到第122天接近正常的核小体水平预测疾病缓解。结果证明核小体水平可用作预后指标，并且可用于指导治疗方案和监测缓解期受试者的疾病复发。CRP分析不可用于临床目的。

2号狗(图8B)最初于2017年被诊断患有血管肉瘤并用阿霉素和免疫调节剂进行治疗。每2-3个月通过全身CT扫描对他定期监测。注意到他在2年后复发并且这反映在高水平的循环核小体上。使用阿霉素、达卡巴嗪(dacarbazine)和免疫调节剂以及全肺放射和立体定向体部放射治疗(SBRT)成功地治疗了复发，并且基于全身CT成像确定2号狗处于缓解期。各种治疗的成功反映在2020年1月测得的接近正常的核小体水平上。2020年2月，2号狗以成像论据被诊断为具有完全反应，但有趣的是，2月测得的核小体水平开始上升，之后在2020年4月的下一次扫描时成像才能够检测出进行性疾病。当4月注意到进行性疾病时，核小体水平仍然很高。如果在治疗时就已经知道核小体水平，则2月就会对该患者确立更强的监测。结果证明核小体水平可用于指导治疗方案和监测缓解期受试者的疾病复发。CRP分析不可用于临床目的。

3号狗(图9A)最初在2018年被诊断出淋巴瘤并成功治疗，但已经过了缓解期并且这反映在测得的核小体水平上。作为CHOP化疗方案的一部分，他在第1天用长春新碱治疗进行性疾病(PD)。长春新碱治疗导致临床状况向稳定疾病(SD)的改善，这反映在核小体水平的下降中，如图9A中的结果所示。然而，由于毒性原因和缺乏强有力的观察到的临床反应，CHOP治疗终止。第22天开始用洛莫司汀(lomustine)加上L-天冬酰胺酶(L-spar)治疗，接着在第34、79和113天进行进一步的洛莫司汀治疗。通过肿瘤测量确定，临床发现在第34天和第79天改善为部分缓解，然后在第113天和第145天改善为对治疗的完全反应(CR)，此时3号狗处于缓解期且不施用进一步化疗。核小体水平在第22-34天之间上升，然后从第34天开始持续下降，预测洛莫司汀治疗成功，稍后在第113天和第145天临床观察到完全反应。而且，根据临床发现，核小体水平在第145天落入对于健康的狗观察到的范围内。CRP水平始终在正常范围内并且不可用于临床目的。

4号狗(图9B)经诊断患有Vb期腹内高钙血症淋巴瘤。从第1天到第93天，他开始接受长春新碱和阿霉素的CHOP化疗方案，并基于循环钙水平监测他对治疗的反应。兽医在临床上认识到对长春新碱有一些反应，但对阿霉素没有反应。然后在第108-164天将治疗从CHOP转换为洛莫司汀加L-spar，他对该治疗也没有反应。由于已注意到对长春新碱的反应，在第164天开始用长春新碱进行COP(不使用阿霉素的CHOP)治疗(第167天无法采集血样)。4号狗对COP疗法有反应并且在撰写本文时仍对治疗有反应。测量的核小体水平反映了观察到的临床发现(图9B)。在用长春新碱治疗后的大多数时间点，核小体水平降低，反映了对这种疗法的反应，而在每剂阿霉素后核小体水平增加，反映了对这种治疗缺乏反应。临床上还发现4号狗对环磷酰胺有部分反应，这也反映在核小体浓度降低上。然而，核小体水平仍高于正常水平，指示继续需要进一步治疗。核小体测量与临床发现明显相关并且可用于监测疾病缓解和指导治疗选择。例如，核小体水平预测对阿霉素疗法缺乏反应，如果根据核小体水平的信息，阿霉素疗法可更早停止。CRP分析显示无任何显著变化且不可用于临床目的。

Claims

1.无细胞核小体作为血浆样品中的生物标志物用于诊断或检测血管癌或血液癌的用途。

2.如权利要求1所限定的用途，其中所述无细胞核小体是单核小体或寡核小体。

3.如权利要求1或权利要求2所限定的用途，其中所述生物标志物是无细胞核小体的水平和/或无细胞核小体的表观遗传特征。

4.如权利要求3所限定的用途，其中所述无细胞核小体的表观遗传特征是组蛋白同种型，诸如核心核小体的组蛋白同种型，尤其是组蛋白H3同种型。

5.如权利要求4所限定的用途，其中所述组蛋白同种型是H3.1。

6.如权利要求3所限定的用途，其中所述无细胞核小体的表观遗传特征是组蛋白翻译后修饰(PTM)，诸如核心核小体的组蛋白PTM，尤其是组蛋白H3 PTM。

7.如权利要求6所限定的用途，其中所述组蛋白PTM选自瓜氨酸化(诸如H3瓜氨酸)或甲基化(诸如H3K27me3)。

8.如权利要求1至7中任一项所限定的用途，其中所述血液癌选自白血病或淋巴瘤。

9.如权利要求8所限定的用途，其中所述白血病选自急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓性白血病(AML)。

10.如权利要求8所限定的用途，其中所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

11.如权利要求1至7中任一项所限定的用途，其中所述血管癌选自血管性肉瘤或血管肉瘤。

12.一种用于诊断或检测血管癌或血液癌的方法，其包括以下步骤：

(i)使获自所述受试者的血浆样品与结合剂接触以检测或测量无细胞核小体；以及

(ii)使用检测到的所述无细胞核小体的水平来诊断患有所述血管癌或血液癌的所述受试者。

13.一种用于确定患有血管癌或血液癌的受试者的预后的方法，其包括以下步骤：

(ii)使用检测到的所述无细胞核小体的水平作为所述血管癌或血液癌的预后指示。

14.一种用于监测疗法在患有、疑似患有或易患血管癌或血液癌的受试者中的功效的方法，其包括以下步骤：

(ii)将检测到的所述无细胞核小体的水平与取自所述受试者的早期血浆样品进行比较，以确定所述疗法的功效。

15.如权利要求12至14中任一项所限定的方法，其中所述检测或测量包括免疫测定法、免疫化学法、质谱法、色谱法、染色质免疫沉淀法或生物传感器法。

16.如权利要求12至15中任一项所限定的方法，其中所述受试者是人或动物受试者。

17.如权利要求12至16中任一项所限定的方法，其中所述受试者疑似血管癌或血液癌复发。

18.如权利要求12至17中任一项所限定的方法，其中所述受试者具有高水平的白细胞增多/高白细胞计数。

19.如权利要求12至18中任一项所限定的方法，其另外包括将所述血浆样品中的所述无细胞核小体的水平与一种或多种对照进行比较。

20.如权利要求19所限定的方法，其中所述对照是健康受试者。

21.如权利要求19所限定的方法，其中所述对照是患有不是血管癌或血液癌的癌症的受试者。

22.如权利要求19所限定的方法，其中所述对照是具有高水平的白细胞增多的受试者。

23.如权利要求12至22中任一项所限定的方法，其中所述无细胞核小体的水平与所述对照相比升高。

24.如权利要求12至23中任一项所限定的方法，其中检测或测量所述无细胞核小体的水平作为小组测量之一。

25.如权利要求24所限定的方法，其中所述小组包含一种或多种白细胞介素。

26.如权利要求25所限定的方法，其中所述一种或多种白细胞介素选自由以下组成的组：IL-6、IL-10和IL-1β。