ES2960550T3 - Cuantificación de modificaciones de nucleosoma utilizando nucleosomas recombinantes definidos químicamente - Google Patents

Cuantificación de modificaciones de nucleosoma utilizando nucleosomas recombinantes definidos químicamente Download PDF

Info

Publication number
ES2960550T3
ES2960550T3 ES19760658T ES19760658T ES2960550T3 ES 2960550 T3 ES2960550 T3 ES 2960550T3 ES 19760658 T ES19760658 T ES 19760658T ES 19760658 T ES19760658 T ES 19760658T ES 2960550 T3 ES2960550 T3 ES 2960550T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nucleosome
histone
nucleosomes
modifications
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19760658T
Other languages
English (en)
Inventor
Martis William Cowles
Matthew F Whelihan
Andrea L Johnstone
Michael-Christopher Keogh
Zu-Wen Sun
Nathan W Hall
Matthew R Marunde
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epicypher Inc
Original Assignee
Epicypher Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epicypher Inc filed Critical Epicypher Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2960550T3 publication Critical patent/ES2960550T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/31—Endoribonucleases active with either ribo- or deoxyribonucleic acids and producing 3'-phosphomonoesters (3.1.31)
    • C12Y301/31001—Micrococcal nuclease (3.1.31.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/18—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material citrullination

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

La invención se refiere al uso de nucleosomas recombinantes/semisintéticos que llevan histonas y/o modificaciones de ADN como estándar de referencia para la cuantificación de nucleosomas modificados covalentemente (en las proteínas histonas o envolviendo el ADN), variantes o mutantes (colectivamente "nucleosomas modificados"). o "modificaciones de nucleosomas") de una muestra biológica. La invención se refiere además a métodos para usar el ensayo para cuantificar con precisión modificaciones de nucleosomas simples o combinatorias como biomarcadores de enfermedad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Cuantificación de modificaciones de nucleosoma utilizando nucleosomas recombinantes definidos químicamente
Declaración de prioridad
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos con el N° de serie 62/637.066,<presentada el>1<de marzo de 2018.>
Campo de la invención
La invención se refiere al uso de nucleosomas recombinantes/semisintéticos que portan modificaciones de histona y/o de ADN como patrón de referencia para la cuantificación de nucleosomas modificados covalentemente (en las proteínas histonas o el ADN de envoltura), variantes o mutantes (colectivamente "nucleosomas modificados") o "modificaciones de nucleosoma") a partir de una muestra biológica. La invención se refiere además a procedimientos para utilizar el ensayo para cuantificar con precisión modificaciones de nucleosoma individuales o combinatorias como biomarcadores de enfermedad.
Antecedentes de la invención
Los nucleosomas son las unidades de repetición de la cromatina, que consisten en 147 pares de bases de ADN que<envuelven de forma integral un octámero de histonas (que contiene>2<copias de cada una de las histonas centrales>(H2A, H2B, H3 y H4)) (Margueron et al., Nat. Rev. Genet. 11 (4):285 (2010)). Los cambios en la estructura y la función de la cromatina regulan diversas actividades celulares, que incluyen la expresión génica, la reparación del ADN, la transmisión cromosómica y la diferenciación celular (Brown et al., Hum. Mol. Genet. 21(R1):R90 (2012)); Lahtz et al., J. Mol. Cell. Biol. 3(1 ):51 (2011); Lunyak et al., Hum. Mol. Genet. 17(R1):R28 (2008); Reik, Nature 447(7143):425 (2007)). Estos procesos están mediados en parte por modificaciones postraduccionales (PTM; por ejemplo, metilación o acetilación de lisina) reversibles de histona, que tienen efectos directos o son "leídas" por proteínas de unión efectoras para transducir vías de señalización posteriores específicas. Hasta la fecha, se han identificado más de 100 PTM de histona individuales, muchas de las cuales están relacionadas con enfermedades humanas, que varían desde la neurodegeneración (Landgrave-Gomez et al., Front. Cell. Neurosci. 9:58 (2015)) y el síndrome metabólico (DelCurto et al., Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 16(4):385 (2013); Wang et al., Antioxid. Redox Signal 17(2):282 (2012)) al cáncer (Chopra et al., Cancer Genet. 208(5):192 (2015); Greenblatt et al., Leukemia 28(7):1396 (2014); Gajer et al., Oncogenesis 4:e137 (2015);
Witt et al., Curr. Pharm. Des. 15(4):436 (2009); Hanmod et al., Pediatr. Blood Cancer 62(1):52 (2015); Kobayashi et al., Oncogene 32(21):2640 (2013)). Significativamente, las proteínas que interactúan con PTM (también conocidas como 'lectoras') son muy susceptibles de modularse mediante fármacos, lo que las convierte en dianas terapéuticas excepcionales para numerosas enfermedades y trastornos humanos (Arrowsmith et al., Nat. Rev. Drug Discov.
11 (5):384 (2012)). Además, las PTM de histona son una clase emergente de biomarcadores de cáncer que pueden ser útiles para la detección y el pronóstico precoz de enfermedades, así como para informar de estrategias de tratamiento personalizadas (Khan et al., World J. Biol. Chem. 6(4):333 (2015)); Chervona et al., Am. J. Cancer Res.
2(5):589 (2012)).
La función cooperativa entre las PTM de histona y las proteínas reguladoras de cromatina representa una red de señalización compleja a nivel de sistemas, y su interrogatorio eficaz requiere herramientas basadas en nucleosomas. La multivalencia (es decir, múltiples dominios lectores dentro de una proteína determinada) es una característica común de los reguladores de cromatina (Ruthenburg et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8(12):983 (2007)), y se cree que sirve como un medio clave mediante el cual las interacciones de histonas se regulan de un modo específico del contexto. De hecho, la unión de la lectora (y los cambios posteriores en la regulación celular) se altera enormemente en presencia de varias PTM o combinaciones de las mismas, una hipótesis conocida como código de histonas (Strahl et al., Nature 403(6765):45 (2000); Jenuwein et al., Science 293(5532):1074 (2001)). Por ejemplo, la proteína lectora del factor de transcripción de dedo de bromodominio PHD (BPTF) contiene dominios con baja afinidad de unión individual para H3K4me3 (Kd = ~1 pM) y H4K12ac (Kd = ~60 pM) (Li et al., Nature 442(7098):91 (2006)), pero esta aumenta significativamente (> 3 veces frente a H3K4me3 solo) en presencia de mononucleosomas modificados combinatoriamente H3K4me3/H4K12ac (Ruthenburg et al., Cell 145(5):692 (2011)). El BPTF es una diana de terapia contra el cáncer (Dar et al., J. Natl. Cancer Inst. 107(5) (2015)); con niveles elevados que también se encuentra en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (Mu et al., Exp. Neurol. 146(1 ):17 (1997)). Es interesante destacar que la acetilación de H3K4me3 y H3/H4 coexiste en promotores activos (Zhang et al., EMBO Rep. 16(11):1467 (2015)), y se ha demostrado que H3K4me3 promueve la acetilación de histonas mediante el reclutamiento de efectores (Tang et al., Cell 154(2):297 (2013)). Los estudios mecanicistas apenas han comenzado a desentrañar el efecto combinatorio de PTM de histona sobre la fisiología celular, un precursor necesario para investigar el estado de enfermedad. Por ejemplo, los cambios en el microbioma intestinal (provocados por la dieta) pueden tener un efecto significativo sobre combinaciones específicas de PTM de histona en el tejido huésped (Krautkramer et al., Mol. Cell 64(5):982 (2016)). De forma similar, hallazgos recientes sugieren que las PTM de nucleosoma combinatorias (frente a las PTM individuales) pueden proporcionar mejores biomarcadores de pronóstico de cáncer de pulmón (Shema et al., Science 352(6286):717 (2016)).
La presentación eficaz de PTM de histona combinatorias depende de la estructura tridimensional del nucleosoma intacto, que sirve como andamio para las interacciones fisiológicas PTM-proteína. Comprender la naturaleza del código combinatorio de histonas es vital si queremos traducir la conexión entre la regulación epigenética y la enfermedad en productos terapéuticos y biomarcadores de próxima generación. Esto es particularmente cierto para la metilación y la acetilación de histonas, que desempeñan un papel integral en la regulación de la cromatina y la enfermedad (Greer et al., Nat. Rev. Genet. 13(5):343 (2012)); Filippakopoulos et al., Nat. Rev.DrugDiscov. 13(5):337 (2014); Soshnev et al., Mol. Cell 62(5):681 (2016)).
Se han desarrollado varios procedimientos para la cuantificación de PTM de histona a partir de muestras biológicas (Sidoli et al., J. Vis. Exp. 2016(111); Onder et al., Expert Rev. Proteomics 12(5):499 (2015); Machleidt et al., J. Biomol. Screen. 16(10):1236 (2011)), la mayor parte de los cuales dependen del uso de anticuerpos específicos de la modificación para el enriquecimiento de nucleosomas (por ejemplo, inmunoprecipitación de cromatina (Chromatin ImmunoPrecipitation); ChIP) o detección (por ejemplo, ELISA o Alfa). El ELISA se usa comúnmente para cuantificar la modificación de histonas o de ADN a partir de muestras biológicas, con ensayos específicos desarrollados para cuantificar directamente modificaciones en histonas o nucleosomas utilizando diversos enfoques de captura de anticuerpos. La detección basada en nucleosomas supera a la basada en histonas por dos razones:
1<) los procedimientos basados en nucleosomas no requieren etapas de extracción con ácido, que son laboriosas>e introducen variabilidad; y,
2<) los ensayos basados en nucleosomas permiten la cuantificación de modificaciones combinatorias in trans (por>ejemplo, combinaciones histona-histona, ADN-ADN o histona-ADN), imposibles de supervisar cuando se utilizan subunidades de histona o ADN solo.
El documento WO 2015/117145 divulga un procedimiento para medir cuantitativamente la densidad de un primer epítopo de una histona central en un locus genómico en cromatina de una célula de un paciente, en el que el primer epítopo de la histona central comprende al menos una modificación de aminoácido postraduccional. El documento WO 2005/019826 divulga el uso de nucleosomas derivados de células procedentes de células de pollo como patrones de ensayo. El documento WO 2015/104431 divulga ensayos bioquímicos que utilizan nucleosomas modificados recombinantes como sustratos para medir los interactores de unión a proteínas o la actividad enzimática.
A pesar de estas importantes ventajas, los ensayos actuales basados en nucleosomas carecen de controles adecuados para cuantificación. De hecho, los ensayos que utilizan la técnica actual son cualitativos, con niveles de PTM notificados como mediciones relativas o normalizados usando xenocromatina exógena (por ejemplo, de ave, levadura o insecto). El uso de preparaciones de cromatina exógena purificada puede presentar una diversidad de problemas, ya que estos reactivos están mal definidos (a nivel específico de PTM) y muestran variabilidad de lote, lo que limita su uso para la normalización de ensayos (entre experimentos o incluso laboratorios). Además de esto, actualmente representa un desafío determinar si las marcas combinatorias realmente se presentan en el mismo nucleosoma en lugar de coincidir en el agrupamiento total.
Teniendo en cuenta lo anterior, existe la necesidad en la técnica de controles mejorados para ensayos basados en nucleosoma que detecten modificaciones de histona y/o de ADN a partir de muestras biológicas.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere al uso de nucleosomas recombinantes/semisintéticos/de diseño (en lo sucesivo denominados "nucleosomas recombinantes") que portan modificaciones de histona y/ADN como patrones de cuantificación para calibración. A diferencia de los extractos de cromatina purificados que se utilizan actualmente, el presente ensayo utiliza nucleosomas recombinantes/semisintéticos completamente definidos para la cuantificación precisa de modificaciones de nucleosoma individuales o combinatorias. De forma similar a los patrones comúnmente utilizados en la técnica, los nucleosomas modificados se someterán a ensayo en el mismo experimento (se tratarán de manera idéntica a las muestras) para generar una curva patrón para la cuantificación del ensayo. La cuantificación de PTM de nucleosoma individuales o combinatorias puede proporcionar mejores biomarcadores de enfermedades que las mediciones relativas actualmente en uso.
Significativamente, los inventores han determinado que solo los nucleosomas proporcionan patrones de referencia útiles en muestras de plasma. Cuando se añaden histonas o nucleosomas al plasma, solo estos últimos se recuperan en los valores predichos y, por tanto, son viables para la cuantificación. De esta forma, los nucleosomas de la presente invención proporcionan patrones útiles para ensayos que cuantifican los nucleosomas circulantes directamente a partir de plasma u otros fluidos corporales.
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas que se incluyen con la presente memoria descriptiva. Además de la invención, un aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para cuantificar la abundancia de una modificación de nucleosoma (histona o ADN) en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en un epítopo diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende un epítopo diana de modificación de histona central y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir un reactivo de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes; y
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en el epítopo diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para cuantificar la abundancia de dos o más modificaciones (histona o ADN) en un nucleosoma individual en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden dos o más modificaciones de histona central y/o de ADN en un epítopo diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan dos o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir dos o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes; y
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en los epítopos diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para cuantificar la abundancia de una o más modificaciones de nucleosoma (histona o ADN) en una muestra biológica de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica del sujeto;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en uno o varios epítopos diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan uno o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir uno o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes; y g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en el epítopo diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar un pronóstico para un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas basado en la cuantificación de una o más modificaciones de nucleosoma, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica del sujeto;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en uno o varios epítopos diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan uno o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir uno o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes;
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en los epítopos diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia; y
h. determinar el pronóstico del sujeto basándose en la abundancia de uno o más epítopos diana.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para identificar un biomarcador de una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas basado en la cuantificación de una o más modificaciones de nucleosoma, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica del sujeto;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en uno o varios epítopos diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan uno o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir uno o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes;
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en los epítopos diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia; y
h. correlacionar la abundancia de uno o más epítopos diana con la enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas; identificando así un biomarcador de la enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento de selección de un agente que modifica el estado epigenético de una o más modificaciones de nucleosoma a partir de una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo el procedimiento determinar la cuantificación de una o más modificaciones de nucleosoma en presencia y ausencia del agente, en el que determinar la cuantificación de una o más modificaciones de nucleosoma comprende:
a. aislar una muestra biológica del sujeto;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en uno o varios epítopos diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan uno o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir uno o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosomas en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes;
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en los epítopos diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia;
en el que un cambio en el estado epigenético en presencia y ausencia del agente identifica un agente que modifica el estado epigenético.
Breve descripción de las figuras
Las figuras 1A-1C muestran la síntesis y validación de la calidad de nucleosomas de diseño (dNucs) recombinantes modificados. (A) Espectrometría de masas de histona tricitrulinada H3R2/R8/R17 antes del ensamblaje de dNuc. Masa esperada = 15227 Daltons; masa real = 15226 Daltons. (B) Validación de octámero y PTM utilizando Coomassie e inmunotransferencia (Abcam: ab5103) después de SDS-PAGE reductora. (C) Validación del ensamblaje de dNuc H3R2cit/R8cit/R17cit utilizando PAGE nativa (sin ADN libre).
Las figuras 2A-2B muestran que los nucleosomas se recuperan en los valores esperados y proporcionan una calibración fiable en plasma humano. Se desarrolló un ELISA de tipo sándwich para medir la citrulinación de nucleosomas, utilizando dNucs e histonas H3R2cit/R8cit/R17cit como sustratos. Los sustratos se capturaron utilizando un anticuerpo anti-H3R2cit/R8cit/R17cit; la detección se realizó utilizando un anticuerpo conjugado con HRP específico para el extremo terminal C no modificado de H3. (A) Curva patrón usando dNucs o H3 citrulinados añadidos a plasma humano al 5%. (B) Recuperación de dNuc o H3 citrulinados añadidos a plasma al 100%. Las muestras se diluyeron 20 veces antes del ELISA y se normalizaron a los patrones en (A). Teórico = valor normalizado esperado.
Las figuras 3A-3C muestran la optimización de ELISA para PTM de nucleosoma utilizando dNucs modificados combinatoriamente. Un anticuerpo de captura contra una PTM específica (H3R8cit) se emparejó con una diversidad de anticuerpos de detección, incluido (A) un anticuerpo anti-H3 C-terminal, (B) un anticuerpo anti-H3R2cit y (C) el mismo anticuerpo anti-H3R8cit utilizado para la captura. Estos pares de captura-detección se sometieron a ensayo contra un dNuc modificado combinatoriamente (H3R2cit/R8cit/R17cit) y dNucs sin modificar en ELISA para identificar reactivos con fondo bajo y alta especificidad.
Las figuras 4A-4B muestran que los dNucs modificados recombinantes se recuperan y se cuantifican de forma fiable a partir de plasma humano. El ELISA de tipo sándwich optimizado utiliza un anticuerpo anti-H3R8cit para la captura del sustrato, seguido de incubación con un anticuerpo anti-H3R2cit biotinilado y detección con estreptavidina-HRP. (A) Se añadieron dNucs H3R2cit/R8cit/R17cit a un tampón ELISA estándar para generar una curva patrón. (B) Se añadieron dNucs H3R2cit/R8cit/R17cit a diluciones variables de plasma humano sano y el porcentaje de recuperación se interpoló a partir de la curva patrón que se muestra en (A).
Las figuras 5A-5D muestran concentraciones estimadas de dNucs de nucleosomas modificados circulantes endógenos en plasma humano. (A, C) Se utilizaron dNucs H3R2cit/R8cit/R17cit para generar curvas patrón para cuantificar la citrulinación de nucleosomas utilizando procedimientos de regresión lineal (A) y no lineal (C) . (B, D) El plasma de pacientes diagnosticados con artritis reumatoide (AR) grave y moderada, una patología asociada con altos niveles de citrulinación de nucleosomas en sangre, y controles sanos se diluyeron y se analizaron mediante ELISA. (B) La dilución lineal de muestras de plasma humano es paralela a la curva patrón lineal (A), estableciendo dNucs como referencias adecuadas para nucleosomas endógenos. (D) La normalización utilizando curvas patrón no lineales proporciona una recuperación precisa y consistente en una amplia gama de diluciones de plasma y muestra niveles alterados de citrulinación de nucleosomas entre los controles y la AR de moderada a grave. Para todas las imágenes de las figuras 5A-5D, se realizó un ELISA utilizando un anticuerpo anti-H3R8cit para la captura del sustrato, seguido de incubación con anticuerpo anti-H3R2cit biotinilado y detección con estreptavidina-HRP.
Descripción detallada de la invención
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas que se incluyen con la presente memoria descriptiva. La presente divulgación se explica con mayor detalle a continuación. Por ejemplo, las características ilustradas con respecto a una forma de realización de la divulgación pueden incorporarse en otras formas de realización de la divulgación, y las características ilustradas con respecto a una forma de realización particular de la divulgación pueden eliminarse de esa forma de realización de la divulgación. Además, a la luz de la presente divulgación, resultarán evidentes para los expertos en la técnica numerosas variaciones y adiciones a las diversas formas de realización de la divulgación sugeridas en el presente documento que no se apartan de la presente divulgación. Por lo tanto, la siguiente memoria descriptiva pretende ilustrar algunas formas de realización particulares de la divulgación, y no especificar exhaustivamente todas las permutaciones, combinaciones y variaciones de las mismas.
A menos que el contexto indique lo contrario, se pretende específicamente que las diversas características de la divulgación descritas en el presente documento puedan usarse en cualquier combinación. Además, la presente divulgación también contempla que en algunas formas de realización de la divulgación, cualquier característica o combinación de características establecidas en el presente documento puede excluirse u omitirse. A modo de ilustración, si la memoria descriptiva establece que un complejo comprende los componentes A, B y C, se pretende específicamente que cualquiera de A, B o C, o una combinación de los mismos, pueda omitirse individualmente o en cualquier combinación.
A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. La terminología utilizada en la descripción de la divulgación en el presente documento tiene únicamente el propósito de describir formas de realización particulares de la divulgación y no pretende ser limitante de la divulgación.
Las secuencias de nucleótidos se presentan en el presente documento por medio de únicamente una cadena sencilla, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha, a menos que se indique específicamente lo contrario. Los nucleótidos y los aminoácidos se representan en el presente documento de la forma recomendada por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB, o (para aminoácidos) mediante el código de una letra o el código de tres letras, ambos de acuerdo con 37 C.F.R. §1.822 y el uso establecido.
A menos que se indique lo contrario, se pueden utilizar procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica para la producción de polipéptidos, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos recombinantes y sintéticos de los mismos, la manipulación de secuencias de ácidos nucleicos, la producción de células transformadas, la construcción de nucleosomas y células transfectadas de forma transitoria y estable. Estas técnicas son conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2a Ed. (Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989); F. M. AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).
Tal como se utilizan en la descripción de la divulgación, se pretende que las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se utiliza en el presente documento, "y/o" se refiere a, y abarca, todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpreta de forma alternativa ("o").
Además, la presente divulgación también contempla que en algunas formas de realización de la divulgación, cualquier característica o combinación de características establecidas en el presente documento puede excluirse u omitirse.
Además, se pretende que el término "aproximadamente", tal como se utiliza en el presente documento cuando se refiere a un valor mensurable tal como una cantidad de un compuesto o agente de la presente divulgación, dosis, tiempo, temperatura y similares, abarque variaciones de ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0,5% o incluso ± 0,1% de la cantidad especificada.
El término "que consiste esencialmente en", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a un ácido nucleico o una proteína, significa que el ácido nucleico o la proteína no contiene ningún elemento distinto del o de los elementos mencionados que altere significativamente (por ejemplo, más de aproximadamente el 1%, 5% o 10%) la función de interés del ácido nucleico o proteína.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Es decir, una descripción que se refiera a un polipéptido se aplica igualmente a una descripción de un péptido y a una descripción de una proteína, y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un aminoácido no natural. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluidas proteínas de longitud completa, en las que los residuos de aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos y/o pseudopeptídicos covalentes.
Un "ácido nucleico" o "secuencia de nucleótidos" es una secuencia de bases de nucleótidos, y pueden ser secuencias de ARN, ADN o híbridos de ADN-ARN (incluidos nucleótidos tanto de origen natural como de origen no natural), pero preferentemente son secuencias de ADN monocatenario o bicatenario.
Tal como se utiliza en el presente documento, un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos "aislado" (por ejemplo, un "ADN aislado" o un "ARN aislado") significa un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos separado o sustancialmente desprovisto de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus de origen natural, por ejemplo, la célula o los componentes estructurales víricos u otros polipéptidos o ácidos nucleicos que se encuentran comúnmente asociados con el ácido nucleico o la secuencia de nucleótidos.
Asimismo, un polipéptido "aislado" significa un polipéptido que se ha separado o está sustancialmente desprovisto de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus de origen natural, por ejemplo, los componentes estructurales celulares o víricos u otros polipéptidos o ácidos nucleicos que se encuentran comúnmente asociados con el polipéptido.
Por "conservar sustancialmente" una propiedad, se entiende que se conserva al menos aproximadamente el 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% de la propiedad (por ejemplo, actividad u otra característica medible).
El término "epítopo" se refiere a cualquier sitio de una biomolécula que pueda provocar la unión de un reactivo de afinidad. El reactivo de afinidad podría reconocer una secuencia lineal de una biomolécula o fragmento de biomolécula, la forma de una biomolécula o fragmento de biomolécula, una propiedad quimiofísica de una biomolécula o fragmento de biomolécula, o una combinación de las mismas.
En el presente documento se puede hacer referencia a los "aminoácidos" mediante sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Los residuos de aminoácidos en proteínas o péptidos se abrevian de la forma siguiente: fenilalanina es Phe o F; leucina es Leu o L; isoleucina es Ile o I; metionina es Met o M; valina es Val o V; serina es Ser o S; prolina es Pro o P; treonina es Thr o T ; alanina es Ala o A; tirosina es Tyr o Y; histidina es His o H; glutamina es Gln o Q; asparagina es Asn o N; lisina es Lys o K; el ácido aspártico es Asp o D; ácido glutámico es Glu o E; cisteína es Cys o C; triptófano es Trp o W; arginina es Arg o R; y glicina es Gly o G.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y no naturales, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que operan de una forma similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos<codificados de forma natural son los>20<aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína,>glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina) y pirrolisina y selenocisteína. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, tales como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina y metionina-metil-sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (tales como norleucina) o cadenas peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que alteran, añaden o eliminan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora" en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Los expertos en la técnica conocen tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Dichas variantes modificadas de forma conservadora son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos/ortólogos entre especies y alelos de los agentes descritos en el presente documento.
Un "antígeno", tal como se utiliza en el presente documento, puede ser cualquier estructura que sea reconocida por un anticuerpo o para la que se puedan generar anticuerpos de reconocimiento (o reactivos de afinidad análogos tales como aptámeros o fagos seleccionados). En determinadas formas de realización de la divulgación, los antígenos pueden comprender un único residuo de aminoácido o un fragmento de aminoácido de 2 o más residuos. En determinadas formas de realización de la divulgación, los antígenos pueden comprender modificaciones de un aminoácido, tales como acetilación, metilación (por ejemplo, mono-, di-, tri-, simétrica, asimétrica), fosforilación, ubiquitinación (por ejemplo, mono-, di-, tri-, poli-), sumoilación, ADP-ribosilación, citrulinación, biotinilación e isomerización cis-trans. En determinadas formas de realización de la divulgación, los antígenos pueden comprender modificaciones de nucleótidos, tales como 5-metilcitosina. En otras formas de realización de la divulgación, los antígenos pueden comprender mutaciones específicas, tales como mutaciones puntuales. En otras formas de realización más de la divulgación, los antígenos pueden comprender secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos de tipo silvestre.
El término "modificación postraduccional" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que se produce o se produciría en dicho aminoácido después de que se haya incorporado a una cadena polipeptídica in vivo o in vitro. Dichas modificaciones incluyen, entre otras, acilación (por ejemplo, acetil-, butiril-, crotonil-), metilación (por ejemplo, mono-, di-, tri-), fosforilación, ubiquitinación (por ejemplo, mono-, di-, tri-, poli-), sumoilación, ADP-ribosilación, citrulinación, biotinilación e isomerización cis-trans. Estas modificaciones podrán introducirse sintéticamente, por ejemplo, químicamente, durante la síntesis de polipéptidos o enzimáticamente después de la síntesis de polipéptidos o de la purificación de polipéptidos.
El término "modificación postranscripcional" se refiere a cualquier modificación de un nucleótido natural o no natural que se produce o se produciría en dicho nucleótido después de que se haya incorporado a una cadena de polinucleótidos in vivo o in vitro. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 5,6-dihidrouracilo, 7-metilguanosina, xantosina e inosina.
La presente invención se refiere al uso de nucleosomas recombinantes/semisintéticos que portan modificaciones de histona y/o de ADN como patrones para la cuantificación de ensayos. A diferencia de los extractos de cromatina purificados que se utilizan actualmente, el presente ensayo utiliza nucleosomas recombinantes/semisintéticos completamente definidos para la cuantificación precisa de modificaciones de nucleosoma individuales o combinatorias. Los procedimientos de la invención, ventajosamente, son capaces de proporcionar una cuantificación absoluta de modificaciones de histona y/o de ADN, es decir, la detección del número de moléculas modificadas en lugar de, o además, de la abundancia relativa. De forma similar a los patrones comúnmente utilizados en la técnica, los nucleosomas modificados se someterán a ensayo en el mismo experimento (se tratarán de manera idéntica a las muestras) para generar una curva patrón para la cuantificación del ensayo. La cuantificación de PTM de nucleosoma individuales o combinatorias puede proporcionar mejores biomarcadores de enfermedades que las mediciones relativas actualmente en uso. En algunas formas de realización de la divulgación, los nucleosomas recombinantes se pueden usar como controles para confirmar que se detectan modificaciones combinatorias en un nucleosoma individual o en nucleosomas adyacentes.
Tal como se utiliza en el presente documento, un nucleosoma recombinante (también llamado nucleosoma de diseño (dNuc)) es uno que se ha preparado reuniendo histonas (incluidas las histonas centrales H2A, H2B, H3 y H4, y<opcionalmente la histona enlazadora H>1<), ADN, y opcionalmente otros factores para formar el nucleosoma. En otras>palabras, un nucleosoma recombinante es aquel que se sintetiza, no que se aísla de células o de cromatina. Cada histona del nucleosoma puede ser independientemente totalmente sintética, semisintética (por ejemplo, producida de forma recombinante y ligada a un péptido sintético), o estar producida de forma recombinante. Cada histona del nucleosoma puede ser una variante de histona (por ejemplo, H3.3, H2A.Bbd, H2A.Z.1, H2A.Z.2, H2A.X, mH2A1.1, mH2A1.2, mH2A2 o TH2B). El término nucleosoma recombinante abarca nucleosomas semisintéticos y nucleosomas sintéticos.
Los nucleosomas recombinantes de la presente descripción se pueden usar como patrones de adición en cualquier inmunoensayo conocido basado en cromatina (o que se basen en un reactivo de afinidad análogo).
Por tanto, un aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para cuantificar la abundancia de una modificación de nucleosoma (histona o ADN) en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en un epítopo diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende un epítopo diana de modificación de histona central y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir un reactivo de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes; y
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en el epítopo diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para cuantificar la abundancia de dos o más modificaciones (histona o ADN) en un nucleosoma individual en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden dos o más modificaciones de histona central y/o de ADN en un epítopo diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan dos o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir dos o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes; y
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en los epítopos diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para cuantificar la abundancia de una o más modificaciones de nucleosoma (histona o ADN) en una muestra biológica de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica del sujeto;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en uno o varios epítopos diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan uno o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir uno o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes; y
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en el epítopo diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia.
En cada uno de los procedimientos de la divulgación, la muestra biológica puede ser cualquier muestra de la que se puedan aislar nucleosomas. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, sangre, suero, plasma, orina, saliva, semen, líquido prostático, aspirado de pezón, líquido lagrimal, transpiración, heces, hisopos de mejillas, líquido cefalorraquídeo, muestras de lisado celular, líquido amniótico, líquido gastrointestinal, tejido de biopsia, líquido linfático o líquido cefalorraquídeo. En algunas formas de realización de la divulgación, la muestra biológica comprende células y la cromatina se aísla de las células. En algunas formas de realización de la divulgación, las células son células de una enfermedad o trastorno asociado a cambios en una o más modificaciones postraduccionales de histonas y/o modificaciones del ADN, por ejemplo, una célula enferma. En algunas formas de realización de la divulgación, las células son células de un tejido u órgano afectado por una enfermedad o trastorno asociado a mutaciones en histonas, por ejemplo, un tejido u órgano enfermo. Las células pueden obtenerse del órgano o tejido enfermo mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluida, pero sin limitación, la aspiración.
En otras formas de realización de la divulgación, las células no son células de un tejido u órgano afectado por una enfermedad o trastorno asociado a cambios en las modificaciones postraduccionales de histonas o modificaciones del ADN o asociado a mutaciones en histonas. Las células pueden ser, por ejemplo, células que sirven como sustitutos de las células enfermas. Las células pueden ser células que son más fácilmente accesibles que las células enfermas, por ejemplo, que se puede obtener sin necesidad de procedimientos complicados o dolorosos tales como biopsias. Los ejemplos de células adecuadas incluyen, sin limitación, células mononucleares de sangre periférica.
En algunas formas de realización de la divulgación, la muestra biológica es una biopsia. En otras formas de realización de la divulgación, la muestra biológica es un fluido biológico. En algunas formas de realización de la divulgación, la muestra biológica comprende células mononucleares de sangre periférica. En otras formas de realización de la divulgación, la muestra biológica comprende nucleosomas circulantes, por ejemplo, liberados de las células moribundas. Los nucleosomas circulantes pueden ser, por ejemplo, de sangre o de células de una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas. En determinadas formas de realización de la divulgación, la muestra biológica es plasma, orina, saliva, heces, líquido linfático o líquido cefalorraquídeo. En algunas formas de realización de la divulgación, la muestra biológica se puede tratar con una enzima para digerir la cromatina en mononucleosomas y/o polinucleosomas. La enzima puede ser, sin limitación, una nucleasa, por ejemplo, nucleasa microcócica.
El sujeto puede ser cualquier sujeto para el que se deseen los procedimientos de la presente divulgación. En algunas formas de realización de la divulgación, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano. En algunas formas de realización de la divulgación, el sujeto es un animal de laboratorio, por ejemplo, un ratón, una rata, un perro o un mono, por ejemplo, un modelo animal de una enfermedad. En determinadas formas de realización de la divulgación, el sujeto puede ser alguien a quien se le ha diagnosticado o se sospecha que padece una enfermedad o trastorno. En algunas formas de realización de la divulgación, el sujeto puede ser alguien que esté en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno, por ejemplo, debido a genética, antecedentes familiares, exposición a toxinas, etc.
El agente de afinidad usado en los procedimientos de la divulgación puede ser cualquier agente que reconozca y se una específicamente a una modificación de histona o de ADN de interés presente en un epítopo diana. En algunas formas de realización de la divulgación, el agente de afinidad es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido hacia el epítopo. El anticuerpo o fragmento del mismo puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, un<Fab, un Fab', un F(ab)'>2<, un scFv, un fragmento Fv, un nanocuerpo, un VHH o una unidad mínima de reconocimiento.>El agente de afinidad puede ser un aptámero o una estructura que no sea de inmunoglobulina, tal como un aficuerpo, una molécula de afilina, una adnectina, una muteína de lipocalina, una DARPina, una knottina, un dominio de tipo Kunitz, un avímero, una tetranectina o un trans-cuerpo.
En algunas formas de realización de la divulgación, la cuantificación de al menos una o más modificaciones de nucleosoma se determina mediante un ensayo de detección basado en anticuerpos. Los ejemplos de procedimientos de detección basados en anticuerpos incluyen, sin limitación, ChIP, ELISA, AlphaLISA, AlphaSCREEN, Luminex e inmunotransferencia. En algunas formas de realización de la divulgación, el ensayo de detección basado en anticuerpos utiliza dos anticuerpos diferentes para la captura y la detección del sustrato. En una forma de realización de la divulgación, los anticuerpos de captura y detección pueden unirse específicamente a una PTM de histona y a otra estructura de nucleosoma, tal como ADN o histona no modificada, respectivamente (tal como se muestra en la figura 3A). En otra forma de realización de la divulgación, los anticuerpos de captura y detección son para dos PTM de histona diferentes, respectivamente (tal como se muestra en la figura 3B). En algunas formas de realización de la divulgación, el ensayo de detección basado en anticuerpos utiliza el mismo anticuerpo tanto para la captura como para la detección del sustrato (tal como se muestra en la figura 3C).
La modificación de histona o ADN que puede cuantificarse mediante los procedimientos de la divulgación incluye cualquier modificación que se conozca en la técnica o se identifique en el futuro. Las modificaciones de aminoácidos postraduccionales conocidas incluyen, sin limitación, N-acetilación de serina y alanina; fosforilación de serina, treonina<y tirosina; N-crotonilación, N-acilación de lisina; N>6<-metilación, N>6<,N>6<-dimetilación, N>6<,N>6<,N>6<-trimetilación de lisina;>omega-N-metilación, dimetilación simétrica, dimetilación asimétrica de arginina; citrulinación de arginina; ubiquitinilación de lisina; sumoilación de lisina; O-metilación de serina y treonina, ADP-ribosilación de arginina, ácido aspártico y ácido glutámico; y mutaciones oncogénicas (por ejemplo, H3K4M, H3K9M, H3K27M, H3G34R, H3G34V, H3G34W o H3K36M). Las modificaciones postranscripcionales de ADN conocidas incluyen, sin limitación, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina, 5-carboxilcitosina, 3-metilcitosina, 5,6-dihidrouracilo, 7-metilguanosina, xantosina e inosina.
El epítopo diana puede ser cualquier epítopo de una histona central o de ADN para el cual se desea una cuantificación y/o una seguimiento. En algunas formas de realización de la divulgación, el epítopo es una modificación postraduccional o isoforma proteica. En algunas formas de realización de la divulgación, el epítopo de la histona central comprende al menos una modificación de aminoácido postraduccional, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en N-acetilación de serina y alanina; fosforilación de serina, treonina y tirosina; N-acilación de lisina (por<ejemplo, crotonilación o butirilación); N>6<-metilación, N>6<,N>6<-dimetilación, N>6<,N>6<,N>6<-trimetilación de lisina; omega-N->metilación, dimetilación simétrica, dimetilación asimétrica de arginina; citrulinación de arginina; ubiquitinilación de lisina; sumoilación de lisina; O-metilación de serina y treonina; fosforilación de serina, treonina o tirosina; ADP-ribosilación de arginina, ácido aspártico y ácido glutámico, y cualquier combinación de las mismas. La modificación<puede ser cualquiera de las enumeradas en la tabla>1<(a>)-1<(f), ya sea sola o en cualquier combinación.>
En algunas formas de realización de la divulgación, el epítopo es una mutación en una histona central, por ejemplo, una mutación asociada con una enfermedad o trastorno. En algunas formas de realización de la divulgación, la mutación es una mutación oncogénica, por ejemplo, una mutación que incluye, pero sin limitación, H3K4M, H3K9M, H3K27M, H3G34R, H3G34V, H3G34W, H3K36M y cualquier combinación de las mismas. Los mutantes H3 pueden basarse en cualquier cadena principal variante de H3, por ejemplo, H3.1, H3.2 o H3.3.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar un pronóstico para un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas basado en la cuantificación de una o más modificaciones de nucleosoma, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica del sujeto;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en uno o varios epítopos diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan uno o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir uno o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes;
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en los epítopos diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia; y
h. determinar el pronóstico del sujeto basándose en la abundancia de uno o más epítopos diana.
Los detalles descritos anteriormente para el procedimiento de detección y cuantificación de la presencia de modificaciones de nucleosoma se aplican también a este procedimiento.
En algunos casos, el estado epigenético de un epítopo es indicativo del pronóstico de una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas. Por lo tanto, una determinación del estado epigenético de un epítopo en un sujeto al que se le ha diagnosticado o se sospecha que padece una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas puede ser útil para determinar el pronóstico para el sujeto. Muchos de estos ejemplos se conocen en la técnica. Un ejemplo es el cáncer de próstata y PTM de histona, que incluyen, sin limitación, un aumento de la acetilación de H3K18 y la dimetilación de H3K4 asociados con un riesgo significativamente mayor de recurrencia del tumor de próstata, la acetilación de H4K12 y la dimetilación de H4R3 correlacionadas con el estadio del tumor, y la dimetilación de H3K9 asociada a pacientes con cáncer de próstata de bajo grado en riesgo de recurrencia. Otro ejemplo es el vínculo entre la supervivencia general en pacientes con cáncer de mama y el estado de metilación de<las CpG en los genes CREB5, EXPH5, ZNF775, ADCY3 y ADMA>8<. Otro ejemplo es el glioblastoma y la hipermetilación>de regiones intrónicas de genes tales como EGFR, P<t>E<n>, NF1, PIK3R1, RB1, PDGFRA y QKI. Otro ejemplo es el pronóstico inferior para el cáncer de colon y el estado de metilación del promotor de los genes CNRIP1, FBN1, INA, MAL, SNCA y SPG20.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para identificar un biomarcador de una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas basado en la cuantificación de una o más modificaciones de nucleosoma, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica del sujeto;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en uno o varios epítopos diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan uno o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir uno o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes;
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en los epítopos diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia; y
h. correlacionar la abundancia de uno o más epítopos diana con la enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas; identificando así un biomarcador de la enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas.
Los detalles descritos anteriormente para el procedimiento de detección y cuanificación de la presencia de una modificación de nucleosoma también se aplican a este procedimiento.
En este procedimiento, se pueden tomar muestras biológicas de tejido enfermo de varios pacientes que padecen una enfermedad o trastorno y se puede determinar el estado epigenético de uno o más epítopos. Pueden identificarse entonces correlaciones entre el estado del epítopo y la incidencia, estadio, subtipo, pronóstico, etc., usando técnicas analíticas que son bien conocidas en la técnica.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento de selección de un agente que modifica el estado epigenético de una o más modificaciones de nucleosoma a partir de una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo el procedimiento determinar la cuantificación de una o más modificaciones de nucleosoma en presencia y ausencia del agente, en el que determinar la cuantificación de una o más modificaciones de nucleosoma comprende:
a. aislar una muestra biológica del sujeto;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en uno o varios epítopos diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende nucleosomas que portan uno o más epítopos diana de modificación de histona y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosomas recombinantes en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia;
e. añadir uno o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes;
g. cuantificar la abundancia de modificación de nucleosoma en los epítopos diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia;
en el que un cambio en el estado epigenético en presencia y ausencia del agente identifica un agente que modifica el estado epigenético.
Los detalles descritos anteriormente para el procedimiento de detectar y cuantificar la presencia de una modificación del nucleosoma también se aplican a este procedimiento.
El procedimiento de selección puede usarse para identificar agentes que aumentan o disminuyen las modificaciones epigenéticas. En algunas formas de realización de la divulgación, el aumento o disminución detectado es estadísticamente significativo, por ejemplo, al menos p < 0,05, por ejemplo, p < 0,01, 0,005 o 0,001. En otras formas<de realización de la divulgación, el aumento o disminución detectado es al menos aproximadamente el>10<%,>20<%,>30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o superior.
Según la presente divulgación, puede seleccionarse cualquier compuesto de interés. Los compuestos de ensayo adecuados incluyen moléculas orgánicas e inorgánicas. Las moléculas orgánicas adecuadas pueden incluir, pero sin limitación, moléculas pequeñas (compuestos de menos de aproximadamente 1000 Dalton), polipéptidos (incluidos enzimas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos), carbohidratos, lípidos, coenzimas y moléculas de ácido nucleico (incluidos ADN, ARN y quimeras y análogos de los mismos) y nucleótidos y análogos de nucleótidos.
Además, los procedimientos de la divulgación se pueden poner en práctica para seleccionar una biblioteca de reguladores potenciales o específicos, por ejemplo, una biblioteca de moléculas pequeñas, una biblioteca de compuestos químicos combinatorios, una biblioteca de polipéptidos, una biblioteca de ADNc, una biblioteca de ácidos nucleicos antisentido, una biblioteca de ARNip y similares, o una colección de compuestos en matrices tales como matrices de polipéptidos y ácidos nucleicos.
Puede usarse cualquier formato de ensayo de selección adecuado, por ejemplo, selección de alto rendimiento.
El procedimiento también puede usarse para caracterizar agentes que se han identificados como agentes que modifican el estado epigenético de un locus genómico específico en la cromatina. La caracterización, por ejemplo, la caracterización preclínica, puede incluir, por ejemplo, determinar concentraciones eficaces, determinar esquemas de dosificación eficaces y medir la farmacocinética y la farmacodinámica.
Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un procedimiento para supervisar cambios en el estado epigenético a lo largo del tiempo en la cromatina de una muestra biológica de un sujeto, usando los procedimientos de la divulgación.
Los detalles descritos anteriormente para el procedimiento de detectar y cuantificar la presencia de una modificación del nucleosoma también se aplican a este procedimiento.
Las etapas del procedimiento se pueden repetir tantas veces como se desee para supervisar cambios en el estado de<una modificación epigenética, por ejemplo, 2, 3, 4, 5,>6<, 7,>8<, 9, 10, 25, 50 o 100 o más veces. El procedimiento puede>repetirse según una agenda regular (por ejemplo, diaria, semanal, mensual, anual) o sobre la base que sea necesaria. El procedimiento puede repetirse, por ejemplo, antes, durante y/o después de un tratamiento terapéutico de un sujeto; después de un diagnóstico de una enfermedad o trastorno en un sujeto; como parte de la determinación de un diagnóstico de una enfermedad o trastorno en un sujeto; después de la identificación de un sujeto que se encuentra en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno, o cualquier otra situación en la que es deseable supervisar posibles cambios en modificaciones o mutaciones epigenéticas.
Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un procedimiento para supervisar la eficacia de una terapia epigenética en un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas, comprendiendo el procedimiento supervisar cambios en el estado epigenético a lo largo del tiempo en la cromatina de una muestra biológica del sujeto, utilizando los procedimientos de la divulgación.
Los detalles descritos anteriormente para el procedimiento de detección y cuanificación de la presencia de una modificación de nucleosoma también se aplican a este procedimiento.
Las terapias epigenéticas son aquellas diseñadas para alterar el estado epigenético de las proteínas (por ejemplo, histonas) o ADN. Un ejemplo de terapia epigenética incluye inhibidores de lisina desacetilasa (también denominados inhibidores de histona desacetilasa) (por ejemplo, vorinostat (suberoilanilida-ácido hidroxámico), CI-994 (tacedinalina), MS-275 (entinostat), BMP-210, M344, n V p -La Q824, LBH-529 (panobinostat), MGCD0103 (mocetinostat), PXD101 (belinostat), CBHA, PCI-24781, ITF2357, ácido valproico, tricostatina A y butirato de sodio), que se utilizan para tratar el linfoma cutáneo de células T (CTCL) o en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores hematológicos y sólidos, incluidos cánceres de pulmón, de mama, de páncreas, de riñón y de vejiga, melanoma, glioblastoma, leucemias, linfomas y mieloma múltiple. Otro ejemplo de terapia epigenética son los inhibidores de lisina acetiltransferasa (también denominados inhibidores de histona acetiltransferasa) (por ejemplo, epigalocatequina-3-galato, garcinol, ácido anacárdico, CPTH2, curcumina, MB-3, MG149, C646 y romidepsina). Otro ejemplo de terapia epigenética son los inhibidores de ADN metiltransferasa (por ejemplo, azacitidina, decitabina, zebularina, ácido cafeico, ácido clorogénico, epigalocatequina, hidralazina, procainamida, procaína y RG108), que han sido aprobados para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda, el síndrome mielodisplásico y la leucemia mielomonocítica crónica y en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos. Otras terapias epigenéticas incluyen, sin limitación, lisina metiltransferasas (por ejemplo, pinometostato, tazometostato, CPI-1205); lisina desmetilasas (por ejemplo, ORY1001); arginina metiltransferasas (por ejemplo, EPZ020411); arginina deiminasas (por ejemplo, GSK484); e isocitrato deshidrogenasas (por ejemplo, enasidenib, ivosidenib). Véase Fischle et al., ACS Chem. Biol. 11:689 (2016); DeWoskin et al., Nature Rev. 12:661 (2013); Campbell et al., J. Clin. Invest. 124:64 (2014); y Brown et al., Future Med. Chem. 7:1901 (2015).
Las etapas del procedimiento se pueden repetir tantas veces como se desee para controlar la eficacia del tratamiento,<por ejemplo, 2, 3, 4, 5,>6<, 7,>8<, 9, 10, 25, 50 o 100 o más veces. El procedimiento puede repetirse según una agenda>regular (por ejemplo, diaria, semanal, mensual, anual) o sobre la base que sea necesaria, por ejemplo, hasta finalizar el tratamiento terapéutico. El procedimiento puede repetirse, por ejemplo, antes, durante y/o después del tratamiento terapéutico de un sujeto, por ejemplo, después de cada administración del tratamiento. En algunas formas de realización de la divulgación, el tratamiento continúa hasta que el procedimiento de la divulgación muestra que el tratamiento ha sido eficaz.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a un procedimiento para seleccionar un tratamiento adecuado para un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas basándose en el estado epigenético en la cromatina a partir de una muestra biológica del sujeto usando los procedimientos de la divulgación.
Los detalles descritos anteriormente para el procedimiento de detección y cuantificación de la presencia de una modificación o mutación del nucleosoma se aplican también a este procedimiento.
El procedimiento puede aplicarse, por ejemplo, a sujetos a los que se les ha diagnosticado o se sospecha que padecen una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas. Una determinación del estado epigenético de un epítopo puede indicar que el estado de un epítopo se ha modificado y se debe administrar una terapia epigenética al sujeto para corregir la modificación. Por el contrario, la determinación de que el estado de un epítopo no se ha modificado indicaría que no se espere que una terapia epigenética sea eficaz y deberá evitarse. Por ejemplo, una determinación de que un residuo de histona acetilada particular (H3K27ac) se ha desacetilado puede indicar que el tratamiento con un inhibidor de lisina desacetilasa sería apropiado. De forma similar, la determinación de que un residuo particular de histona metilada (H3K27me3) se ha hipermetilado puede indicar que el tratamiento con un inhibidor de lisina metiltransferasa sería apropiado.
Tal como se utiliza en el presente documento, una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas es cualquier enfermedad o trastorno en el que se sabe que una modificación epigenética es la causa de la enfermedad o trastorno o al menos un síntoma de la enfermedad o trastorno o una enfermedad o trastorno en el que una modificación epigenética es un biomarcador de la enfermedad o trastorno. En cualquiera de los procedimientos de la divulgación, la enfermedad o trastorno asociado a modificaciones o mutaciones epigenéticas puede ser un cáncer, un trastorno del sistema nervioso central (SNC), un trastorno autoinmunitario, un trastorno inflamatorio o una enfermedad infecciosa.
El cáncer puede ser cualquier crecimiento anormal de células, benigno o maligno, incluidos, pero sin limitación, neuroma acústico, leucemia granulocítica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, adenocarcinoma, carcinoma suprarrenal, carcinoma de corteza suprarrenal, cáncer anal, astrocitoma anaplásico, angiosarcoma, carcinoma de células basales, carcinoma de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma cervical, hiperplasia cervical, cordoma, coriocarcinoma, leucemia granulocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, cistoadenosarcoma, carcinoma embrionario, cáncer de endometrio, endoteliosarcoma, ependimoma, carcinoma epitelial, carcinoma de esófago, trombocitosis esencial, tumor de Ewing, fibrosarcoma, carcinoma genitourinario, glioblastoma, glioma, gliosarcoma, leucemia de células peludas, cáncer de cabeza y cuello, hemangioblastoma, carcinoma hepático, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, leucemia, liposarcoma, cáncer de pulmón, linfangioendoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfoma, carcinoma carcinoide maligno, hipercalcemia maligna, melanoma maligno, insulinoma pancreático maligno, mastocitoma, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, mesotelioma, mieloma múltiple, micosis fungoide, mieloma, mixoma, mixosarcoma, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, oligodendroglioma, sarcoma osteogénico, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, adenosarcoma papilar, sarcoma papilar, pinealoma, policitemia vera, carcinoma cerebral primario, macroglobulinemia primaria, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de glándulas sebáceas, seminoma, cáncer de piel, carcinoma de pulmón de células pequeñas, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, carcinoma de estómago, carcinoma de glándulas sudoríparas, sinovioma, carcinoma testicular , cáncer de garganta, carcinoma de tiroides y tumor de Wilms.
Los trastornos del SNC incluyen trastornos genéticos, trastornos neurodegenerativos, trastornos psiquiátricos y tumores. Enfermedades ilustrativas del SNC incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Canavan, enfermedad de Leigh, enfermedad de Refsum, síndrome de Tourette, esclerosis lateral primaria, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular progresiva, enfermedad de Pick, distrofia muscular, esclerosis múltiple, miastenia gravis, enfermedad de Binswanger, traumatismo debido a lesión de la médula espinal o de la cabeza, enfermedad de Tay Sachs, enfermedad de Lesch-Nyan, epilepsia, infartos cerebrales, trastornos psiquiátricos, incluidos trastornos del estado de ánimo (por ejemplo, depresión, trastorno afectivo bipolar, trastorno afectivo persistente, trastorno secundario del estado de ánimo, manía, psicosis maníaca), esquizofrenia, trastorno esquizoafectivo, trastorno esquizofreniforme, drogodependencia (por ejemplo, alcoholismo y otras drogodependencias), neurosis (por ejemplo, ansiedad, trastorno obsesivo, trastorno somatomorfo, trastorno disociativo, duelo, depresión posparto), psicosis (por ejemplo, alucinaciones y delirios, psicosis no especificada de otra manera (psicosis NOS), demencia, envejecimiento, paranoia, trastorno de déficit de atención, trastornos psicosexuales, trastornos del sueño, trastornos del dolor, trastornos de la alimentación o del peso (por ejemplo, obesidad, caquexia, anorexia nerviosa y bulemia), trastornos oftálmicos que afectan a la retina, el tracto posterior y el nervio óptico (por ejemplo, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética y otras enfermedades degenerativas de la retina, uveítis, degeneración macular asociada a la edad, glaucoma), y cánceres y tumores (por ejemplo, tumores hipofisarios) del SNC.
Las enfermedades y trastornos autoinmunitarias e inflamatorias incluyen, sin limitación, miocarditis, síndrome posinfarto de miocardio, síndrome pospericardiotomía, endocarditis bacteriana subaguda, nefritis antimembrana basal glomerular, cistitis intersticial, nefritis lúpica, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, síndrome antisintetasa, sinusitis, periodontitis, aterosclerosis, dermatitis, alergia, rinitis alérgica, inflamación alérgica de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía eosinofílica, esofagitis eosinofílica, síndrome hipereosinofílico, enfermedad de injerto contra huésped, dermatitis atópica, tuberculosis, asma, úlcera péptica crónica, alopecia areata, angioedema autoinmunitaria, dermatitis autoinmunitaria por progesterona, urticaria autoinmunitaria, penfigoide ampolloso, penfigoide cicatricial, dermatitis herpetiforme, lupus eritematoso discoide, epidermólisis ampollosa adquirida, eritema nudoso, penfigoide gestacional, hidradenitis supurativa, liquen plano, liquen escleroso, enfermedad de IgA lineal, morfea, pénfigo vulgar, pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda, enfermedad de Mucha-Habermann, psoriasis, esclerodermia sistémica, vitiligo, enfermedad de Addison, síndrome<poliendocrino autoinmunitario tipo>1<, síndrome poliendocrino autoinmunitario tipo>2<, síndrome poliendocrino>autoinmunitario tipo 3, pancreatitis autoinmunitaria, diabetes mellitus tipo 1, tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis de Ord, enfermedad de Graves, ooforitis autoinmunitaria, endometriosis, orquitis autoinmunitaria, síndrome de Sjogren, enteropatía autoinmunitaria, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, síndrome del intestino irritable, diverticulitis, colitis microscópica, colitis ulcerosa, síndrome antifosfolípido, anemia aplásica, anemia hemolítica autoinmunitaria, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, neutropenia autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, enfermedad de aglutininas frías, crioglobulinemia mixta esencial, síndrome de Evans, anemia perniciosa, aplasia eritrocitaria pura, trombocitopenia, adiposis dolorosa, enfermedad de Still del adulto, espondilitis anquilosante, síndrome CREST, lupus inducido por fármacos, artritis relacionada con entesitis, fascitis eosinofílica, síndrome de Felty, enfermedad relacionada con IgG4, artritis juvenil, enfermedad de Lyme (crónica), enfermedad mixta del tejido conectivo, reumatismo palindrómico, síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonage-Turner, artritis psoriásica, artritis reactiva, policondritis recurrente, fibrosis retroperitoneal, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, síndrome de Schnitzler, lupus eritematoso sistémico, enfermedad indiferenciada del tejido conectivo, dermatomiositis, fibromialgia, miositis, miastenia gravis, neuromiotonía, degeneración cerebelosa paraneoplásica, polimiositis, encefalomielitis aguda diseminada, neuropatía axonal motora aguda, encefalitis anti-receptor de N-metil-D-aspartato, esclerosis concéntrica de Balo, encefalitis de Bickerstaff, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Guillain-Barré, encefalopatía de Hashimoto, enfermedades desmielinizantes inflamatorias idiopáticas, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, esclerosis múltiple, síndrome de Oshtoran, trastorno neuropsiquiátrico autoinmunitario pediátrico asociado con estreptococos (PANDAS), neuropatía inflamatoria progresiva, síndrome de piernas inquietas, síndrome de persona rígida, corea de Sydenham, mielitis transversa, retinopatía autoinmunitaria, uveítis autoinmunitaria, síndrome de Cogan, oftalmopatía de Graves, uveítis intermedia, conjuntivitis leñosa, úlcera de Mooren, neuromielitis óptica, síndrome opsoclonus mioclonus, neuritis óptica, escleritis, síndrome de Susac, oftalmía simpática, síndrome de Tolosa-Hunt, enfermedad autoinmunitaria del oído interno, enfermedad de Méniere, enfermedad de Behcet, granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, arteritis de células gigantes, granulomatosis con poliangeítis, vasculitis por IgA, enfermedad de Kawasaki, vasculitis leucocitoclástica, vasculitis lúpica, vasculitis reumatoide, poliangeítis microscópica, poliarteritis nodosa, polimialgia reumática, vasculitis urticaria, vasculitis e inmunodeficiencia primaria.
El término "enfermedades infecciosas", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad asociada con una infección por un agente infeccioso. Los ejemplos de agentes infecciosos incluyen, sin limitación virus y microorganismos (por ejemplo, bacterias, parásitos, protozoos, criptosporidios). Los virus incluyen, sin limitación, Hepadnaviridae, incluidas hepatitis A, B, C, D, E, F, G, etc.; Flaviviridae, incluidos el virus de la hepatitis C humana (VHC), el virus de la fiebre amarilla y los virus del dengue; Retroviridae, incluidos el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y virus linfotrópicos T humanos (HTLV1 y HTLV2); Herpesviridae, incluidos los virus del herpes simple (HSV-1 y HSV-2), el virus de Epstein Barr (EBV), el citomegalovirus, el virus varicela-zoster (VZV), el virus del herpes<humano>6<(HHV->6<) y el virus del herpes humano>8<(HHV->8<) y virus del herpes B; Papovaviridae, incluido el virus del>papiloma humano; Rhabdoviridae, incluido el virus de la rabia; Paramixoviridae, incluido el virus respiratorio sincitial; Reoviridae, incluidos rotavirus; Bunyaviridae, incluidos hantavirus; Filoviridae, incluido el virus del Ébola; Adenoviridae; Parvoviridae, incluido el parvovirus B-19; Arenaviridae, incluido el virus Lassa; Orthomyxoviridae, incluidos los virus de la gripe; Poxviridae, incluidos el virus Orf, el virus del molusco contagioso, el virus de la viruela y el virus de la viruela del mono; Togaviridae, incluido el virus de la encefalitis equina venezolana; Coronaviridae, incluidos coronavirus tales como el virus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS); y Picornaviridae, incluidos poliovirus; rinovirus; orbivirus; picodnavirus; el virus de la encefalomiocarditis (EMV); virus de la parainfluenza, adenovirus, virus Coxsackie, virus Echo, virus de la rubeola, virus de la rubiola, virus del papiloma humano, virus del moquillo canino, virus de la hepatitis contagiosa canina, calicivirus felino, virus de la rinotraqueítis felina, virus GET (porcino), virus de la fiebre aftosa, virus de los simios 5, virus de la parainfluenza humana tipo 2, metapneumomovirus humano, enterovirus y cualquier otro virus patógeno conocido actualmente o identificado posteriormente (véase, por ejemplo, Fundamental Virology, Fields et al., Eds., 3.a ed., Lippincott-Raven, Nueva York, 1996).
Los microorganismos patógenos incluyen, pero sin limitación, Rickettsia, Chlamydia, Chlamydophila, Mycobacteria, Clostridia, Corynebacteria, Mycoplasma, Ureaplasma, Legionella, Shigella, Salmonella, especies patógenas de Escherichia coli, Bordatella, Neisseria, Treponema, Bacillus, Haemophilus, Moraxella, Vibrio, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Campylobacter spp., Borrelia spp., Leptospira spp., Erlichia spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Helicobacter spp. y cualquier otro microorganismo patógeno conocido actualmente o identificado posteriormente (véase, por ejemplo, Microbiology, Davis et al, Eds., 4a ed., Lippincott, Nueva York, 1990). Los ejemplos específicos de microorganismos incluyen, pero sin limitación, Helicobacterpylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Enterococcus faecalis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Salmonella typhi, Vibrio cholera, Pasteurella pestis (Yersinia pestis), Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Mycobacterium tuberculosis, Borrelia burgdorferi, Haemophilus ducreyi, Corynebacterium diphtheria, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus influenza, Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Anaplasma phagocytophilum, enterotoxic Escherichia coli y Schistosoma haematobium.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a procedimientos para determinar la especificidad de un reactivo de detección (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, un aptámero, etc.) para un epítopo diana de modificación de histona central y/o de ADN, que comprende utilizar la muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes de la divulgación que comprende un epítopo diana de modificación de histona central y/o de ADN.
En algunas formas de realización de la divulgación, la enfermedad o trastorno incluye, pero sin limitación, obesidad, diabetes, enfermedad cardiaca, autismo, síndrome de X frágil, síndrome ATR-X, síndrome de Angelman, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Beckwith Wiedemann, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Coffin-Lowry, síndrome de inmunodeficiencia-inestabilidad centrométrica-anomalías faciales, a-talasemia, leucemia, síndrome de Cornelia de Langue, síndrome de Kabuki, esclerosis sistémica progresiva e hipertrofia cardiaca.
En algunas formas de realización de la divulgación, la enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de células renales, glioma, gliosarcoma, astrocitoma anaplásico, meduloblastoma, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma cervical, cáncer de colon, cáncer de recto, cordoma, cáncer de garganta, sarcoma de Kaposi, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, carcinoma hepático, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, tumor testicular, tumor de Wilms, tumor de Ewing, carcinoma de vejiga, angiosarcoma, endoteliosarcoma, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, sarcoma de glándulas sebáceas, sarcoma papilar, adenosarcoma papilar, cistoadenosarcoma, carcinoma broncogénico, carcinoma medular, mastocitoma, mesotelioma, sinovioma, melanoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, glioblastoma, oligodendroglioma, neuroma acústico, hemangioblastoma, meningioma, pinealoma, ependimoma, craneofaringioma, carcinoma epitelial, carcinoma embrionario, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células base, fibrosarcoma, mixoma, mixosarcoma, glioma, liposarcoma, infecciones provocadas por Helicobacter pylori , Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Anaplasma phagocytophilum, Chlamydophila, virus de Epstein-Barr, herpes, VIH, Schistosoma haematobium; obesidad, diabetes, enfermedades cardiacas; autismo, síndrome de X frágil, síndrome ATR-X, síndrome de Angelman, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Beckwith Wiedemann, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Coffin-Lowry, síndrome de inmunodeficiencia-inestabilidad centrométrica-anomalías faciales, atalasemia, leucemia, enfermedad de Huntington, esquizofrenia, enfermedad bipolar, envejecimiento, demencia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de Cornelia de Langue, síndrome de Kabuki, síndrome de Sjogren, vitíligo, esclerosis sistémica progresiva, psoriasis, cirrosis biliar primaria, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis e hipertrofia cardiaca.
Otro aspecto de la divulgación proporciona reactivos y kits que incluyen reactivos para llevar a cabo uno de los procedimientos descritos en el presente documento. Los reactivos pueden incluirse en envases o recipientes adecuados. El kit puede incluir uno o más reactivos que contienen nucleosomas recombinantes tal como se describe en el presente documento para la cuantificación de epítopos, por ejemplo en ensayos de detección basados en anticuerpos. El kit también puede incluir al menos un reactivo de afinidad tal como se describe en el presente documento, por ejemplo un anticuerpo o un fragmento o variante del mismo.
En algunas formas de realización de la divulgación, los nucleosomas recombinantes incluyen complejos de ADN-proteína elaborados con histonas, isoformas de histonas, modificaciones postraduccionales de histonas o mutaciones de histonas. En diversas formas de realización de la divulgación, cualquier variante de secuencias de histonas<centrales, que se conocen en la técnica, o modificación postraduccional, incluidas las definidas en las tablas>1<(a>)-1<(f),>se puede instalar en las histonas que comprende el octámero de histonas. En una forma de realización de la divulgación, se proporciona un conjunto de nucleosomas recombinantes.
En otras formas de realización de la divulgación, el kit puede incluir uno o más tampones de lavado (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato) y/u otros tampones en envases o recipientes. El kit también puede incluir reactivos necesarios para la medición de la cantidad de patrón o muestra capturada.
Cuando se suministra un kit, los diferentes componentes pueden envasarse en recipientes separados y mezclarse inmediatamente antes de su uso. Dicho envasado de los componentes por separado puede permitir un almacenamiento a largo plazo sin que se pierdan las funciones de los componentes activos. También se pueden suministrar kits con materiales con instrucciones. Las instrucciones pueden imprimirse en papel u otro sustrato y/o pueden suministrarse como un medio legible electrónicamente.
En algunas formas de realización de la divulgación, el kit puede comprender un panel de patrones que representan algunas o todas las diferentes posibilidades de una clase particular de PTM, por ejemplo, metilación de lisina, acilación de lisina o metilación de arginina. por ejemplo, de una sola histona o de múltiples histonas. El panel puede incluir algunas o todas las modificaciones que se consideren relevantes para una o más enfermedades. En algunas formas de realización de la divulgación, el kit puede comprender un conjunto de patrones que representan la mayor parte de las diferentes posibilidades de mutaciones de histonas, o la totalidad de las mismas, por ejemplo, mutaciones oncogénicas de histonas, por ejemplo, de una sola histona o de múltiples histonas. Los paneles se pueden utilizar para evaluar la especificidad de los reactivos de afinidad, controlar la variabilidad técnica y normalizar experimentos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Síntesis y validación de calidad de nucleosomas de diseño (dNucs) recombinantes modificados
Los dNucs recombinantes son patrones de ELISA ideales, ya que están altamente definidos e imitan la diana del anticuerpo endógeno. Las figuras 1A-1C muestran métricas de calidad representativas para el ensamblaje de dNuc. En este ejemplo, se generó una histona tricitrulinada H3R2/R8/R17 (H3R2cit/R8cit/R17cit) utilizando un enfoque de ligación química nativa basado en procedimientos publicados (Chen et al., Chembiochem 15(14): 2071 (2014)). La histona modificada resultante tenía > 95% de pureza mediante HPLC analítica y se encontraba dentro de un intervalo de un Dalton de la masa esperada mediante espectrometría de masas de alta resolución (figura 1A). Para generar dNucs citrulinados, la subunidad H3 de la histona no modificada se reemplazó por histonas H3R2cit/R8cit/R17cit durante el ensamblaje del octámero. Tal como se esperaba, el dNuc resultante fue inmunorreactivo con un anticuerpo anti-histona citrulinada (H3R2cit/R8cit/R17cit) (figura 1B; arriba) y mostró proporciones estequiométricas iguales de histonas (figura 1B; abajo) y nada de ADN libre detectable (figura 1C). Estos datos muestran que los dNucs recombinantes son muy puros, lo que les convierte en patrones excepcionales para los ELISA que tienen como objetivo cuantificar las PTM de histona.
Ejemplo 2: Los nucleosomas se recuperan en los valores esperados y proporcionan una calibración fiable en plasma humano
Los avances recientes en el análisis de nucleosomas exentos de células (CFN) han hecho que las biopsias líquidas no invasivas dirigidas a la cromatina sean una realidad potencial (Holdenrieder et al., Int. J. Cancer 95(2): 114 (2001); Holdenrieder et al., Ann. NYAcad. Sci. 1137:180 (2008); Rumore et al., J. Clin. Invest. 86(1):69 (1990); Holdenrieder et al., Clin. Chem. 51 (8):1544 (2005)). Sin embargo, los ensayos existentes para la cuantificación de PTM de nucleosoma utilizan generalmente subunidades de histonas modificadas como patrones de ensayo. Estas no logran recapitular las características de unión de la cromatina nativa y, por lo tanto, solo pueden proporcionar mediciones relativas cuando se utilizan como controles en el ensayo. Además, las histonas son inestables en plasma/suero, lo que limita su utilidad en biopsias líquidas, que se están convirtiendo rápidamente en el nuevo foco del ensayo de PTM de nucleosoma y el desarrollo de biomarcadores.
En las figuras 2A-2B, se comparó la recuperación de dNucs citrulinados y subunidades de histona H3 añadidas a plasma humano sano. Para ello, se desarrolló un ELISA de tipo sándwich estándar para medir la citrulinación de histonas: se utilizó un anticuerpo anti-H3R2cit/R8cit/R17cit para capturar los sustratos, seguido de la detección con un anticuerpo conjugado con HRP específico para el extremo C terminal no modificado de H3. En la figura 2A, se añadieron dNucs o histona H3R2cit/R8cit/R17cit en un intervalo de 1000 veces (1 nM a 1 pM) en plasma humano al 5%. Téngase en cuenta que la señal de ELISA se reduce drásticamente cuando se cuantifica en plasma con histona H3 citrulinada frente a dNucs citrulinados. Estos resultados demuestran: 1) recuperación lineal de dNucs citrulinados añadidos al plasma; y 2) mayor sensibilidad de la detección de dNuc citrulinado en plasma en comparación con H3 citrulinada (es decir, intervalo más amplio de detección de analitos).
Los calibrantes fiables son estables en la matriz de ensayo (por ejemplo, plasma o lisados celulares). Para determinar si la pérdida de señal de histonas observada se debe a agregación aberrante o a interacciones con proteínas plasmáticas, se añadieron sustratos de dNuc o histona H3R2cit/R8cit/R17cit en plasma al 100%, después se diluyeron muestras a plasma al 5% y se cuantificó la citrulinación de H3 (figura 2B). Las muestras se normalizaron según los patrones preparados en plasma al 5% (figura 2A). Cabe destacar que los dNuc citrulinados se recuperaron fácilmente en los valores esperados (figura 2B). Sin embargo, la histona H3 citrulinada fue significativamente menor (es decir, no detectable) cuando se añadió al 100% de plasma frente al 5%. Estos datos demuestran que solo los dNucs citrulinados (no la histona H3) proporcionan una calibración fiable en muestras de plasma. Además, los resultados respaldan el desarrollo de dNucs como patrones fiables para ensayos de biopsia líquida de próxima generación, lo que permite una cuantificación precisa de PTM de histona directamente del plasma del paciente.
Ejemplo 3: Optimización de ELISA para PTM de nucleosoma utilizando dNucs modificados combinatoriamente
Dado que los dNucs son estructuralmente análogos y muestran características de unión similares a los nucleosomas endógenos (Shah et al., Mol. Cell 72(1 ):162 (2018)), se razonó que pueden usarse para diseñar ensayos de detección de PTM de histona altamente sensibles y específicos. En este caso, se aplicó el dNuc H3R2cit/R8cit/R17cit al desarrollo de un ELISA para la detección de la citrulinación de nucleosomas. Los dNucs se utilizaron por primera vez para identificar anticuerpos altamente específicos con baja actividad de unión a PTM que no son diana. Después, los dNucs se aplicaron como sustratos altamente purificados para el desarrollo de ELISA, utilizando varios pares de anticuerpos de captura y detección. Los tres ejemplos representados en las figuras 3A-3C utilizaron un anticuerpo de captura específico de PTM (anti-H3R8cit) combinado con tres tipos diferentes de anticuerpos de detección biotinilados: 1) un anticuerpo dirigido a una porción no modificada de la histona H3 (figura 3A); 2) un anticuerpo que reconoce otra PTM concurrente, H3R2cit (figura 3B); y 3) el mismo anticuerpo anti-H3R8cit utilizado para la captura de dNuc (figura 3C). La señal de ELISA se generó utilizando una HRP conjugada con estreptavidina (SA-HRP). Para los tres experimentos mostrados, se incluyó dNuc sin modificar como control negativo, para supervisar la señal de fondo.
Sorprendentemente, el ensayo con mayor sensibilidad y menor fondo utilizó el mismo anticuerpo anti-H3R8cit tanto para la captura como para la detección (figura 3C, abajo). El direccionamiento a diferentes PTM (figura 3B) tuvo una especificidad similar, pero mostró un fondo ligeramente elevado en el control de Nuc no modificado. Estos experimentos demuestran las notables capacidades de los anticuerpos para unirse a múltiples PTM en el mismo nucleosoma (por ejemplo, H3R8Cit/H3R2Cit o H3R8cit/H3R8cit), lo que puede permitir la cuantificación de PTM concurrentes en estudios futuros. Cabe destacar que hay dos copias de cada subunidad de histona (por ejemplo, H2A, H2B, H3 y H4) en un nucleosoma. Por lo tanto, no está claro si la combinación ELISA-H3R8cit/H3R2cit detecta estas PTM de histona en cis o trans. El desarrollo de nucleosomas que portan modificaciones asimétricamente (es decir, en los que solo se modifica una de las subunidades de histonas) se requiere para determinar estos posibles modos de acción.
La detección con un anticuerpo anti-histona H3 (figura 3A, abajo) mostró una sensibilidad sustancialmente reducida en comparación con la detección con anticuerpos PTM. En particular, este tipo de configuración de captura/detección es el enfoque industrial habitual para ELISA de PTM de histona (utilizando sustratos o patrones basados en histona), lo que sugiere que se pueden lograr ganancias significativas en la especificidad y sensibilidad del ensayo aprovechando la estructura del nucleosoma. De hecho, los ensayos existentes que miden las PTM de nucleosoma se desarrollan utilizando extractos de histonas purificadas o plasma humano con niveles endógenos desconocidos del analito diana. Tal como se demuestra en las figuras 3A-3C, la generación de dNucs altamente purificados permite determinar empíricamente el par de anticuerpos más sensible y específico para ELISA, proporcionando ensayos con una exactitud y una precisión incomparables. Además, la recuperación lineal de la señal de dNucs respalda el desarrollo continuo de dNucs como calibradores de ensayos específicos de PTM de nucleosoma.
Ejemplo 4: los dNucs se recuperan y se cuantifican de forma fiable a partir de plasma humano
La utilidad de los dNucs como calibradores en ensayos clínicos depende de su capacidad para recuperarse con precisión de una matriz biológica, tal como plasma. A este respecto, se empleó uno de los ELISA de tipo sándwich optimizados de las figuras 3A-3C, utilizando anticuerpo anti-H3R8cit para la captura del sustrato, seguido de la detección con anticuerpo anti-H3R2cit biotinilado y estreptavidina-HRP. En primer lugar, se generó una curva patrón utilizando dNucs H3R2cit/R8cit/R17cit añadidos a un intervalo de concentración de seis puntos en tampón ELISA<(figura 4A). La curva patrón demuestra una recuperación lineal consistente de dNucs en tampón ELISA, con una R>2<=>0,98. En experimentos paralelos, se añadieron dNucs H3R2cit/R8cit/R17cit (50 ng/ml) a diluciones variables de plasma humano sano y el porcentaje de recuperación se interpoló a partir de la curva patrón (figura 4B). Estos resultados demuestran una recuperación > 95% de la señal de dNuc en plasma diluido 2X-32X, lo que indica una interferencia mínima con la matriz del ensayo, y sugiere que los dNucs proporcionan patrones cuantitativos altamente estables y fiables en una amplia gama de diluciones de plasma.
Ejemplo 5: los dNucs estiman concentraciones de nucleosomas modificados circulantes endógenos en plasma humano
La aplicación completa de dNucs como calibradores de ensayos requiere que se comporten de forma similar a los nucleosomas endógenos (es decir, características de unión y detección). Con este objetivo, se recogió plasma de pacientes con síntomas de artritis reumatoide (AR) moderados y graves (según la puntuación DAS28 (Prevoo et al., Arthritis Rheum. 38(1):44 (1995)). Los pacientes con AR tienen altos niveles de citrulinación de nucleosomas (Pratesi et al., Ann. Rheum. Dis. 73(7):1414 (2014); Dwivedi et al., FASEB J. 28(7):2840 (2014); Sohn et al., Arthritis Rheumatol.
67(11 ):2877 (2015)), lo que los convierte en un candidato ideal para este estudio de prueba de concepto. El plasma de pacientes con AR (junto con controles sanos de la misma edad y el mismo sexo) se diluyó de 2X a 128X y se analizó por ELISA (figuras 5B, 5D). Para este estudio, se utilizó el ELISA para la detección de citrulinación de nucleosomas, utilizando un anticuerpo anti-H3R8cit para la captura de nucleosomas y un anticuerpo anti-H3R2cit biotinilado y estreptavidina-HRP para la detección. Se generaron curvas patrón usando dNucs H3R2cit/R8cit/R17cit añadidos en un intervalo de concentración de seis puntos en tampón ELISA, y se analizaron usando procedimientos de regresión lineal (figura 5A) y no lineal (figura 5C). Lo que se muestra en este caso (figuras 5B, 5D) son los promedios de un paciente de cada categoría (sano, AR moderada y AR grave) de nuestro estudio en curso.
Tal como se muestra en la figura 5B, la dilución de muestras de plasma humano generó una curva lineal similar a la de la curva patrón de la figura 5A. Estos datos confirman que la curva patrón representaba con precisión la curva de dilución de la muestra, validando el uso del calibrador elegido para cuantificar el material endógeno. Los datos de ELISA también se normalizaron utilizando la curva patrón no lineal (figuras 5C, 5D), que proporcionó una recuperación constante en una amplia gama de diluciones de plasma. Además, estos análisis demuestran niveles alterados de citrulinación de nucleosomas entre los controles y la AR de moderada a grave, lo que respalda la implementación de dNucs como patrones para la cuantificación en ensayos clínicamente relevantes.
TABLA 1(a) Modificaciones postraduccionales para las histonas humanas H2A tipo 1/2/3, H2A.X, H2A.Z y H2A.V isoforma 1/2/3/4/5
TABLA 1b Modificaciones ostraduccionales ara las histonas humanas H2A.J H2B ti o 1
TABLA 1c Modificaciones ostraduccionales ara la histona humana H2B ti o 2/3/F-S
TABLA 1d Modificaciones ostraduccionales ara la histona utativa humana H2B ti o 2-D/2-C
TABLA 1e Modificaciones ostraduccionales ara la histona humana H3.1/H3.1t/H3.2/H3.3/H3.3C
TABLA 1(f) Modificaciones postraduccionales para la proteína centromérica A similar a la histona H3 humana y la histona H4 humana

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para cuantificar la abundancia de una modificación de histona o de ADN en un nucleosoma en una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo el procedimiento:
a. aislar una muestra biológica;
b. preparar una biblioteca de mononucleosomas y/o polinucleosomas nativos a partir de la muestra biológica, comprendiendo la biblioteca nucleosomas que comprenden una o más modificaciones de histona central y/o de ADN en un epítopo diana;
c. preparar una muestra de mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes que comprende un epítopo diana de modificación de histona central y/o de ADN;
d. proporcionar la muestra de nucleosoma recombinante en diversas concentraciones para crear un patrón de referencia, sometiéndose a ensayo mononucleosomas y/o polinucleosomas recombinantes para generar una curva patrón;
e. añadir un reactivo de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a muestras de referencia de nucleosomas recombinantes, dirigiéndose el reactivo de afinidad a una histona modificada o a un ADN modificado;
f. realizar un ensayo basado en reactivos de afinidad para medir la cantidad de modificación de nucleosoma en la biblioteca de nucleosomas nativos y el patrón de referencia de nucleosomas recombinantes; y
g. cuantificar la abundancia de modificación de histona o de modificación de ADN en el epítopo diana mediante comparación de la abundancia relativa en la biblioteca de nucleosomas nativos con el patrón de referencia.
2<. El procedimiento de la reivindicación>1<, que comprende cuantificar la abundancia de dos o más modificaciones de>histona o de ADN en un nucleosoma individual en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento añadir dos o más reactivos de afinidad a la biblioteca de nucleosomas nativos y a referencias de nucleosomas recombinantes.
3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la muestra biológica se trata con una enzima para digerir la cromatina en mononucleosomas y/o polinucleosomas; opcionalmente en el que la enzima es nucleasa microcócica.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica comprende células y la cromatina se aísla a partir de las células.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra biológica es un fluido biológico.
6<. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra biológica comprende células>mononucleares de sangre periférica.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra biológica comprende nucleosomas circulantes; opcionalmente en el que los nucleosomas circulantes son de sangre o de células de una enfermedad o trastorno asociado a modificaciones epigenéticas.
8<. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el agente de afinidad es un anticuerpo>o un fragmento del mismo dirigido hacia el epítopo.
<9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a>8<, en el que se cuantifican al menos una o más>modificaciones de nucleosoma en el mismo nucleosoma.
<10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a>8<, en el que se cuantifican al menos una o más>modificaciones de nucleosoma en diferentes nucleosomas.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cuantificación de al menos una o más modificaciones de nucleosoma se determina mediante un ensayo de detección basado en anticuerpos, opcionalmente en el que el procedimiento de detección basado en anticuerpos se selecciona del grupo que consiste en ELISA, AlphaLISA, AlphaSCREEN, Luminex e inmunotransferencia.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el ensayo de detección basado en anticuerpos utiliza dos anticuerpos diferentes para la captura y la detección del sustrato; opcionalmente, en el que los anticuerpos de captura y detección se unen específicamente a una PTM de histona y otra estructura de nucleosoma, tal como ADN o histona no modificada, o en el que los anticuerpos de captura y detección se unen específicamente a dos PTM de histona diferentes.
13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el ensayo de detección basado en anticuerpos utiliza el mismo anticuerpo tanto para la captura como para la detección del sustrato.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el nucleosoma comprende al menos una modificación de aminoácido postraduccional o modificación de ADN seleccionada del grupo que consiste en N<acetilación de serina y alanina; fosforilación de serina, treonina y tirosina; N-crotonilación, N-acilación de lisina; N>6<-metilación, N>6<,N>6<-dimetilación, N>6<,N>6<,N>6<-trimetilación de lisina; omega-N-metilación, dimetilación simétrica,>dimetilación asimétrica de arginina; citrulinación de arginina; ubiquitinilación de lisina; sumoilación de lisina; O-metilación de serina y treonina, ADP-ribosilación de arginina, ácido aspártico y ácido glutámico; mutaciones oncogénicas K a M (por ejemplo, H3K4M, H3K9M, H3K27M, H3G34R, H3G34<v>, H3G34W o H3K36M); 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina, 5-carboxilcitosina, 3-metilcitosina, 5,6-dihidrouracilo, 7-metilguanosina, xantosina e inosina.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que se usan nucleosomas recombinantes<modificados como controles para confirmar que se detectan modificaciones combinatorias en un nucleosoma individual>o en nucleosomas adyacentes.
ES19760658T 2018-03-01 2019-03-01 Cuantificación de modificaciones de nucleosoma utilizando nucleosomas recombinantes definidos químicamente Active ES2960550T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862637066P 2018-03-01 2018-03-01
PCT/US2019/020283 WO2019169263A1 (en) 2018-03-01 2019-03-01 Quantification of nucleosome modifications using chemically-defined recombinant nucleosomes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2960550T3 true ES2960550T3 (es) 2024-03-05

Family

ID=67805943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19760658T Active ES2960550T3 (es) 2018-03-01 2019-03-01 Cuantificación de modificaciones de nucleosoma utilizando nucleosomas recombinantes definidos químicamente

Country Status (10)

Country Link
US (1) US10787697B2 (es)
EP (2) EP4215621A1 (es)
JP (1) JP7376493B2 (es)
CN (1) CN111918971B (es)
AU (1) AU2019228625A1 (es)
CA (1) CA3091807A1 (es)
DK (1) DK3759249T3 (es)
ES (1) ES2960550T3 (es)
FI (1) FI3759249T3 (es)
WO (1) WO2019169263A1 (es)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022006655A (es) * 2019-12-02 2022-09-07 Belgian Volition Srl Uso de nucleosomas libres de celulas como biomarcadores.
JP2023544112A (ja) * 2020-09-21 2023-10-20 ベルジアン ボリション エスアールエル 血液中の遊離ヌクレオソームのインラインモニタリングのための装置
CN112359092B (zh) * 2020-10-22 2023-09-19 中国农业科学院农业基因组研究所 一种基因组短片段文库的构建方法
EP4237850A4 (en) * 2020-11-02 2024-09-18 Epicypher Inc IMPROVED ASSAYS FOR QUANTIFYING CHROMATIN TARGETS USING ANTIBODY-TARGETED ENZYMATIC DIGESTION
GB202108185D0 (en) * 2021-06-08 2021-07-21 Belgian Volition Sprl Standardisation of nucleosome assays using biologically derived calibrants
WO2024042208A1 (en) * 2022-08-25 2024-02-29 Belgian Volition Srl Method for the detection of dementia
WO2024081782A1 (en) * 2022-10-12 2024-04-18 Epicypher, Inc. High efficiency antibodies for chromatin targets
WO2024133225A1 (en) * 2022-12-19 2024-06-27 Belgian Volition Srl Calibration

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1008748A (en) 1910-06-15 1911-11-14 Christian Keene Snavely Shade-roller.
GB0319376D0 (en) * 2003-08-18 2003-09-17 Chroma Therapeutics Ltd Histone modification detection
WO2011016869A1 (en) * 2009-08-06 2011-02-10 Kamran Tahamtanzadeh Methods and compositions for drug discovery
EP2621942A4 (en) * 2010-09-29 2015-01-21 Gen Hospital Corp MEANS FOR PROVIDING CONTROLS AND STANDARDS FOR IMMUNE PRECIPITATION ASSAYS
GB201115098D0 (en) * 2011-09-01 2011-10-19 Belgian Volition Sa Method for detecting nucleosomes containing histone variants
GB201115099D0 (en) * 2011-09-01 2011-10-19 Belgian Volition Sa Method for detecting nucleosomes
GB201115095D0 (en) * 2011-09-01 2011-10-19 Singapore Volition Pte Ltd Method for detecting nucleosomes containing nucleotides
GB201303575D0 (en) * 2013-02-28 2013-04-10 Singapore Volition Pte Ltd Method for detecting histone modifications in nucleosomes
GB201400522D0 (en) * 2014-01-13 2014-02-26 Proteros Biostructure Gmbh Nucleosome substrate assays
WO2015117145A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 The University Of Chicago Compositions and methods for quantitative assesment of dna-protein complex density
GB201511512D0 (en) * 2015-07-01 2015-08-12 Singapore Volition Pte Ltd Use of cell-free nucleosomes as biomarkers
US11479805B2 (en) * 2015-08-21 2022-10-25 The General Hospital Corporation Combinatorial single molecule analysis of chromatin
GB201518665D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Singapore Volition Pte Ltd Method for enrichment of cell free nucleosomes
EP3371601A1 (en) * 2015-11-05 2018-09-12 Epizyme Inc Flow cytometry for monitoring histone h3 methylation status

Also Published As

Publication number Publication date
CN111918971B (zh) 2024-09-03
EP3759249A1 (en) 2021-01-06
JP7376493B2 (ja) 2023-11-08
EP3759249A4 (en) 2021-11-24
CA3091807A1 (en) 2019-09-06
US20200071745A1 (en) 2020-03-05
AU2019228625A1 (en) 2020-09-03
DK3759249T3 (da) 2023-10-30
US10787697B2 (en) 2020-09-29
JP2021515888A (ja) 2021-06-24
EP3759249B1 (en) 2023-08-30
CN111918971A (zh) 2020-11-10
WO2019169263A1 (en) 2019-09-06
US20210010058A1 (en) 2021-01-14
FI3759249T3 (fi) 2023-10-11
EP4215621A1 (en) 2023-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2960550T3 (es) Cuantificación de modificaciones de nucleosoma utilizando nucleosomas recombinantes definidos químicamente
US11965890B2 (en) Compositions and methods for quantitative assessment of DNA-protein complex density
US20230407406A1 (en) Methods for Quantification of Nucleosome Modifications and Mutations at Genomic Loci and Clinical Applications Thereof
US20220042074A1 (en) Dna-barcoded nucleosomes for chromatin mapping assays
JPWO2019169263A5 (es)
US20230417742A1 (en) Improved assays to detect nucleosome modifications using antibody-targeted enzyme digestion
US12104199B2 (en) Quantification of nucleosome modifications using chemically-defined recombinant nucleosomes
JP6140277B2 (ja) 細胞のエピジェネティックな情報を得る方法、細胞の特性を判定する方法、薬剤感受性を判断するまたは薬剤若しくは免疫療法剤の種類を選択する方法、疾患の診断方法、並びに自己複製ベクター、アッセイキットおよび分析装置
Yamamoto et al. Phosphorylated proteome analysis of a novel germline ABL1 mutation causing an autosomal dominant syndrome with ventricular septal defect
US20140171413A1 (en) Compositions and methods for diagnosis of schizophrenia
JP2022521708A (ja) ロングリードシーケンシングを使用するクロマチンマッピングアッセイおよびキット
Sharma et al. A genetically encoded fluorescent reporter for polyamines
ES2940157A1 (es) Metodos y usos diagnosticos/pronosticos de la enfermedad de wilson basados en la determinacion de los niveles de mir-192 y/o mir-885
US20140288055A1 (en) Compositions and methods for diagnosis of schizophrenia