JP5783909B2 - 悪性腫瘍の診断方法 - Google Patents

Description

本発明は、悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無の判定方法及び診断キットに関する。

近年、世界で悪性腫瘍と診断される人は、１０００万人／年以上になり、悪性腫瘍が死因となる人も７００万人／年を越え、いずれも増加傾向にある。悪性腫瘍患者の生存に係わる重要な要因としては、正確な診断、適切な治療及びその効果判定、再発の予知・防止等が考えられる。これらにおける有用な情報を得る為、組織病理診断、遺伝子検査、画像診断、血液を利用した臨床検査等が、単独は又は組み合わされて利用されている。中でも、血液中の腫瘍マーカーの測定は、簡便性が良く、比較的安価な検査である。

悪性腫瘍は、上皮性悪性腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と非上皮性悪性腫瘍（ｓａｒｃｏｍａ）に大きく分けられる。非上皮性悪性腫瘍の一種である造血器腫瘍は、新ＷＨＯ分類では、大きくは白血病と悪性リンパ腫に分けられている。白血病は、進行の早い急性白血病と、比較的進行の遅い慢性白血病に分けられ、急性白血病は、さらに急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）や急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に分けられている。ＡＬＬは、さらに白血病細胞の起源によりＴ細胞性とＢ細胞性とに分けられる。
一方、ＡＭＬは、骨髄中に２０％以上の芽球を認める場合に分類され、２０％未満の場合は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に分類されている。
急性白血病（ＡＬ）の場合は、病状の進行が早い為、すぐに治療を開始することが重要である。ＡＬと疑われた場合や再発の可能性が疑われた場合には、骨髄穿刺検査を行い、骨髄細胞を分析して診断されているが、この検査は、患者に対する侵襲性が非常に高く、頻繁に実施するのは無理である。
また、ＡＬとは異なり、分化・成熟能力を保持している慢性白血病（ＣＬ）については、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）に、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が悪性リンパ腫に分類されている。ＣＬの場合は、症状に乏しく、病状の進行は緩やかであるが、長期的にはＡＬ化（急性転化）を起こす場合があることから、治療中又は終了後も定期的な経過観察が必要となっている。

一方、悪性リンパ腫は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）と非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に大別されている。
日本においては、悪性リンパ腫の約９０％がＮＨＬに分類され、ゆっくりと進行する低悪性度の濾胞性リンパ腫や、より進行の早い中悪性度のびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫の症例が多い。ＮＨＬの治療は、ステージ分類や悪性度によって異なるが、特に低悪性度のリンパ種は、進行が遅く治療が効きにくいという特徴があり、悪性度の進行や白血病への移行も見られるため、病状の経過に注意が必要となっている。
また、悪性リンパ腫の病巣となるリンパ節は、全身にあることから、白血病と比較して、具体的な病巣部位を特定しにくい。特に、再発していた場合に、具体的な病巣部位を発見しにくいのが実情である。その為、病気が体のどこに、どれくらい広がっているかを知ることが大変重要であり、ＣＴ、ＭＲＩやＰＥＴなどの高額な画像診断や、侵襲性の大きい骨髄穿刺検査が必要となっている。
さらに、病気の広がりや勢い、治療効果を反映する検査として、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、β２−マイクログロブリン、フェリチン、可溶性インターロイキン‐２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）などの血液検査が行われている。しかしながら、これらの血液検査項目は、肝機能障害、腎機能障害、細菌感染、関節リウマチやＳＬＥなどの膠原病などでも高値になることが知られている。それ故、これらの血液検査項目を造血器腫瘍診断に応用するに当たっては、前記のような高値化要因に注意しなければならなかった。

肝臓癌、膵臓癌、大腸癌などに代表的される上皮性悪性腫瘍に係る腫瘍マーカーとしては、α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９などが臨床検査において利用されているが、単独では臓器特異性や悪性腫瘍検出感度が不足している場合が多く、複数の腫瘍マーカーを組み合わせて測定しているケースもしばしば見られる。従って、新しい腫瘍マーカーとなりうる測定項目の開発が要望されている。

ＬＲ１１（ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｗｉｔｈ １１ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ）は、ＬＤＬ受容体ファミリーに特徴的な構造を有する新規なＬＤＬ受容体類似蛋白質として同定されたものである（特許文献１、非特許文献１）。このＬＲ１１は、平滑筋細胞の遊走及び増殖によって引き起こされる血管内膜肥厚部位に、特異的にその発現が亢進していることが報告されている（非特許文献２）。さらに、哺乳動物の血液中に可溶性ＬＲ１１が存在していること、及び動脈硬化性疾患患者中の可溶性ＬＲ１１濃度が健常者と比較して有意に高値化していること（特許文献２）や、頚動脈内膜中膜肥厚度（ＩＭＴ）を規定する独立した説明因子となること（非特許文献３）などが知られている。さらに、血液や髄液中の可溶性ＬＲ１１を簡単で正確に測定する方法（特許文献３、非特許文献４）も知られている。

特開平９−１６３９８８号公報 ＷＯ２００８／１５５８９１ ＷＯ２００９／１１６２６８

Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１，２４７６１−２４７６８ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９，２６８７−２６９５ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８，２７３３−２７４６ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００９；５５，１８０１−１８０８

本発明は、悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無を判定する方法及び診断用試薬又はキットを提供することにある。

そこで本発明者は、新たな悪性腫瘍マーカーを見出すべく種々検討してきたところ、全く意外にも、悪性腫瘍患者の体液検体中には、健常者と比較してはるかに高い濃度で可溶性ＬＲ１１が存在していることを見い出した。そして、その可溶性ＬＲ１１濃度が治療により正常化することや、再発時には再び上昇している等の知見を得、悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無を判定するための腫瘍マーカーとして有用であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。

すなわち、本発明は、１）被験体由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度及び／又は量を測定する工程、並びに２）該測定値を健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値と比較する工程を含むことを特徴とする悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無を判定する方法を提供するものである。
また、本発明は被験体由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度及び／又は量を測定できる試薬を含有し、該測定値を健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値と比較することにより悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無を判定するための試薬又はキットを提供するものである。
また、本発明は、可溶性ＬＲ１１濃度及び／又は量を測定できる試薬を含むことを特徴とする、悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無の診断用キットを提供するものである。

本発明の方法によれば、悪性腫瘍の存在を疑われた患者由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定し、健常者のＬＲ１１濃度と比較することにより、悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択又は効果判定を評価する上で有用な情報を提供することが可能となる。さらに、悪性腫瘍を治療した後でも、継続的な可溶性ＬＲ１１の測定により、再発の危険性又は再発の有無を予知することが可能となる。

急性骨髄性白血病患者の寛解治療前後の血清中の可溶性ＬＲ１１の濃度変化をモニターした結果を示す。 可溶性ＬＲ１１タンパク質濃度が低い（＜２０ｎｇ／ｍＬ）急性骨髄性白血病患者と高い（≧２０ｎｇ／ｍＬ）急性骨髄性白血病患者の寛解率を示す図である。 可溶性ＬＲ１１タンパク質濃度が低い（＜２０ｎｇ／ｍＬ）急性骨髄性白血病患者と高い（≧２０ｎｇ／ｍＬ）急性骨髄性白血病患者の全生存率を示す図である。

以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、可溶性ＬＲ１１を悪性腫瘍のマーカーとして使用することを特徴とするものである。

本発明で対象とされる悪性腫瘍は、上皮性悪性腫瘍、及び非上皮性悪性腫瘍の一種である造血器腫瘍に分類される。さらに詳細には、上皮性悪性腫瘍は、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、結腸癌、大腸癌、胆嚢癌などを含み、造血器腫瘍は、急性白血病や慢性白血病、非ホジキンリンパ腫に代表される悪性リンパ腫を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の判定方法は、（１）被験体由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度及び／又は量を測定する工程と、（２）該測定値を健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値と比較する工程を含む。

本発明における被験体としては、悪性腫瘍を発症しうる被験体であれば特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコなどの哺乳動物が挙げられる。
また、被験体由来試料としては、血液（血清、血漿）、髄液、リンパ液、尿、組織、細胞等が挙げられるが、試料の調製の容易さから、血液、特に血清が好ましい。
また、被験体由来試料は、悪性腫瘍が疑われる動物（特にヒト）由来の試料、特に他の腫瘍マーカーにより悪性腫瘍が疑われるヒト由来の試料が好ましい。

被験体由来試料中の可溶性ＬＲ１１の濃度又は量の測定は、可溶性ＬＲ１１に親和性のある物質を用いて行われる。該親和性物質は、可溶性ＬＲ１１に結合能を有する物質であれば特に制限されず、可溶性ＬＲ１１に特異的に結合する蛋白質、例えば、アポリポプロテインＥ（ａｐｏ Ｅ）、ａｐｏ ＥリッチＶＬＤＬ（β−ＶＬＤＬ）、ＲＡＰ（Ｔｈｅ ３９−４０ｋＤａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＰＡＩ−１（ｔｙｐｅ−１ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体等の蛋白質、及び抗可溶性ＬＲ１１抗体等が挙げられる。中でも、ＲＡＰ及び抗可溶性ＬＲ１１抗体がより好ましく、抗可溶性ＬＲ１１抗体が特に好ましい。

抗可溶性ＬＲ１１抗体としては、血清から精製した可溶性ＬＲ１１と反応する抗体であれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも良いが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。当該抗体の作製は周知の方法にて作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体の作製には、免疫する動物としてマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどが用いられる。抗血清は、抗原を動物の皮下、皮内、腹腔などに一回又は複数回投与した後、血清から得ることができる。タンパク質、ペプチドを抗原として用いる時は、免疫賦活効果を有する補液との混合物の免疫がより好ましい。
また、モノクローナル抗体の作製には、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、長宗香明、寺田弘共著、「単クローン抗体」廣川書店（１９９０年）や、Ｊａｍｅ Ｗ．Ｇｏｌｄｉｎｇ，‘‘Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ’’，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６年に従い作製することができる。また、ＤＮＡ免疫法によりモノクローナル抗体を作製することもでき、Ｎａｔｕｒｅ １９９２ Ｍａｒ１２；３５６ １５２−１５４やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｒ １；２４９ １４７−１５４を参考に作製することができる。
抗体作製に用いられる抗原としては、ＬＲ１１タンパク質、又はその一部断片（ペプチド）、或いはＬＲ１１タンパクをコードするｃＤＮＡを組み込んだベクターを用いることができる。ＬＲ１１の高次構造を認識するモノクローナル抗体を得るために、ヒトＬＲ１１全長遺伝子が入った構築物である全長ＬＲ１１ベクターが最適な免疫用抗原遺伝子となるが、そのほか、ＬＲ１１配列の一部領域が挿入された構築物も、免疫用抗原遺伝子として使用できる。ＤＮＡ免疫法は、上記遺伝子構築物を単独又は混合して、免疫動物に対して様々な遺伝子導入法（例えば筋肉注射、エレクトロポレーション、遺伝子銃など）のいずれかを用いて、動物（マウス、又はラット等）の皮下に注入し、細胞内に取り込ませることにより実施できる。

当該モノクローナル抗体は、常法に従い作成したハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、該ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により製造できる。

抗体は、必要に応じてそれをより精製して使用することができる。抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィ法、プロテインＡカラムなどによるアフィニティ精製法などがある。

被験体由来試料中の可溶性ＬＲ１１の測定方法は、特に限定されないが、抗可溶性ＬＲ１１抗体を用いた免疫学的方法、ＲＡＰ等の親和性を利用した方法、並びにそれらを組み合わせた方法により測定することが望ましい。免疫学的方法としては、例えば免疫染色（ウエスタンブロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡやＬＴＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどに加えて、抗体とＲＡＰ等のＬＲ１１に親和性を有する物質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡも利用できる。また、予め、ＲＡＰ等の親和性物質を担持させた不溶性担体に、試料中の可溶性ＬＲ１１を吸着させた後、適当な緩衝液を用いて洗浄、並びに該可溶性ＬＲ１１を溶出させるような前処理を組み合わせれば、試料中に含まれる夾雑蛋白質が除去でき、可溶性ＬＲ１１を精度よく測定できることから、好ましい。
さらに、本発明者らが構築した、界面活性剤による前処理を用いたＥＬＩＳＡ法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００９；５５，１８０１−１８０８）は、非常に簡便でかつ精度よく測定できることから、特に好ましい。

尚、可溶性ＬＲ１１の測定において、定量値、もしくは半定量値を得るためには、基準となるＬＲ１１量／濃度と比較することが好ましい。この場合、基準となるＬＲ１１量／濃度としては、既知濃度の血清可溶性ＬＲ１１、平滑筋細胞や神経芽細胞株の培養細胞又は培養上清より回収したＬＲ１１、リコンビナントＬＲ１１、あるいは抗体作製において免疫原として使用した合成ペプチド等の使用が好ましい。

次に、得られた測定値を健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値と比較する。

健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値は、前記の被験体由来試料の場合と同様の方法で予め測定しておくのが好ましい。比較には、健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値を統計学的に処理して求めた基準値を使用するのが好ましい。この基準値は、対象疾患毎に統計学的に求めることが好ましい。

悪性腫瘍が存在している場合、重篤化している場合、再発の危険性がある場合には、被験体由来試料の可溶性ＬＲ１１濃度又は量は、後述の実施例に記載の如く、健常者群の前記基準値よりも有意に高いことが判明した。従って、被験体由来試料の可溶性ＬＲ１１濃度又は量と、この基準値との対比により、悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無を判定することができる。
悪性腫瘍の重篤度とは、癌がどの程度進行しているかの指標になるものである。本発明において、「悪性腫瘍の存在、重篤度を判定する」とは、例えば、造血器腫瘍の場合は、ＷＨＯ分類で、白血病や悪性リンパ腫が詳細に分類され、悪性度も評価されていることから、これらの分類に区分することを含む。また、非ホジキンリンパ腫の場合は、ＷＨＯ分類で、細胞増殖の速度により「高悪性度」、「中悪性度」、及び「低悪性度」に分類されおり、これらの分類に区分することを含む。尚、それぞれの代表的なものに、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂリンパ腫、Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫が挙げられている。
また、上皮性悪性腫瘍に関しては、腫瘍の大きさと進展度、所属リンパ節への転移状況、及び遠隔転移の有無によるＴＮＭ分類という国際的な病期分類に関する指標が使用され、さらにこの分類をもとに、癌の進行度と広がりの程度を一度に表わすことが出来るステージ分類が使われており、これらの分類に区分することを含む。
例えば、寛解期導入療法により、寛解期に入った場合は、所期の治療目的は達成したことになる。ここで寛解とは、例えば造血器腫瘍の場合、血液や骨髄中から白血病細胞や悪性リンパ腫が検出されなくなった状態をいう。
治療方法の選択又は効果判定は、発症した腫瘍の大きさの変化を見ることで評価することができる。又、再発の危険性については、治療により可溶性ＬＲ１１の濃度が正常域に下がらない場合に再発の危険性が高いと判断すること、さらに再発の有無については、間欠期や治療による寛解の後に、可溶性ＬＲ１１の濃度が上昇し始めた場合に、腫瘍が再び発生している恐れが高い、と評価することができる。さらに、本発明方法によれば、予後の予測が可能であり、例えば２〜３年生存率を予測することが可能である。

また、前記の悪性腫瘍の存在等を判定するにあたっては、可溶性ＬＲ１１の測定値だけでなく、他の公知の腫瘍マーカーと組み合せて判断するのが好ましい。公知の腫瘍マーカーとしては、α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＩＶＫＡＩＩ、ＳＣＣ、ＳＬＸ、エラスターゼＩ、サイトケラチン１９フラグメント、ＤＵＰＡＮ２等が挙げられる。

本発明のキットは、可溶性ＬＲ１１を測定できる試薬を含むことを特徴とする。可溶性ＬＲ１１を測定できる試薬としては、可溶性ＬＲ１１に親和性を有する物質、例えば抗可溶性ＬＲ１１抗体やＲＡＰ等の前記蛋白質を含む試薬が好ましく挙げられるが、それらに限定されるものではなく、該キットは、可溶性ＬＲ１１の検出に必要な他の構成要素、例えば、反応緩衝液や反応容器を含むことができる。さらに本発明のキットには、前記の健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値のデータ、該データとの比較のためのプロトコールを含むことができる。

以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

参考例１ ＤＮＡ免疫法による抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体の作製
（１）発現ベクターの構築
ＬＲ１１の全長遺伝子（Ｑ９２６７３）を構成する一部分のアミノ配列（１０００−１５５０）（配列番号１）の遺伝子断片を、ＦＬＡＧタグ付の哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組込んだ。発現ベクターはヒトアルカリフォスファターゼ由来ＧＰＩアンカー配列からなるペプチドをコードするＤＮＡを含む。これをＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターとした。
（２）ＣＨＯ発現物の確認
構築したＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターにより、目的とする遺伝子産物が、設計どおりに細胞膜表面に発現するかどうかについて免疫前にＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）を用いた一過性導入発現実験により確認した。すなわち、前日に６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのｗｅｌｌあたり１×１０６個の細胞をｐｌａｔｉｎｇした。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一晩培養した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ当日、ポリスチレンラウンドチューブ内でプラスミド希釈液（３μｇ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ＋５００μＬ Ｄ−ＭＥＭ）とｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００希釈液（９μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００＋５００μＬのＤ−ＭＥＭ）を良く混ぜ、室温で２０分間インキュベート後、前日にｐｌａｔｉｎｇしてあった培養上清を捨て、細胞を剥がさないように静かに細胞に添加した。５％ＣＯ２，３７℃で５時間インキュベート後、上清を取り除き、５％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を添加後２４時間５％ＣＯ２，３７℃で培養した。翌日、細胞はＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でｐｌａｔｅから剥がし、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析に使用された。ＦＣＭ解析は以下のように実施した。すなわち、１次抗体反応は、細胞に３％ＦＣＳ入りリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）中でＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ）を４℃、３０分間反応させた。２次抗体は、細胞を３％ＦＣＳ入りＰＢＳで洗浄後、３％ＦＣＳ入りＰＢＳ中でＰＥ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ）を４℃、３０分間反応させた。細胞を３％ＦＣＳ入りＰＢＳで洗浄後、適量の３％ＦＣＳ入りＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターに供した。この結果、構築したＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターにより目的の遺伝子産物が細胞表面に発現していることが確認された。

（３）ＤＮＡ免疫法による抗体の作製
ＤＮＡ免疫法は、前記（１）のＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターを単独又は混合して金粒子に感作したものを、免疫動物（マウス又はラット）の皮下に対して遺伝子銃で行い細胞内に取り込ませた。具体的には、Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）を用い、該キットの使用説明書に従って２００μｇの前記ＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターを２５ｍｇの金粒子あたり投与した。免疫は２週間おきに４回実施した。４回目の免疫時に、少量の抗血清をサンプリングし、３％ＦＣＳ入りＰＢＳで１，０００倍希釈した抗血清を１次抗体としてＦＣＭ解析を行った。この際、前記（２）の目的とする遺伝子産物を一過性発現させたＣＨＯ細胞（以下、強制発現細胞ともいう）を用いてＦＣＭ解析を行い、抗体価が上昇していることを確認した。また、モノクローナル抗体の作製は一般的な細胞融合法を用いて実施した。すなわち、最終ブースト（ｆｉｎａｌ ｂｏｏｓｔ）を２回行った後、免疫した動物を解剖し定法に従い抗体産生細胞を単離してマウス骨髄腫細胞と細胞融合させて抗体産生ハイブリドーマ株を調製した。これらハイブリドーマ株の培養後、培養上清の一部をとり、強制発現細胞を用いた酵素免疫測定法及びＦＣＭにより、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択した。尚、強制発現細胞を用いた酵素免疫測定法は、次のようにして行った。強制発現細胞を９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清を第一抗体として反応させ、第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加した。ここで、第二抗体とは、第一抗体のマウスイムノグロブリン又はラットイムノグロブリンを認識できる抗体であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗体である。反応後、第二抗体を標識した酵素に応じた蛍光基質を添加し、蛍光測定プレートリーダーで解析した。
ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択した。
次に、腹水からのモノクローナル抗体の大量調製を次のようにして実施した。プリスタン０．５ｍＬで前処理したヌードマウスに０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中の１×１０６〜３×１０６クローン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。およそ２週間後に、腹水を集め、モノクローナル抗体をプロテインＡで親和精製した。
こうしてＤＮＡ免疫法により得られた代表的な抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体２種（マウス由来；Ｍ３、ラット由来；Ｒ１４）は、ヒト及びウサギ血清由来の可溶性ＬＲ１１と反応することが確認された。

参考例２ ウサギ血清からの可溶性ＬＲ１１の精製
ヒトＲＡＰ遺伝子を組み込んだｐＧＥＸ２Ｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）ベクターにより形質転換した大腸菌ＤＨ５αを培養して、遠心分離により菌体を回収した。３Ｌの培養液から回収した菌体を、０．２％リゾチーム及び０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）に懸濁して、超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液の遠心上清中のＲＡＰ／ＧＳＴ融合タンパク質を、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）１０ｍＬに通して吸着させた後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２、以降、特に記載のない場合は同ｐＨ）で洗浄しＲＡＰ−セファロース樹脂を調製した。このＲＡＰ−セファロース樹脂１０ｍＬとウサギ血清１Ｌを混和し、４℃で穏やかに撹拌しながら一晩反応させた後、ＲＡＰ−セファロース樹脂を回収してＰＢＳで洗浄した。次にクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にてウサギ可溶性ＬＲ１１溶出して濃縮後、ＰＢＳで透析した。さらに、この液を、抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ｍ３）を化学結合させたセファロース樹脂と混ぜ、４℃で穏やかに撹拌しながら一晩反応させた後、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）にてウサギ可溶性ＬＲ１１溶出した。この溶出液を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｄｅｘ２００；ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）により、ＰＢＳで分離精製した。可溶性ＬＲ１１の溶出フラクションを集め濃縮したものを、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１とした。この蛋白質含量は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により分離後、銀染色により可溶性ＬＲ１１の蛋白質を検出した。同時に、含量既知のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の染色バンドの発色強度に基づき、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１の濃度を算出し、次の参考例３に記載のＥＬＩＳＡ法におけるキャリブレーターとして用いた。

参考例３ ＥＬＩＳＡ法による血清中の可溶性ＬＲ１１の検出
マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ｍ３）をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈して１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で２時間固相化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）を１ウエルあたり２００μＬ添加し、室温で１時間ブロッキングした。７％ＭＥＧＡ−９（同仁化学社製）とＨＢＲ（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を３：１に混合した検体処理液で、ヒト血清を１１倍に希釈した。別に、参考例２で精製したウサギ由来可溶性ＬＲ１１も前記検体処理液で段階希釈し、キャリブレーターとした。これら希釈検体を、１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で一晩反応させた後、ビオチン標識した抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ｒ１４）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈し０．４μｇ／ｍＬとして１ウエルあたり１００μＬ添加し室温で４時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとして１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、次いでＴＭＢ基質液を１ウエルあたり１００μＬ加え室温で３０分間発色させ、１．５Ｎ硫酸を１ウエルあたり１００μＬ加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４５０ｎｍ）で測定した。キャリブレーターによる検量線より、検体中の可溶性ＬＲ１１濃度を算出し、希釈倍率を掛けて、ヒト血清中の可溶性ＬＲ１１濃度とした。

実施例１ 造血器腫瘍疾患に係るマーカーとしての可溶性ＬＲ１１
初診で造血器腫瘍と診断された８１名の個人から採取された血清について、可溶性ＬＲ１１濃度を求め、別に脂質異常のない健常者８７名から採取された血清中の可溶性ＬＲ１１濃度と比較した。
造血器腫瘍と診断された８１名の疾患分類の内訳は、急性リンパ性白血病６名、急性骨髄性白血病１１名、慢性リンパ性白血病５名、慢性骨髄性白血病７名、ホジキンリンパ腫５名、非ホジキンリンパ腫２６名、骨髄異形性症候群４名、多発性骨髄腫８名、及びＰＯＥＭＳ症候群９名であった。血清中の可溶性ＬＲ１１濃度は、参考例２に示したＥＬＩＳＡ法によって測定した。それぞれの疾患分類毎に、健常者の濃度レベルを考慮し暫定的なカットオフ値を２０ｎｇ／ｍＬと設定した場合の症例数並びにその平均値を表１に示した。表１より、健常者と比較して、特に白血病や非ホジキンリンパ腫で、カットオフ値を大きく超える症例が高頻度に認められたことが判る。

実施例２ 治療による効果判定への応用
実施例１中で、急性骨髄性白血病と診断され、尚且つ可溶性ＬＲ１１濃度が高値であった５症例において、寛解治療前後の血清中の可溶性ＬＲ１１の濃度変化をモニターした結果を図１に示す。治療により、可溶性ＬＲ１１の濃度レベルが正常域（２０ｎｇ／ｍＬ以下）まで低下した。このことは、腫瘍の存在又はその重篤度が、造血器腫瘍患者における血液中の可溶性ＬＲ１１の上昇とよく相関するということを示唆するものである。

実施例３ 再発の危険性の予測
造血器腫瘍と診断され、治療を受けて寛解したものの、再発した患者９名の中で、再発時に可溶性ＬＲ１１濃度レベルが正常域（２０ｎｇ／ｍＬ）を越えていたケースは、急性リンパ性白血病１名、急性骨髄性白血病２名（５名中）、慢性リンパ性白血病１名、非ホジキンリンパ腫１名（２名中）の合計５名と５０％を超えていた。このことより、造血器腫瘍患者の可溶性ＬＲ１１濃度レベルをモニターすることで、造血器腫瘍疾患の再発の危険性を予測／再発している可能性を評価できる可能性があることが判る。

実施例４ 上皮性悪性腫瘍でのバイオマーカーとしての可溶性ＬＲ１１
各種上皮性悪性腫瘍について、それぞれ無作為に５名の患者から採取された血清中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定した。実施例１と同様に、暫定的なカットオフ値を２０ｎｇ／ｍＬと設定した場合、各種上皮性悪性腫瘍でカットオフ値を超える症例が高頻度に認められた（表２）。

実施例５ 寛解率の予測
急性骨髄性白血病と診断され、治療を受けた患者４１名の中で、血清可溶性ＬＲ１１濃度レベルが正常域（２０ｎｇ／ｍＬ未満）群では、治療により寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ， ＣＲ）に至った症例が２１名中２０名と高い寛解率（９５％）を示したのに対して、可溶性ＬＲ１１濃度レベルが２０ｎｇ／ｍＬ以上であった群では、治療により寛解に至った症例は２０名中１３名と有意に寛解率（６５％）が低かった（図２）。このことより、造血器腫瘍患者の可溶性ＬＲ１１濃度レベルを測定することで、造血器腫瘍疾患の治療により寛解に至る可能性が予測できる。

実施例６ 生存率との関係
血清中の可溶性ＬＲ１１濃度が低い（＜２０ｎｇ／ｍＬ）急性骨髄性白血病患者（２１名）と高い（≧２０ｎｇ／ｍＬ）急性骨髄性白血病患者（２２名）の全生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ， ＯＳ）を図３に示す。この結果から、可溶性ＬＲ１１濃度が、特に短期間（２−３年）の重要な予後因子であることが分かった。

Claims (10)

1. 白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、大腸癌及び胆嚢癌からなる群より選択される悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無を判定するために可溶性ＬＲ１１を測定する方法であって、
   １）被験体由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度及び／又は量を測定する工程、並びに２）該測定値を健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値と比較する工程を含むことを特徴とする方法。
2. 被験体由来試料が、血液、血清、血漿、髄液及び尿のいずれかである請求項１に記載の方法。
3. 測定が、可溶性ＬＲ１１に特異的に結合する蛋白質を用いて行う請求項１又は２記載の方法。
4. 蛋白質が、抗可溶性ＬＲ１１抗体、ａｐｏ Ｅ、β−ＶＬＤＬ、ＲＡＰ、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体から選ばれるものである請求項３に記載の方法。
5. 被験体由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度及び／又は量を測定できる試薬を含有し、該測定値を健常者群の可溶性ＬＲ１１測定値と比較することにより悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無を判定するためのキットであって、
   前記悪性腫瘍が、白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、大腸癌及び胆嚢癌からなる群より選択されるものであるキット。
6. 被験体由来試料が、血液、血清、血漿、髄液及び尿のいずれかである請求項５記載のキット。
7. 測定が、可溶性ＬＲ１１に特異的に結合する蛋白質を用いて行う請求項５又は６記載のキット。
8. 蛋白質が、抗可溶性ＬＲ１１抗体、ａｐｏ Ｅ、β−ＶＬＤＬ、ＲＡＰ、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体から選ばれるものである請求項７記載のキット。
9. 可溶性ＬＲ１１濃度及び／又は量を測定できる試薬を含むことを特徴とする、悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無の診断用キットであって、
   前記悪性腫瘍が、白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、大腸癌及び胆嚢癌からなる群より選択されるものであるキット。
10. 可溶性ＬＲ１１濃度及び／又は量を測定できる試薬が、抗可溶性ＬＲ１１抗体、ａｐｏ Ｅ、β−ＶＬＤＬ、ＲＡＰ、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体から選ばれるものを含む試薬である請求項９記載のキット。

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