BR112012014954B1

BR112012014954B1 - Metodo para diagnosticar tumor maligno

Info

Publication number: BR112012014954B1
Application number: BR112012014954-7A
Authority: BR
Inventors: Hiroyuki Ebinuma; Kohei Takubo; Masanao Matsuo; Isamu Fukamachi; Hideaki Bujo; Chiaki Nakaseko; Yasushi Saito
Original assignee: Sekisui Medical Co., Ltd
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2020-11-24
Also published as: RU2595854C2; EP2515114A1; WO2011074594A1; KR101832199B1; JP5783909B2; BR112012014954A2; EP2515114A4; CN102656456A; CA2783308A1; AU2010331291B2; CA2783308C; US9097714B2; KR20120123248A; AU2010331291A1; CN102656456B; US20130029363A1; JPWO2011074594A1; MX2012007009A; RU2012129913A; EP2515114B1

Abstract

MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR TUMOR MALIGNO Fornecer um método e um kit diagnóstico para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, um método para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico, ou um método para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou determinar a presença ou ausência do retorno. O método para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, método para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico, ou método para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno é caracterizado incluindo 1) uma etapa de medir a concentração e/ou quantidade de LR11 solúvel em uma amostra originando-se de um indivíduo e 2) uma etapa de comparar o valor medido acima com um valor de medida de LR11 solúvel obtido de um grupo de indivíduo saudável.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um método para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, um método para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico, ou um método para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno, e a um kit diagnóstico para os mesmos propósitos.

Antecedente da Invenção

[002] Nos recentes anos, em base anual, mais de 10 milhões de pessoas foram diagnosticadas como tendo um tumor maligno, e mais de 7 milhões de pessoas morrem de tumor maligno, e os números tendem a aumentar. O diagnóstico correto, tratamento apropriado, avaliação do efeito do tratamento, e predição e prevenção de retorno de tumor maligno são pensados ser fatores importantes para pacientes com tumores malignos sobreviverem. Atualmente, para obter informação valiosa sobre isto, diagnóstico histopatológico, teste genético, imageamento diagnóstico, testes clínicos com base no sangue, etc. são realizados isoladamente ou em combinação. Em particular, a determinação do nível marcador de tumor em uma amostra de sangue é um método de teste conveniente e relativamente barato.

[003] Tumores malignos são geralmente classificados em carcinoma e sarcoma.De acordo com a nova classificação de WHO, um tumor hematopoiético, que é um tipo de sarcoma, é geralmente dividido em leucemia e linfoma maligno.Leucemia é dividida em leucemia aguda (crescimento rápido) e leucemia crônica (crescimento lento), e leucemia aguda é dividida em leucemia linfocítica aguda (ALL) e leucemia mieloide aguda (AML). ALL é também dividida, com base no tipo celular, em ALL de célula T e ALL de célula B.

[004] No caso onde o nível de explosão na medula óssea é 20% ou mais alta, a condição é diagnosticada como AML, e no caso onde o nível de explosão namedula óssea é mais baixo que 20%, a condição é diagnosticada como síndrome mielodisplásica (MDS).

[005] No caso de leucemia aguda (AL), o começo imediato do tratamento para este é essencial, visto mostrando o progresso rápido. Quando AL ou retorno do mesmo é suspeito, células de medula óssea são analisadas por aspiração da medula óssea para diagnóstico definido. Porém, este teste não pode ser usado frequentemente, visto que é muito invasivo aos pacientes.

[006] Na leucemia crônica (CL), que difere-se de AL nessa diferenciação e habilidade de maturação é mantida, leucemia mieloide crônica (CML) é classificada como um distúrbio miloproliferativo (MPD), e leucemia linfocítica crônica (CLL) é classificada como um linfoma maligno. CL não tem sintomas específicos e progride lentamente. Entretanto, visto que CL pode, às vezes, tornar-se AL (conversão aguda) à longo prazo, a observação periódica é requerida durante e depois do tratamento.

[007] Enquanto isso, linfoma maligno é geralmente classificado no linfoma Hodgkin (HL) e linfoma não Hodgkin (NHL).

[008] No Japão, cerca de 90% dos casos de linfoma maligno são NHL, e linfoma folicular é frequentemente observado, que é um linfoma de crescimento lento e de baixo grau e difunde linfoma de célula B grande, que é um linfoma de crescimento rápido e médio grau. O tratamento de NHL varia, dependendo da fase classificada e grau de malignidade. Entre casos de linfoma, particularmente, linfoma de baixo grau progride lentamente e é menos suscetível a tratamento, e aumenta na malignidade e a transição para leucemia pode ocorrer. Portanto, a observação do acompanhamento cuidadoso de sintomas de linfoma de baixo grau é requerida.

[009] Linfoma maligno ocorre em linfonodos como focos. Considerando que linfonodos estão presentes ao longo do corpo, os locais focais de linfoma maligno são difíceis de encontrar, quando comparado com o caso de leucemia. Particularmente no caso de retorno do mesmo, locais focais específicos são difíceis de descobrir na realidade. Portanto, é muito importante determinar o local focal e escala da condição patológica no corpo, requerendo imageamento diagnóstico caro tal como CT, MRI, ou PET e aspiração da medula óssea altamente invasiva.

[0010] Para avaliar a expansão e força da doença e o efeito do trata-mento para este, exame de sangue para lactato desidrogenase (LDH), Proteína C- reativa (CRP), (2-microglobulina, ferritina, receptor de interleucina-2 solúvel (slL-2R), etc. é realizado. Entretanto, valores de teste para estes itens de análise sanguínea são conhecidos aumentar através do mal funcionamento do fígado, mal funcionamento do rim, infecção bacteriana, e doenças de colágeno tais como artrite reuma- toide e SLE. Portanto, estes fatores de aumento de valor de teste devem ser cuida-dosamente levados em consideração quando o tumor hematopoiético é diagnosticado com base nos itens de análise sanguínea acima descritos.

[0011] No exame clínico, marcadores de tumor tais como a- fetoproteína, CEA, e CA19-9 são empregados para detectar carcinomas tais como câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de cólon, etc. Quando quaisquer destes marcadores são empregados isoladamente, em muitos casos, a sensibilidade do tumor maligno e especificidade de órgão são insuficientes. Desse modo, uma pluralidade de marcadores de tumor é frequentemente analisada em combinação, e portanto, há demanda quanto ao desenvolvimento de um item de ensaio que pode servir como um novo marcador de tumor.

[0012] LR11 (receptor de LDL relativo com 11 repetições de ligação de ligante) foi uma nova proteína semelhante ao receptor de LDL identificada ramo tendo uma estrutura característica à família do receptor de LDL (Documento de Patente 1 e Documento de Não patente 1). Expressão de LR11 é relatada ser promovida particularmente em sítios espessos da íntima vascular gerados por migração e proliferação de células do músculo liso (Documento de Não patente 2). Além disso, os seguintes também são conhecidos: LR11 solúvel está presente no sangue de mamíferos; o nível de LR11 solúvel de pacientes com doença arteriosclerose é significativamente mais alto que aquele de indivíduos saudáveis (Documento de Patente 2); e nível de LR11 solúvel é um fator independente que define as densidades médias da intima (IMT) (Documento de Não Patente 3). Além disso, é também conhecido um método para facilmente e corretamente determinar o nível de LR11 solúvel no sangue e fluido cérebro-espinhal (Documento de Patente 3, Documento de Não Patente 4).

Documentos da Arte Anterior Documentos de Patente Documento de Patente 1: JP09-163988 A Documento de Patente 2: W02008155891 Documento de Patente 3: W02009116268 Documentos de Não Patente Documento de Não Patente 1: J. Biol. Chem. 1996; 271,24761-24768 Documento de Não Patente 2: Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol. 1999; 19, 2687-2695 Documento de Não Patente 3: J. Clin. Invest. 2008; 118, 2733-2746 Documento de Não Patente 4: Clin. Chem. 2009; 55, 1801-1808 Sumário da Invenção

[0013] Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, um método para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico, ou um método para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno. Outro objetivo da presente invenção é fornecer um reagente diagnóstico para este. Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um kit diagnóstico para os mesmos propósitos.

Meios para Resolver os Problemas

[0014] Os presentes inventores realizaram estudos extensos com a fi-nalidade de encontrar um novo marcador de tumor maligno. Bastante surpreendentemente, os inventores constataram que um LR11 solúvel está presente em uma concentração consideravelmente mais alta em amostras de fluido corporal retiradas de pacientes com tumor maligno do que aquelas retiradas de indivíduos saudáveis. Os inventores também constataram que a concentração de LR11 solúvel abaixa novamente a um nível normal por tratamento do tumor maligno e aumenta no retorno do tumor maligno, e essa concentração de LR11 solúvel pode ser empregada como um marcador de tumor útil para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico, ou para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno. A presente invenção foi realizada com base nestes resultados.

[0015] Adequadamente, a presente invenção fornece um método para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, um método para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico, ou um método para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno, em que o método inclui 1) uma etapa de medir a concentração e/ou quantidade de LR11 solúvel em uma amostra originando-se de um indivíduo e 2) uma etapa de comparar o valor obtido acima com um valor de LR11 solúvel em uma amostra obtida de um grupo de indivíduo saudável.

[0016] A presente invenção também fornece uma Composição reagente ou um kit para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico, ou para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno, cuja Composição reagente ou kit contém um reagente quepode determinar a concentração e/ou quantidade de LR11 solúvel em uma amostra originando-se de um indivíduo e cuja Composição reagente ou kit é empregado comparando-se o determinado valor com um valor de LR11 solúvel em uma amostra obtida de um grupo de indivíduo saudável.

[0017] A presente invenção também fornece um kit diagnóstico para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico, ou para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno, em que o kit diagnóstico contém um reagente que pode determinar a concentração e/ou quantidade de LR11 solúvel.

Efeito Vantajoso da Invenção

[0018] De acordo com o método da presente invenção, a concentração de LR11 solúvel em uma amostra originando-se de um paciente suspeito da presença de um tumor maligno é medida, e a concentração medida acima é comparada com a concentração de LR11 medida em um indivíduo saudável, para desse modo obter informação útil para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo ou para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico. Além disso, até mesmo depois que o tumor maligno estiver curado, o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno pode ser calculado por monitoramento contínuo do nível de LR11 solúvel.

Breve Descrição dos Desenhos

[0019] [Fig. 1] Um gráfico mostrando o resultado monitorado das mu-danças em níveis de LR11 solúvel de soro em pacientes ∞m leucemia mieloide aguda de antes do tratamento para remissão.

[0020] [Fig. 2] Um gráfico mostrando a porcentagem de pacientes com leucemia mieloide aguda tendo um nível baixo de proteína de LR11 solúvel (<20 ng/mL) em pacientes com leucemia mieloide aguda e remissão tendo um nível deproteína de LR11 solúvel alto (>20 ng/mL) na remissão.

[0021] [Fig. 3] Um gráfico mostrando as taxas de sobrevivência global de pacientes com leucemia mieloide aguda tendo um nível baixo de proteína de LR11 solúvel (< 20 ng/mL) e pacientes com leucemia mieloide aguda tendo um nível alto de proteína de LR11 solúvel (>20 ng/mL).

Descrição Detalhada da Invenção

[0022] A presente invenção será a seguir descrita em detalhes.

[0023] Um aspecto característico da presente invenção reside neste LR11 solúvel que é empregado ∞mo um marcador de tumor maligno.

[0024] O tumor maligno alvo da presente invenção inclui um carcinoma e um tumor hematopoiético que são um tipo de sarcoma. Exemplos do carcinoma incluem câncer de estômago, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer esofágico, câncer de mama, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer colorretal, e câncer da vesícula biliar. Exemplos de tumor hematopoiético incluem leucemia aguda, leucemia crônica, e linfoma maligno tal como linfoma não Hodgkin. Porém, o tumor maligno alvo não é limitado aos exemplos anteriores.

[0025] O método de determinação da presente invenção inclui (1) uma etapa de medir a concentração e/ou quantidade de LR11 solúvel em uma amostra originando-se de um indivíduo e (2) uma etapa de comparar o valor obtido acima com um valor de LR11 solúvel obtido em um grupo de indivíduo saudável.

[0026] Nenhuma limitação particular é imposta na seleção de indivíduo da presente invenção, contanto que o indivíduo possa sofrer um tumor maligno. Exemplos do indivíduo incluem o humano e outros mamíferos, tais como camundongo, rato, coelho, porco, cachorro e gato.

[0027] Exemplos da amostra originando-se do indivíduo incluem san-gue (soro, plasma), fluido cérebro-espinhal, fluido de linfa, urina, tecidos, e células.Destes, sangue (particularmente soro) é preferido devido à facilidade na preparação da amostra.

[0028] Da mesma forma, a amostra originando-se do indivíduo é preferivelmente uma amostra derivada de um animal (em particular, um indivíduo humano) que é suspeito de ter um tumor maligno, mais particularmente de um indivíduo humano que é suspeito de ter um tumor maligno como resultado de exame por uso de um marcador de tumor convencional.

[0029] A concentração ou quantidade de LR11 solúvel na amostra derivada de um indivíduo é determinada por uso de uma substância tendo uma afinidade a LR11 solúvel. Nenhuma limitação particular é imposta na seleção de substância tendo uma afinidade a LR11 solúvel, contanto que a substância possa ligar-se a LR11 solúvel. Exemplos da substância incluem proteínas que especificamente ligam- se a LR11 solúvel como apolipoproteína E (apo E), VLDL apo rico em E (β-VLDL), RAP (A proteína associada ao receptor de 39-40kDa), uPA (ativador de plasminogê- nio tipo urocinase), PAI-1 (inibidor de ativador de plasminogênio tipo 1), e complexo de uPA-PAI-1 (proteínas) e anticorpos LR11 antissolúveis. Entre eles, anticorpos RAP e LR11 antissolúveis são preferidos, com anticorpos LR11 antissolúveis que são preferidos particularmente.

[0030] O anticorpo LR11 antissolúvel pode ser um anticorpo monoclo-nal ou um anticorpo policlonal, contanto que o anticorpo reaja com LR11 solúvel purificado de soro.Entretanto, um anticorpo monoclonal é empregado preferivelmente. O anticorpo pode ser produzido por um método extensamente conhecido. Em um procedimento de produção de um anticorpo policlonal, animais tais como camundongos, ratos, hamsters, coelhos, cabras, ovelhas, e galinhas são usados para ser imunizados pelo imunógeno. O antissoro pode ser preparado administrando-se sub- cutaneamente, intradermicamente ou intraperitonealmente um antígeno a um animal uma vez ou várias vezes e recuperando-se o antissoro de soro. Quando a proteínaou peptídeo é usado como um antígeno, a imunização é realizada preferivelmente por uso de uma mistura de um imunógeno e um adjuvante exibindo efeito de imunoestimulação.

[0031] O anticorpo monoclonal pode ser produzido por um método co-nhecido para produzir um anticorpo monoclonal; por exemplo, "Monoclonal Antibody" (Hideaki NAGAMUNE e Hiroshi TERADA, Hirokawa-shoten, 1990) ou "Monoclonal Antibody" (Jame W. Golding, 3a edição, Academic Press, 1996).Da mesma forma, o anticorpo monoclonal pode ser produzida por técnica de imunização de DNA (veja, por exemplo, Nature 1992, 12 de Março; 356 152-154 ou J. Immunol.Methods, 1 de Março; 249 147-154).

[0032] O antígeno empregado na produção do anticorpo pode ser pro-teína de LR11, um fragmento da mesma (peptídeo), ou um vetor incluindo cDNA codificando a proteína de LR11. Para produzir um anticorpo monoclonal que reconhece a estrutura de alta ordem de LR11, um vetor de LR11 de tamanho natural, uma construção incluindo um gene de LR11 humano de tamanho natural, é o gene de antígeno mais adequado para uso em imunização. Alternativamente, uma construção incluindo uma parte de sequência de LR11 pode ser usada ramo gene de antígeno para imunização. Em um modo de imunização de DNA, um ou mais das construções de gene acima mencionadas são subcutaneamente injetadas separadamente ou em combinação aos animais (camundongo, rato, etc.) por quaisquer de vários métodos de transfecção (por exemplo, injeção intramuscular, eletroporação, e imunização mediada por pistola gênica) para incorporação da(s) construção(ões) de gene em células.

[0033] O anticorpo monoclonal pode ser produzido por um método in-cluindo o cultivo de hibridomas produzidos por um método convencional e isolar um anticorpo alvo do sobrenadante de cultura; ou um método incluindo administrar um hibridoma a um mamífero compatível com o hibridoma e coletar ascite do mamífero.

[0034] Se preciso for, o anticorpo pode ser também purificado antes do uso. Exemplos do método de purificação/isolamento de anticorpo incluem métodos conhecidos como precipitação por saturação (por exemplo, precipitação de sulfato de amónio), filtração de gel (por exemplo, por uso de Sephadex), cromatografia de troca iônica, e purificação por afinidade (por exemplo, por uso de coluna de proteína A).

[0035] Nenhuma limitação particular é imposta no método para determinar LR11 solúvel contido em uma amostra originando-se de um indivíduo. Entretanto, preferivelmente, um método imunológico empregando um anticorpo LR11 an- tissolúvel, um método empregando afinidade de RAP ou similar, ou um método de combinação do mesmo é preferivelmente empregado. Exemplos do método imunológico da presente invenção incluem imunomanchamento (western blotting), ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), imunonefelometria (TIA ou LTIA), imuno- ensaio de enzima, imunoensaio quimioluminescente, e imunoensaio fluorescente. Alternativamente, ELISA sanduíche empregando um anticorpo e uma substância tendo uma afinidade a LR11 (por exemplo, RAP) também pode ser empregado para o método imunológico. Além disso, um tratamento preliminar para eluir um LR11 solúvel, que compreende uma etapa de absorver um LR11 solúvel contido em uma amostra em um veículo insolúvel que transporta uma substância tendo uma afinidade a LR11 (por exemplo, RAP), e em seguida lavando e eluindo o LR11 solúvel absorvido por uso de tampão apropriado, é empregado preferivelmente, desde que um tal processo de pré-tratamento permita a remoção de impurezas de proteína contidas na amostra e o ensaio preciso de LR11 solúvel.

[0036] Além disso, um método de ELISA modificado empregando o pré- tratamento de surfactante de uma amostra, previamente estabelecido pelos inventores, (Clin. Chem. 2009; 55, 1801-1808) é preferido particularmente, desde que o método atinja a alta precisão por um procedimento muito simples.

[0037] Para obter valores quantitativos ou semiquantitativos, a comparação com quantidade/concentração de LR11 de referência de LR11 é preferivelmente realizada. Neste caso, o LR11 de referência empregado na invenção é preferivelmente, por exemplo, LR11 solúvel de soro tendo uma concentração conhecida, LR11 recuperado de células cultivadas ou sobrenadante de cultura de células do músculo liso ou linhagem celular de neuroblasto, LR11 recombinante, ou um peptí- deo sintético usado como um imunógeno na preparação do anticorpo.

[0038] Subsequentemente, os valores de medida desse modo obtidos são comparados com os valores de medida de LR11 solúvel de um grupo de indivíduo saudável.

[0039] Preferivelmente, o valor de medição de LR11 solúvel de um grupo de indivíduo saudável é determinado com antecedência pelo mesmo método como empregado na determinação do valor de medição de LR11 solúvel da amostra acima mencionada originando-se de um indivíduo. O valor de referência empregado na etapa de comparação é obtido preferivelmente processando-se estatisticamente os valores de medida de LR11 solúvel do grupo de indivíduo saudável. Preferivelmente, o valor de referência é estatisticamente determinado com respeito a cada distúrbio alvo.

[0040] Os inventores constataram que quando um indivíduo tem um tumor maligno, um tumor maligno com severidade mais alta, ou um risco de retorno do mesmo, como descrito nos Exemplos aqui a seguir, a concentração ou quantidade de LR11 solúvel em uma amostra originando-se do indivíduo é significativamente mais alta que aquela de um grupo de indivíduo saudável. Portanto, a comparação da concentração de LR11 solúvel em uma amostra originando-se do indivíduo ou a quantidade de LR11 solúvel contida na amostra com o valor de referência permite a determinação da presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, seleção de um método terapêutico para este, avaliação do efeito do método terapêutico,estimativa do risco de retorno do tumor maligno, ou determinação da presença ou ausência do retorno.

[0041] A severidade de um tumor maligno é um índice para o grau de progresso de câncer. Na presente invenção, no caso de um tumor hematopoiético, a expressão "determinação da presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo" pode referir-se à classificação do tumor de acordo com a classificação WHO, visto que leucemia e linfoma maligno são classificados nesta em detalhes e a severidade dos mesmos é avaliada por WHO. O linfoma Não Hodgkin é classificado por WHO em "malignidade de alto grau", "malignidade de grau intermediário", e "malignidade de baixo grau" em termos da taxa de proliferação da célula. Neste caso, a expressão anterior pode referir-se a este procedimento de classificação. Exemplos típicos do linfoma Não Hodgkin incluem linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, e linfoma linfoblástico T.

[0042] Carcinoma é classificado de acordo com a classificação de TNM, que é uma classificação da fase internacionalmente aceita e com base nas dimensões de tumor e grau de progresso, estado de metástase para linfonodos regionais, e a presença de metástase distante. É também empregada uma classificação de estágio adicional com base na classificação de TNM, que pode fornecer tanto o grau de progresso de câncer quanto o grau de disseminação de câncer. No caso de carcinoma, a expressão anterior pode referir-se a estes procedimentos de classificação.

[0043] No caso onde uma remissão é alcançada por terapia de indução de remissão, o propósito terapêutico pretendido foi considerado ser atingido.Aqui, o termo "remissão" refere-se, no caso de um tumor hematopoiético, um estado em que nenhuma célula de leucemia ou linfoma maligno é detectada no sangue ou medula óssea.

[0044] A seleção de um método terapêutico e avaliação do efeito do método terapêutico podem ser avaliadas monitorando-se as mudanças dimensionaisdo tumor no início. Quando a concentração de LR11 solúvel não é diminuída a um nível normal depois do tratamento, o risco de retorno pode ser calculado ser alto, e quando a concentração de LR11 solúvel sobe durante um estágio de intervalo ou depois da remissão alcançada por um certo tratamento, a possibilidade de retorno de um tumor pode ser avaliada como sendo alto. Além disso, de acordo com o método da presente invenção, o prognóstico pode ser predito.Por exemplo, a taxa de sobrevivência de 2 a 3 anos pode ser predita.

[0045] Além disso, é preferível administrar a determinação da presença de tumor maligno, etc., não só com valores de medida de LR11 solúvel, mas também em combinação com um marcador de tumor conhecido. Exemplos de tal marcador de tumor conhecido incluem a-fetoproteína, CEA, CA19-9, CA125, PIVKA-II, SCC, SLX, elastase I, fragmento de citoqueratina-19, e DUPAN2.

[0046] O kit da presente invenção é caracterizado contendo-se um reagente que pode determinar o LR11 solúvel. Exemplos de um tal reagente incluem preferivelmente, mas não limitados a um reagente que inclui uma substância que tem afinidade a um LR11 solúvel, por exemplo, anticorpo LR11 antissolúvel ou as proteínas acima descritas tal como RAP. O kit pode incluir outros elementos do que tais reagentes, por exemplo, tampão de reação e um reator requerido para detecção de LR11 solúvel. O kit da presente invenção pode também incluir dados de valores de medida de LR11 solúvel nos indivíduos saudáveis e um protocolo para realizar uma comparação das medidas de LR11 solúvel com os dados.

Exemplos

[0047] A presente invenção será descrita a seguir por meio de exem-plos que não devem ser interpretados como limitando a invenção a estes.

Exemplo Referencial 1: Produção de anticorpo monoclonal de LR11 antissolúvel por imunização de DNA (1)Construção de vetor de expressão

[0048] Um fragmento de gene, que é uma sequência de aminoácido (1000 a 1550) (SEQ ID NO: 1) e que forma uma parte do gene de tamanho natural LR11 (Q92673), foi incorporado em um vetor de expressão de mamífero tendo um rótulo FLAG (pcDNA3.1, produto de Invitrogen). O vetor de expressão inclui um fragmento de DNA codificando um peptídeo formado de uma sequência âncora de GPI derivada de fosfatase alcalina humana. O vetor foi empregado como vetor LR11 [1000-1550].

(2)Confirmação do produto de expressão de CHO

[0049] Se ou não um produto gênico alvo é expresso em membranas de célula como esperado por meio do vetor LR11 desse modo construído [1000- 1550] foi confirmado antes da imunização por uma experiência de transfecção transitória empregando células de CHO (células de ovário de hamster chinês). Especificamente, no dia antes da imunização, as células de CHO foram semeadas em uma placa de 6 cavidades em 1x106 células/cavidade e cultivadas durante a noite a 37oC sob 5% de CO2. No dia da transfecção, uma diluição de plasmídeo (3 pg de DNA de plasmídeo + 500 pL de D-MEM) e diluição de lipofectamina 2000 (9 pL de lipofecta- mina 2000 + 500 pL de D-MEM) foram suficientemente misturadas juntamente em um tubo redondo de poliestireno, e a incubação foi realizada em temperatura ambiente durante 20 minutos. Depois que o sobrenadante de cultura das células de CHO previamente semeadas foi removido, o produto de incubação foi adicionado suavemente à placa de forma que a remoção das células de CHO seja prevenida. Outra incubação foi realizada durante cinco horas a 37oC sob 5% de CO2, e o sobrenadante foi removido. Um meio de D-MEM contendo 5% de FCS foi adicionado à placa, e as células de CHO foram cultivadas durante 24 horas a 37oC sob 5% de CO2. No dia seguinte, as células foram removidas da placa por uso de tampão de dissociação (produto de Invitrogen) e foram submetidas à citometria de fluxo (FCM). A análise de FCM foi realizada como segue. Especificamente, na reação de anticorpo primário, as células foram reagidas com anticorpo M2 ANTI-FLAG (marca registrada) (produto de SIGMA) em 3% de tampão de fosfato contendo FCS (pH: 7,2 (PBS)) a 4 oC durante 30 minutos. Em reação de anticorpo secundário, as células foram lavadas com 3% de PBS contendo FCS, e em seguida reagidas com anticorpo de IgG anticamundongo rotulado por PE (produto de Beckman) em 3% de PBS contendo FCS a 4oC durante 30 minutos. Depois disso, as células foram lavadas com 3% de PBS contendo FCS, e foram suspensas em PBS contendo uma quantidade apropriada de 3% de FCS. A suspensão foi submetida à citometria de fluxo.A análise revelou que o produto gênico alvo foi expresso em superfícies de membrana por meio do vetor de LR11 construído [1000-1550].

(3)Produção de anticorpo por imunização de DNA

[0050] Na imunização de DNA, o vetor de LR11 [1000-1550] produzido no (1) acima ou partículas de ouro sensibilizadas com o vetor de LR11 [1000-1550] foram subcutaneamente injetados em animais de imunização (camundongos ou ratos) por meio de uma pistola gênica, para desse modo incorporar o vetor em células. Mais especificamente, o vetor de LR11 [1000-1550] (200 pg/25 mg de partículas de ouro) foi administrado a cada animal por meio de Helios (marca registrada) Gene Gun Optimization Kit (produto de Bio-Rad, USA) de acordo com uma instrução manual ligada a este. A imunização foi realizada quatro vezes com intervalos de duas semanas. Na quarta imunização, uma quantidade pequena de antissoro foi experimentada. O antissoro foi diluído 1.000 vezes com 3% de PBS contendo FCS, e a diluição de antissoro foi empregada como um anticorpo primário em análise de FCM. A análise de FCM também foi realizada por uso de células de CHO em que um produto gênico alvo foi transitoriamente expresso (produzido em (2)) (em seguida também pode ser referido como células de expressão forçadas), por meio do qual o título de anticorpo foi confirmado ser elevado. O anticorpo monoclonal foi produzido por uma técnica de fusão celular convencional. Especificamente, um animal que tinhasofrido reforço final duas vezes foi dissecado, e células produtoras de anticorpo foram isoladas por um método de rotina.As células desse modo isoladas foram fundidas com células de mieloma de camundongo, para desse modo preparar as cepas de hibridoma produtoras de anticorpo.Estes hibridomas foram cultivados, e uma porção de sobrenadante de cultura foi experimentada. Através de imunoensaio de enzima e FCM empregando as células de expressão forçadas, uma amostra que reagiu com a proteína de antígeno e não reagiu com proteína de não antígeno foi selecionada. Imunoensaio de enzima empregando as células de expressão forçadas foi realizado como segue. Primeiramente, as células de expressão forçadas foram imobilizadas em uma placa de 96 cavidades e reagiram com o sobrenadante de cultura de hibridoma como um anticorpo primário. Depois da conclusão da reação de anticorpo primário, a placa foi lavada, e um anti-corpo secundário foi adicionado a esta. O anticorpo secundário é um anticorpo que pode reconhecer imunoglobulina de camundongo ou imunoglobulina de rato do anticorpo primário e que foi rotulado com peroxidase de rábano-picante (HRP). Depois da conclusão da reação, um substrato fluorescente que corresponde à enzima com que o anticorpo secundário foi rotulado, foi adicionado, e a placa foi analisada por meio de uma leitora de placa fluorescente.

[0051] Em seguida, a clonagem foi realizada por uma técnica de dilui-ção limitante, por meio da qual um hibridoma exibindo constantemente o título de anticorpo alto foi selecionado ∞mo uma cepa de hibridoma produtora de anticorpo monoclonal.

[0052] Subsequentemente, o anticorpo monoclonal foi produzido por massa de ascite como segue. Para camundongos nus que tinham sido tratados com antecedência ∞m pristano (0,5 ml_), células de hibridoma clonadas (1 x 106 a 3 x 106 em solução salina tamponada por fosfato (pH: 7,4) (0,5 ml_) foram intraperitone- almente injetadas. Cerca de duas semanas depois, ascite foi coletado dos camundongos nus, e o anticorpo monoclonal foi purificado por afinidade com a proteína A.

[0053] Os dois anticorpos monoclonais de LR11 antissolúveis típicos (M3 derivado de camundongo, R14 derivado de rato) produzidos por imunização de DNA foram constatados reagir com LR11 solúvel derivado de soro humano e soro de coelho.

[0054] Exemplo Referencial 2: Purificação de LR11 solúvel recuperado de soro de coelho

[0055] E. coli que foi transformada com um vetor carregando um gene RAP humano, pGEX2T (produto de GE Healthcare Bioscience) (isto é, DH5α de E. coli) foi cultivada, e o produto cultivado foi centrifugado, para desse modo recuperar as células do mesmo. As células recuperadas da cultura (3 L) foram suspensas em PBS (pH: 7,2) contendo 0,2% de lisozima e 0,5% de TritonX-100, e as células foram rompidas por ultrassonicação. A proteína de fusão RAP/GST contida no sobrenadan- te de centrifugação do líquido rompido por célula foi produzido para atravessar Glutathione Sepharose 4 FF (produto de GE Healthcare Bioscience) (10 ml_), para desse modo ser absorvido no gel, e o gel foi lavado com PBS (pH: 7,2 (em seguida o mesmo pH aplica-se a menos que de outra maneira especificado)), para desse modo preparar a resina RAP-Sepharose. A resina RAP-Sepharose (10 ml_) foi misturada com soro de coelho (1 L), e a mistura foi permitida reagir durante a noite a 4oC sob condições de agitação moderadas. Depois da conclusão da reação, a resina RAP- Sepharose foi acondicionada à coluna e lavada com PBS. Portanto, LR11 solúvel de coelho foi eluído da resina por uso de tampão de citrato (pH: 5,0), e o eluente foi concentrado e o eluído concentrado foi dialisado em comparação à PBS. O líquido desse modo obtido foi misturado com uma resina de Sepharose quimicamente ligada com um anticorpo monoclonal LR11 antissolúvel (M3), e a mistura foi permitida reagir durante a noite a 4oC sob condições ativas moderadas. Em seguida, o LR11 solúvel de coelho foi eluído da resina por uso de tampão de citrato (pH: 3,0). O eluído foi concentrado e separado/purificado por cromatografia de filtração de gel (Supedex200; produto de GE Healthcare Bioscience) por uso de PBS. As frações eluídas de LR11 solúveis foram combinadas e concentradas, para desse modo fornecer o LR11 solúvel de coelho purificado. O teor de proteína de LR11 solúvel foi determinado se- parando-se a proteína de LR11 por eletroforese de poliacrilamida de SDS e detec- tando-se a proteína de LR11 solúvel por manchamento de Ag. Da mesma forma, o nível de LR11 solúvel de coelho purificado foi calculado com base na intensidade de coloração de uma faixa de albumina de soro bovino (BSA) de concentração conhecida. O nível de LR11 foi empregado como um calibrador para uso em ELISA realizado no Exemplo Referencial 3 aqui a seguir.

Exemplo Referencial 3: Detecção de LR11 solúvel em soro por ELISA

[0056] O anticorpo monoclonal de LR11 antissolúvel (M3) foi diluído com PBS em 10 pg/mL, e o líquido de anticorpo foi adicionado a uma microplaca (produto de NUNC) em um volume de 100 pL/cavidade. O anticorpo foi imobilizado em temperatura ambiente durante duas horas. A microplaca foi lavada com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST), e PBST contendo 1 % de BSA (BSA-PBST) foi adicionado à microplaca em um volume de 200 pL/cavidade, e bloqueada em temperatura ambiente durante uma hora. Separadamente, soro humano foi diluído 11 vezes com uma mistura de tratamento de amostra (3:1) de 7% de MEGA-9 (produto de Dojindo Laboratories) e HBR (produto de Scantibodies Laboratories).Da mesma forma, o LR11 solúvel derivado de coelho purificado no Exemplo Referencial 2 foi serialmente diluído com a mistura de tratamento de amostra acima mencionada, para desse modo preparar um calibrador. Cada uma das amostras diluídas anteriores foi adicionada à microplaca em um volume de 100 pL/cavidade e foi permitida reagir durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, o anticorpo monoclonal de LR11 antissolúvel rotulado por biotina (R14) foi diluído com ESA-PBST em uma concentração de 0,4 pg/mL, e o anticorpo diluído foi adicionado à microplaca em um volume de 100 pL/cavidade, seguido por reação em temperatura ambientedurante quatro horas. Depois da lavagem da microplaca com PBST, estreptavidina rotulada por peroxidase (produto de PIERCE) diluída com BSA-PBST a 0,2 pg/mL foi adicionada à microplaca em um volume de 100 pL/cavidade, seguido por reação em temperatura ambiente durante uma hora. Depois da lavagem da microplaca com PBST, um líquido de substrato de TMB foi adicionado à microplaca em um volume de 100 pL/cavidade, e os teores na placa de microplaca foram permitidos desenvolver a cor em temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, a coloração foi interrompida adicionando-se 1,5N de ácido sulfúrico à microplaca em um volume de 100 pL/cavidade, e a absorvência foi medida por meio de uma leitora de microplaca (Abs. 450 nm). O nível de LR11 solúvel da amostra foi calculado pela curva de cali- bração obtida das medidas do calibrador. Através da multiplicação dos resultados pelo fator de diluição, a concentração de LR11 solúvel de soro humano correspondente foi obtida.

Exemplo 1: LR11 Solúvel como um marcador de tumor hematopoiético

[0057] De 81 pessoas que foram diagnosticadas como tendo um tumor hematopoiético em um primeiro exame médico, amostras de soro foram coletadas. A concentração de LR11 solúvel de cada amostra foi determinada e comparada com o nível de LR11 solúvel de soro em um grupo de indivíduo saudável (87 pessoas sem anormalidade de lipídio).

[0058] Os tipos de doença das 81 pessoas que foram diagnosticadas como tendo um tumor hematopoiético incluem leucemia linfocítica aguda (6), leucemia mieloide aguda (11), leucemia linfocítica crônica (5), leucemia mieloide crônica (7), linfoma Hodgkin (5), linfoma não Hodgkin (26), síndromes mielodisplásicas (4), mieloma múltiplo (8), e síndrome de POEMS (9). A concentração de LR11 solúvel de soro foi determinada pela técnica de ELISA empregada no Exemplo Referencial 2.Em consideração aos níveis de LR11 solúvel em indivíduos saudáveis, valor de redução provisório foi fixado em 20 ng/mL.Tabela 1 mostra o número de casos e ovalor de LR11 calculado por média em cada caso de doença. Como está claro a partir da Tabela 1, pacientes que exibiram uma concentração de LR11 solúvel mais alta que o valor de redução foram frequentemente encontrados, particularmente nos casos de leucemia e linfoma não Hodgkin, quando comparados com os indivíduos saudáveis.[Tabela 1]

Exemplo 2: Aplicação de valor de LR11 solúvel à avaliação do efeito do método terapêutico

[0059] No Exemplo 1, cinco pacientes foram diagnosticados como ten-do leucemia mieloide aguda e mostrou alta concentração de LR11 solúvel. Fig. 1 mostra os resultados monitorados das mudanças em níveis de LR11 solúvel de soro de antes do tratamento a remissão destes cinco pacientes. As concentrações de LR11 solúvel foram diminuídas para incluírem-se em uma faixa normal (<20 ng/mL) em virtude do tratamento. Portanto, em um paciente ∞m tumor hematopoiético, a presença de um tumor ou a severidade do mesmo está consideravelmente correlacionada ao aumento no LR11 solúvel no sangue do paciente.

Exemplo 3: Predição do risco de retorno

[0060] Entre os nove pacientes que tinham sido diagnosticados como tendo um tumor hematopoiético e que entraram em um estágio de remissão através de tratamento mas sofreram de tumor periódico, cinco pacientes exibiram uma concentração de LR11 solúvel mais alta que o valor de redução (20ng/mL) no retorno. Os cinco de nove pacientes (>50%) tiveram leucemia linfocítica aguda (1), leucemia mieloide aguda (2 em 5), leucemia linfocítica crônica (1), e linfoma não Hodgkin (1 em 2).Portanto, em pacientes com tumor hematopoiético, o risco de retorno de um tumor hematopoiético pode ser calculado, ou a possibilidade de retorno do mesmo pode ser determinada através do monitoramento do nível de LR11 solúvel de um paciente alvo.

Exemplo 4: LR11 solúvel como um biomarcador em carcinoma

[0061] Em cada caso de carcinoma, cinco pacientes foram escolhidos randomicamente, e a concentração de LR11 solúvel de soro de cada paciente foi medida.Semelhante ao Exemplo 1, o valor de redução provisório foi fixado em 20ng/mL. Em todos os casos de carcinoma, muitos pacientes exibiram uma concentração de LR11 solúvel mais alta que o valor de redução (Tabela 2).[Tabela 2]

Exemplo 5: Estimativa da taxa de remissão

[0062] Entre os 41 pacientes que foram diagnosticados como tendo leucemia mieloide aguda e que receberam um tratamento, no grupo de concentração de LR11 solúvel de soro normal (< 20 ng/mL), 20 de 21 pacientes alcançaram a remissão completa (CR) pelo tratamento (taxa de remissão alta: 95%), considerando que no grupo de concentração de LR11 solúvel alta (>20 ng/mL), apenas 13 de 20 pacientes alcançaram a remissão completa pelo tratamento (taxa de remissão significativamente baixa: 65%) (veja Fig. 2). Portanto, através da medição dos níveis de LR11 solúvel de um paciente com tumor hematopoiético, a possibilidade de remissão pelo tratamento do mesmo pode ser predita.

Exemplo 6: Relação entre LR11 solúvel e taxa de sobrevivência

[0063] Fig. 3 mostra taxas de sobrevivência global (OS) de 21 pacien-tes com leucemia mieloide aguda exibindo baixa concentração de LR11 solúvel de soro (< 20 ng/mL) e 22 pacientes com leucemia mieloide aguda exibindo alta concentração de LR11 solúvel de soro (>20 ng/mL). Como está claro a partir da Fig. 3, o nível de LR11 solúvel foi constatado ser particularmente um fator prognóstico importante em um período curto (2 a 3 anos).

Claims

1.Método para determinar a presença de um tumor maligno ou a severidade do mesmo, para selecionar um método terapêutico para este ou avaliar o efeito do método terapêutico ou para calcular o risco de retorno do tumor maligno ou a presença ou ausência do retorno, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: 1)uma etapa de medir a concentração e/ou quantidade de LR11 solúvel em uma amostra originária de um indivíduo e 2)uma etapa de comparar o valor medido acima com um valor de medição de LR11 solúvel em um grupo de indivíduos saudáveis; em que o tumor maligno é câncer de fígado, pâncreas, colón, colorretal, vesícula biliar ou hematopoiético.

2.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o tumor maligno é leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica ou linfoma não Hodgkin.

3.Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra originária de um indivíduo é qualquer uma dentre sangue, soro, plasma, fluido cérebro-espinhal e urina.

4.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a medida é realizada por uso de uma proteína que pode especificamente ligar-se ao LR11 solúvel.

5.Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato deque a proteína é selecionada dentre um anticorpo LR11 antissolúvel, apo E, β-VLDL, RAP, uPA, PAI-1 e complexo de uPA-PAI-1.