CN104991064A - 卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括微柱凝胶卡、指示红细胞，其制备方法包括微柱凝胶卡的制备和指示红细胞的制备。本发明卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒灵敏度高，特异性好，质量稳定，检测过程耗时短，方法简便易行，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化，能够使卵巢上皮性恶性肿瘤检测成为临床常规检测项目。

Description

卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术中体外诊断试剂领域，涉及一种卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒的组成、制备方法及其应用，适用于卵巢上皮性恶性肿瘤的诊断预防和治疗后监测。
背景技术
卵巢上皮性恶性肿瘤是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性恶性肿瘤的早期诊断对于降低死亡率具有重要意义。CA125 是卵巢肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原。微柱凝胶检测方法目前已广泛用于ABO血型、血清中不规则抗体的检测以及其在交叉配血中，但在卵巢上皮性恶性肿瘤标记物的检测中尚未见相关研究报道。目前已存在的卵巢上皮性恶性肿瘤检测技术有：ELISA法、化学发光免疫分析法、放射免疫分析技术、质谱技术、高密度阵列杂交技术等，而这些试验的操作程序复杂，需要时间长，并且所需设备仪器昂贵，因此检测并不方便。而微柱凝胶免疫检测技术广泛应用于血型临床检查，而该技术在卵巢上皮性恶性肿瘤标记物检测中应用尚未报道。微柱凝胶技术具有所需标本量少、无须洗涤、结果稳定、易于判读等优点，有望成为卵巢恶性肿瘤标志物检测的常规筛查技术，由于不需要大型仪器，且操作简单，价格便宜，适合中小医院及社区、乡镇医院开展，为我们卵巢恶性肿瘤标志物前期筛查提供便利。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种灵敏度高、特异性好、操作简单、价格便宜且质量稳定的卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括微柱凝胶卡、指示红细胞，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中均含有聚丙烯酰胺或葡聚糖凝胶颗粒；所述指示红细胞是结合卵巢恶性肿瘤标志物的正常O型Rh阴性红细胞或O型醛化红细胞。
所述试剂盒的制备包括以下步骤：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0~6.5）×l0-4g／mL、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2~1.5）×l0-4g／mL、甘氨酸（1. 6~1.9）×l0-2g／mL、氯化钠（1. 6~1.8）×l0-3g／mL、磷酸二氢钾（2. 0~2.4）×l0-4g／mL、磷酸氢二钠（4.5~4.8）×l0-4g／mL，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6~6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1~6：1的比例混合后配制成凝胶；
步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20~30μL的量，分别加入到微柱凝胶卡的微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
1）红细胞洗涤：将O型红细胞在离心机3000rpm下离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6~8次后配制成5%红细胞；
2）醛化处理：在1）所得的5%红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1~2:1进行混合；
3）洗涤：将2）醛化后的红细胞2500rpm离心2.5 min，用0.9%的生理盐水溶液洗涤5~6次；
4）保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
步骤二、抗CA125致敏醛化红细胞的制备
1）配制：配制pH为6.6~7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）；
2）洗涤：取上述步骤一所得醛化后的红细胞0.5 mL，用生理盐水洗涤2~4次，PBS洗涤1次，在3000rpm下离心3 min后弃上清液，将得到的红细胞悬浮于2mL PBS中；
3）酸化：加入2mL37°C的PBS/5mgTCA；37°C水浴振荡15 min；
4）洗涤：生理盐水洗涤1次，PBS洗涤1次后悬浮于2mL PBS中；
5）标记：加入2mL抗CA125溶液；37°C下水浴振荡60 min；
6）快速用生理盐水洗涤5次，PBS洗涤1次，用PBS保存备用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒灵敏度高，特异性好，质量稳定，检测过程耗时短，方法简便易行，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化，能够使卵巢上皮性恶性肿瘤检测技术成为临床常规检测项目。
具体实施方式
本发明卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒主要包括：微柱凝胶卡、指示红细胞，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中含有聚丙烯酰胺或葡聚糖凝胶颗粒；所述指示红细胞是结合卵巢恶性肿瘤标志物的正常O型Rh阴性红细胞或O型醛化红细胞；
卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒的制备方法如下：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0~6.5）×l0-4g／mL、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2~1.5）×l0-4g／mL、甘氨酸（1. 6~1.9）×l0-2g／mL、氯化钠（1. 6~1.8）×l0-3g／mL、磷酸二氢钾（2. 0~2.4）×l0-4g／mL、磷酸氢二钠（4.5~4.8）×l0-4g／mL，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6~6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1～6：1的比例混合后配制成凝胶；
步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20~30μL的量，分别加入到微柱凝胶卡的微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
1）红细胞洗涤：将O型红细胞在离心机3000rpm下离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6-8次后配制成5%红细胞；
2）醛化处理：在1）所得的5%红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1~2:1进行混合；
3）洗涤：将2）醛化后的红细胞2500rpm离心2.5 min，用0.9%的生理盐水溶液洗涤5~6次；
4）保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
步骤二、抗CA125致敏醛化红细胞的制备
1）配制：配制pH为6.6~7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）；
2）洗涤：取上述步骤一所得醛化后的红细胞0.5 mL，用生理盐水洗涤2~4次，PBS洗涤1次，在3000rpm下离心3 min后弃上清液，将得到的红细胞悬浮于2mL PBS中；
3）酸化：加入2mL37°C的PBS/5mgTCA；37°C水浴振荡15 min；
4）洗涤：生理盐水洗涤1次，PBS洗涤1次后悬浮于2mL PBS中；
5）标记：加入2mL抗CA125溶液；37°C下水浴振荡60 min；
6）快速用生理盐水洗涤5次，PBS洗涤1次，用PBS保存备用。
三、卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒的使用
1）将抗CA125致敏的醛化红细胞50μL与病人的血清25μL加入到微柱管中，于37℃下反应10~15min；
2）将微柱凝胶卡在专用离心机离心，900rpm下离心2min，1500rpm 下离心3min，取出后肉眼判定结果，并作记录；
3）结果判定标准：当血清中有被检物质时，抗原抗体反应时，凝集的红细胞在离心力的作用下不能通过凝胶而留在凝胶上层或游离在凝胶中，呈现阳性反应；而当血清中没有被检物质时，抗原抗体没有反应时，未凝集的红细胞在离心力的作用下可通过凝胶而沉积在微柱凝胶管的底部，呈现阴性反应。
本发明卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系中各种成分的协同作用：微柱凝胶卡上排列有多个微柱管可以完成多次检测；缓冲体系可以维持微柱凝胶卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内；润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力；酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效；丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间合适的间隙。

Claims (1)

1.一种卵巢恶性肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法，其特征在于：所述试剂盒包括微柱凝胶卡、指示红细胞，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中均包括若干个聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒；所述指示红细胞是结合卵巢恶性肿瘤标志物的正常O型Rh阴性红细胞或O型醛化红细胞；
所述试剂盒的制备包括以下步骤：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0~6.5）×l0-4g／mL、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2~1.5）×l0-4g／mL、甘氨酸（1. 6~1.9）×l0-2g／mL、氯化钠（1. 6~1.8）×l0-3g／mL、磷酸二氢钾（2. 0~2.4）×l0-4g／mL、磷酸氢二钠（4.5~4.8）×l0-4g／mL，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6~6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1～6：1的比例混合后配制成凝胶；步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20~30μL的量，分别加入到微柱凝胶卡的微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
1）红细胞洗涤：将O型红细胞在离心机3000rpm下离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6~8次后配制成5%红细胞；
2）醛化处理：在1）所得的5%红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1~2:1进行混合；
3）洗涤：将2）醛化后的红细胞2500rpm离心2.5 min，用0.9%的生理盐水溶液洗涤5~6次；
4）保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
步骤二、抗CA125致敏醛化红细胞的制备
1）配制：配制pH为6.6~7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）；
2）洗涤：取上述步骤一所得醛化后的红细胞0.5 mL，用生理盐水洗涤2~4次，PBS洗涤1次，在3000rpm下离心3 min后弃上清液，将得到的红细胞悬浮于2mL PBS中；
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4）洗涤：生理盐水洗涤1次，PBS洗涤1次后悬浮于2mL PBS中；
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6）快速用生理盐水洗涤5次，PBS洗涤1次，用PBS保存备用。
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