CN106093390A - 一种PtCu@g‑C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种PtCu@g‑C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种PtCu@g‑C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用。采用PtCu@g‑C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器，实现了胰腺癌肿瘤标记物CA724、CA242、CEA的定量检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低，对肿瘤的早期检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及 应用
技术领域
本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术
肿瘤的发病率高，不易察觉，我国病例数相当庞大，对人类的健康产生极大危害。肿瘤标志物是肿瘤细胞产生和释放的以抗原、酶、激素等形式的代谢产物存在于肿瘤细胞内或宿主体液中，其在临床上对于原发肿瘤的发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。
CA724、CA242、CEA等常见的胰腺癌肿瘤标志物，对于胰腺癌的诊断都能起到一定的作用。夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。
氧化石墨烯表面有大量的羧基官能团，使得它更容易与有机物结合。且具有大的比表面积，良好的电子传递能力和催化性能，能有效固载抗体。g-C3N4作为一种非金属半导体材料，由于其独特的结构特性、比表面积高、化学稳定性好、热稳定性好、同时具有最小的能带隙宽度，环保无不良和毒性作用，作为一个不含金属的催化剂具有良好的生物相容性。g-C3N4和rGO的耦合能显著提高g-C3N4/rGO合成材料的比表面积和导电率、增加其生物相容性。将PtCu合金杂化到g-C3N4/rGO，大大提高了材料的热稳定性，导电性，催化性。
发明内容
本发明提供了一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器，用于检测肿瘤标志物。
本发明的技术方案，包括以下步骤
1. 一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的纳米金硫堇修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（5）将6 µL、2.0 ~ 3.0 mg/mL的PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器。
2.纳米金硫堇修饰的还原石墨烯的制备，步骤如下：
称取60 ~ 100 mg的氧化石墨烯加入到80 mL超纯水中，超声溶解，与3 ~ 5 mL、0.5mol/mL的硫堇溶液混合，磁力搅拌6 ~7 h后，加入25 ~ 35 mg硼氢化钠，磁力搅拌4 ~ 5 h，离心分离，超纯水洗涤三次，制得纳米金硫堇修饰的还原石墨烯。
3. PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
（1）g-C3N4/rGO的合成
称取120 ~ 130 mg GO和190 ~ 210 mg g-C3N4加入到100 mL超纯水中，超声溶解；将1.5 ~ 2.5 mL聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA加入到上述溶液，超声分散30 min，再加入1 ~2 mL水合肼，90 ℃下反应24 h，离心分离，依次用超纯水、无水乙醇洗涤三次，得到g-C3N4/rGO；
（2）PtCu@g-C3N4/rGO标记物的合成
0.015 ~ 0.025 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于40 mL水中，与5 ~ 7 mL、6.75 mg/mL的g-C3N4/rGO混合，超声30 min，再依次加入3 mL、18.8 mmol/mL的CuSO4； 2.7 mL、10 mmol/mL的H2PtCI6·6H2O； 5 mL、2.64 mol/L的硼氢化钠，室温下搅拌12 h，离心分离，超纯水洗涤三次，35 ℃下真空干燥12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物；
（3）PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将4 mg的PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，加入1 mL 20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
4. 肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 8.10磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
上述所述肿瘤标志物选自下列之一： CA724、CA242、CEA。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明使用了纳米金硫堇修饰的还原石墨烯作为基底材料，石墨烯有大的比表面积，可提供更多抗体的结合位点，还原石墨烯，是亲水性物质，且能与抗体上的氨基有效结合，纳米金及硫堇的修饰提高了还原石墨烯的导电性，加快了电子的传递，能够提高检测的灵敏度。
（2）采用PtCu@g-C3N4/rGO作为检测抗体标记物， g-C3N4和rGO耦合是很好的选择，因为g-C3N4和石墨烯都是二维材料，能显著提高g-C3N4/rGO合成材料的比表面积和导电率、增加其生物相容性，且对过氧化氢有催化作用，Pt和Cu对过氧化氢也有催化作用，将PtCu合金杂化到g-C3N4/rGO上，大大提高了材料的热稳定性，导电性，催化性，因此，PtCu@g-C3N4/rGO对过氧化氢的催化作用呈多重放大，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；
（3）一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器对肿瘤标志物CA724、CA242、CEA的检测，其线性范围1 fg/mL ～ 10 ng/mL，检测限最低0.33 fg/mL，表明一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、1.0 mg/mL的纳米金硫堇修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（5）将6 µL、2.0 mg/mL的PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器。。
实施例2一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、1.5 mg/mL的纳米金硫堇修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、10.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、2.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（5）将6 µL、2.5 mg/mL的PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器。
实施例3一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、2.0 mg/mL的纳米金硫堇修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、3.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（5）将6 µL、3.0 mg/mL的PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器。
实施例4纳米金硫堇修饰的还原石墨烯的制备，步骤如下：
称取60 mg的氧化石墨烯加入到80 mL超纯水中，超声溶解，与3 mL、0.5 mol/mL的硫堇溶液混合，磁力搅拌6 h后，加入25 mg硼氢化钠，磁力搅拌4 h，离心分离，超纯水洗涤三次，制得纳米金硫堇修饰的还原石墨烯。
实施例5纳米金硫堇修饰的还原石墨烯的制备，步骤如下：
称取80 mg的氧化石墨烯加入到80 mL超纯水中，超声溶解，与4 mL、0.5 mol/mL的硫堇溶液混合，磁力搅拌6.5 h后，加入30 mg硼氢化钠，磁力搅拌4.5 h，离心分离，超纯水洗涤三次，制得纳米金硫堇修饰的还原石墨烯。
实施例6纳米金硫堇修饰的还原石墨烯的制备，步骤如下：
称取100 mg的氧化石墨烯加入到80 mL超纯水中，超声溶解，与5 mL、0.5 mol/mL的硫堇溶液混合，磁力搅拌7 h后，加入35 mg硼氢化钠，磁力搅拌5 h，离心分离，超纯水洗涤三次，制得纳米金硫堇修饰的还原石墨烯。
实施例7 PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
（1）g-C3N4/rGO的合成
称取120 mg GO和190 mg g-C3N4加入到100 mL超纯水中，超声溶解；将1.5 mL聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA加入到上述溶液，超声分散30 min，再加入1 mL水合肼，90 ℃下反应24 h，离心分离，依次用超纯水、无水乙醇洗涤三次，得到g-C3N4/rGO；
（2）PtCu@g-C3N4/rGO标记物的合成
0.015 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于40 mL水中，与5 mL、6.75 mg/mL的g-C3N4/rGO混合，超声30 min，再依次加入3 mL、18.8 mmol/mL的CuSO4； 2.7 mL、10 mmol/mL 的H2PtCI6·6H2O； 5 mL、2.64 mol/L的硼氢化钠，室温下搅拌12 h，离心分离，超纯水洗涤三次，35 ℃下真空干燥12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物；
（3）PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将4 mg的PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，加入1 mL 20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例8 PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
（1）g-C3N4/rGO的合成
称取125 mg GO和200 mg g-C3N4加入到100 mL超纯水中，超声溶解；将2.0 mL聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA加入到上述溶液，超声分散30 min，再加入1.5 mL水合肼，90 ℃下反应24 h，离心分离，依次用超纯水、无水乙醇洗涤三次，得到g-C3N4/rGO；
（2）PtCu@g-C3N4/rGO标记物的合成
0.020 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于40 mL水中，与6 mL、6.75 mg/mL的g-C3N4/rGO混合，超声30 min，再依次加入3 mL、18.8 mmol/mL的CuSO4； 2.7 mL、10 mmol/mL 的H2PtCI6·6H2O； 5 mL、2.64 mol/L的硼氢化钠，室温下搅拌12 h，离心分离，超纯水洗涤三次，35 ℃下真空干燥12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物；
（3）PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将4 mg的PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，加入1 mL 20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例9 PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
（1）g-C3N4/rGO的合成
称取130 mg GO和210 mg g-C3N4加入到100 mL超纯水中，超声溶解；将2.5 mL聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA加入到上述溶液，超声分散30 min，再加入2 mL水合肼，90 ℃下反应24 h，离心分离，依次用超纯水、无水乙醇洗涤三次，得到g-C3N4/rGO；
（2）PtCu@g-C3N4/rGO标记物的合成
0.025 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于40 mL水中，与7 mL、6.75 mg/mL的g-C3N4/rGO混合，超声30 min，再依次加入3 mL、18.8 mmol/mL的CuSO4； 2.7 mL、10 mmol/mL 的H2PtCI6·6H2O； 5 mL、2.64 mol/L的硼氢化钠，室温下搅拌12 h，离心分离，超纯水洗涤三次，35 ℃下真空干燥12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物；
（3）PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将4 mg的PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，加入1 mL 20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例10 肿瘤标志物CA724的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）测定样品中CA724的线性范围为1 fg/mL~10 ng/mL，检测限为0.33 fg/mL。
实施例11 肿瘤标志物CA242的检测
按照实施例10的方法对样品中CA242进行检测，其线性范围为1 fg/mL~10 ng/mL，检测限为0.33 fg/mL。
实施例12 肿瘤标志物CEA的检测
按照实施例10的方法对样品中CEA进行检测，其线性范围为1 fg/mL~10 ng/mL，检测限为0.33 fg/mL。

Claims (5)

1.一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的纳米金硫堇修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（5）将6 µL、2.0 ~ 3.0 mg/mL的PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法，所述纳米金硫堇修饰的还原石墨烯的制备，步骤如下：
称取60 ~ 100 mg的氧化石墨烯加入到80 mL超纯水中，超声溶解，与3 ~ 5 mL、0.5mol/mL的硫堇溶液混合，磁力搅拌6 ~7 h后，加入25 ~ 35 mg硼氢化钠，磁力搅拌4 ~ 5 h，离心分离，超纯水洗涤三次，制得纳米金硫堇修饰的还原石墨烯。
3.如权利要求1所述的一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法，所述PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
（1）g-C3N4/rGO的合成
称取120 ~ 130 mg GO和190 ~ 210 mg g-C3N4加入到100 mL超纯水中，超声溶解；将1.5 ~ 2.5 mL聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA加入到上述溶液，超声分散30 min，再加入1 ~2 mL水合肼，90 ℃下反应24 h，离心分离，依次用超纯水、无水乙醇洗涤三次，得到g-C3N4/rGO；
（2）PtCu@g-C3N4/rGO标记物的合成
0.015 ~ 0.025 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于40 mL水中，与5 ~ 7 mL、6.75 mg/mL的g-C3N4/rGO混合，超声30 min，再依次加入3 mL、18.8 mmol/mL的CuSO4； 2.7 mL、10 mmol/mL 的H2PtCI6·6H2O； 5 mL、2.64 mol/L的硼氢化钠，室温下搅拌12 h，离心分离，超纯水洗涤三次，35 ℃下真空干燥12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物；
（3）PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将4 mg的PtCu@g-C3N4/rGO检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，加入1mL 20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h，制得PtCu@g-C3N4/rGO-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种PtCu@g-C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 8.10磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
5.如权利要求1、3和4所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤标志物选自下列之一：CA724、CA242、CEA。
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