CN103018438A - 一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：制备了一种新型纳米材料多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物：多壁碳纳米管具有的良好的化学稳定性，导电性和极高的机械强度，然而其溶解性很差，需要寻找一种良好的分散剂；而壳聚糖具有良好的生物相容性与成膜性，可以增大多壁碳纳米管在溶液里的溶解性；另外，硫堇作为一种电子传递的媒介，提高了电子的传输，进一步增强了多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物的导电性；而作为交联剂的戊二醛可以很好地结合硫堇、壳聚糖与抗体中所含的氨基（-NH2），进而制备成一种新型的免疫传感器。该免疫传感器检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，再生能力强，回收率符合要求。
Description
技术领域
本发明提供一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，属于生物传感器技术领域。
背景技术
在农业生产中，农药在控制农作物病虫害，保障农产品稳产、高产方面起到至关重要的作用，但是，农药的不合理使用，不仅造成了水环境、土壤、大气的污染，也导致了农产品中农药残留超标，引起人体中毒以及贸易壁垒。当前，我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药，其中毒死蜱的生产使用逐渐增加，毒死蜱在人体中主要分布于肝脏、肾脏、脾脏等血流量较高的器官。它可以抑制胆碱酯酶活性，对人体有致畸作用，甚而对人体的中枢神经产生影响。因此，建立一种快速、灵敏、安全可靠的毒死蜱农药残留的检测方法迫在眉睫。
传统的农药残留检测主要有：光谱法（红外光谱法、荧光光谱法、紫外-可见光、化学发光法等）、色谱法（气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、高效液相色谱（HPLC））、气-质联用（GC-MS），液-质联用（LC-MS）、酶联免疫（ELISA）等。虽然这些方法的选择性好、灵敏度高和准确度高，同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备,样品的前处理过程繁琐、费时,并且对分析人员的技术水平要求很高,不适于现场快速检测。因此,人们迫切需要快速、可靠、经济和适合于现场应用的快速检测方法。于是,廉价、快速、可信、敏感的生物传感器应运而生。与传统的分析方法相比,生物传感器具有如下特点：（1）较高的选择性，因此不需要对被测组分进行分离，即不用对样品进行预处理。（2）结构简单，体积小，使用方便，特别是便携式的生物传感器，非常有利于食品质量的市场快速评价。（3）可实现连续在线检测，使食品加工过程的质量控制变得简便。（4）响应速度快，样品用量少，与其他大型分析仪器相比，生物传感器制作成本低，且可反复使用。因此本文尝试制备一种毒死蜱残留的免疫传感器。
发明的目的在于提供一种能克服上述方法的缺陷、且操作简单、灵敏度高，选择性好的毒死蜱农药残留检测的免疫传感器制备方法。
其技术方案为：一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：制备出一种新型的纳米复合物多壁碳-硫堇-壳聚糖，从而增大电极表面的电流信号，加大检测范围，降低免疫传感器的检测限。
所述的一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：多壁碳纳米管具有的良好的化学稳定性，导电性和极高的机械强度；壳聚糖具有良好的生物相容性与成膜性，可以增大多壁碳纳米管在溶液里的溶解性，解决了多壁碳纳米管难溶解的问题；硫堇作为一种电子传递的媒介，可以很大程度上提高电子的传输，进一步增强了多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物的导电性。
所述的一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：实验条件的优化，主要包括免疫传感器的修饰及表征过程，有关实验参数的优化（纳米复合物中硫堇的浓度、测试底液的pH、孵育时间等）；所制备出电流型免疫传感器的工作曲线；免疫传感器性能检测包括重现性、稳定性、特异性、再生性以及免疫传感器对蔬菜样品加标回收率的测定。所制备的免疫传感器的工作曲线为：y = 9.5771 lgC (ng/mL) + 16.220，(R2=0.9964)，其检测限为0.046ng/mL；免疫传感器性能检测包括特异性、稳定性、重现性、再生性以及免疫传感器对多种果蔬样品回收率的测定。
其制备原理为：本发明利用功能化的多壁碳纳米管，具有羧基（-COOH），可以提供大的外部表面面积，且可以促进电子转移；壳聚糖富含氨基（-NH2），是多壁碳纳米管很好的分散剂，具有较高的成膜性及生物相容性；硫堇作为电子传递的媒介，具有大量的氨基（-NH2），将三种物质按一定比例混合，从而制备出多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物；而作为交联剂的戊二醛可以与氨基（-NH2）结合，因此可以将多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物中壳聚糖、硫堇与毒死蜱抗体连接；用牛血清蛋白（BSA）封闭抗体上的非特异性结合位点后即可制备得到一种新型的、便捷的免疫传感器。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：（1）基于新型纳米材料多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物，增大电流相应；（2）通过戊二醛将多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物中硫堇、壳聚糖与抗体中所含的氨基（-NH2）很好地结合，从而实现抗体的固定。
本发明制备了新型纳米材料多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物，利用多壁碳纳米管具有的良好的化学稳定性，导电性和极高的机械强度，广泛用于电极的表面修饰，然而其溶解性很差，进而需要寻找一种良好的分散剂。壳聚糖具有良好的生物相容性与成膜性，可以增大多壁碳在溶液里的溶解性，从而解决多壁碳的难溶解的问题。另外，硫堇作为一种电子传递的媒介，可以很大程度上提高电子的传输，进而加强了多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物的导电性。而戊二醛，作为交联剂，可以很好地结合多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物中硫堇、壳聚糖与抗体中所含的氨基（-NH2），进而制备成一种新型的免疫传感器，该免疫传感器检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，再生能力强，回收率符合要求以及可以用于实际样品的检测。
所述一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法的制备工艺如下：（1）制备多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物；（2）将6μL多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物修饰到清洗好的裸玻碳电极修饰上，烘干；（3）修饰3μL 2.5%戊二醛，烘干；（4）修饰6μL 200 ng/mL毒死蜱抗体，4℃孵育12h；（5）将上述制备好的电极最后浸入2.5%的BSA溶液中室温下静置1 h，以封闭电极上非特异性结合位点，室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。
具体实施方式
实施例：（1）多壁碳-硫堇-壳聚糖（MWCNTs-THI-CS）纳米复合物的制备：将0.5g壳聚糖溶于100mL 1.0%的醋酸溶液中，室温下搅拌3h，配成0.5% CS溶液，室温下磁力搅拌1h，使壳聚糖完全溶解；称取5.0mg 多壁碳纳米管，加入5.0mL上述得到的壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的黑色分散液(多壁碳-壳聚糖纳米复合材料)；再将5.0mg 硫堇加入多壁碳-壳聚糖纳米复合材料中，再在室温下超声分散12h至硫堇完全溶解，最终得到了多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物。（2）免疫传感器的制备：取6μL上述制备好的多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物滴涂在清洗好的玻碳电极（GCE）表面，晾干，然后用pH=7.5的硫酸盐缓冲液（PBS）冲洗表面，晾干，该修饰电极记作MWCNTs-THI-CS/GCE；取3μL 2.5%戊二醛（GA）溶液滴涂在MWCNTs-THI-CS/GCE表面，孵育30min，然后用pH=7.5的PBS缓冲液冲洗表面，晾干，记作GA/MWCNTs-THI-CS/GCE；取6μL 200ng/mL毒死蜱抗体（anti-chlorpyrifos）溶液滴涂在GA/MWCNTs-THI-CS/GCE上，4℃孵育12h，然后用pH=7.5的PBS缓冲液冲洗表面，晾干，记作anti-chlorpyrifos/GA/MWCNTs-THI-CS/GCE；将上述组装好的电极浸入2.5%的BSA溶液中室温下1h，以封闭抗体上的非特异性结合位点，室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。（3）对所制备的免疫传感器的复合物中硫堇的浓度、测试底液pH值、和孵育时间三方面实验条件进行优化：硫堇的最佳浓度为1.0mg/mL，pH值的范围为7.5，孵育时间的范围为25min。 
配置0.1-1.0×105ng/mL的毒死蜱标准溶液，将上述制备好的免疫传感器分别浸入不同浓度的毒死蜱标准溶液，在常温下孵育25min，检测免疫前后电流变化得到其工作曲线；（4）选5根制备好的免疫传感器测量毒死蜱农药残留，检测其重现性；将制备好的免疫传感器保存24天之后，再去检测毒死蜱农药残留量，从而检测其稳定性；将免疫传感器在克百威、辛硫磷、西维因、3-羟基克百威等干扰物存在的情况下对200ng/mL的毒死蜱进行测试，以检测其选择性；将免疫后的传感器用甘氨酸-HCl缓冲液 (pH=2.8)解离毒死蜱农药5min后再次免疫，检测其再生能力；（5）将多种果蔬样品清洗干净，进行实际样品加标回收率的测试。
此种阻抗型免疫传感器检测农药毒死蜱残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，灵敏度高，选择性好，稳定性高，再生能力好和回收率符合要求，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。
Claims (3)
1.一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：制备了多壁碳-硫堇-壳聚糖（MWCNTs-THI-CS）纳米复合材料，该传感器的组装过程为：将多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物滴涂到玻碳电极表面，然后用戊二醛交联，再在抗体溶液中孵育12小时，用BSA封闭，进而制备出一种检测毒死蜱农药的免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：多壁碳纳米管具有良好的化学稳定性、导电性和极高的机械强度；壳聚糖具有良好的生物相容性与成膜性，可以增大多壁碳纳米管在溶液里的溶解性，解决了多壁碳纳米管难溶解的问题
，硫堇作为一种电子传递的媒介，通过π-π键与多壁碳纳米管形成很强的作用力，很大程度上提高了复合物中电子的传输，进一步增强了多壁碳-硫堇-壳聚糖纳米复合物的导电性；而戊二醛又可以很好地交联复合物里硫堇、壳聚糖与抗体中的氨基（-NH2），因此，制备的免疫传感器灵敏度高，稳定性好。
3.如权利要求1所述的一种检测毒死蜱农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：免疫传感器的修饰及表征过程，有关实验参数的优化，所制备的免疫传感器的工作曲线为：毒死蜱浓度0.1-105ng/mL时，检测毒死蜱农药的线性范围为y = 9.5771 lgC (ng/mL) + 16.220，检测限为0.046ng/mL，免疫传感器性能检测包括重现性、稳定性、特异性、再生性以及免疫传感器对蔬菜样品加标回收率的测定。
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