CN108693361A - 氧化锆微珠abo血型正反定型试剂卡及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氧化锆(ZrO₂)微珠ABO血型正反定型试剂卡及其制备方法，所述试剂卡包括：A正定型微柱管，管内装有含有IgM性质的单克隆抗A抗体的氧化锆微珠；B正定型微柱管，管内装有含有IgM性质的单克隆抗A抗体的氧化锆微珠；A反定型微柱管，管内装有氧化锆悬浮介质和氧化锆微珠；B反定型微柱管，管内装有含有氧化锆悬浮介质的氧化锆微珠。本发明制备的ABO血型正反定型试剂卡灵敏度高，特异性好，成本低，质量稳定且能同时进行正反定型。

Description

氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学检测领域，更具体的说，本发明涉及一种氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡及其制备方法。

背景技术

自1900年Landsteiner发现ABO血型以来，输血成为临床抢救病人生命的重要医疗手段之一，正确鉴定血型是安全输血的首要步骤，ABO血型不相容在临床输血中会导致严重的即发性溶血性输血反应，危及患者生命。因此，ABO血型的准确定型至关重要，是安全输血的基础和保障。

卫生部在2000年发文规定每位供血及受血的个体均要进行ABO、Rh血型定型鉴定(卫生部卫医发(2000)184号文件)。

1986年Lapierre等人发明了观察红细胞凝集的凝胶技术(gel technique)，该技术很快商品化并迅速推广应用到临床输血，并产生了“凝胶试验”(gel test)的专用名词。

在国外，已经有厂家生产用于ABO血型定型试剂卡，但其采用的介质为玻璃微珠或葡聚糖凝胶。国内目前已有厂商生产ABO血型定型试剂卡产品，使用的介质均为葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶。但是葡聚糖凝胶会受温度、盐浓度、渗透压、pH的变化而致颗粒的孔径会改变，床外的空间也会改变，导致离心层析结果受影响。由于是一种凝胶状的颗粒，物理强度较差，随着保存期的延长，会导致变形，非特异吸附高，会影响试验结果。另外，价格也比较昂贵。

因此，本领域需要开发成本低、且稳定性更好的ABO血型定型试剂卡。

发明内容

本发明的目的在于，国内外首次提出一种新的氧化锆微珠及悬浮介质(见图2)，用于ABO血型正反定型试剂卡，提供一种灵敏度高、特异性好、质量稳定、能同时进行正反定型的，成本较低的氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡及其制备方法。

本发明的第一发明，提供一种氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，所述检测试剂卡包括：

A正定型微柱管，管内装有氧化锆微珠和IgM性质的单克隆抗A抗体；

B正定型微柱管，管内装有氧化锆微珠和IgM性质的单克隆抗B抗体；

A反定型微柱管，管内装有氧化锆微珠和氧化锆微珠悬浮介质；

B反定型微柱管，管内装有氧化锆微珠和氧化锆微珠悬浮介质；

所述氧化锆微珠悬浮介质，pH值为6.6-6.8。

上述微柱管均为二管，所述氧化锆微珠颗粒直径为63-125微米。

上述单克隆抗A抗体效价≥1280；上述单克隆抗B抗体效价≥1280。

上述微珠悬浮介质的组份为：

上述氧化锆微珠与抗体的体积比为2:1；上述氧化锆微珠与微珠悬浮介质体积比为2:1。

上述微柱管开口处设铝箔封片。

本发明的第二发明，提供上述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的制备方法，所述方法包括步骤：

(a)筛选出颗粒直径为63-125微米的氧化锆微珠，用微珠悬浮介质洗涤3-5次，除去微珠破损碎片以及聚集的微珠颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的微珠；

(b)将步骤(a)制备的微珠与各抗体分别按照体积比2：1的比例混合，配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的微珠和含有IgM性质的单克隆抗B抗体的微珠；

(c)将步骤(a)制备的微珠与微珠悬浮介质按照体积比2：1的比例混合，配制成含有氧化锆微珠悬浮介质的微珠；

(d)按照每管22-28微升的量，将步骤(b)、步骤(c)配制的微珠分别分装到检测卡的微柱管中。

上述方法还包括以下步骤：

(e)用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。

本发明所述微珠悬浮介质中“水”为蒸馏水、纯化水或去离子水，优选蒸馏水。本发明步骤(b)和步骤(c)无特定秩序，可以先后进行或者同时进行。

本发明的有益效果是：

本发明的第一个方面，提出了一种氧化锆微珠及标准化的氧化锆微珠悬浮介质体系，用于氧化锆微珠的洗涤和悬浮，并可以长时间维持抗体以及氧化锆微珠的稳定.其特点在于：

1、设计了具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸钾盐、钠盐以及氨基酸组成的缓冲体系，使体系的pH值维持在6.6-6.8。与输血领域通常采用的单一的枸橼酸缓冲体系相比，具有缓冲能力更强的特点，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围，同时保证了整个氧化锆微珠悬浮介质的离子强度。

2、具有更加有效的低盐浓度体系，从其组成可以看出，本发明的氧化锆微珠悬浮介质采用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助以微量的磷酸盐来维持低离子强度环境，保持氧化锆微珠颗粒呈圆球颗粒，并维持氧化锆微珠颗粒的直径大小在所要求的范围内(63-125微米)。

3、本发明具有独特的润滑体系，采用一定浓度的牛血清白蛋白，使得红细胞通过氧化锆微珠间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过氧化锆微珠颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。

4、本发明具有优越的防腐体系，选择苯甲酸钠作为防腐剂，采用聚乙烯吡咯烷酮协同作用，因而其在穿透细胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位点就不同，所以针对不同种类微生物的抑制能力就不同，具有更好的防腐能力，有效防止细菌的繁衍，获得较长时间的保存期，同时不仅避免使用叠氮钠化学防腐剂对氧化锆微珠悬浮介质体系的离子强度提升，从而对氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的灵敏度和特异性产生的不良影响，也避免使用抗生素类在保存过程中所代谢产生的中间体对氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的特异性产生不良影响。

本发明的另一方面，为了保证本发明氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的质量，在制备过程中还需要对氧化锆微珠进行筛选，即，首先要选择适当的氧化锆微珠，一般应该满足的条件是：选择颗粒直径为63-125微米的氧化锆微珠。对筛选获得的氧化锆微珠原料需要进行洗涤、悬浮，目的是让氧化锆微珠颗粒洗涤去除破损的氧化锆微珠颗粒、聚集的氧化锆微珠颗粒、内径在63-125微米以外的超大或超小氧化锆微珠颗粒以及氧化锆微珠以外的其它杂质成分。洗涤完成后用氧化锆微珠悬浮介质来悬浮氧化锆微珠。

本发明的再一方面，为了保证本发明氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的质量，在制备过程中还需要对与氧化锆微珠混合的抗体原料进行筛选。

综上所述，本发明的氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡之所以可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用。各种氧化锆微珠微柱管排列于一张卡上可以保证仅使用一张卡就能完成2人份的ABO血型正反定型。缓冲体系可以维持分型卡反应体系需要的pH。低盐浓度体系可以保证氧化锆微珠颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证氧化锆微珠颗粒之间适当的润滑能力。苯甲酸钠防腐剂可以防止氧化锆微珠或抗体因为细菌繁殖而失效。标准化的氧化锆微珠可以保证氧化锆微珠颗粒之间的合适的间隙。标准化的抗体可以保障抗原的有效检出。

用此氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡进行ABO血型定型，产生的阳性反应均不低于3+。一般在18-25℃条件下保存有效期不低于12个月。

总之，本发明的实施提供了标准化的氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡产品，各采供血机构可以得到标准一致的氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，为准确进行ABO血型正反定型、保证安全输血创造条件。

附图说明

图1为氧化锆微珠显微镜图；

图2为本发明氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的结构示意图；

图3为本发明氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的检测结果图；

图4为本发明氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的另一检测结果图。

1-8.氧化锆微珠微柱管；9.检测试剂卡；11.氧化锆微珠；12.微珠悬浮介质；13.微柱管；14.空卡片。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。

实施例1：

步骤一、氧化锆微珠悬浮介质的配制

所述氧化锆微珠悬浮介质配方如下：

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、氧化锆微珠的制备

选用氧化锆微珠11，颗粒直径为63-125微米。用氧化锆微珠悬浮介质12洗涤3-5次，除去氧化锆微珠破损碎片以及聚集的氧化锆微珠颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的氧化锆微珠。

步骤三、抗体的选择

选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥1280；

选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥1280。

步骤四、氧化锆微珠的配制

将步骤二制备的氧化锆微珠与步骤三选择的各抗体均按照体积比2：1的比例混合，分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的氧化锆微珠和含有IgM性质的单克隆抗B抗体的氧化锆微珠；将步骤二制备的氧化锆微珠与步骤一配制的氧化锆微珠悬浮介质按照体积比2：1的比例混合，配制成含有氧化锆微珠悬浮介质的氧化锆微珠。

步骤五、分装

按照每管22-28微升的量加入到空白卡片14中，将步骤四配制的各氧化锆微珠分别加入到一空白卡片的八个微柱管13中，形成具有8个氧化锆微珠微柱管的ABO血型正反定型试剂卡9。如图2所示，其中管1/3为含有单克隆抗A抗体的氧化锆微珠的微柱管；管2/4为含有单克隆抗B抗体的氧化锆微珠的微柱管；管5-8为装有氧化锆微珠及悬浮介质的微柱管。本产品可以用于同时测试二个样品。

步骤六、半成品测定

要求含有抗体的微柱氧化锆微珠的微柱管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生≥3+的阳性反应，即红细胞集中在氧化锆微珠上层表面，呈现直线型。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过氧化锆微珠到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有氧化锆微珠悬浮介质和氧化锆微珠混合物的氧化锆微柱管中红细胞可以全部通过氧化锆微珠到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。

步骤七、封口

用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。贴标签标记后于18-25℃保存。

实施例2、本发明试剂卡的保存和检测特性

上述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡保存了1年以上，在此保存期间，该氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡具有以下检测结果：

(1)外观

氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡中的抗A氧化锆微珠呈均匀蓝色，抗B氧化锆微珠呈均匀黄色，氧化锆微珠悬浮介质悬浮的氧化锆微珠呈均匀白色，微珠层上端有2-3毫米清澈透明的液体，氧化锆微珠颗粒之间不应有气泡和异物。

(2)灵敏度

含有抗体的氧化锆微珠微柱管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生≥3+的阳性反应，即红细胞集中在氧化锆微珠上层表面，呈现直线型。

(3)特异性

含有抗体的氧化锆微珠微柱管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在氧化锆微珠上层表面，呈现直线型。与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过氧化锆微珠到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有氧化锆微珠悬浮介质和氧化锆微珠混合物的氧化锆微珠微柱管中红细胞可以全部通过氧化锆微珠到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。

实施例3:所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡使用方法

1、氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡有八个氧化锆微珠微柱管。其中8个氧化锆微珠氧化锆微珠微柱管分别是2管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的氧化锆微珠微柱管(1/3)、2管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的氧化锆微珠微柱管(2/4)、4管用于反定型的含有氧化锆微珠悬浮介质的氧化锆微珠微柱管(5-8)。2、用低离子强度盐溶液(LISS)或生理盐水将待检者红细胞配制成2％浓度，分别加入第一、第二和第三、第四支微管中(两份样品)，每管20微升。

3、将已知A型、B型用LISS溶液或生理盐水配制成2％浓度，分别加入至第五到第八支微管(两个样品)，每管20微升。5/7为A血球，6/8为B血球。

4、将待检者血清或血浆分别加入到第五至第八支微管中，每管20微升。

5、混匀后用氧化锆微珠微柱卡专用离心机离心，1200rpm离心4分钟，取出后肉眼判定结果，记录。

6、判定结果

阳性结果：红细胞浮在氧化锆微珠表面或胶中，为阳性反应。

阴性结果：红细胞沉于氧化锆微珠微柱管的底部。

血型判定见下表及图3、图4所示，图3中血型为B血型和A血型；图4中血型为AB血型和O血型

注：“+”为凝集“－”为不凝集

本发明采用氧化锆微珠，其成本低，通常葡聚糖凝胶价格是氧化锆的30余倍。另外，氧化锆是白色无臭无味晶体，不溶于水、盐酸和稀硫酸。化学性质不活泼，且高熔点、高电阻率、高析射率和低热膨胀系数的性质，是重要的耐高温材料，陶瓷绝缘材料。

氧化锆微珠的特点是化学物理稳定性高，非特异性吸附低，细菌等微生物不会生长，填料反压特低。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例。

Claims (9)

1.一种氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包括：

A正定型微柱管，管内装有含有IgM性质的单克隆抗A抗体的氧化锆微珠；

B正定型微柱管，管内装有含有IgM性质的单克隆抗B抗体的氧化锆微珠；

A反定型微柱管，管内装有氧化锆悬浮介质和氧化锆微珠；

B反定型微柱管，管内装有氧化锆悬浮介质和氧化锆微珠；

所述氧化锆微珠悬浮介质，pH值为6.6-6.8。

2.如权利要求1所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，其特征在于，所述检测管均为二管，所述氧化锆微珠颗粒直径为63-125微米。

3.如权利要求2所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，其特征在于，所述单克隆抗A抗体效价≥1280；所述单克隆抗B抗体效价≥1280。

4.如权利要求1所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，其特征在于，所述氧化锆微珠悬浮介质的组份为：

5.如权利要求1-4任一权利要求所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，其特征在于，所述氧化锆微珠与抗体的体积比为2:1；所述氧化锆微珠与微珠悬浮介质体积比为2:1。

6.如权利要求5所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，其特征在于，所述微柱管开口处有铝箔封片。

7.如权利要求6所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡，其特征在于，所述试剂卡上贴有标签纸。

8.如权利要求5所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)筛选出颗粒直径为63-125微米的氧化锆微珠，用微珠悬浮介质洗涤3-5次，除去微珠破损碎片以及聚集的微珠颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的微珠；

(b)将步骤(a)制备的微珠与各抗体分别按照体积比2：1的比例混合，配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的微珠和含有IgM性质的单克隆抗B抗体的微珠；

(c)将步骤(a)制备的微珠与微珠悬浮介质按照体积比2：1的比例混合，配制成含有氧化锆微珠悬浮介质的微珠；

(d)按照每管22-28微升的量，将步骤(b)、步骤(c)配制的微珠分别分装到试剂卡的微柱管中。

9.如权利要求8所述氧化锆微珠ABO血型正反定型试剂卡的制备方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

(e)用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。