CN103033632A - Abo血型反定型胶体金试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ABO血型反定型胶体金试剂盒及制备方法,包括反应板,红细胞膜抗原金粒子与基础液,反应板上设置3N个反应孔,分别放置A红细胞膜抗原金粒子与基础液,B红细胞膜抗原金粒子与基础液和O红细胞膜抗原金粒子与基础液,反应孔为圆形结构,孔底光滑呈U型,反应孔上设置密封盖。试剂盒也可以为干试剂盒,将红细胞膜抗原金粒子与基础液干燥在反应孔上。本发明通过制备红细胞膜血型抗原提取物,然后进行胶体金标记,解决了新鲜红细胞保存期短的问题。试剂盒一般在2-20℃条件下保存有效期不低于12个月,而且具有灵敏度高、使用方便、结果好判读及成本较低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及输血医学领域,尤其涉及一种ABO血型反定型胶体金试剂盒及制备方法。
背景技术
ABO血型系统是根据红细胞上A及B凝集原的不同,将血型分为O、A、B及AB血型。A型血红细胞上含A抗原,血清中含抗B抗体;B型血红细胞上含B抗原,血清中含抗A抗体;O型血红细胞上则没有A及B抗原,血清中含抗A及抗B抗体;AB型血红细胞上含A及B两种抗原,血清中则不含抗A及抗B抗体。A抗原和抗A抗体,B抗原和抗B抗体会发生免疫结合反应,使红细胞发生凝聚。
ABO血型是由红细胞表面抗原和血清中的抗体两者共同决定的。利用标准的抗A、抗B抗体检测红细胞抗原,称之为正定型;用标准的A及B抗原检测血清中的抗体,称之为反定型。正反定型同时检测,才能正确判断ABO血型。
正确的血型鉴定是保证临床输血安全和抢救生命的重要工作,ABO血型检测是常规的输血前血型血清学检测项目之一,为了保证正确的血型鉴定,卫生部在2000年发文(卫医法[2000]184号)明确规定:每位供血及受血的个体均要进行ABO血型正反定型。
目前临床实验室最常用的ABO血型反定型的鉴定方法是血凝试验和微柱凝胶试验。血凝试验中用到的标准A型、B型和O型红细胞,保存期短,一般为2~8℃条件下保存3个月,且容易发生微生物污染及溶血现象。微柱凝胶法检测时则需要特制的凝胶卡,同时需配备专用离心机,检测成本较高。除以上两种常用的方法之外,还有磁珠法。磁珠法在使用前,需进行试剂的复溶,复溶后的试剂存放时间较短,一般7天内必须使用完,而且需要专门的磁化程控振荡器。
目前,反定型用红细胞试剂存在有效期短、保存条件苛刻、质量不稳定等问题,容易导致血型鉴定出差错,甚至出现严重输血事故。所以急需一种使用方便、有效期长、准确性好、成本较低的检测ABO血型反定型的试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,提供一种使用方便、有效期长、准确性好、成本较低的检测ABO血型反定型的胶体金试剂盒。
本发明所要解决的第二个技术问题是,提供检测ABO血型反定型的胶体金试剂盒的制备方法。
为了解决上述问题,本发明提供了一种ABO血型反定型胶体金试剂盒,其特征在于,包括反应板,红细胞膜抗原金粒子与基础液,反应板上设置3N个反应孔,分为三横排和N纵排,其中第一横排标有字母A,所对应的孔为A反应孔,第二横排标有字母B,所对应的孔为B反应孔,第三横排标有字母O,所对应的孔为O反应孔,或者分为三纵排和N横排,其中第一纵排标有字母A,所对应的孔为A反应孔,第二纵排标有字母B,所对应的孔为B反应孔,第三纵排标有字母O,所对应的孔为O反应孔,其中N=1,2,3,4……,反应孔为圆形结构,孔底光滑呈U型,反应孔上设置密封盖,所述A反应孔含有A红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述B反应孔含有B红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述O反应孔含有O红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述基础液配方如下:
超纯水定容至1L。
作为一个优选方案,所述基础液配方如下:
超纯水定容至1L。
作为又一个优选方案,所述试剂盒为干试剂盒,所述红细胞膜抗原金粒子与基础液干燥在反应孔上。
干试剂盒的基础液配方优选如下:
超纯水定容至1L。
即提高蔗糖含量和增加牛血清白蛋白,以改善干燥后的反定型试剂难以复溶和灵敏度低的情况。
干试剂盒的又一个优选基础液配方如下:
超纯水定容至1L。
试剂盒的优选方案中,反应板对产品测试性能有直接影响,如造成假阴、弱阳或假阳等现象,为了筛选到适合ABO血型反定型试剂盒(粒子法)的反应孔,本发明提出了反应孔尺寸的优选方案,所述反应孔的孔径为13mm~10mm,优选为13mm;孔深为1.5mm~3.0mm,优选为1.5mm。
为了解决本发明第二个技术方案,本发明提供了ABO血型反定型胶体金液体试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备胶体金颗粒溶液:氯金酸在还原剂作用下,聚合成大小为40nm~60nm的胶体金颗粒,所述还原剂为枸橼酸钠、白磷、抗坏血酸、鞣酸中的一种或几种;
(2)制备红细胞膜血型抗原提取物:采用低渗压溶液分别破碎A型红细胞、B型红细胞和O型红细胞,离心弃上清,再超纯水洗涤,离心弃上清,直到上清无色透明,弃上清和底层杂质即为红细胞膜血型抗原提取物,即A红细胞膜抗原、B红细胞膜抗原和O红细胞膜抗原,所述低渗压溶液为0.1%的CaCl2溶液;
(3)标记:将步骤(1)获得的胶体金颗粒溶液调节pH至5.5~6.5,加入待标记红细胞膜血型抗原提取物反应;
(4)离心:3000r/min离心,弃上清,沉淀即获得红细胞膜抗原金粒子;
(5)复溶:将步骤(4)获得的红细胞膜抗原金粒子复溶于基础液;
(6)反应板亲水处理:用亲水处理液浸渍反应板,其中亲水处理液配方如下:曲拉通X-100:1.0~5.0g,超纯水定容至1L;
(7)分装:将步骤(5)获得的红细胞膜抗原金粒子溶液分装于对应的A、B、O反应孔中,密闭保存。
本发明亦提供了ABO血型反定型胶体金试剂盒为干试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备胶体金颗粒溶液:氯金酸在还原剂作用下,聚合成大小为40nm~60nm的胶体金颗粒,所述还原剂为枸橼酸钠、白磷、抗坏血酸、鞣酸中的一种或几种;
(2)制备红细胞膜血型抗原提取物:采用低渗压溶液分别破碎A型红细胞、B型红细胞和O型红细胞,离心弃上清,再超纯水洗涤,离心弃上清,直到上清无色透明,弃上清和底层杂质即为红细胞膜血型抗原提取物,即A红细胞膜抗原、B红细胞膜抗原和O红细胞膜抗原,所述低渗压溶液为0.1%的CaCl2溶液;
(3)标记:将步骤(1)获得的胶体金颗粒溶液调节pH至5.5~6.5,加入待标记红细胞膜血型抗原提取物反应;
(4)离心:3000r/min离心,弃上清,沉淀即获得红细胞膜抗原金粒子;
(5)复溶:将步骤(4)获得的红细胞膜抗原金粒子复溶于基础液;
(6)反应板亲水处理:用亲水处理液浸渍反应板,其中亲水处理液配方如下:曲拉通X-100:1.0~5.0g,超纯水定容至1L;
(7)分装:将步骤(5)获得的红细胞膜抗原金粒子溶液分装于对应的A、B、O反应孔中;
(8)干燥保存:将步骤(7)获得的反应板进行干燥处理,所述干燥为冷冻干燥、抽湿机抽干或烘干,将干燥后的包被有红细胞膜抗原金粒子溶液的反应板封装于铝箔袋内保存。
即在液体试剂盒的制备方法中,增加干燥的操作即可以获得干试剂盒。
本发明的优点在于,本发明通过制备红细胞膜血型抗原提取物,然后进行胶体金标记,这样就不用考虑由于红细胞溶血或保存不当而引起的红细胞血型抗原性降低的因素,解决了新鲜红细胞保存期短的问题。试剂盒还可以干试剂盒形态存在,将液体干燥直接包被在反应孔,检测时直接滴加血清或血浆样本即可反应,结果容易观察,有效期长,可以室温保存。ABO血型反定型胶体金试剂一般在2-20℃条件下保存有效期不低于12个月,而且具有灵敏度高、使用方便、结果好判读及成本较低等优点。
附图说明
图1为ABO血型反定型胶体金试剂盒的内部构造,其中1为反应孔,2为反应板。
图2反应孔尺寸筛选结果。
图3为标号方式。
图4为阳性反应图片。
图5为可疑阳性反应图片。
图6为阴性反应图片。
图7为实施例检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.ABO血型反定型胶体金液体试剂盒
ABO血型反定型胶体金试剂盒的内部构造如图1所示,包括反应板2,红细胞膜抗原金粒子与基础液,反应板2上设置3N个反应孔1,分为三横排和N纵排,其中第一横排标有字母A,所对应的孔为A反应孔,第二横排标有字母B,所对应的孔为B反应孔,第三横排标有字母O,所对应的孔为O反应孔,反应孔1为圆形结构,孔底光滑呈U型,反应孔1上设置密封盖,所述A反应孔含有A红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述B反应孔含有B红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述O反应孔含有O红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述基础液配方如下:
超纯水定容至1L。
基础液配方优选如下:
超纯水定容至1L。
反应板2可以是玻璃、塑料及硬纸等材质,优选为PET、PVC或PS塑料材质。
实施例2.ABO血型反定型胶体金干试剂盒
所述试剂盒可以为干试剂盒,即红细胞膜抗原金粒子与基础液干燥在反应孔上。干试剂盒的基础液可以采用和液体试剂盒一样,也可以采用优选方案,即提高蔗糖含量和增加牛血清白蛋白,以改善干燥后的反定型试剂难以复溶和灵敏度低的情况。
干试剂盒的基础液配方中,优选提高蔗糖含量和增加牛血清白蛋白,以改善干燥后的反定型试剂难以复溶和灵敏度低的情况,配方如下:
超纯水定容至1L。
干试剂盒的又一个优选基础液配方如下:
超纯水定容至1L。
实施例3.反应孔尺寸对试剂盒性能的影响
本公司产品ABO血型反定型胶体金试剂盒(粒子法)的测试方法采用微量板法(U型板),反应板对产品测试性能有直接影响,如造成假阴、弱阳或假阳等现象,为了筛选到适合本公司产品ABO血型反定型胶体金试剂盒(粒子法)的反应孔,特进行此试验。
主要材料:
(1)ABS材料的反定型孔板;
(4)振荡器(江苏康健,编号:YH-DFX-003,型号:KJ-201BD);
(5)倍比稀释的抗-A/B血型定型试剂(单克隆抗体);
(6)EDTA·2K抗凝血。
方法步骤:
方法:反定型试剂为ABO血型反定型试剂(粒子法),检测方法均为微孔板振荡法。
步骤:1.在包含有ABO红细胞膜血型抗原粒子的反应孔中加入一定量待测血清或倍比稀释的单克隆抗体,手动使液体完全扩散于反应孔;
2.反应板置于振荡器振荡数分钟,判读结果,记录。
实验结果:
结果好坏的判读指标为凝集颗粒的形态,要求阳性反应的凝集颗粒集中在反应孔中心形成大凝集块,阴性反应的反应孔中无肉眼可见细小凝集颗粒。反应结果如图2,由图2可知A排的标有4、3、2的孔都可行,具体标号见图3,经过大量的临床试验最后确定的优选方案为A排的标有4的反应孔。
用于筛选的反应孔的尺寸如图3所示,同一排的孔的上表面孔径一致,即Da=13mm、Db=12mm、Dc=11mm、Dd=10mm,同一列的孔的深度一致,即d4=1.5mm、d3=2.0mm、d2=2.5mm、d1=3.0mm。因此优选方案A排的标有4的反应孔的孔径为13mm,孔深为1.5mm。
实施例4.ABO血型反定型胶体金液体试剂盒的制备方法
1)制备胶体金溶液
由氯金酸在还原剂枸橼酸钠作用下,聚合成大小为40nm~60nm的金颗粒溶液。
2)制备红细胞膜血型抗原提取物
红细胞膜血型抗原提取物是采用低渗压溶液法,分别破碎A型红细胞、B型红细胞和O型红细胞,然后离心弃上清,再超纯水洗涤,离心弃上清,直到上清无色透明,弃上清和底层杂质即为红细胞膜血型抗原提取物。
低渗溶液为0.1%的CaCl2溶液,不仅可以降低成本,还可以保护膜抗原的完整性,防止膜抗原的不稳定性。
3)标记
将制备好的胶体金颗粒溶液调节pH至5.5,加入待标记红细胞膜血型抗原提取物,反应5分钟。
可以使用NaOH、Na2CO3、KOH或者K2CO3调节pH至5.5。
4)离心
3000r/min离心3分钟,弃上清,沉淀即红细胞膜抗原金粒子。
5)复溶
将红细胞膜抗原金粒子复溶于基础液。
基础液的配方如下:
超纯水定容至1L。
6)反应板亲水处理:用亲水处理液浸渍反应板,其中亲水处理液配方如下:曲拉通X-100:1.0~5.0g,超纯水定容至1L;
7)分装:将步骤(5)获得的红细胞膜抗原金粒子溶液分装于对应的A、B、O反应孔中,每孔10ul,密闭保存。
实施例5.ABO血型反定型胶体金干试剂盒的制备方法
1)制备胶体金溶液
由氯金酸在还原剂枸橼酸钠作用下,聚合成大小为40nm~60nm的金颗粒溶液。
2)制备红细胞膜血型抗原提取物
红细胞膜血型抗原提取物是采用低渗压溶液法,分别破碎A型红细胞、B型红细胞和O型红细胞,然后离心弃上清,再超纯水洗涤,离心弃上清,直到上清无色透明,弃上清和底层杂质即为红细胞膜血型抗原提取物。
低渗溶液为0.1%的CaCl2溶液,不仅可以降低成本,还可以保护膜抗原的完整性,防止膜抗原的不稳定性。
3)标记
将制备好的胶体金颗粒溶液调节pH至5.5,加入待标记红细胞膜血型抗原提取物,反应5分钟。
可以使用NaOH、Na2CO3、KOH或者K2CO3调节pH至5.5。
4)离心
3000r/min离心3分钟,弃上清,沉淀即红细胞膜抗原金粒子。
5)复溶
将红细胞膜抗原金粒子复溶于基础液。
基础液的配方如下:
超纯水定容至1L。
6)反应板亲水处理:用亲水处理液浸渍反应板,浸渍时间为10min,其中亲水处理液配方如下:曲拉通X-100:1.0~5.0g,超纯水定容至1L。
7)分装:将步骤(5)获得的红细胞膜抗原金粒子溶液分装于对应的A、B、O反应孔中,每孔10ul。
8)干燥保存:将步骤(7)获得的反应板进行干燥处理,所述干燥为抽湿机抽干,将干燥后的包被有红细胞膜抗原金粒子溶液的反应板封装于铝箔袋保存。
实施例6.ABO 型反定型胶体金试剂盒的检测结果
1)半成品检验
要求红细胞膜抗原金粒子与相应的血型抗体产生阳性反应,即在反应板微孔中有凝集块出现。而与不含有红细胞膜抗原金粒子对应的血型抗体产生阴性反应,即在反应板微孔中有无凝集块出现。
2)保存实验
分装后经半成品检验合格的液体试剂在2~8℃下或干试剂在2~20℃下保存12个月,保存期间,ABO 血型反定型胶体金试剂具有以下检测结果:
(1)外观
液体试剂密封不漏液、无絮状、不溶物或其它漂浮物质,干试剂盒包装密封不漏气,外观平整,内容物整齐。
(2)灵敏度
用已注册上市的抗A抗B血型正定型试剂和抗H试剂与本试剂相应抗原金粒子溶液反应,结果应达到表1所示标准。
表1ABO血型反定型胶体金试剂灵敏度检测
抗血清 | 待检抗原金粒子 | 凝集3+抗血清最高稀释度 | 凝集1+抗血清最高稀释度 |
抗A | A | ≥8 | ≥64 |
抗B | B | ≥8 | ≥64 |
抗H | O | ≥原液 | ≥2 |
(3)特异性
特异性检测结果应达到表2标准。
表2ABO血型反定型胶体金试剂特异性检测
抗体 | A红细胞膜抗原金粒子 | B红细胞膜抗原金粒子 | O红细胞膜抗原金粒子 |
A型人血清 | - | + | - |
B型人血清 | + | - | - |
O型人血清 | + | + | - |
AB型人血清 | - | - | - |
抗H | / | / | + |
生理氯化钠溶液 | - | - | - |
“/”表示不进行此单项试验;“+”表示出现凝集,为阳性反应;“-”表示未出现凝集,为阴性反应。
(4)精密性
精密性检测要求同一样本重复检测10次,结果一致。
实施例7.ABO血型反定型胶体金试剂盒的使用方法及结果
1.液体试剂盒,试剂使用前必须先摇匀。取出包含有红细胞膜抗原金粒子溶液的反应板,一份标本需要三孔,分别标记为A、B、O。分别加入待检血清或者血浆40ul于标记好的孔内,手动使其在微孔板中完全扩散。
2.干试剂盒的话,取出反应板,一份标本需要三孔。分别加入待检血清或者血浆50ul于标记有A、B、O编号的孔内,手动使其在微孔板中完全扩散。
3.将反应板放置在普通振荡器上80~90rpm振荡6~10分钟。
4.反应结束后,观察反应板,肉眼判读结果,记录。
5.结果判定
5.1阳性结果(4+,3+,2+,1+),见图4。
阳性反应表示反应体系中发生了特异性免疫反应,有特异性抗原抗体复合物产生,反应强度以4+~1+依次减弱,具体如下:
4+为反应板微孔中有一个完整而结实的大凝集块,颜色为深紫,无游离细小凝集块;
3+为反应板微孔中有一个完整而不结实的大凝集块,颜色为紫色,有少量游离细小凝集块;
2+一个完整而不结实的中等凝集块,颜色为浅紫色,有少量游离细小凝集块;
1+为反应板微孔中有一个蓬松的小凝集块,颜色为浅紫色,有少量游离细小凝集块。
5.2可疑阳性反应(±),见图5。
±为反应板微孔中有很多肉眼可见细小凝集块,与阴性结果有差别,需重测或改用其它已注册上市试剂检测该样本。
5.3阴性反应(-),见图6。
阴性反应表示反应体系中未发生了特异性免疫反应,无特异性抗原抗体复合物产生。
6.反应结果对照表如下:
7.实施例结果判读,见图7,结果易于观察保存。
8.注意事项
①血清或血浆不得有凝块、絮状物或沉淀;
②反应板应保持清洁;
③如果出现可疑阳性反应(±),则结果作废,需重测或改用其它已注册上市试剂检测该样本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.ABO血型反定型胶体金试剂盒,其特征在于,包括反应板,红细胞膜抗原金粒子与基础液,反应板上设置3N个反应孔,分为三横排和N纵排,其中第一横排标有字母A,所对应的孔为A反应孔,第二横排标有字母B,所对应的孔为B反应孔,第三横排标有字母O,所对应的孔为O反应孔,或者分为三纵排和N横排,其中第一纵排标有字母A,所对应的孔为A反应孔,第二纵排标有字母B,所对应的孔为B反应孔,第三纵排标有字母O,所对应的孔为O反应孔,其中N=1,2,3,4……,反应孔为圆形结构,孔底光滑呈U型,反应孔上设置密封盖,所述A反应孔含有A红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述B反应孔含有B红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述O反应孔含有O红细胞膜抗原金粒子与基础液,所述基础液配方如下:
超纯水定容至1L。
2.根据权利要求1所述的ABO血型反定型胶体金试剂盒,其特征在于,所述基础液配方如下:
超纯水定容至1L。
3.根据权利要求1所述的ABO血型反定型胶体金试剂盒,其特征在于,所述试剂盒为干试剂盒,所述红细胞膜抗原金粒子与基础液干燥在反应孔上。
4.根据权利要求3所述的ABO血型反定型胶体金试剂盒,其特征在于,所述基础液配方如下:
超纯水定容至1L。
6.根据权利要求1所述的ABO血型反定型胶体金试剂盒,其特征在于,所述反应孔的孔径为13mm~10mm,孔深为1.5mm~3.0mm。
7.根据权利要求1所述的ABO血型反定型胶体金试剂盒,其特征在于,所述反应孔的孔径为13mm,孔深为1.5mm。
8.权利要求1—2任一所述ABO血型反定型胶体金试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备胶体金颗粒溶液:氯金酸在还原剂作用下,聚合成大小为40nm~60nm的胶体金颗粒,所述还原剂为枸橼酸钠、白磷、抗坏血酸、鞣酸中的一种或几种;
(2)制备红细胞膜血型抗原提取物:采用低渗压溶液分别破碎A型红细胞、B型红细胞和O型红细胞,离心弃上清,再超纯水洗涤,离心弃上清,直到上清无色透明,弃上清和底层杂质即为红细胞膜血型抗原提取物,即A红细胞膜抗原、B红细胞膜抗原和O红细胞膜抗原,所述低渗压溶液为0.1%的CaCl2溶液;
(3)标记:将步骤(1)获得的胶体金颗粒溶液调节pH至5.5~6.5,加入待标记红细胞膜血型抗原提取物反应;
(4)离心:3000r/min离心,弃上清,沉淀即获得红细胞膜抗原金粒子;
(5)复溶:将步骤(4)获得的红细胞膜抗原金粒子复溶于基础液;
(6)反应板亲水处理:用亲水处理液浸渍反应板,其中亲水处理液配方如下:曲拉通X-100:1.0~5.0g,超纯水定容至1L;
(7)分装:将步骤(5)获得的红细胞膜抗原金粒子溶液分装于对应的A、B、O反应孔中,密闭保存。
9.权利要求3—5任一所述ABO血型反定型胶体金试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备胶体金颗粒溶液:氯金酸在还原剂作用下,聚合成大小为40nm~60nm的胶体金颗粒,所述还原剂为枸橼酸钠、白磷、抗坏血酸、鞣酸中的一种或几种;
(2)制备红细胞膜血型抗原提取物:采用低渗压溶液分别破碎A型红细胞、B型红细胞和O型红细胞,离心弃上清,再超纯水洗涤,离心弃上清,直到上清无色透明,弃上清和底层杂质即为红细胞膜血型抗原提取物,即A红细胞膜抗原、B红细胞膜抗原和O红细胞膜抗原,所述低渗压溶液为0.1%的CaCl2溶液;
(3)标记:将步骤(1)获得的胶体金颗粒溶液调节pH至5.5~6.5,加入待标记红细胞膜血型抗原提取物反应;
(4)离心:3000r/min离心,弃上清,沉淀即获得红细胞膜抗原金粒子;
(5)复溶:将步骤(4)获得的红细胞膜抗原金粒子复溶于基础液;
(6)反应板亲水处理:用亲水处理液浸渍反应板,其中亲水处理液配方如下:曲拉通X-100:1.0~5.0g,超纯水定容至1L;
(7)分装:将步骤(5)获得的红细胞膜抗原金粒子溶液分装于对应的A、B、O反应孔中;
(8)干燥保存:将步骤(7)获得的反应板进行干燥处理,所述干燥为冷冻干燥、抽湿机抽干或烘干,将干燥后的包被有红细胞膜抗原金粒子溶液的反应板封装于铝箔袋内保存。
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