CN102565409A - 一种苯二氮卓类药物检测试剂盒及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苯二氮卓类药物的检测试剂盒及其制备。本发明的检测试剂盒包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体的玻璃纤维垫片，所述免疫硝酸纤维素膜为设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线上包被有苯二氮卓-牛血清白蛋白复合物，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。本发明还进一步提供了上述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法。采用本发明，可减少单克隆抗体用量，节约生产成本。

Description

一种苯二氮卓类药物检测试剂盒及其制备

技术领域

本发明涉及一种免疫胶体金检测试剂盒，尤其涉及一种苯二氮卓类药物相关的免疫胶体金快速检测试剂盒及其制备。

背景技术

苯二氮卓类药物是临床广泛使用的一类药物，多为1，4-苯并二氮的衍生物，主要包括地西泮(安定)、氟西泮(氟安定)、氯氮、奥沙西泮和三唑仑等，具有镇静催眠、抗焦虑、抗惊厥、肌肉松弛等作用。然而，大剂量使用苯二氮卓类药物会致共济失调，过量急性中毒可致昏迷和呼吸抑制，久服会产生身体和精神依赖性，产生依赖性的风险随剂量的增加及治疗期的延长而增加。一旦出现身体依赖性，立即停药会出现戒断症状，包括头痛、肌肉痛、极度焦虑紧张、烦躁、兴奋和谵妄。严重时会出现失眠、意识障碍、失去理智、听觉过敏、麻木、四肢麻刺感，出现幻觉和癫痫发作。且苯二氮卓类药物与酒精和其他镇静催眠药合用后可导致中毒死亡。

鉴于其严重的危害性，苯二氮卓类药物已被国家列入精神药品进行管理。苯二氮卓类药物最普遍的使用方法为口服形式，其代谢速度快，绝大部分在人体内转变为代谢物随尿液排出体外。然而这些代谢物消除缓慢，清除时间很长，数月或数年使用此药物的个体，即使在停止用药后的几周甚至几个月里都能在尿液中持续检测到苯二氮卓。

目前对苯二氮卓类的检测主要使用薄层色谱扫描、气相和液相色谱分析，这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要进一步的提纯处理才能进行。

对于苯二氮卓类抗体的研究国外在二十世纪八、九十年代有少数的报道，由于苯二氮卓类药物属于小分子物质，要想得到相应的抗体，首先需将其与载体物质相连接，具有免疫原性，才能够利用免疫学技术得到相应的抗体。目前，苯二氮卓类抗体在免疫学方面的应用主要通过酶放大酶免疫实验、荧光偏振免疫测定、放射免疫法等方法。虽然这些检测方法灵敏，但也因所使用的仪器和设备非常昂贵，不易于基层工作的展开。免疫胶体金技术这种检测方法，可直接对血液、尿液、体腔液中的苯二氮卓类药物进行检测，不需要对样品进行处理，且具有快速、易于使用、便于指导临床和侦察的特点。

国内现有的苯二氮卓类药物检测方法的相关专利有：专利号200920165271.7，其提供了一种定量快速检测苯二氮卓类药物的上转磷光检测试剂条，与胶体金方法相比耗时长。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术，如酶放大酶免疫实验、荧光偏振免疫测定、放射免疫法等测定方法检测苯二氮卓类药物速度慢、操作复杂等缺点，提供一种快速、方便、灵敏的不依赖专门设备的苯二氮卓类药物检测试剂盒及其应用。

本发明一方面提供了一种苯二氮卓类药物的检测试剂盒，它包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体的玻璃纤维垫片，所述免疫硝酸纤维素膜为设有检测线(T线)和质控线(C线)的硝酸纤维素膜，所述检测线上包被有苯二氮卓-牛血清白蛋白复合物，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。

进一步的，所述胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体中，胶体金的粒径为39-42nm，纳米金与抗苯二氮卓单克隆抗体的标记比例为2分子纳米金标记1分子抗苯二氮卓单抗。

所述苯二氮卓类药物为1，4-苯并二氮的衍生物，包括但不限于地西泮(安定)、氟西泮(氟安定)、奥沙西泮、阿普唑仑、氯硝西泮、服利宁、氯甲西泮、利眠宁、羟基三唑仑和普拉西泮。

上述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的工作原理，既是利用高度特异的抗体-抗原特异结合反应及免疫膜层析技术，通过免疫竞争抑制法来定性检测人尿液中出现的苯二氮卓类药物。检测时，当尿液从试剂盒加样孔加入，渗透到试剂条的加样垫上，如果尿液中含有苯二氮卓类，它们首先与玻璃纤维片上胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体结合形成苯二氮卓类-抗苯二氮卓单克隆抗体-胶体金复合物，在毛细作用下复合物层析至T线区，当苯二氮卓类浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，它们将占据抗苯二氮卓单克隆抗体上全部的抗原结合位点，阻止了抗苯二氮卓单克隆抗体-胶体金和检测区的苯二氮卓-载体复合物的结合，检测区不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，为阳性结果。如果尿液中没有苯二氮卓类或苯二氮卓类的浓度低于阈值浓度，则抗苯二氮卓单克隆抗体-胶体金随同尿液运行至检测区，检测区捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，为阴性结果。

在试纸条上的质控线(C线)包被有羊抗鼠IgG，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控线的出现与苯二氮卓类或其代谢物的存在无关。质控线色带的出现表明：①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。

本发明的第二方面还提供了上述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤：

1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；

2)采用步骤1制得的胶体金标记抗苯二氮卓单克隆抗体获得免疫胶体金；

3)采用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；

4)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷点苯二氮卓-牛血清白蛋白复合物及羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；

5)将滤样纸、步骤3制备的免疫胶体金纸片、步骤4制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。

步骤1)所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤：

a)第一次还原氯金酸溶液：

制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶(8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，既制得14～16nm粒径的胶体金原溶液。

b)第二次还原氯金酸溶液：

将第一步制得的胶体金原溶液放置于4.0-4.5℃恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1∶(1.9-2.0)加入4.0-4.5℃的0.003-0.004mol/L HAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0-4.5℃的抗坏血酸与PVP(聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为(25-26)∶1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1∶(2.0-2.1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液。

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。

步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.01-0.02mol/L。

步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。

步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/s。

步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为0.017-0.019mol/L，PVP的浓度为0.137-0.139g/L。

步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。

采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。

步骤2)所述胶体金标记抗苯二氮卓单克隆抗体的主要改进在于：将抗苯二氮卓单克隆抗体与胶体金溶液分别采用磷酸盐缓冲液稀释后，按照1分子抗苯二氮卓单克隆抗体标记2分子纳米金的比例进行混合反应制得胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体。这样既减少单克隆抗体用量，节约生产成本，又能提高检测灵敏度。

具体的，步骤2)所述胶体金标记抗苯二氮卓单克隆抗体方法包括下列步骤：

A.将抗苯二氮卓单克隆抗体用0.1M pH7.6的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1.0mg/ml的抗体稀释溶液；

B.将胶体金溶液与0.1M pH7.6磷酸盐缓冲液以体积比10∶1混合，搅拌并将稀释的抗苯二氮卓单克隆抗体溶液加入其中，胶体金溶液与稀释的苯二氮卓单克隆抗体溶液体积比为125∶1，搅拌反应；

C.反应结束后，在上述反应液中快速加入1/50倍反应液总体积的10wt％的牛血清白蛋白溶液，室温搅拌反应；将制备好的免疫胶体金离心收集沉淀，用含有0.1wt％BSA的硼酸缓冲液复溶，制得的纯化免疫胶体金为1分子抗苯二氮卓单克隆抗体标记了2分子纳米金。

具体的，步骤3)免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤：

I.用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金，获得OD₅₄₀值为1.2～2.0的免疫胶体金溶液；

II.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。

较佳的，步骤I所述喷金缓冲液的组分为：8～12v％1.0M Tris液、0.2～0.4w/v％聚乙二醇20000、0.15～0.25w/v％牛血清白蛋白，0.1～0.3w/v％脱脂牛奶、0.25～0.35w/v％酪蛋白，和0.02～0.08w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

最优的，步骤I中喷金缓冲液配方为：10v％1.0M Tris液、0.3w/v％聚乙二醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脱脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

较佳的，步骤II所述预处理液的组分包括：0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。最优的，步骤II中预处理液配方为：0.7％Tween-20，16w/v％蔗糖，余量为水。

较佳的，步骤II中，用预处理液浸泡玻璃纤维纸时，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm；用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸时，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

本发明中，wt％为重量百分比，v％指体积百分比；w/v％指重量体积百分比，1w/v％即为100ml溶液中含1g。

苯二氮卓-牛血清白蛋白可市购或采用常规方法将苯二氮卓类化合物与牛血清白蛋白复合制得。

本发明试剂盒的使用方法为：

将试剂盒放置在水平台面上。

用加样吸管吸取尿样，然后滴3滴(约120ul)尿样到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品注意要使用不同的吸管。

观察结果：在滴加样品后3-8分钟判读结果。

检测结果的判断方法：

阴性：在结果观察窗口内出现两条色带。即检测线(T线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条。表示样品中无苯二氮卓类存在。

阳性：只在结果观察窗口的质控线(C线)位置出现一条红色线条，检测线(T线)未出现任何线条，表示样品中有苯二氮卓类存在。

无效：质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用的两步还原法，使得到的胶体金分子呈大小均一的约40nm球形颗粒，由于胶体金颗粒大小适中、整体均一，使其与单克隆抗体的结合效率更高、效果更稳定，这保证了标记步骤的可控性、降低了试剂盒的批间差异。

(2)本发明在制备苯二氮卓类药物的检测试剂盒时，采用了2分子纳米金标记1分子抗苯二氮卓单抗的免疫胶体金，实验证实将之用于苯二氮卓类药物的检测试剂盒，比之已公开的技术，虽然减少了单克隆抗体用量，但由于1分子抗苯二氮卓单抗标记了更少的纳米金，使得显色反应更为灵敏，从而不仅有效地节约了生产成本，而且还获得了更为灵敏的苯二氮卓类药物的检测试剂盒；

(3)免疫胶体金纸片制备步骤中，通过采用合理配方的预处理液对玻璃纤维膜进行预处理并选配合适的喷金缓冲液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效减慢检测时免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。

(4)本发明制备的苯二氮卓检测试剂盒具有批间差异小，灵敏度高；特异性强，不影响检测结果；临床符合率高；操作简单；检测结果肉眼判断，无需特殊仪器和专业技术人员；检测快速，5-8分钟显示检测结果；而且检测费用低廉，存储和运输方便等优点。

附图说明

图1：胶体金透射电镜图

图2：苯二氮卓类药物的检测试剂盒试剂条示意图

1：滤样纸2：免疫胶体金纸3：免疫硝酸纤维素膜4：吸水纸5：检测线(T线)6：质控线(C线)

图3：苯二氮卓类药物的检测试剂盒示意图

1：加样孔2：判读框

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

实施例1苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备

试剂来源：

抗苯二氮卓单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体、苯二氮卓-牛血清白蛋白复合物(BZ0-BSA)：购自美国美迪生物技术有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)

硝酸纤维素薄膜、玻璃纤维纸：购自德国赛多利斯公司(SARTORIUS)

试剂配制：

0.1M pH7.6的磷酸盐缓冲液：分别称取10.2gNa₂HPO₄，3.4gNaH₂PO₄，加900ml纯化水溶解，用盐酸调节溶液pH值为7.6，用纯化水定容至1000ml。

10％的牛血清白蛋白(BSA)溶液：称取100gBSA用纯化水溶解并定容至1000ml。

0.1％BSA的硼酸缓冲液：称取硼砂9.535g溶解于900ml纯化水中，用盐酸调pH值至8.6±0.05，定容至1000ml，即得0.1M硼酸盐缓冲液。称取1gBSA用0.1M硼酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，即为0.1％BSA的硼酸缓冲液。

制备步骤：

1、胶体金的制备：

a)第一次还原氯金酸溶液：将6ml 0.0164mol/L的HAuCl₄水溶液加入200ml双蒸水中，加热煮沸30分钟，之后缓慢搅动并准确加入50ml 0.016mol/L柠檬酸三钠水溶液。25KHZ超声振荡2分钟后冷却至室温，既制得约15nm粒径的胶体金原溶液。

b)第二次还原氯金酸溶液：取第一步制得的胶体金原核溶液26ml，并放置于4℃水浴锅中稳定温度，随后加入50ml预冷为4.0℃的0.0035mol/L HAuCl₄水溶液并立即缓慢滴加250ml预冷为4.0℃的含0.018mol/L的抗坏血酸与0.138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度为1-2滴/s，搅拌反应1小时，溶液呈透明的酒红色，既制得40nm粒径的胶体金溶液。

制得的胶体金采用紫外分光光度计扫描有单一吸收峰，峰形窄，λmax约为525nm，采用透射电镜观察，如图1所示，粒径范围约为40nm，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。

2、免疫胶体金制备

2.1将抗苯二氮卓单克隆抗体用0.1M pH7.6的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1.0mg/ml的抗体溶液。

2.2取1000ml的胶体金溶液，往里加入1/10倍胶体金体积的0.1M pH7.6磷酸盐缓冲液混合3分钟。在快速搅拌下，再缓缓将稀释的抗苯二氮卓单克隆抗体溶液8ml加入其中。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。

2.3反应结束后，在上述反应液中快速加入20ml的10％的牛血清白蛋白(BSA)溶液。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。

2.4将制备好的免疫胶体金8000转/分钟离心20分钟，保留沉淀，并收集上清12500转/分钟离心30分钟，弃上清。收集两次离心沉淀用含有0.1％BSA的硼酸缓冲液复溶到OD₅₄₀在13-15之间。

2.5制得的纯化免疫胶体金为1分子抗苯二氮卓单克隆抗体标记了2分子纳米金。

3、免疫胶体金纸制备

分别采用方法1、2、3制备。

方法1：

3.1预处理液的制备：准确称取7ml Tween-20，160g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

3.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入100ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取3.0g聚乙二醇20000、2.0g牛血清白蛋白，2.0g脱脂牛奶，

3.0g酪蛋白溶液和0.5g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

3.3用喷金缓冲液稀释步骤2制备的免疫胶体金，至溶液OD₅₄₀值为1.5，获得免疫胶体金溶液。

3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，浸泡30min后，37℃下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

方法2：

3.1预处理液的制备：准确称取5ml Tween-20，180g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

3.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入120ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取2.0g聚乙二醇20000、1.5g牛血清白蛋白，3.0g脱脂牛奶，

2.5g酪蛋白溶液和0.8g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

3.3用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金，至溶液OD₅₄₀值为1.5，获得免疫胶体金溶液。

3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，浸泡25min后，37℃下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

方法3：

3.1预处理液的制备：准确称取8ml Tween-20，120g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

3.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入80ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取4.0g聚乙二醇20000、2.5g牛血清白蛋白，1.0g脱脂牛奶，

3.5g酪蛋白溶液和0.2g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

3.3用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金，至溶液OD₅₄₀值为1.5，获得免疫胶体金溶液。

3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，浸泡30min后，37℃下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

4、免疫硝酸纤维素膜的制备

4.1将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0.5mg/ml，制得质控线(C线)溶液。

4.2将苯二氮卓-BSA复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0.1mg/ml制得检测线(T线)溶液。

4.3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每1m长硝酸纤维素膜各包被有1ml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为5.0mm。

5、将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条(如图2所示)。

6、将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒(如图3所示)。

实施例2苯二氮卓类药物的检测试剂盒的灵敏度实验

检测方法：

1、取实施例1制得的苯二氮卓类药物的检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

2、用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。

3、观察结果：在滴加样品后3-8分钟判读结果。

检测样品：

配置奥沙西泮浓度为150ng/ml、300ng/ml、600ng/ml的质控参考品作为样品，每种试剂盒每个浓度重复6次。

灵敏度试验结果表

ng/ml

奥沙西泮浓度	试剂盒检测结果
		150	阴性
300	阳性
		600	阳性

苯二氮卓类药物的检测灵敏度结果

ng/ml

成分	阈值浓度	成分	阈值浓度
				奥沙西泮	300	服利宁	200
地西泮	150	硝西泮	1000
				阿普唑仑	150	氯硝西泮	1000
羟基三唑仑	1500	氯甲西泮	1000
				普拉西泮	1000	利眠宁	300

结果证实，制得的苯二氮卓类药物的检测试剂盒可用于苯二氮卓类药物，且灵敏度高。

实施例3苯二氮卓类药物的检测试剂盒的特异性实验

采用实施例2的方法，对以下药品进行检测，观察是否发生交叉反应。

交叉试验

检测结果表明：以上药物在浓度等于100μg/ml时，不会对检测结果产生影响。

实施例4苯二氮卓类药物的检测试剂盒的重复性和稳定性实验

一、试剂盒的批内和批间重复性实验

1.实验方法：

将采用实施例1的方法制备的同批和不同批次的苯二氮卓类药物的检测试剂盒分别检测150ng/ml、300ng/ml、600ng/ml标准品(奥沙西泮)，每个浓度重复3次，观察试剂盒的重复性。

2.实验结果：经验证，试剂盒的批内和批间重复性为100％，假阳性率和假阴性率均为0。

二、试剂盒的稳定性实验

1.实验目的：

将苯二氮卓类药物的检测试剂盒密封保存，并存放于室温(25℃左右)下，观察试剂盒的稳定性。

2.实验方法：

保存于室温的试剂盒每周取出4盒，分别检测150ng/ml、300ng/ml、600ng/ml标准品(奥沙西泮)；

3.实验结果：

经验证，试纸盒在室温下可保存18个月，在可保存的期限内，试剂盒均可达到300ng/ml的检测灵敏度。

对比实验1

一、试剂盒的制备：

1.免疫胶体金纸制备：取pH为8.5的0.1M Tris缓冲液稀释实施例1制备的免疫胶体金至溶液OD₅₄₀值为1.5，获得免疫胶体金溶液，采用该免疫胶体金溶液直接喷涂未经预处理液浸泡的玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

2.将滤样纸、本实验制备的免疫胶体金纸片、实施例1制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条。

3.将检测试剂条装入塑料盒内获得检测试剂盒。

二、试剂盒灵敏度检测：

(1)分别取实施例1方法1和本实验制得的检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

(2)配置浓度为250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml的质控参考品(奥沙西泮)作为样品。用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每个浓度设3个重复，每检测一份不同的样品使用不同的吸管。

(3)观察结果：在滴加样品后3-8分钟判读结果。

三.检测结果：

表3不同方法制备的检测试剂盒的灵敏度实验结果

由表3可知，采用同样量的免疫胶体金溶液，本发明实施例1制备的试剂盒的检测灵敏度为300ng/ml，而本次对比试验制备的试剂盒灵敏度为350ng/ml左右，低于实施例1制备的试剂盒。

Claims (10)

1.一种苯二氮卓类药物的检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体的玻璃纤维垫片，所述免疫硝酸纤维素膜为设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线上包被有苯二氮卓-牛血清白蛋白复合物，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。

2.如权利要求1所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体中，胶体金的粒径为39-42nm，纳米金与抗苯二氮卓单克隆抗体的标记比例为2分子纳米金标记1分子抗苯二氮卓单克隆抗体。

3.如权利要求1或2所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤：

1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；

2)采用步骤1制得的胶体金标记抗苯二氮卓单克隆抗体获得免疫胶体金；

3)采用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；

4)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷点苯二氮卓-牛血清白蛋白复合物及羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；

5)将滤样纸、步骤3)制备的免疫胶体金纸片、步骤4)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。

4.如权利要求3所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤1)所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤：

a)第一次还原氯金酸溶液：

制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶(8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，既制得14～16nm粒径的胶体金原溶液；

b)第二次还原氯金酸溶液：

将a)制得的胶体金原溶液放置于4.0-4.5℃恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1∶(1.9-2.0)加入4.0-4.5℃的0.003-0.004mol/L HAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0-4.5℃的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为(25-26)∶1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1∶(2.0-2.1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液；

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。

5.如权利要求4所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.01-0.02mol/L；超声震荡的频率为20-30KHZ。

6.如权利要求4所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为0.017-0.019mol/L，PVP的浓度为0.137-0.139g/L。

7.如权利要求3所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤2)中纳米金与抗苯二氮卓单克隆抗体的标记比例为2分子纳米金标记1分子抗苯二氮卓单克隆抗体。

8.如权利要求3所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤3)免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤：

I.用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金，获得OD₅₄₀值为1.2～2.0的免疫胶体金溶液；

II.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。

9.如权利要求8所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤I所述喷金缓冲液的组分为：8～12v％1.0M Tris液、0.2～0.4w/v％聚乙二醇20000、0.15～0.25w/v％牛血清白蛋白，0.1～0.3w/v％脱脂牛奶、0.25～0.35w/v％酪蛋白，和0.02～0.08w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

10.如权利要求8所述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤II所述预处理液的组分包括：0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。

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