CN102590521B

CN102590521B - 快速检测咖啡因的胶体金检测试剂盒及其制备工艺

Info

Publication number: CN102590521B
Application number: CN201210046239.3A
Authority: CN
Inventors: 张国华
Original assignee: SHANGHAI CHEMTRON BIOTECH CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI CHEMTRON BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2032-02-27
Also published as: CN102590521A

Abstract

本发明提供了一种咖啡因胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗咖啡因-BSA单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区喷点有咖啡因-载体复合物、质控区喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。本发明还进一步提供了上述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，采用本发明可获得一种快速检测人尿液中是否含有咖啡因的试剂盒。

Description

快速检测咖啡因的胶体金检测试剂盒及其制备工艺

技术领域

本发明涉及一种胶体金检测试剂盒及其制备工艺，具体涉及咖啡因检测试剂盒以及制备工艺。

背景技术

咖啡因(Caffeine)，又名三甲基黄嘌呤，是一种黄嘌呤生物碱化合物，一种中枢神经兴奋剂。适度地使用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。

在北美，90％的成年人每天都通过饮用含咖啡因的咖啡、茶、软饮料及能量饮料等形式使用咖啡因，我国的使用量也在逐年增加。但是，大剂量或长期使用咖啡因也会对人体造成损害，特别是其具成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状。虽然成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重，但由于药物的耐受性而导致用药量不断增加时，咖啡因就不仅作用于大脑皮层，还能直接兴奋延髓，引起阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝、胃、肾等重要内脏器官，诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤等疾病，甚至导致吸食者下一代智能低下，肢体畸形。滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。

目前，我国已经把咖啡因列为“精神药品”管制，非法走私、贩卖、运输、制造咖啡因，无论数量多少，均属刑事罪行。因此，咖啡因的实时、快速、准确检测能为公安机关监控、管制咖啡因的非法流通起到良好的辅助作用。当前，咖啡因提取和检测的成熟技术包括有：色谱、色谱/质谱联用、毛细管电泳、分光光度和流动注射等分析方法，这些方法往往存在有机溶剂消耗多，分析时间长，分析成本相对较高等缺点，急需一种简单、快速、无需使用大型设备就可以对咖啡因进行准确检测的方法。国内有关咖啡因快速检测的专利还未见报道，少数国外专利虽有涉及，但仅限普通饮料的非专业咖啡因检测，灵敏度、特异性有限，不能用于咖啡因的专业检测。

发明内容

本发明的目的是弥补该领域的空缺，提供一种方便、快速、灵敏度高的咖啡因胶体金检测试剂盒。

本发明的一方面，提供了一种咖啡因胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗咖啡因-BSA(牛血清白蛋白)单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有咖啡因-载体复合物、质控区(C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。

较佳的，所述胶体金标记的抗咖啡因-BSA单克隆抗体中，胶体金为粒径39-42nm的球形颗粒。

本发明的另一方面，提供了这种咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；

2)采用步骤1制得的胶体金标记抗咖啡因-BSA单克隆抗体获得免疫胶体金；

3)采用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；

4)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷点咖啡因-载体复合物及羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；

5)将滤样纸、步骤3制备的免疫胶体金纸片、步骤4制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。

步骤1)所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤：

a)第一次还原氯金酸溶液：

制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶(8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，既制得14～16nm粒径的胶体金原溶液。

b)第二次还原氯金酸溶液：

将第一步制得的胶体金原溶液放置于4.0-4.5℃恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1∶(1.9-2.0)加入4.0-4.5℃的0.003-0.004mol/L HAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0-4.5℃的抗坏血酸与PVP(聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为(25-26)∶1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1∶(2.0-2.1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液。

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。

步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.01-0.02mol/L。

步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。

步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/s。

步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为0.017-0.019mol/L，PVP的浓度为0.137-0.139g/L。

步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。

采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。

步骤2)所述抗咖啡因-BSA单克隆抗体是以咖啡因-BSA复合物为免疫抗原，利用杂交瘤技术制得抗咖啡因-BSA单克隆抗体。

步骤2)所述胶体金标记抗咖啡因-BSA单克隆抗体可采用常规方法标记。

具体的，步骤3)免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤：

I.用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金，获得OD₅₄₀值为1.0～2.0的免疫胶体金溶液；

II.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。

较佳的，步骤I所述喷金缓冲液的组分为：8～12v％1.0M Tris液、0.2～0.4w/v％聚乙二醇20000、0.15～0.25w/v％牛血清白蛋白，0.1～0.3w/v％脱脂牛奶、0.25～0.35w/v％酪蛋白，和0.02～0.08w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

最优的，步骤I中喷金缓冲液配方为：10v％1.0M Tris液、0.3w/v％聚乙二醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脱脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

较佳的，步骤II所述预处理液的组分包括：0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。最优的，步骤II中预处理液配方为：0.7％Tween-20，16w/v％蔗糖，余量为水。

较佳的，步骤II中，用预处理液浸泡玻璃纤维纸时，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm；用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸时，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

本发明中，wt％为重量百分比，v％指体积百分比；w/v％指重量体积百分比，1w/v％即为100ml溶液中含1g。

所述咖啡因-载体复合物可以为咖啡因-牛血清白蛋白复合物，可市购或采用常规方法将咖啡因与载体复合制得。

上述咖啡因胶体金检测试剂盒的工作原理，即是利用高度特异的抗体-抗原特异结合反应及免疫膜层析技术，通过免疫竞争抑制法来定性检测人尿液中出现的咖啡因。

试剂盒内的检测试剂条是实现咖啡因检测的关键，在试纸条检测区(T线)包被了咖啡因-载体复合物。在试纸条的另一端固定有抗咖啡因-BSA单克隆抗体-胶体金纸片。当尿液从加样孔加入，渗透到试剂条的加样垫上，被检样本首先与玻璃纤维膜上的胶体金标记的抗咖啡因-BSA单克隆抗体结合，并通过毛细作用继续层析至试剂条硝酸纤维素膜，顺序通过硝酸纤维素膜上喷点了咖啡因-载体复合物的检测区和喷点了IgG的质控区。如果尿液中含有咖啡因，它们将与咖啡因-载体复合物竞争胶体金-抗咖啡因-BSA单克隆抗体上有限的抗原结合位点，当咖啡因浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，它们将占据抗咖啡因-BSA单克隆抗体上全部的抗原结合位点，这样就阻止了抗咖啡因-BSA单克隆抗体-胶体金和检测区的咖啡因-复合物结合，检测区不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，检测结果呈阳性。如果尿液中没有咖啡因或咖啡因的浓度低于阈值浓度，则抗咖啡因-BSA单克隆抗体-胶体金随同尿液运行至检测区，检测区捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，检测结果呈阴性。

在试纸条上的质控区(C线)包被有羊抗鼠IgG，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控线的出现与咖啡因的存在无关。质控区色带的出现表明：①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。

本发明试剂盒的使用方法为：

1.将试剂盒放置在水平台面上。

2.用加样吸管吸取尿样，然后滴3滴(约120ul)尿样到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品注意要使用不同的吸管。

3.观察结果：在滴加样品后3-8分钟判读结果。

检测结果的判断方法：

阴性：在结果观察窗口内出现两条色带，即检测线(T线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条，表示样品中无咖啡因存在。

阳性：只在结果观察窗口的质控线(C线)位置出现一条红色线条，检测线(T线)未出现任何线条，表示样品中有咖啡因存在。

无效：质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。

本发明的有益效果：

(1)本发明在制备胶体金检测试剂盒时，采用了两步还原法制备胶体金分子，使得到的胶体金分子呈大小均一的约40nm球形颗粒，比之已公开的技术，虽然增加了一个操作步骤，但由于胶体金颗粒大小适中、整体均一，使其与单克隆抗体的结合效率更高、效果更稳定，这保证了标记步骤的可控性、降低了试剂盒的批间差异。

(2)免疫胶体金纸片制备步骤中，通过采用合理配方的预处理液对玻璃纤维膜进行预处理并选配合适的喷金缓冲液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效减慢检测时免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。

(3)本发明制备的咖啡因检测试剂盒具有：灵敏度高；操作简单；检测结果肉眼可见，无需特殊实验仪器和专业技术人员；检测快速，5-8分钟内可显示检测结果；而且检测结果费用低廉，储存和运输方便等优点。

附图说明

图1：胶体金透射电镜图

图2：咖啡因胶体金检测试剂盒试剂条示意图

1：滤样纸2：免疫胶体金纸3：免疫硝酸纤维素膜4：吸水纸5：检测线(T线)6：质控线(C线)

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的保护范围。

实施例1咖啡因胶体金检测试剂盒的制备

试剂来源：

羊抗鼠IgG多克隆抗体、咖啡因-牛血清白蛋白复合物(KET-BSA)：购自美国美迪生物技术有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)

咖啡因小分子购自中国药品生物制品检定所。

硝酸纤维素薄膜、玻璃纤维纸：购自德国赛多利斯公司(SARTORIUS)

制备步骤：

(1)胶体金的制备：用柠檬酸钠-抗坏血酸两步还原法制备粒径40nm的胶体金

a)第一次还原氯金酸溶液：将6ml 0.0164mol/L的HAuCl₄水溶液加入200ml双蒸水中，加热煮沸30分钟，之后缓慢搅动并准确加入50ml 0.016mol/L柠檬酸三钠水溶液。25KHZ超声振荡2分钟后冷却至室温，既制得约15nm粒径的胶体金原溶液。

b)第二次还原氯金酸溶液：取第一步制得的胶体金原核溶液26ml，并放置于4℃水浴锅中稳定温度，随后加入50ml预冷为4.0℃的0.0035mol/L HAuCl₄水溶液并立即缓慢滴加250ml预冷为4.0℃的含0.018mol/L的抗坏血酸与0.138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度为1-2滴/s，搅拌反应1小时，溶液呈透明的酒红色，既制得40nm粒径的胶体金溶液。

制得的胶体金采用紫外分光光度计扫描有单一吸收峰，峰形窄，λmax约为525nm，采用透射电镜观察，如图1所示，粒径范围约为40nm，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。

(2)利用杂交瘤技术制备抗咖啡因-BSA单克隆抗体；

a)取6周龄BALB/C雌性小鼠进行免疫，首次腹腔注射100μg纯化的咖啡因-BSA复合物，随后每周注射100μg咖啡因-BSA复合物，共注射3次进行免疫。融合前3天用150μg静脉注射加强免疫。

b)取加强免疫的小鼠，拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3-5分钟，取出脾脏，制备高活性的脾细胞悬浮液。

c)将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按1∶5比例充分混合，在37℃水浴条件下利用PEG进行细胞融合，融合细胞转入HAT培养液中，接种96孔培养板继续培养，约80％的孔生长形成克隆，多步筛选获得一株高抗体分泌细胞株，规模化培养后经分离纯化制得抗咖啡因-BSA单克隆抗体。

(3)制备抗咖啡因-BSA(咖啡因-牛血清白蛋白)单克隆抗体-胶体金复合物；

a)将抗咖啡因-BSA单克隆抗体用0.1M PH7.2的磷酸盐缓冲液稀释成1.2mg/ml的单克隆抗体溶液。

b)免疫胶体金溶液的配制：在1000ml的胶体金溶液里加入100ml 0.1M PH7.2的磷酸盐缓冲液混匀。在搅拌下，再缓缓加入1.2mg/ml的单克隆抗体溶液。室温反应10分钟。

c)反应结束后，在上述反应液中加入1/50倍反应液总体积的5％BSA，使反应液中BSA的终浓度为0.1％。室温反应10分钟。

d)浓缩免疫胶体金复合物溶液至体积小于80ml，补充PH7.2，0.01M磷酸盐-0.01％BSA缓冲液至最终体积80ml。

e)将制备好的免疫胶体金8000转/分钟离心20分钟，保留沉淀，并收集上清12500转/分钟离心30分钟，弃上清。收集两次离心沉淀用含有0.1％BSA的硼酸缓冲液复溶到OD₅₄₀在13-15之间。制得的纯化胶体金标记的抗咖啡因单克隆抗体。

(4)免疫胶体金纸制备

分别采用方法1、2、3制备。

方法1：

4.1预处理液的制备：准确称取7ml Tween-20，160g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

4.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入100ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取3.0g聚乙二醇20000、2.0g牛血清白蛋白，2.0g脱脂牛奶，3.0g酪蛋白溶液和0.5g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

4.3用喷金缓冲液稀释步骤3制备的免疫胶体金，至溶液OD₅₄₀值为1.2，获得免疫胶体金溶液。

4.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，浸泡30min后，37℃下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

方法2：

4.1预处理液的制备：准确称取5ml Tween-20，180g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

4.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入120ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取2.0g聚乙二醇20000、1.5g牛血清白蛋白，3.0g脱脂牛奶，2.5g酪蛋白溶液和0.8g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

4.3用喷金缓冲液稀释步骤3)的免疫胶体金，至溶液OD₅₄₀值为1.2，获得免疫胶体金溶液。

4.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，浸泡25min后，37℃下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

方法3：

4.1预处理液的制备：准确称取8ml Tween-20，120g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

4.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入80ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取4.0g聚乙二醇20000、2.5g牛血清白蛋白，1.0g脱脂牛奶，3.5g酪蛋白溶液和0.2g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

(5)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷点咖啡因-BSA复合物及羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；

a)C线溶液的配制：将羊抗鼠IgG原液用0.01M，PH7.2磷酸缓冲液稀释成2.5mg/ml的羊抗鼠IgG抗体溶液。

b)T线溶液的配制：取20ml终浓度为2.0mg/ml的吗啡-BSA单克隆抗体蛋白。

d)在硝酸纤维素膜上喷点C、T线，将喷好的膜放入真空腔中抽真空干燥6小时以上，备用。

(6)将滤样纸、免疫胶体金纸、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为3～5mm的试剂条制得检测试剂条；

(7)将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。

实施例2咖啡因胶体金检测试剂盒的灵敏度实验

检测方法：

1、取实施例1制得的咖啡因胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

2、用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。

3、观察结果：在滴加样品后3-8分钟判读结果。

检测样品：

配置咖啡因浓度为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml的质控参考品作为样品。

检测结果：

咖啡因浓度	试剂盒检测结果
		10ng/ml	阴性
20ng/ml	阴性
		30ng/ml	阳性
40ng/ml	阳性

结果证实，制得的咖啡因胶体金检测试剂盒灵敏度的灵敏度为30ng/ml。

实施例4咖啡因胶体金检测试剂盒的特异性实验

取实例1制得的检测试剂盒，按下述表格分别加样检测，检测结果如下：

单位：ng/ml

样品	浓度1	浓度2	结果
				吗啡	300	3000	阴性
摇头丸	500	50000	阴性
				安非他明	1000	10000	阴性
甲基安非他明	1000	10000	阴性
				可卡因	300	3000	阴性
巴比妥	300	3000	阴性
				苯二氮卓	300	3000	阴性
三环抗抑郁药	1000	10000	阴性
				氯胺酮	1000	10000	阴性

由此可见，该试剂盒与其他常见毒品如吗啡、安非他明、甲基安非他明、冰毒等无交叉反应，特异性好。

实施例5咖啡因胶体金检测试剂盒的重复性和稳定性实验

一、试剂盒的批内和批间重复性实验

1.实验方法：

将采用实施例1的方法制备的同批和不同批次的咖啡因胶体金检测试剂盒分别检测咖啡因浓度为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml的标准品，每个浓度重复3次，观察试剂盒的重复性。

2.实验结果：经验证，试剂盒的批内和批间重复性为100％，假阳性率和假阴性率均为0。

二、试剂盒的稳定性实验

1.实验目的：

将咖啡因胶体金检测试剂盒密封保存，并存放于室温(25℃左右)下，观察试剂盒的稳定性。

1.实验方法：

保存于室温的试剂盒每周取出12人份，分别检测咖啡因浓度为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml的标准品，每个浓度测试3人份；

2.实验结果：

经验证，试纸盒在室温下可保存18个月，在可保存的期限内，试剂盒均可达到30ng/ml的检测灵敏度。

对比实验1

一、试剂盒的制备：

1.免疫胶体金纸制备：取pH为8.5的0.1M Tris缓冲液稀释实施例1制备的免疫胶体金至溶液OD₅₄₀值为1.2，获得免疫胶体金溶液，采用该免疫胶体金溶液直接喷涂未经预处理液浸泡的玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

2.将滤样纸、本实验制备的免疫胶体金纸片、实施例1制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条。

3.将检测试剂条装入塑料盒内获得检测试剂盒。

二、试剂盒灵敏度检测：

(1)分别取实施例1方法1和本实验制得的检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

(2)配置咖啡因浓度为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml的质控参考品作为样品。用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每个浓度设3个重复，每检测一份不同的样品使用不同的吸管。

(3)观察结果：在滴加样品后3-8分钟判读结果。

三.检测结果：

表3不同方法制备的检测试剂盒的灵敏度实验结果

由表3可知，采用同样量的免疫胶体金溶液，本发明实施例1制备的试剂盒在30ng/ml时，为典型阳性，而本次对比试验制备的试剂盒在30ng/ml时，检测线上仍有些微显色，灵敏度低于实施例1制备的试剂盒。

Claims

1.一种咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，所述咖啡因胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗咖啡因-BSA单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区喷点有咖啡因-载体复合物、质控区喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG，所述制备方法包括以下步骤：

1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金，具体包括下列步骤：

a)第一次还原氯金酸溶液：

制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1:(8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14～16nm粒径的胶体金原溶液；

b)第二次还原氯金酸溶液：

将第一步制得的胶体金原溶液放置于4.0-4.5℃恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1：(1.9-2.0)加入4.0-4.5℃的0.003-0.004mol/L HAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0-4.5℃的抗坏血酸与PVP(聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为(25-26):1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1:(2.0-2.1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，即制得39-42nm粒径的胶体金溶液；

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水；

2)采用步骤1)制得的胶体金标记抗咖啡因-BSA单克隆抗体获得免疫胶体金；

5)将滤样纸、步骤3)制备的免疫胶体金纸片、步骤4)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。

2.如权利要求1所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.01-0.02mol/L。

3.如权利要求1所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为0.017-0.019mol/L，PVP的浓度为0.137-0.139g/L。

4.如权利要求1所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤3)免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤：

5.如权利要求4所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤I所述喷金缓冲液的组分为：8～12v％1.0M Tris液、0.2～0.4w/v％聚乙二醇20000、0.15～0.25w/v％牛血清白蛋白，0.1～0.3w/v％脱脂牛奶、0.25～0.35w/v％酪蛋白，和0.02～0.08w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

6.如权利要求4所述咖啡因胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤II所述预处理液的组分包括：0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。

7.一种咖啡因胶体金检测试剂盒，由权利要求1-6任一权利要求所述制备方法制得，所述咖啡因胶体金检测试剂盒包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗咖啡因-BSA单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区喷点有咖啡因-载体复合物、质控区喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。

8.如权利要求7所述咖啡因胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记的抗咖啡因-BSA单克隆抗体中，胶体金为粒径39-42nm的球形颗粒。