CN106771268A

CN106771268A - 一种人abo血型反定型胶体金试纸条及其制备方法和应用

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Publication number: CN106771268A
Application number: CN201710009239.9A
Authority: CN
Inventors: 海洋; 赵洪礼; 康慧颖; 孙雪薇; 魏冉; 杨振; 王昆; 何伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明涉及一种人ABO血型反定型胶体金试纸条及其制备方法和应用。所述的人ABO血型反定型胶体金试纸条，由底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成。将待测样本滴加到加样区，则样品中的A型、B型抗体与试纸条上的胶体金标记的A、B抗原发生特异性结合，在虹吸作用下，复合物沿硝酸纤维素膜向前泳动，当移动至检测区时，被检测区抗体捕获，形成抗体‑抗原‑抗体*胶体金双抗体夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的显色反应。如样品中没有待测抗体，则不发生结合，即不显色。本发明试纸条具有灵敏度高、使用方便、结果客观及成本较低、便于保存和运输等优点。

Description

一种人ABO血型反定型胶体金试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于血型检测领域，具体的涉及一种人ABO血型反定型胶体金试剂条及其制备方法。

背景技术

ABO血型系统是根据红细胞表面有无特异性抗原A和B来划分血液类型系统。其将血型分为O、A、B及AB血型。A型血红细胞上含A抗原，血清中含抗B抗体；B型血红细胞上含B抗原，血清中含抗A抗体；O型血红细胞上则没有A和B抗原，血清中含抗A和抗B抗体；AB型血红细胞上含A和B两种抗原，血清中则不含抗A和抗B抗体。A抗原和抗A抗体，B抗原和抗B抗体会发生免疫结合反应，使红细胞发生凝聚。

ABO血型是由红细胞表面抗原和血清中的抗体两者共同决定的。利用标准的抗A及抗B抗体检测红细胞抗原，称之为正定型；用标准的A及B抗原检测血清中的抗体，称之为反定型。正反定型同时检测，才能正确判断ABO血型。

正确的血型鉴定是保证临床输血安全和抢救生命的重要工作，ABO血型检测是常规的输血前血型血清学检测项目之一，为了保证正确的血型鉴定，卫生部在2000年发文(卫医法[2000]184号)明确规定：每位供血及受血的个体均要进行ABO血型正反定型。

目前临床实验室最常用的ABO血型反定型的鉴定方法是血凝试验和微柱凝胶试验。血凝试验具有技术要求高，主观性强，易出现差错，成本高等缺点，同时，用到的标准A型、B型和O型红细胞保存期短，且容易发生微生物污染及溶血现象。微柱凝胶法检测时则需要特制的凝胶卡，同时需配备专用离心机，检测成本较高。

胶体金技术是二十世纪八十年代后期发展起来的高科技技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

目前，急需一种使用方便、有效期长、准确性好、成本较低的检测ABO血型的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用方便、有效期长、便于保存和运输、准确性好、成本较低的检测ABO血型反定型的胶体金试剂条。

本发明的另一目的是提供一种检测ABO血型反定型的胶体金试剂条的制备方法。

本发明采用的技术方案是：一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，由底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；底板中部铺设一层硝酸纤维素膜，在底板的入样端设有样品垫和胶体金垫，胶体金垫的两端分别与样品垫和硝酸纤维素膜搭接，硝酸纤维素膜的检测区上设有A抗体显色带、B抗体显色带和质控带；底板的出样端设有吸水纸，吸水纸端部与硝酸纤维素膜的端部搭接；所述的胶体金垫是，将胶体金试剂与人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白混合均匀后，吸附在玻璃纤维上制得；所述的A抗体显色带上吸附有人血型抗A抗体；所述的B抗体显色带上吸附有人血型抗B抗体；所述的质控带上设有人血型抗A抗体和人血型抗B抗体双抗体。

上述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，所述的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白是天然提取的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白，或者是基因重组的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。

上述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，所述的基因重组的人血型A抗原蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因重组的人血型B抗原蛋白的DNA序列如SEQIDNO.2所示。

上述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，所述的基因重组的人血型A抗原蛋白和基因重组的人血型B抗原蛋白的制备方法如下：

1)提取人全血中的总DNA；

2)以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，分别得到A抗原

PCR扩增产物或B抗原PCR扩增产物；其中，所述的特异性引物是：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

3)将得到的A抗原PCR扩增产物和B抗原PCR扩增产物分别与质粒pMD18-T进行T克隆，得到重组质粒pMD18-T/A和pMD18-T/B；

4)将重组质粒pMD18-T/A及pMD18-T/B分别和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接，分别制得重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B；

5)将重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分别转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株；

6)将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，经诱导表达，纯化后，得到基因重组的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。

上述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，步骤2)中，

PCR反应体系为：20μL体系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，样品DNA 100～200ng，超纯水余量；

PCR反应程序为：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，进行10个循环；94℃20s，60℃30s，72℃1min，进行25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

上述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，步骤6)中，所述的诱导表达是：将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。

上述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，步骤6)中，所述的纯化是：将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中加入SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，上清液再加入SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得纯化的基因重组的人血型A抗原蛋白和基因重组的人血型B抗原蛋白。

上述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条的制备方法，方法如下：

1)将氯金酸与还原剂枸橼酸钠混合，于沸腾状态下，搅拌30分钟，调节pH为5.5，得胶体金试剂；将胶体金试剂与人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白混合均匀后，吸附在玻璃纤维上，制得胶体金垫，备用；

2)在硝酸纤维素膜的检测区上，将混合均匀的人血型抗A抗体滴加于A抗体显色带上；将混合均匀的人血型抗B抗体滴加于B抗体显色带上；将人血型抗A抗体和人血型抗B抗体双抗体滴加于质控带上；制得硝酸纤维素膜，备用；

3)先在底板上铺设硝酸纤维素膜，然后在样品的入样端，先铺设胶体金垫，胶体金垫的一端与硝酸纤维素膜搭接，另一端搭接样品垫，再将样品垫与底板连接；

4)在样品的出样端，铺设吸水纸，吸水纸的一端与硝酸纤维素膜搭接。

上述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条在反定型检测人ABO血型中的应用。方法如下：将待测血液样品滴加于样品垫上，随着虹吸作用，血液样品向前泳动，与胶体金垫上的人血型A抗原蛋白或人血型B抗原蛋白反应，继续前行，根据在A抗体显色带和/或B抗体显色带上的显色，判断待测血液样品的血型，质控带必须显色，否则检测失效。

本发明的原理是：血清样品中所含的A、B抗体与试纸条上的胶体金标记的抗原发生特异性结合，形成携带胶体金的抗原-抗体*胶体金复合物，在层析作用下，样品中相应的抗原-抗体*胶体金复合物继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，被检测区抗体捕获，可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金双抗体夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的显色反应。如样品中没有待测抗原或抗体，则不发生结合，即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近再固定上针对金标结合物相应的抗体作为质控带，无论样品中有无待测物，质控带应都显示，若无，则检测失败。

本发明的有益效果是：本发明制备的快速检验血型的胶体金试纸条，不仅可检测血液中的抗体，也可检测陈旧血迹、唾液等中的抗体。本发明整个检测过程不超过5分钟，快速准确，灵敏度高，特异性强，不需要其它仪器设备，技术要求低。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2为本发明基因重组的人血型A抗原蛋白基因与人血型B抗原蛋白基因的RT-PCR产物鉴定图。

图3为本发明PMD18-T/A与PMD18-T/B质粒的PCR鉴定图。

图4为本发明PMD18-T/A与PMD18-T/B质粒的酶切图。

图5为本发明pUCm-4T-1/A与pUCm-4T-1/B质粒的PCR鉴定图。

图6为本发明pUCm-4T-1/A和pUCm-4T-1/B质粒的酶切鉴定图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1一种人ABO血型反定型胶体金试纸条

如图1所示，一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，由底板(1)、样品垫(2)、胶体金垫(3)、硝酸纤维素膜(5)和吸水纸(4)组成。

底板(1)中部铺设一层硝酸纤维素膜(5)，硝酸纤维素膜(5)的检测区上设有A抗体显色带(5-1)、B抗体显色带(5-2)和质控带(5-3)。所述的A抗体显色带(5-1)上吸附有人血型抗A抗体；所述的B抗体显色带(5-2)上吸附有人血型抗B抗体；所述的质控带(5-3)上吸附有人血型抗A抗体和人血型抗B抗体双抗体。

在底板(1)的入样端设有样品垫(2)和胶体金垫(3)，胶体金垫(3)的两端分别与样品垫(2)和硝酸纤维素膜(5)搭接。

所述的胶体金垫(3)是，将胶体金试剂与人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白混合均匀后，吸附在玻璃纤维上制得。

所述的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白可以选用天然提取的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。

所述的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白也可以选用基因重组的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。所述的基因重组的人血型A抗原蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因重组的人血型B抗原蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

底板(1)的出样端设有吸水纸(4)，吸水纸(4)端部与硝酸纤维素膜(5)的端部搭接。

实施例2一种人ABO血型反定型胶体金试纸条的制备方法

方法如下：

Trizol plus，PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒，Prime STAR PCR Mix，DL2000Marker、DL5000 Marker，ligation mix连接试剂盒，BamHI、XhoI限制性内切酶，IPTG等试剂购于宝生物工程(大连)有限公司。

质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等购自OMEGA。

(一)基因重组的人血型A抗原蛋白

1.提取人全血中的总DNA

收集4例中国汉族无偿捐血者，根据血库操作规程，采集静脉全血，运用快速盐析法，从全血白膜层抽提基因组DNA，作为DNA模板。

2.PCR扩增

1)引物设计

根据Genbank登录号为AY845133的A抗原全基因序列，设计扩增A抗原基因DNA片段的特异性引物，在上下游引物的末端同时引入BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点，预期的扩增片段长度约为1887bp。经设计扩增A抗原基因的特异性引物如下：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

2)PCR扩增

以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，得到A抗原PCR扩增产物。

PCR反应体系为：20μL体系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，样品DNA 100～200ng，超纯水余量。

3)RT-PCR产物的检测

电泳鉴定扩增片段，于2％琼脂糖凝胶上检测扩增产物，电压为10v/cm，电泳20min左右。使用DNA分子标记DL2000(TAKARA,大连宝生物)标记目的片段长度，结果如图2所示，由图2可见，扩增片段为1887bp，与预期相符。

4)PCR特异片段的回收和纯化

使用MontageTM PCR Centrifugal Filter Devices试剂盒(MILLIPORE公司)对扩增产物回收和纯化。

3.构建重组表达载体

1)进行T克隆，构建重组质粒PMD18-T/A

将鉴定正确的PCR特异片段按DNA胶回收试剂盒说明书纯化回收产物，将胶回收产物末端加A，方法：普通2×Taq酶Mix 2.5μL，胶回收产物7.5μL，混匀，72℃延伸30min，得加A后的目的片段。

加A后的目的片段与载体pMD18-T的连接反应在离心管中进行。连接反应体系为：

混匀后，16℃水浴反应2～4h或者过夜，得连接产物-重组质粒pMD18-T/A。

将5μL重组质粒PMD18-T/A转入DH5a感受态细胞中，缓慢吹打混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴2min，加入445μL LB液体培养基，37℃200～250r/min振荡培养1h，4000r/min离心2min，混匀；将菌液均匀地涂布于含有抗生素的LB琼脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒温箱过夜培养到单个菌落出现；挑菌，37℃300r/min振荡培养过夜。

菌液PCR筛选阳性克隆：以变浑浊的菌液为模板，PCR扩增A基因。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。

重组质粒的酶切鉴定：按照质粒抽提试剂盒(OMEGA)操作步骤进行质粒抽提，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切体系：10×buffer1μl，BamHⅠ0.5μl，XhoⅠ0.5μl，重组质粒8μl。37℃酶切1.5h，酶切产物用1％琼脂糖电泳鉴定，结果如图3和图4所示。

鉴定结果：由图3和图4可见，A基因连接至T-Vector后，经PCR及酶切鉴定后A基因长度为1887bp，得到了预期的条带。

2)构建重组表达载体pUCm-4T-1/A

将重组质粒PMD18-T/A和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接，制得重组表达载体pUCm-4T-1/A。

连接反应体系：目的基因片段5.5μl，表达载体2μl，2×T4DNA Ligase Mix 7.5μl。瞬离，混匀，16℃连接过夜。

重组表达载体pUCm-4T-1/A的转化和鉴定方法与T克隆步骤中的转化和鉴定的方法相同，最后测序确认，结果如图5和图6。

鉴定结果：将A基因克隆至pUCm-4T-1载体，经PCR及酶切鉴定后均得到预期的条带，重组质粒pUCm-4T-1/A中A的长度为1887bp，图5中M：DL2000Marker。pUCm-4T-1/A的BamHⅠ或XhoⅠ酶切产物，图6中M：DL5000Marker。pUCm-4T-1/A测序结果通过NCBI上Blastn同源性比对分析表明，载体中插入的基因片段大小为1887bp，与预期一致，表明重组表达载体构建成功。

4.转化

将重组表达载体pUCm-4T-1/A转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株。

5.诱导表达

将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。

6.纯化

将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，取上清液80ul，加入20ul 5×SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用1ml 8M尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，取80ul上清液加入20ul 5×SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得到基因重组的人血型A抗原蛋白。

产物经大连宝生物检测，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

(二)基因重组的B抗原蛋白

1)提取人血中的总DNA

2)PCR扩增

1、引物设计

根据Genbank登录号为AY845133的B抗原全基因序列，设计扩增B抗原基因DNA片段的特异性引物，在上下游引物的末端同时引入BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点，预期的扩增片段长度约为188bp。经设计扩增B抗原基因的特异性引物如下：

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

2、PCR扩增

以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，得到B抗原PCR扩增产物。

3、RT-PCR产物的检测

4、PCR特异片段的回收和纯化

3)构建重组表达载体

1.进行T克隆，构建重组质粒PMD18-T/B

混匀后，16℃水浴反应2～4h或者过夜，得连接产物-重组质粒PMD18-T/B。

将5μL重组质粒PMD18-T/B转入DH5a感受态细胞中，缓慢吹打混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴2min，加入445μL LB液体培养基，37℃200～250r/min振荡培养1h，4000r/min离心2min，混匀；将菌液均匀地涂布于含有抗生素的LB琼脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒温箱过夜培养到单个菌落出现；挑菌，37℃300r/min振荡培养过夜。

菌液PCR筛选阳性克隆：以变浑浊的菌液为模板，PCR扩增B基因。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。

鉴定结果：由图3和图4可见，B基因连接至T-Vector后，经PCR及酶切鉴定后B基因长度为1887bp，得到了预期的条带。

2.构建重组表达载体pUCm-4T-1/B

将重组质粒PMD18-T/B和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接，制得重组表达载体pUCm-4T-1/B。

重组表达载体pUCm-4T-1/B的转化和鉴定方法与T克隆步骤中的转化和鉴定的方法相同，最后测序确认，结果如图5和图6。

鉴定结果：将B基因克隆至pUCm-4T-1载体，经PCR及酶切鉴定后均得到预期的条带，重组质粒pUCm-4T-1/B中B的长度为1887bp，图5中M：DL2000Marker。pUCm-4T-1/B的BamHⅠ或XhoⅠ酶切产物，图6中M：DL5000Marker。pUCm-4T-1/B测序结果通过NCBI上Blastn同源性比对分析表明，载体中插入的基因片段大小为1887bp，与预期一致，表明重组表达载体构建成功。

4)转化

将重组表达载体pUCm-4T-1/B转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株。

5)诱导表达

将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。

6)纯化

将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，取上清液80ul，加入20ul 5×SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用1ml 8M尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，取80ul上清液加入20ul 5×SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得到基因重组的人血型B抗原蛋白。

产物经大连宝生物检测，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示

(三)制备胶体金垫

将氯金酸与还原剂枸橼酸钠混合，于沸腾状态下，搅拌30分钟，制得粒径大小为40nm～60nm的胶体金颗粒溶液，调节pH至5.5，制得胶体金试剂；然后加入基因重组的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白，于室温下，反应5分钟，3000r/min离心3分钟，弃上清，沉淀即为重组AB抗原金粒子，然后将重组AB抗原金粒子吸附在玻璃纤维上制得胶体金垫，备用；

(四)硝酸纤维素膜

兔抗A、B抗原多克隆抗体的制备

1)人重组A、B抗原经FCA或FIA充分乳化后。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。

2)免疫方法采用背部多点注射法。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可。

在硝酸纤维素膜的检测区上，将混合均匀的人血型抗A抗体滴加于A抗体显色带(5-1)上；将混合均匀的人血型抗B抗体滴加于B抗体显色带(5-2)上；将人血型抗A抗体和人血型抗B抗体双抗体滴加于质控带(5-3)上；制得硝酸纤维素膜，备用；

(五)制备

1)先在底板上铺设硝酸纤维素膜，然后在样品的入样端，先铺设胶体金垫，胶体金垫的一端与硝酸纤维素膜搭接，另一端在搭接样品垫，再将样品垫与底板连接；

2)在样品的出样端，铺设吸水纸，吸水纸的一端与硝酸纤维素膜搭接。

实施例3一种人ABO血型反定型胶体金试纸条的应用

(一)方法如下

采用实施例2制备的人ABO血型反定型胶体金试纸条。

将待检血清样品50ul滴加于样品垫1上，等待3～5分钟，随着毛细作用，血液样品上前移动，与胶体金垫上的人血型A抗原蛋白或人血型B抗原蛋白反应，继续前行，根据在A抗体显色带(5-1)和/或B抗体显色带(5-2)上的显色情况，判断待测血液样品的血型，控制线必须显色，否则检测失效。

(二)结果判定

B抗体显色带显色，则是A型血；A抗体显色带显色，则是B型血；A和B抗体显色带均显色，则是O型血；A和B抗体显色带均不显色，则是AB型血。但上述结果需质控带均显色才为有效结果，否则无效。

(三)检测

1.稳定性：将新制备的ABO反定型免疫胶体金试剂置于37℃保存7d(相当于在2～8℃保存1年)，再测定特异性，外观完好，无非特异性。

2.灵敏度：检测稀释度为0.1μg/L的抗-A、抗-B标准血清，经检测，结果灵敏准确。

3.特异性：记录结果出现的时间、反应5min时判断血型，结果显示，只能与相应的红细胞抗体发生凝集，无非特异性凝集，结果准确率100％。

4.准确性：随机收集已知血型的临床常规标本，进行血型鉴定，计算准确率，达到100％。

5.精密性：精密性检测要求同一样本重复检测10次，结果一致。

<110> 何伟

<120> 一种人ABO血型反定型胶体金试纸条及其制备方法和应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1887

<212> DNA

<213> 基因重组A抗原蛋白

<400> 1

1 ATGGAGCCCC CGGACGCACC GGCCCAGGCG CGCGGGGCCC CGCGGCTGCT GTTGCTCGCA

61 GTCCTGCTGG CGGCGCACCC AGATGCCCAG GCGGAGGTGC GCTTGTCTGT ACCCCCGCTG

121 GTGGAGGTGA TGCGAGGAAA GTCTGTCATT CTGGACTGCA CCCCTACGGG AACCCACGAC

181 CATTATATGC TGGAATGGTT CCTTACCGAC CGCTCGGGAG CTCGCCCCCGCCTAGCCTCG

241 GCTGAGATGC AGGGCTCTGA GCTCCAGGTC ACAATGCACG ACACCCGGGG CCGAAGTCCC

301 CCATACCAGC TGGACTCCCA GGGGCGCCTG GTGCTGGCTG AGGCCCAGGT GGGCGACGAG

361 CGAGACTACG TGTGCGTGGT GAGGGCAGGG GCGGCAGGCA CTGCTGAGGC CACTGCGCGG

421 CTCAACGTGT TTGCAAAGCC AGAGGCCACT GAGGTCTCCC CCAACAAAGG GACACTGTCT

481 GTGATGGAGG ACTCTGCCCA GGAGATCGCC ACCTGCAACA GCGGGAACGG GAACCCGGCC

541 CCCAAGATCA CGTGGTATCG CAACGGGCAG CGCCTGGAGG TGCCCGTAGA GATGAACCCA

601 GAGGGCTACA TGACCAGCCG CACGGTCCGG GAGGCCTCGG GCCTGCTCTC CCTCACCAGC

661 ACCCTCTACC TGCGGCTCCG CAAGGATGAC CGAGACGCCA GCTTCCACTG CGCCGCCCAC

721 TACAGCCTGC CCGAGGGCCG CCACGGCCGC CTGGACAGCC CCACCTTCCA CCTCACCCTG

781 CACTATCCCA CGCAGCACGT GCAGTTCTGGGTGGGCAGCC CGTCCACCCC AGCAGGCTGG

841 GTACGCGAGG GTGACACTGT CCAGCTGCTC TGCCGGGGGG ACGGCAGCCC CAGCCCGGAG

901 TATACGCTTT TCCGCCTTCA GGATGAGCAG GAGGAAGTGC TGAATGTGAA TCTCGAGGGG

961 AACTTGACCC TGGAGGGAGT GACCCGGGGC CAGAGCGGGA CCTATGGCTG CAGAGTGGAG

1021 GATTACGACG CGGCAGATGA CGTGCAGCTC TCCAAGACGC TGGAGCTGCG CGTGGCCTAT

1081 CTGGACCCCC TGGAGCTCAG CGAGGGGAAG GTGCTTTCCT TACCTCTAAA CAGCAGTGCA

1141 GTCGTGAACT GCTCCGTGCA CGGCCTGCCC ACCCCTGCCC TACGCTGGAC CAAGGACTCC

1201 ACTCCCCTGG GCGATGGCCC CATGCTGTCG CTCAGTTCTA TCACCTTCGA TTCCAATGGC

1261 ACCTACGTAT GTGAGGCCTC CCTGCCCACA GTCCCGGTCC TCAGCCGCAC CCAGAACTTC

1321 ACGCTGCTGG TCCAAGGCTC GCCAGAGCTA AAGACAGCGG AAATAGAGCC CAAGGCAGAT

1381 GGCAGCTGGA GGGAAGGAGA CGAAGTCACA CTCATCTGCT CTGCCCGCGG CCATCCAGAC

1441 CCCAAACTCA GCTGGAGCCA ATTGGGGGGC AGCCCCGCAG AGCCAATCCC CGGACGGCAG

1501 GGTTGGGTGA GCAGCTCTCT GACCCTGAAA GTGACCAGCG CCCTGAGCCG CGATGGCATC

1561 TCCTGTGAAG CCTCCAACCC CCACGGGAAC AAGCGCCATG TCTTCCACTT CGGCACCGTG

1621 AGCCCCCAGA CCTCCCAGGC TGGAGTGGCC GTCATGGCCG TGGCCGTCAG CGTGGGCCTC

1681 CTGCTCCTCG TCGTTGCTGT CTTCTACTGC GTGAGACGCA AAGGGGGCCC CTGCTGCCGC

1741 CAGCGGCGGG AGAAGGGGGC TCCGCCGCCA GGGGAGCCAG GGCTGAGCCA CTCGGGGTCG

1801 GAGCAACCAG AGCAGACCGG CCTTCTCATG GGAGGTGCCT CCGGAGGAGC CAGGGGTGGC

1861 AGCGGGGGCTTCGGAGACGA GTGCTGA

<210> 2

<211> 1887

<212> DNA

<213> 基因重组B抗原蛋白

<400> 2

1 ATGGAGCCCC CGGACGCACC GGCCCAGGCG CGCGGGGCCC CGCGGCTGCT GTTGCTCGCA

61 GTCCTGCTGG CGGCGCACCC AGATGCCCAG GCGGAGGTGC GCTTGTCTGT ACCCCCGCTG

121 GTGGAGGTGA TGCGAGGAAA GTCTGTCATT CTGGACTGCA CCCCTACGGG AACCCACGAC

181 CATTATATGC TGGAATGGTT CCTTACCGAC CGCTCGGGAG CTCGCCCCCGCCTAGCCTCG

241 GCTGAGATGC AGGGCTCTGA GCTCCAGGTC ACAATGCACG ACACCCGGGG CCGCAGTCCC

301 CCATACCAGC TGGACTCCCA GGGGCGCCTG GTGCTGGCTG AGGCCCAGGT GGGCGACGAG

361 CGAGACTACG TGTGCGTGGT GAGGGCAGGG GCGGCAGGCA CTGCTGAGGC CACTGCGCGG

421 CTCAACGTGT TTGCAAAGCC AGAGGCCACT GAGGTCTCCC CCAACAAAGG GACACTGTCT

481 GTGATGGAGG ACTCTGCCCA GGAGATCGCC ACCTGCAACA GCCGGAACGG GAACCCGGCC

541 CCCAAGATCA CGTGGTATCG CAACGGGCAG CGCCTGGAGG TGCCCGTAGA GATGAACCCA

601 GAGGGCTACA TGACCAGCCG CACGGTCCGG GAGGCCTCGG GCCTGCTCTC CCTCACCAGC

661 ACCCTCTACC TGCGGCTCCG CAAGGATGAC CGAGACGCCA GCTTCCACTG CGCCGCCCAC

721 TACAGCCTGC CCGAGGGCCG CCACGGCCGC CTGGACAGCC CCACCTTCCA CCTCACCCTG

781 CACTATCCCA CGGAGCACGT GCAGTTCTGG GTGGGCAGCC CGTCCACCCC AGCAGGCTGG

841 GTACGCGAGG GTGACACTGT CCAGCTGCTC TGCCGGGGGG ACGGCAGCCC CAGCCCGGAG

901 TATACGCTTT TCCGCCTTCA GGATGAGCAG GAGGAAGTGC TGAATGTGAA TCTCGAGGGG

961 AACTTGACCC TGGAGGGAGT GACCCGGGGC CAGAGCGGGA CCTATGGCTG CAGAGTGGAG

1021 GATTACGACG CGGCAGATGA CGTGCAGCTC TCCAAGACGC TGGAGCTGCG CGTGGCCTAT

1081 CTGGACCCCC TGGAGCTCAG CGAGGGGAAG GTGCTTTCCT TACCTCTAAA CAGCAGTGCA

1141 GTCGTGAACT GCTCCGTGCA CGGCCTGCCC ACCCCTGCCC TACGCTGGAC CAAGGACTCC

1201 ACTCCCCTGG GCGATGGCCC CATGCTGTCG CTCAGTTCTA TCACCTTCGA TTCCAATGGC

1261 ACCTACGTAT GTGAGGCCTC CCTGCCCACA GTCCCGGTCC TCAGCCGCAC CCAGAACTTC

1321 ACGCTGCTGG TCCAAGGCTC GCCAGAGCTA AAGACAGCGG AAATAGAGCC CAAGGCAGAT

1381 GGCAGCTGGA GGGAAGGAGA CGAAGTCACA CTCATCTGCT CTGCCCGCGG CCATCCAGAC

1441 CCCAAACTCA GCTGGAGCCA ATTGGGGGGC AGCCCCGCAG AGCCAATCCC CGGACGGCAG

1501 GGTTGGGTGA GCAGCTCTCT GACCCTGAAA GTGACCAGCG CCCTGAGCCG CGATGGCATC

1561 TCCTGTGAAG CCTCCAACCC CCACGGGAAC AAGCGCCATG TCTTCCACTT CGGCACCGTG

1621 AGCCCCCAGA CCTCCCAGGC TGGAGTGGCC GTCATGGCCG TGGCCGTCAG CGTGGGCCTC

1681 CTGCTCCTCG TCGTTGCTGT CTTCTACTGC GTGAGACGCA AAGGGGGCCC CTGCTGCCGC

1741 CAGCGGCGGG AGAAGGGGGC TCCGCCGCCA GGGGAGCCAG GGCTGAGCCA CTCGGGGTCG

1801 GAGCAACCAG AGCAGACCGG CCTTCTCATG GGAGGTGCCT CCGGAGGAGC CAGGGGTGGC

1861 AGCGGGGGCTTCGGAGACGA GTGCTGA

Claims

1.一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，其特征在于，由底板(1)、样品垫(2)、胶体金垫(3)、硝酸纤维素膜(5)和吸水纸(4)组成；底板(1)中部铺设一层硝酸纤维素膜(5)，在底板(1)的入样端设有样品垫(2)和胶体金垫(3)，胶体金垫(3)的两端分别与样品垫(2)和硝酸纤维素膜(5)搭接，硝酸纤维素膜(5)的检测区上设有A抗体显色带(5-1)、B抗体显色带(5-2)和质控带(5-3)；底板(1)的出样端设有吸水纸(4)，吸水纸(4)端部与硝酸纤维素膜(5)的端部搭接；所述的胶体金垫(3)是，将胶体金试剂与人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白混合均匀后，吸附在玻璃纤维上制得；所述的A抗体显色带(5-1)上吸附有人血型抗A抗体；所述的B抗体显色带(5-2)上吸附有人血型抗B抗体；所述的质控带(5-3)上吸附有人血型抗A抗体和人血型抗B抗体双抗体。

2.根据权利要求1所述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，其特征在于，所述的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白是天然提取的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白，或者是基因重组的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，其特征在于，所述的基因重组的人血型A抗原蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因重组的人血型B抗原蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，其特征在于，所述的基因重组的人血型A抗原蛋白和基因重组的人血型B抗原蛋白的制备方法如下：

1)提取人全血中的总DNA；

2)以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，分别得到A抗原PCR扩增产物或B抗原PCR扩增产物；其中，所述的特异性引物是：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

4)将重组质粒pMD18-T/A及pMD18-T/B分别和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切，连接，分别制得重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B；

5.根据权利要求4所述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，其特征在于，步骤2)中，

PCR反应体系为：20μL体系：Mg²⁺ 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，样品DNA 100～200ng，超纯水余量；

6.根据权利要求4所述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，其特征在于，步骤6)中，所述的诱导表达是：将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。

7.根据权利要求4所述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条，其特征在于，步骤6)中，所述的纯化是：将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/LpH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中加入SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，上清液再加入SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得纯化的基因重组的人血型A抗原蛋白和基因重组的人血型B抗原蛋白。

8.权利要求1所述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条的制备方法，其特征在于方法如下：

2)在硝酸纤维素膜的检测区上，将混合均匀的人血型抗A抗体滴加于A抗体显色带(5-1)上；将混合均匀的人血型抗B抗体滴加于B抗体显色带(5-2)上；将人血型抗A抗体和人血型抗B抗体双抗体滴加于质控带(5-3)上；制得硝酸纤维素膜，备用；

9.权利要求1所述的一种人ABO血型反定型胶体金试纸条在反定型检测人ABO血型中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于方法如下：将待测血液样品滴加于样品垫(1)上，随着虹吸作用，血液样品向前泳动，与胶体金垫上的人血型A抗原蛋白或人血型B抗原蛋白反应，继续前行，根据在A抗体显色带(5-1)和/或B抗体显色带(5-2)上的显色，判断待测血液样品的血型，质控带必须显色，否则检测失效。