CN102879583A - 一种快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法，包括塑料外壳、底衬和检测模块，其中塑料外壳上有加样孔和观察窗，观察窗上和加样孔上固定有透明的防水薄膜。所述底衬上设置有多个纵向平行排列的凹槽；所述检测模块为多个，其数量与所述底衬凹槽的数量一致，各个检测模块粘接于所述底衬的各个凹槽内。检测模块包括层析膜、结合垫、样品垫、过滤垫和吸水垫。层析膜上设置有测试线和质控线，测试线为包被的TAP多克隆抗体，质控线为包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体。本发明可快速准确地诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的病症，可同时加入多个样品和阴性、阳性对照，具有检测方便快速、灵敏度准确率高、性能稳定、成本低廉的优点。

Description

一种快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床诊断领域，尤其涉及一种快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法

背景技术

胰腺创伤和急性胰腺炎是临床上常见的急危重病，若不及时治疗往往危及患者生命，因此对胰腺创伤和急性胰腺炎的及时诊断对于挽救患者的生命非常重要。

目前胰腺创伤和急性胰腺炎的常规诊断主要是测定腹腔渗出液及血液中的淀粉酶活性，以其活性的急剧升高作为诊断依据，但该方法的准确性欠佳，因为仍然有部分患者测得的淀粉酶活性没有较大的变化。另外还通过APACHE II评分对胰腺创伤和急性胰腺炎进行诊断，但该评分方法过于繁琐，若评分不足则容易导致患者病情延误；若评分过高则容易导致治疗过渡，因此该评分方法也不能满足对胰腺创伤和急性胰腺炎的快速诊断的要求。

近年来，随着研究的深入，发现在急性胰腺炎和胰腺创伤发生时，胰蛋白酶原被激活时产生一个小分子肽，叫做胰蛋白酶原激活肽(TAP)，该分子在腹水、血液以及尿液中含量的升高与急性胰腺炎和胰腺创伤的发生密切相关，通过TAP含量测定不仅可以诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的病情，还可以对患者预后进行有效评估，因此有研究者开始把该分子作为急性胰腺炎和胰腺创伤的特异性诊断物并取得良好的效果。

目前对TAP的检测方法主要是酶联免疫吸附法(ELISA)，但该方法耗时较长(4～5小时)，还需要特定的吸光度检测仪器和专业人员操作，另外价格也较贵，因此不能满足对病情快速诊断的要求，更不适合在基层医疗机构使用。申请人在使用中发现，公开号CN101609093A的发明专利申请在实际使用中存在以下问题，因层析膜、吸水垫、过滤垫均由易吸湿的材料制备，在实际使用中常常因环境湿度较大和存放时间较长而降低材料的性能，继而影响测试卡的测试准确度实验发现使用依照CN101609093A的测试卡测试约100个样品，使用酶联免疫吸附法(ELISA)验证有近15％的假阳性(误差率)，而且使用依照CN101609093A的测试卡不能同时对待测样品作平行和对照测试，降低了测试的准确性。更不能实现对测试样品大致定量的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合现场使用的，检测方便快速、灵敏度和准确度高、性能稳定、成本低廉的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法，该测试卡通过设置多个加样孔，可同时进行待测样品的平行测试和阴性、阳性对照测试，通过设置防水薄膜，以及使用微孔滤膜作为过滤垫，使测试结果更加准确可靠。

本发明所依据的原理是：待检样品中的TAP与结合垫上的胶体金标记的TAP单克隆抗体特异性结合，结合物以及被样品中的水份溶解的胶体金标记的单克隆抗体在层析作用的推动下向试纸另一端移动，当移动至包被TAP多克隆抗体的测试线时，形成双抗体夹心复合物并聚集显色，而游离的胶体金标记的TAP单克隆抗体在移动到质控线时与兔抗小鼠免疫球蛋白抗体捕获并显色以表明测试卡的有效性。

本发明的技术方案为：

一种快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法，包括：

塑料外壳，所述塑料外壳上部设置有加样孔和观察窗，其中所述加样孔的数量为至少三个，所述多个加样孔沿所述塑料外壳宽度的方向等距离分布在所述塑料外壳的一端，所述加样孔和所述观察窗上固定有一层透明的防水薄膜；

底衬，所述底衬以粘接的方式固定于所述塑料外壳内底部；

检测模块，所述检测模块包括层析膜、结合垫、样品垫、过滤垫和吸水垫，所述结合垫、样品垫和过滤垫从下至上依次粘接在所述层析膜上面对应于所述加样孔的一端，其中所述过滤垫位于所述检测模块的最上层，并对应于所述加样孔的位置，所述吸水垫设置于所述层析膜上面的另一端，所述层析膜上设置有测试线和质控线，所述测试线为包被的TAP多克隆抗体，所述质控线为包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体，所述层析膜与底衬粘接在一起。

优选的是，所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述底衬上设置有多个纵向平行排列的凹槽；所述检测模块为多个，其数量与所述底衬的凹槽数量一致，并分别粘贴于所述底衬的各个凹槽内，彼此之间由所述凹槽的侧壁隔开，所述加样孔对应于所述凹槽内检测模块上部的位置。

优选的是，所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述结合垫、样品垫和过滤垫的长度小于所述层析膜的长度，对应于所述塑料外壳上部加样孔的位置，且其边缘不超过所述观察窗的左侧边缘；所述吸水垫的长度小于所述层析膜的长度，且其边缘不超过所述观察窗的右侧边缘。

优选的是，所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述检测模块中的过滤垫为微孔滤膜，滤膜孔径为0.2-0.45μ。

优选的是，所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述吸水垫由至少一层滤纸包被干燥剂而成，呈长方体，其底面与所述层析膜接触。

优选的是，所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述测试线与质控线设置于层析膜上对应于所述观察窗的位置，其中所述测试线数量为三条，每条测试线之间的距离为3-6mm，按照从左到右的顺序三条测试线的TAP多克隆抗体的浓度分别为1-10nmol/L、10-50nmol/L和50-100nmol/L；所述质控线数量为一条，位于所述测试线右侧的位置，所述质控线与最右侧测试线之间的距离为3-8mm。

优选的是，所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡的制备方法中，所述TAP多克隆抗体测试线的制备过程如下

步骤一、合成人源TAP，并以合成的人源TAP作为抗原；

步骤二、制备胶体金溶胶；

步骤三、制备TAP单克隆抗体，

a、采用常规的戊二醛交联法，将人源TAP分别与血蓝蛋白和血清蛋白交联制成TAP-KLL偶联物和TAP-BSA偶联物；

b、用TAP-KLH偶联物免疫Balb/c小鼠；

c、取免疫小鼠脾细胞和商品SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇PEG-4000作用下，按照常规方法进行细胞融合，生成杂交瘤细胞株悬液；

d、采用间接酶联免疫吸附法筛选抗TAP的杂交瘤细胞株；

e、将杂交瘤细胞株接种于用福氏不完全佐剂预处理1周后的Balb/c小鼠腹腔内，收集腹水按照单克隆抗体亚类的不同采用辛酸法或硫酸铵法或聚乙二醇PEG沉淀法纯化腹水即收获TAP单克隆抗体。

步骤四、将TAP单克隆抗体用磷酸盐缓冲液溶解作为母液加入胶体金溶胶，去上清液后用磷酸盐缓冲液复溶即制成胶体金标记的TAP单克隆抗体；

步骤五、将磷酸盐缓冲液制备溶液复溶，复溶后与福氏完全佐剂混合，然后将此混合物在家兔的不同部位进行皮下注射，重复多次后收集家兔血液，去除血凝块后通过离心机收集含多克隆抗体的抗血清，将抗血清纯化后得到TAP多克隆抗体溶液；

步骤六、将TAP多克隆抗体溶液制成不同浓度后包被在层析膜上即成测试线。

优选的是，所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡的制备方法中，所述兔抗小鼠免疫球蛋白抗体质控线的制备过程如下：

步骤一、将Balb/c小鼠的免疫球蛋白作为抗原，对家兔不同部位进行皮下注射，重复多次后收集家兔血液；

步骤二、通过离心机离心收集兔血中的抗血清；

步骤三、将收集到的抗血清进行纯化；

步骤四、将纯化后所得到的溶液包被在层析膜上，即成质控线。

本发明具有以下有益效果：通过在一个测试卡中设置平行的多个加样孔和多条检测模块，可以实现以下功能：(1)加入待检测样品，并加入阴性对照和阳性对照作为对照参考，提高了检测的准确度和灵敏度；(2)可同时加入待检测的多个样品作为平行，提高检测效率，或对同一样品进行多次测试，以提高测试准确度；(3)加入待检测的样品，并同时加入高低TAP含量的标准对照品，观察待检测样品与标准对照品的显色情况，从而判断是低于低标准对照品，介于高低标准对照品之间，或高于高标准对照品，从而对胰腺炎和胰腺创伤的急慢性和轻重度做出大致的判断，为临床诊断确诊提供依据。通过在加样孔和观察窗的位置设置透明的防水薄膜，能防止检测模块受潮造成检测的结果不准确，从而提高了检测卡的性能稳定性；通过在检测模块的样品垫上方设置微孔滤膜作为过滤垫，能够过滤待检测样品中干扰检测反应的一些大分子物质，提高了检测的准确率。本发明利用免疫学中抗原抗体能特异结合的原理，利用成熟的胶体金免疫层析技术，以人源TAP作为抗原，制备检测TAP含量的测试卡，可快速半定量检测病人尿液和腹腔渗出液中的TAP来反映急性胰腺炎和胰腺创伤的病情发展程度，整个测试过程只需10～15分钟，使本发明具有灵敏度与准确度高、特异性强、性能稳定、价格低廉及不需要任何辅助仪器设备等优点，非常适合在基层医疗机构现场使用。测试约100个样品，使用酶联免疫吸附法(ELISA)验证准确率为100％。

附图说明

图1为本发明所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡的结构示意图；

图2为本发明所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡的正面示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。

如图1所示，一种快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法，包括塑料外壳1，所述塑料外壳1上部设置有加样孔10和观察窗9，其中所述加样孔10的数量为多个，包括至少一个待测样品加样孔、一个阴性对照加样孔和一个阳性对照加样孔，可同时加入一个待检测个体的多个样品进行平行测试，并进行阴性和阳性对照测试，增加了检测的准确性，或同时对不同待检测个体的多个样品进行检测，提高了检测的效率，并降低检测成本。所述多个加样孔10沿所述塑料外壳1宽度的方向等距离分布在所述塑料外壳1的一端。所述加样孔10和所述观察窗9上固定有一层透明的防水薄膜，使检测模块与外界隔绝，起到防潮防尘的作用，增加了检测模块的性能稳定性和检测结果的准确率。底衬，所述底衬以粘接的方式固定于所述塑料外壳1内底部；检测模块，所述检测模块包括层析膜2、结合垫5、样品垫4、过滤垫3和吸水垫7，所述结合垫5、样品垫4和过滤垫3从下至上依次粘接在所述层析膜2上面的一端，其中所述过滤垫3位于所述检测模块的最上层，并对应于所述加样孔10的位置，所述吸水垫7粘接在层析膜2上面的另一端，所述层析膜2上设置有测试线8和质控线6，所述测试线8为包被的TAP多克隆抗体，所述质控线6为包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体，所述层析膜2与底衬粘接在一起。所述检测模块中样品垫4、结合垫5和层析膜2的选择材料及处理方法如下：

样品垫4：由玻璃纤维纸制成，用pH 7.0～8.4的PBS浸泡2min后取出，80℃以下烘干或者其它方式干燥。

结合垫5：由玻璃纤维纸制成，用pH 7.0～8.4的PBS浸泡2min后取出，80℃以下烘干，冷却后浸入到10～100nmol/L浓度范围的胶体金标记的TAP单克隆抗体溶液中，10min后取出在室温下干燥。

层析膜2：材料为硝酸纤维素膜(NC膜)，用0.8％(g/ml)的戊二醛溶液浸泡30min，取出，室温下干燥，在上面包被3条不同浓度的TAP多克隆抗体线作为测试线8，同时包被1条兔抗小鼠免疫球蛋白抗体线作为质控线6。

所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述底衬上设置有多个纵向平行排列的凹槽；所述检测模块为多个，其数量与所述底衬的凹槽数量一致，并分别粘贴于所述底衬的各个凹槽内，彼此之间由所述凹槽的侧壁隔开，所述加样孔10对应于所述凹槽内检测模块上部的位置。所述凹槽的侧壁具有一定高度，所述检测模块由所述凹槽的侧壁隔开，彼此之间不相互接触，从而使加入的各个样品不会相互渗透干扰。

所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述结合垫5、样品垫4和过滤垫3的长度小于所述层析膜2的长度，对应于所述塑料外壳1上部加样孔10的位置，且其边缘不超过所述观察窗9的左侧边缘；所述吸水垫7的长度小于所述层析膜2的长度，且其边缘不超过所述观察窗9的右侧边缘，使层析膜2上部相对于观察窗9的位置形成一开放的空间，可以直观地观察检测的结果。

所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述检测模块中的过滤垫3为微孔滤膜，滤膜孔径为0.2-0.45μ。所述微孔滤膜可选混合纤维素微孔滤膜，滤膜孔径为0.2-0.45μ，所述微孔滤膜表面平滑，质地轻薄，孔隙率高，且微孔结构均匀，具有流速快，不易吸附的特点，可以有效过滤待检测样品中的一些能够干扰检测反应的大分子物质

所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡中，所述吸水垫7由至少一层滤纸包被干燥剂而成，呈长方体，其底面与所述层析膜2接触。所述干燥剂可选择硅胶、生石灰粉、氯化镁、活性炭等，因其具有良好的吸水性，一方面能够起到虹吸作用，另一方面能够保持检测模块的干燥，增加检测模块的稳定性。

所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法中，所述测试线8与质控线6设置于层析2上对应于所述观察窗99的位置，其中所述测试线8数量为三条，在3条测试线8上采用喷涂机(市售)包被TAP多克隆抗体，3条测试线8上包被物的浓度依次递增，每条测试线8之间的距离为3-6mm，按照从左到右的顺序三条测试线8的TAP多克隆抗体的浓度分别为1-10nmol/L、10-50nmol/L和50-100nmol/L；所述质控线6数量为一条，位于所述测试线8右侧的位置，质控线6包被范围为1～100nmol/L的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体，所述质控线6与最右侧测试线8之间的距离为3-8mm。当3条测试线8任意一条呈现红色时，表示样品为阳性；当测试线8第1条显色，第2、3条测试线8不显色时，表示待测样品中TAP的含量大于2nmol/L；当第1、2条测试线8显色，第3条测试线8不显色时，表明待测样品中的TAP含量大于25nmol/L；当3条测试线8均显色时，表示待测样品中TAP含量大于90nmol/L；质控线6始终显色，若不显色表明试纸条失效。籍此，加入待检测的样品，并同时加入高低TAP含量的标准对照品，观察待检测样品与标准对照品的显色情况，从而判断是低于低标准对照品，介于高低标准对照品之间，或高于高标准对照品，从而对胰腺炎和胰腺创伤的急慢性和轻重度做出大致的判断，为临床诊断确诊提供依据。

所述TAP多克隆抗体测试线8的制备方法如下：

步骤一、合成人源TAP，并以合成的人源TAP作为抗原；

步骤二、制备胶体金溶胶；

步骤三、制备TAP单克隆抗体；

步骤四、将TAP单克隆抗体用磷酸盐缓冲液溶解作为母液加入胶体金溶胶，去上清液后用磷酸盐缓冲液复溶即制成胶体金标记的TAP单克隆抗体，具体操作为将TAP单克隆抗体用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 7.0～7.5)溶解并稀释至2～4mg/ml，作为母液。每100ml胶体金溶胶加入1～3ml抗体母液，振荡2min，用0.2mol/L的K2CO3调节pH至8.4，振荡5min，加入2ml 11％(g/ml)聚乙二醇PEG-10000(市售)，振荡5min，8000～15000rpm离心15min，除去上清后用磷酸盐缓冲液复溶。在6000～13000rpm离心15min，去上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液稀释后即得胶体金标记的TAP单克隆抗体。

步骤五、将磷酸盐缓冲液制备溶液复溶，复溶后与福氏完全佐剂混合，然后将此混合物在家兔的不同部位进行皮下注射，重复多次后收集家兔血液，去除血凝块后通过离心机收集含多克隆抗体的抗血清，将抗血清纯化后得到TAP多克隆抗体溶液；

步骤六、将TAP多克隆抗体溶液制成不同浓度后包被在层析膜2上即成测试线8。

所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法中，所述TAP单克隆抗体的制备方法如下：

步骤一、采用常规的戊二醛交联法，将TAP与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)交联，具体方法为：将5mg合成的TAP分别加入到7mg的KLH和BSA中，边振荡边缓慢加入1ml新鲜配制的0.3％(g/ml)戊二醛溶液，室温下反应2h，以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜即得。制成的TAP-KLH偶联物和TAP-BSA偶联物分别用于小鼠免疫和单克隆抗体筛选；

步骤二、用TAP-KLH偶联物免疫Balb/c小鼠，用TAP-KLH偶联物免疫6周龄的Balb/C小鼠，首先用300μg的TAP-KLH偶联物与福氏完全佐剂等量混合成的油包水乳化液进行腹腔注射。之后每隔4周，用同样剂量的TAP-KLH偶联物与福氏不完全佐剂等量混合进行腹腔注射。如此共免疫4次，最后1次腹腔和尾静脉各注射TAP-KLH偶联物150μg进行加强免疫，3天后取脾细胞进行细胞融合；

步骤三、取免疫小鼠脾细胞和购买的SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇PEG-4000(市售)作用下，按照常规方法进行细胞融合。用市售的HAT培养基(即含有黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的细胞培养基)进行培养，1周后换用市售采用HT培养基(即含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的细胞培养基)培养；

步骤四、采用间接酶联免疫吸附法筛选分泌抗TAP的单克隆抗体杂交瘤细胞株，具体操作为：将10μg/ml的TAP-BSA偶联物按常规方法包被在市售聚乙烯软板的孔中，采用pH 9.6，0.02mol/L碳酸盐缓冲液为包被缓冲液。在包被好的孔中加入待检样品100μl，37℃孵育1h，洗涤，加羊抗小鼠酶标抗体(市售，工作浓度为1∶1000稀释)100μl，37℃孵育45min，洗涤，加底物3’，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)100μl，37℃孵育15min，加入2mol/L的硫酸100μl终止反应，在波长450nm处比色以筛选分泌TAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用有限稀释法进行克隆化，共进行4次克隆；

步骤五、将杂交瘤细胞悬液接种于预先以福氏不完全佐剂预处理1周后的Balb/C小鼠腹腔内，收集腹水，按照单克隆抗体亚类的不同采用辛酸/硫酸铵法或者聚乙二醇PEG沉淀法纯化腹水即收获TAP单克隆抗体。

所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡及其制备方法中，所述兔抗小鼠免疫球蛋白抗体质控线6的制备方法如下：

步骤一、将Balb/c小鼠的免疫球蛋白作为抗原，对家兔不同部位进行皮下注射，重复多次后收集家兔血液；

步骤二、通过离心机离心收集兔血中的抗血清；

步骤三、将收集到的抗血清进行纯化；

步骤四、将纯化后所得到的溶液包被在层析膜2上，即成质控线6。应用实例

(一)配制不同浓度的样品液进行检测

1、用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 7.0～7.5)配制浓度为1nmol/L的TAP溶液作为待测样品液，取2～3滴直接滴在测试卡的加样孔10上，放置10min后观察，质控线6显色而测试线8无明显色带出现，表明样品中TAP含量低于2nmol/L。

2、用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 7.0～7.5)配制浓度为10nmol/L的TAP溶液作为待测样品液，取2～～3滴直接滴在测试卡的加样孔10上，放置10min后观察，第1条测试线8和质控线6均显色。表明样品中TAP含量在2～25nmol/L之间。

3、用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 7.0～7.5)配制浓度为50nmol/L的TAP溶液作为待测样品液，取2～3滴直接滴在测试卡的加样孔10上，放置10min后观察，第1、2条测试线8和质控线6均显色，表明样品中TAP含量在25～90nmol/L之间。

4、用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 7.0～7.5)配制浓度为100nmol/L的TAP溶液作为待测样品液，取2～3滴直接滴在测试卡的加样孔10上，放置10min后观察，3条测试线8和质控线6均显色，表明样品中TAP大于90nmol/L。

(二)干扰测定

将正常人的尿液以及用pH 7.0～～8.4的PBS配制成浓度为10、50、100nmol/L的人胰蛋白酶、人蛋白酶原-1、人蛋白酶原-2、人血清白蛋白、人免疫球蛋白溶液，用测试卡进行检测，结果均为阴性，表明上述物质均不对测试造成干扰。

(三)病人标本检测

1、尿液标本：取2～3滴病人尿液直接滴在测试卡的加样孔10上，放置10min后观察，若无测试线8显色，表明尿液中的TAP含量低于2nmol/L，诊断为无急性胰腺炎和胰腺创伤发生；若仅第1条测试线8显色，表明尿液中的TAP含量在2～25nmol/L之间，诊断为可能发生急性胰腺炎和胰腺创伤；若仅第1、2条测试线8显色，表明尿液中的TAP含量在25～90nmol/L之间，诊断为极有可能发生急性胰腺炎和胰腺创伤；若3条测试线8均显色，表明尿液中的TAP含量高于90nmol/L，诊断为重症急性胰腺炎和胰腺创伤；若质控线6无显色，表明测试卡失效。

2、腹腔渗出液标本：取2～3滴病人腹腔渗出液直接滴在测试卡的加样孔10上，放置10min后观察，若无测试线8显色，表明腹腔渗出液中的TAP含量低于2nmol/L，诊断为无急性胰腺炎和胰腺创伤发生；若仅第1条测试线8显色，表明腹腔渗出液中的TAP含量在2～25nmol/L之间，诊断为可能发生急性胰腺炎和胰腺创伤；若仅第1、2条测试线8显色，表明腹腔渗出液中的TAP含量在25～90nmol/L之间，诊断为极有可能发生急性胰腺炎和胰腺创伤；若3条测试线8均显色，表明腹腔渗出液中的TAP含量高于90nmol/L，诊断为重症急性胰腺炎和胰腺创伤；若质控线6无显色，表明测试卡失效。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.一种快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡，其特征在于，包括：

塑料外壳，所述塑料外壳上部设置有加样孔和观察窗，其中所述加样孔的数量为至少三个，所述多个加样孔沿所述塑料外壳宽度的方向等距离分布在所述塑料外壳的一端，所述加样孔和所述观察窗上固定有一层透明的防水薄膜；

底衬，所述底衬以粘接的方式固定于所述塑料外壳内底部；

检测模块，所述检测模块包括层析膜、结合垫、样品垫、过滤垫和吸水垫，所述结合垫、样品垫和过滤垫从下至上依次粘接在所述层析膜上面对应于所述加样孔的一端，其中所述过滤垫位于所述检测模块的最上层，并对应于所述加样孔的位置，所述吸水垫设置于所述层析膜上面的另一端，所述层析膜上设置有测试线和质控线，所述测试线为包被的TAP多克隆抗体，所述质控线为包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体，所述层析膜与底衬粘接在一起。

2.如权利要求1所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡，其特征在于，所述底衬上设置有多个纵向平行排列的凹槽；所述检测模块为多个，其数量与所述底衬的凹槽数量一致，并分别粘贴于所述底衬的各个凹槽内，彼此之间由所述凹槽的侧壁隔开，所述加样孔对应于所述凹槽内检测模块上部的位置。

3.如权利要求2所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡，其特征在于，所述结合垫、样品垫和过滤垫的长度小于所述层析膜的长度，对应于所述塑料外壳上部加样孔的位置，且其边缘不超过所述观察窗的左侧边缘；所述吸水垫的长度小于所述层析膜的长度，且其边缘不超过所述观察窗的右侧边缘。

4.如权利要求3所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡，其特征在于，所述检测模块中的过滤垫为微孔滤膜，滤膜孔径为0.2-0.45μ。

5.如权利要求4所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡，其特征在于，所述吸水垫由至少一层滤纸包被干燥剂而成，呈长方体，其底面与所述层析膜接触。

6.如权利要求5所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡，其特征在于，所述测试线与质控线设置于层析膜上对应于所述观察窗的位置，其中所述测试线数量为三条，每条测试线之间的距离为3-6mm，按照从左到右的顺序三条测试线的TAP多克隆抗体的浓度分别为1-10nmol/L、10-50nmol/L和50-100nmol/L；所述质控线数量为一条，位于所述测试线右侧的位置，所述质控线与最右侧测试线之间的距离为3-8mm。

7.如权利要求2或6所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡的制备方法，其中所述TAP多克隆抗体测试线的制备过程如下

步骤一、合成人源TAP，并以合成的人源TAP作为抗原；

步骤二、制备胶体金溶胶；

步骤三、制备TAP单克隆抗体：

a、采用常规的戊二醛交联法，将人源TAP分别与血蓝蛋白和血清蛋白交联制成TAP-KLL偶联物和TAP-BSA偶联物；

b、用TAP-KLH偶联物免疫Balb/c小鼠；

c、取免疫小鼠脾细胞和商品SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇PEG-4000作用下，按照常规方法进行细胞融合，生成杂交瘤细胞株悬液；

d、采用间接酶联免疫吸附法筛选抗TAP的杂交瘤细胞株；

e、将杂交瘤细胞株接种于用福氏不完全佐剂预处理1周后的Balb/c小鼠腹腔内，收集腹水按照单克隆抗体亚类的不同采用辛酸法或硫酸铵法或聚乙二醇PEG沉淀法纯化腹水即收获TAP单克隆抗体。

步骤四、将TAP单克隆抗体用磷酸盐缓冲液溶解作为母液加入胶体金溶胶，去上清液后用磷酸盐缓冲液复溶即制成胶体金标记的TAP单克隆抗体；

步骤五、将磷酸盐缓冲液制备溶液复溶，复溶后与福氏完全佐剂混合，然后将此混合物在家兔的不同部位进行皮下注射，重复多次后收集家兔血液，去除血凝块后通过离心机收集含多克隆抗体的抗血清，将抗血清纯化后得到TAP多克隆抗体溶液；

步骤六、将TAP多克隆抗体溶液制成不同浓度后包被在层析膜上即成测试线。

8.如权利要求2或6所述的快速诊断胰腺创伤和急性胰腺炎的测试卡的制备方法，其中所述兔抗小鼠免疫球蛋白抗体质控线的制备过程如下：

步骤一、将Balb/c小鼠的免疫球蛋白作为抗原，对家兔不同部位进行皮下注射，重复多次后收集家兔血液；

步骤二、通过离心机离心收集兔血中的抗血清；

步骤三、将收集到的抗血清进行纯化；

步骤四、将纯化后所得到的溶液包被在层析膜上，即成质控线。

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