CN107782894A - 避免准确性受测试过程中湿气影响的测试卡及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供避免准确性受测试过程中湿气影响的测试卡及其应用，所述测试卡包括试条及卡盒，所述卡盒设置检查窗口，其中：在所述的检测窗口上方覆盖有用于隔绝环境湿气的防潮薄层；所述防潮薄层为不透光材料或透光材料薄层。所述应用包括利用所述测试卡进行免疫层析，特别是应用于检测指标硝基酪氨酸。本发明所述测试卡可以避免检测过程中受环境湿度影响，提高了测试卡检测结果的稳定性和一致性，同时扩大了测试卡对于环境的适用范围，特别适合高湿度环境下的测量；应用于检测硝基酪氨酸时，可以实现对硝基酪氨酸快速、定量的检测，同时对配套设备要求低，可以大大简化检测过程，具有线性范围宽、准确性高和重复性好等特点。

Description

避免准确性受测试过程中湿气影响的测试卡及其应用

技术领域

本发明涉及避免准确性受测试过程中湿气影响的测试卡及其应用，属于免疫层析领域。

背景技术

免疫层析是80年代初开始兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗原或抗体先固定于硝酸纤维素膜(NC膜)的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端加入样品(如尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗原或抗体的区域时，样品中相应的抗体或抗原即与该抗原或抗体发生特异性结合，从而实现特异性的免疫诊断。常用的免疫层析技术使特定区带显色或带有荧光，再通过颜色深浅或荧光强弱判断待测样品浓度。免疫层析技术的优点在于结构简单，操作简便、快速、结果判读容易(肉眼观测或简单仪器测量)，越来越广泛地应用于临场快检或即时检验(POCT)领域。

目前大部分免疫层析产品主要基于胶体金技术和荧光标记技术，其主要制备工艺是先在硝酸纤维素膜膜上制作检测带(T带)和质控带(C带)，再用显色或发光物质标记可以与待测物质特异性结合的单抗，并固定于单抗垫上，然后与样品垫、吸水纸组装成试条，最后将试条放入卡盒进行组装，形成测试卡。上述测试卡在使用时环境湿度有较严格的要求，一般使用湿度为20％～60％，尽管部分测试卡可以在相对湿度<80％的环境下进行检测，但这类测试卡在原材料选择上相对比较严格，需要挑选湿度稳定性、一致性好的NC膜，不具备普遍性，且对于特殊高湿环境(例如岛礁、热带雨林或其他高湿度封闭环境)适应性差。本领域技术人员长期想获得适用于宽范围及特殊高湿环境的测试卡，但目前国内外还未出现这种明显具有市场优势的测试卡。

另一方面，在检测目标物质的选择上，人们也提出了更多需求。随着现代社会生活节奏的加快，工作压力的增大，个人健康相关的POCT监测越来越受到重视。其中对高压力人群以及特殊工作环境下人群情绪的监测是一项新兴的关注重点，相关检测指标为硝基酪氨酸。

硝基酪氨酸指标与机体的应激反应相关。机体在受到有害刺激时，会产生氧化应激和硝化应激，从而导致蛋白质上酪氨酸的硝基化，生成3-硝基酪氨酸。在生理pH条件下，蛋白质上的硝基酪氨酸会引起周围化学环境改变，导致蛋白质结构发生变化等，最终导致病理损伤。另有研究表明，II型糖尿病患者胰岛分泌胰岛素功能与硝基酪氨酸水平关系密切。蛋白质酪氨酸硝基化不仅会引起胰岛β细胞损伤，还能引起胰岛素空间结构变化而影响其功能。同时，硝基酪氨酸也可以为评价特殊环境工作者机体应激状态提供客观依据。由此可见，对硝基酪氨酸的检测具有重要意义。

目前针对硝基酪氨酸的检测产品种类有限，方法主要基于ELISA试剂盒，由于其原理所限，存在如下明显不足：

(1)检测时间长，检测过程包括包板、孵育、洗涤、显色等一系列过程，全过程所需时间要数小时，不能满足现场检测及快速检测的要求。

(2)所需配套仪器繁琐，检测过程中需要恒温设备、酶标板清洗设备以及荧光读取设备以及相关配套耗材，如酶标板、八连排样品管等，整体设备和耗材消耗量较大。

现有技术针对上述缺点进行改进，尝试用免疫层析平台检验硝基酪氨酸。如CN104198699A公开了一种基于上转换荧光材料的硝基酪氨酸定量试纸条，可以实现对硝基酪氨酸的定量快速检测，但是上述上转换荧光颗粒对于检测设备要求相对较高，需要配套的远红外激发光源，试条的适用性较窄，且该案公布的试条在使用时同样对环境湿度有较严格的要求，在一些特殊环境(如高湿度)下适应性差。

发明内容

为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供避免准确性受测试过程中湿气影响的测试卡及其应用，特别是将该测试卡应用于检测硝基酪氨酸指标。

为实现上述目的，本发明提供避免准确性受测试过程中湿气影响的测试卡，所述测试卡包括试条及卡盒，所述卡盒设置检查窗口，其中：在所述的检测窗口上方覆盖有用于隔绝环境湿气的防潮薄层；所述防潮薄层为不透光材料薄层或透光材料薄层。

根据本发明的具体实施方式，所述不透光材料薄层包括防水织物薄层、防水胶带薄层、塑料片薄层或金属片薄层。

根据本发明的具体实施方式，所述透光材料薄层包括透明塑料片薄层或防水光学薄膜。

根据本发明的具体实施方式，优选地，所述防潮薄膜为防水光学薄膜。所述防水光学薄膜非常薄，透光性好，使检测时激发光和发射光因折射或吸收产生的损失较小；此外，光学膜有一定柔性，与卡盒贴合紧密，密封性好。

根据本发明的具体实施方式，所述不透光材料薄层或所述透光材料薄层一面为带胶面，带胶面直接粘黏在所述检测窗口上方。采用带胶材料的薄层可直接将其粘贴在卡盒上即可，操作简单，而无胶材料需要采取其他方式与卡盒连接。

根据本发明的具体实施方式，所述不透光材料薄层或所述透光材料薄层的厚度为0.1mm～4mm。

根据本发明的具体实施方式，所述测试卡的宽度为3～5cm。

根据本发明的具体实施方式，所述不透光材料薄层或透光材料薄层的形状为矩形(长方形)、圆形、椭圆形、菱形或三角形。优选地，所述不透光材料薄层或透光材料薄层为矩形。更优选地，所述矩形的长×宽为1mm×1mm～50mm×50mm。

本发明未从本领域技术人员易想到的从试条材料的选择等角度出发来解决测试结果的准确性易受测试过程中环境的影响的技术问题，而是另辟途径，采用简单的在检测窗口上方覆盖防潮薄层的技术手段，有效避免了测试卡测试结果的准确性受测试过程中湿气的影响。本发明所述的测试卡，试条位于卡盒内部，与环境只通过进样口连通，形成相对封闭的体系。本发明实验结果表明所述测试卡可应用于湿度高达90％的高湿环境中，与不在所述的检测窗口上方覆盖有用于隔绝环境湿气的防水薄层的测试卡相比，定量测试偏差大大减小，可应用特殊的高湿度环境，例如岛礁、热带雨林或其他高湿度封闭环境。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述测试卡中的试条按照被检样品流动的方向自上游至下游依次包括样品垫、单抗垫、硝酸纤维膜及吸水垫，所述单抗垫中喷涂有被显色或发光物质标记的检测指标的单抗，所述硝酸纤维膜设有检测带及质控带；所述检测带包被有检测指标与载体蛋白连接形成的抗原，所述质控带包被有抗所述检测指标的单抗的二抗。

优选地，所述被显色或发光物质标记的检测指标的单抗为被显色或发光物质标记的硝基酪氨酸的单抗；

所述检测指标与载体蛋白连接形成的抗原为硝基酪氨酸与载体蛋白连接形成的抗原；

所述抗所述检测指标的单抗的二抗为抗所述硝基酪氨酸的单抗的二抗。

使用上述单抗、抗原及二抗形成的试纸可检侧硝基酪氨酸指标。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述被显色或发光物质标记的检测指标的单抗是显色或发光物质与检测指标的单抗通过物理吸附或化学交联进行连接而得到的。优选地，所述显色或发光物质与所述检测指标的单抗的摩尔比为20:1～1:200。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述显色或发光物质包括胶体金、胶体碳、有机荧光染料和荧光微球中的一种或多种。

优选地，所述显色或发光物质为激发波长与发射波长不互相干扰的掺杂无机荧光染料的荧光微球，其可采用紫外光激发，可见光发射，采用化学交联的方法将其与所述检测指标的抗体相连。采用化学交联的掺杂无机荧光染料的荧光微球标记抗体，一方面相较于现有技术胶体金吸附方法的产物更稳定，使得测试结果更加可靠；另一方面，由于所选用的掺杂无机荧光染料的荧光微球激发光强与发射光强不互相干扰，相较于现有技术常用的有机荧光染料(如Cy3/Cy5/FITC/Alex Flour系列染料等)，避免了激发光对发射光的干扰。更重要的是，这种掺杂无机荧光染料的荧光微球可直接使用常规LED光源激发，避免了CN104198699A中需要的特制红外激发光源。

前述掺杂无机荧光染料的荧光微球为现有技术中的荧光微球，示例性的例子包括但不限于掺杂含铕无机荧光染料的荧光微球。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述检测带及质控带是采用划线操作制得的；

用于制作所述检测带的试剂为检测指标与载体蛋白连接形成的抗原的溶液，该抗原的浓度为0.01～10mg/ml；

用于制作所述质控带的试剂为抗所述检测指标的单抗的二抗的溶液，该二抗的浓度为0.01～10mg/ml。

根据本发明的具体实施方式，在本发明所述测试卡中，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)、钙网蛋白(CRT)、人血清白蛋白(HSA)或多聚赖氨酸(PLL)。

本发明可按如下方法制作及应用前述测试卡：以显色或发光物质标记单抗，再将所得标记单抗喷涂于单抗垫上，然后与带有检测带(T带)和质控带(C带)的硝酸纤维素膜(NC膜)、样品垫、吸水垫一起组装成试条并剪切；最后在卡盒的检测窗口区域上覆盖防水薄层，再将剪切好的试条装入卡盒进行组装，得到测试卡。测试卡使用时先带薄层一起加样、层析，检测时可以揭掉薄层后进行检测，或带薄层一起测试。

本发明所述测试卡可以避免检测过程中受环境湿度影响，提高了测试卡检测结果的稳定性和一致性，同时扩大了测试卡对于环境的适用范围，特别适合高湿度环境下的测量。如下所述，当应用于检测硝基酪氨酸时，可以实现对硝基酪氨酸快速、定量的检测，同时对配套设备要求低，可以大大简化检测过程，具有线性范围宽、准确性高和重复性好等特点。

另一方面，本发明提供一种免疫层析的方法，其中，所述方法使用本发明所述的测试卡。

本发明所述免疫层析的方法可用于任何指标的定性或定量检测，该方法均可以避免测试过程中准确性受到湿气的不利影响。

再一方面，本发明提供一种硝基酪氨酸的检测方法，其中，所述检测方法使用本发明所述的测试卡。

优选地，所述检测方法用于定量检测试样中硝基酪氨酸，其包括如下步骤：

(a)在所述测试卡的样品垫上加样并进行层析；

(b)待层析完后，检测检测带以及质控带的荧光强度，并计算检测值，所述检测值为检测带荧光强度绝对值及质控带荧光强度绝对值之和与检测带荧光强度绝对值的比值，并将所得检测值代入标准曲线计算样品的硝基酪氨酸浓度；

当所述防潮薄层为不透光材料时，移去所述防水薄层检测检测带以及质控带的荧光强度；

当所述防潮薄层为透光材料时，带有所述防水薄层直接检测检测带以及质控带的荧光强度；

所述标准曲线为采用浓度范围在100～3000ng/ml的系列浓度的硝基酪氨酸溶液按照步骤(a)及(b)测得系列检测值，并采用所得检测值对浓度进行线性拟合而得。

当所述防潮薄层为透明材料薄层(特别是光学膜一类的透明薄层)，试条在结果判读过程中需要带着薄层一起测试，这类防潮薄层会降低试条的检测信号，实验过程中以荧光免疫层析试条为例，加入这类防潮薄层后，试条的T、C带荧光信号绝对值会降低约20％，这样的结果对于试条来说是不利的，本发明采用光强的比值对检测结果进行计算，首先由T、C带荧光信号绝对值计算出(|T|+|C|)/|T|值，再将(|T|+|C|)/|T|值代入试条的标准曲线，回推出对应样本中的硝基酪氨酸实际浓度。采取比值的形式可以排除因试条荧光强度绝对值波动导致的偏差，提高检测结果一致性。采用本发明的试条不仅可以避免其准确性受测试过程中湿气的影响，还可实现对硝基酪氨酸快速、定量的检测，同时对配套设备要求低，可以大大简化检测过程，具有线性范围宽、准确性高和重复性好等特点。

作为本发明的具体实施方式，本发明用于检测硝基酪氨酸的测试卡的制作及应用包括如下操作步骤：

(1)制备测试卡：以显色或发光物质标记硝基酪氨酸单抗，再将所得标记单抗喷涂于单抗垫上，然后与带有检测带(T带)和质控带(C带)的硝酸纤维素膜(NC膜)、样品垫、吸水垫一起组装成试条并剪切。最后在卡盒的检测窗口区域上覆盖防水薄层，再将剪切好的试条装入卡盒进行组装，得到测试卡。

(2)硝基酪氨酸的定量检测：先带薄层一起加样、层析，检测时可以揭掉薄层后放入仪器进行检测，或带薄层一起放入仪器进行检测。每批次测试卡对应一套标准曲线，通过将检测值代入标准曲线，可以回推出待测样品的硝基酪氨酸浓度。从加样到检测全过程小于10分钟。

测试卡对硝基酪氨酸的检测灵敏度为100ng/ml，线性范围是100～3000ng/ml，检测时间小于10分钟。相比于Abcam公司的硝基酪氨酸ELISA检测试剂盒，本发明在检测时间上大大缩短，检测流程大大简化，且在线性范围内区分度大于上述试剂盒OD值差异，提高了检测准确性。

所述标准曲线为(|T|+|C|)/|T|对浓度的线性拟合方程(T和C分别代表T带和C带荧光强度)，检测值为待测样品的(|T|+|C|)/|T|值。

本领域技术人员应当知晓本发明所述免疫层析的方法不仅可适用于硝基酪氨酸指标的检测，还可适用于其他指标的检测。

综上可知，本发明提供的测试卡及方法可以用于基于免疫层析的定性和定量检测，通过在测试卡卡盒的检测窗口区域加防水的薄层结构，可以避免测试卡受环境湿度影响，提高了测试卡检测结果的稳定性和一致性，同时扩大了测试卡对于环境的适用范围，特别适合高湿度环境下的测量。同时本发明所公开的方法制作简便，易于操作，有利于推广。

特别地，本发明针对现有的硝基酪氨酸检测方法过程繁琐、适用性差等问题，提供了一种采用本发明所述测试卡检测硝基酪氨酸的方法，可以实现对硝基酪氨酸快速、定量的检测，同时对配套设备要求低，可以大大简化检测过程，具有线性范围宽、准确性高和重复性好等特点；且配合测试卡的卡盒封装试条，还能避免环境湿度对检测结果的影响，提高检测结果的准确性。另外所选显色或发光物质对检测设备要求低，适用性强，易于推广。

附图说明

图1为实施例1～4中测试卡示意图，其中上图为俯视图，下图为侧面图；

图2为实施例1～4试条结构示意图；

图3为实施例3第一批硝基酪氨酸测试卡标准曲线；

图4为实施例4第二批硝基酪氨酸测试卡标准曲线；

图中标号具有如下意义：

1：卡盒；2：检测窗口；3：防潮薄层；4：进样口；5：吸水垫；6：NC膜；7：C线；8：T线；9：荧光单抗垫；10：样品垫。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

1)测试卡的制备

取1mg/ml硝基酪氨酸抗原(硝基酪氨酸与BSA载体蛋白连接形成的抗原)的PBS溶液及1mg/ml羊抗小鼠IgG的PBS溶液，通过划线仪在NC膜上制作T线和C线，划线量均为50μl/300mm。划线后NC膜置于37℃烘箱中干燥过夜。

取硝基酪氨酸单抗的PBS溶液30μl，及具有紫外激发可见发射性能的掺杂含铕无机荧光染料的荧光微球溶液50μl，混合均匀后加入NHS/EDC混合液，NHS终浓度为5mM，EDC终浓度为20mM，荧光微球与单抗摩尔比为1:100，室温反应1小时后10000rpm离心15分钟×3次，沉淀用PBS溶液复溶至单抗浓度为0.5mg/ml。将所得荧光标记单抗通过喷金仪在单抗垫上喷涂，喷液量为100μl/300mm。喷液后将单抗垫置于干燥柜中干燥4小时。

取出上述NC膜、单抗垫加吸水垫和样品垫组装成试条，通过切条机制作成宽度为4mm的试条，加干燥剂分装待用。

取塑料卡盒，先在卡盒的检测窗口部分人工粘贴透明胶带，再将上述剪切好的试条放入卡盒进行组装，得到测试用的测试卡。

所得测试卡的示意图如图1所示，其中上图为俯视图，下图为侧面图；从图1中可以看出，所述测试卡包括试条及卡盒1，所述卡盒设置检测窗口2，在所述的检测窗口2上方覆盖有用于隔绝环境湿气的防潮薄层3；本实施例为透明胶带，厚度为0.1～0.3mm，形状为长方形，该形状的大小为13mm×40mm，卡盒上还设有进样口4。所得试条的结构示意图如图2所示，从图2中可以看出，按样品流动的方向，自上游至下游依次包括样品垫10、荧光单抗垫9、NC膜6、吸水垫5，NC膜上设有C线7及T线8。

2)测试卡的检测

取分别含有硝基酪氨酸500、1000、2000ng/ml的质控液(人工尿液)，从卡盒的加样口加入，每张测试卡滴加75μl，静置9分钟后揭掉检测窗口上的透明胶带，将试条放入测试仪，通过365nm LED光源激发荧光染料，在610nm处接收发射光，分别检测T线和C线荧光强度。每个浓度测试3张试条，统计(|T|+|C|)/|T|值的平均值，对质控液浓度作图并线性拟合，得到标准曲线，再通过标准曲线回推出每个质控液的回推浓度，并计算平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。分别在相对湿度50％、60％、70％、80％和90％的环境下重复上述过程，均以50％相对湿度下所得标准曲线回推其他湿度下的检测结果，对比湿度对检测结果的影响。

同时准备无薄层结构的卡盒对同一批剪切好的试条进行组装和测试，测试过程同上所述，对比有无薄层的差异。

3)测试结果

检测结果如表1所示：

表1不同湿度下有无防水薄层的测试卡(|T|+|C|)/|T|及与50％相对湿度下的偏差

由表1可见，以50％相对湿度下的标准曲线回推，有透明胶带的试条在不同湿度下的回推浓度偏差不超过13％；而无透明胶带的试条在不同湿度下的回推浓度偏差接近40％，且湿度越大，回推浓度越低。上述结果说明在卡盒检测窗口上覆盖防水薄层后，可以有效隔绝试条与环境中的水汽，使测试卡在高湿度环境下保持检测结果准确。

实施例2

1)测试卡的制备

取0.1mg/ml硝基酪氨酸抗原(硝基酪氨酸与BSA载体蛋白连接形成的抗原)的PBS溶液及0.1mg/ml羊抗小鼠IgG的PBS溶液，通过划线仪在NC膜上制作T线和C线，划线量均为50μl/300mm。划线后NC膜置于37℃烘箱中干燥过夜。

取硝基酪氨酸单抗的PBS溶液30μl，及具有紫外激发可见发射性能的掺杂含铕无机荧光染料的荧光微球溶液50μl，混合均匀后加入NHS/EDC混合液，NHS终浓度为5mM，EDC终浓度为20mM，荧光微球与单抗摩尔比为1:1，室温反应1小时后10000rpm离心15分钟×3次，沉淀用PBS溶液复溶至单抗浓度为1mg/ml。将所得荧光标记单抗通过喷金仪在单抗垫上喷涂，喷液量为100μl/300mm。喷液后将单抗垫置于干燥柜中干燥4小时。

取出上述NC膜、单抗垫加吸水垫和样品垫组装成试条，通过切条机制作成宽度为4mm的试条，加干燥剂分装待用。

取塑料卡盒，先在卡盒的检测窗口部分人工粘贴带有压敏胶的光学薄膜，再将上述剪切好的试条放入卡盒进行组装，得到测试用的测试卡。本实施例测试卡的防潮薄层为带有压敏胶的光学薄膜，厚度为0.1～0.3mm，形状为长方形，该形状的大小为13mm×40mm，结构示意图如图1及图2所示。

2)测试卡的检测

取分别含有硝基酪氨酸500、1000、2000ng/mL的质控液(人工尿液)，从卡盒的加样口加入，每张测试卡滴加75μL，静置9分钟后不揭掉检测窗口上的光学膜，将试条放入测试仪，通过365nm LED光源激发荧光染料，在610nm处接收发射光，分别检测T线和C线荧光强度。每个浓度测试3张试条，统计(|T|+|C|)/|T|值的平均值，对质控液浓度作图并线性拟合，得到标准曲线，再通过标准曲线回推出每个质控液的回推浓度，并计算平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。分别在相对湿度20％、40％、60％和80％环境下重复上述过程，均以20％相对湿度下所得标准曲线回推其他湿度下的检测结果，对比湿度对检测结果的影响。

3)测试结果

测试结果如表2所示，其为以20％相对湿度下的标准曲线回推，带有光学薄膜的试条在不同湿度下的回推浓度偏差<15％。

表2不同湿度下有光学膜的测试卡检测结果

实施例3

1)测试卡的制备

取0.5mg/ml硝基酪氨酸抗原(硝基酪氨酸与BSA载体蛋白连接形成的抗原)的PBS溶液及0.5mg/ml羊抗小鼠IgG的PBS溶液，通过划线仪在NC膜上制作T线和C线，划线量均为50μl/300mm。划线后NC膜置于37℃烘箱中干燥过夜。

取硝基酪氨酸单抗的PBS溶液30μl，及具有紫外激发可见发射性能的掺杂含铕无机荧光染料的荧光微球溶液50μl，混合均匀后加入NHS/EDC混合液，NHS终浓度为5mM，EDC终浓度为20mM，荧光微球与单抗摩尔比为1:200，室温反应1小时后10000rpm离心15分钟×3次，沉淀用PBS溶液复溶至单抗浓度为0.25mg/ml。将所得荧光标记单抗通过喷金仪在单抗垫上喷涂，喷液量为100μl/300mm。喷液后将单抗垫置于干燥柜中干燥4小时。

取出上述NC膜、单抗垫加吸水垫和样品垫组装成试条，通过切条机制作成宽度为4mm的试条，加干燥剂分装待用。

取带有防水薄层的塑料卡盒，其中防水层为透明胶带，再将上述剪切好的试条放入卡盒进行组装，得到测试用的测试卡。本实施例测试卡的防潮薄层为透明胶带，厚度为0.1～0.3mm，形状为长方形，该形状的大小为13mm×40mm，结构示意图如图1及图2所示。

2)测试卡的检测

在相对湿度为50％的条件下，取分别含有硝基酪氨酸0、100、500、1000、1500、2000ng/mL的质控液(人工尿液)，从卡盒的加样口加入，每张测试卡滴加75μL，静置9分钟后揭掉检测窗口上的透明胶带，将试条放入测试仪，通过365nm LED光源激发荧光染料，在610nm处接收发射光，分别检测T线和C线荧光强度。每个浓度测试3张试条，统计(|T|+|C|)/|T|值的平均值，对质控液浓度作图并线性拟合，得到标准曲线，再通过标准曲线回推出每个质控液的回推浓度，并计算平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。用2SD评价测试卡的检测灵敏度，用标准曲线的线性系数R²评价测试卡的线性范围。

3)测试结果

检测结果如表3所示，标准曲线如图3所示。

表3不同浓度硝基酪氨酸检测结果

由表3可见，用上述硝基酪氨酸测试卡可以实现对质控液中的硝基酪氨酸定量测试，且回推浓度准确，低浓度样品SD<50ng/ml，高浓度(≥500ng/ml)样品CV<15％用2SD衡量，检测灵敏度可达到100ng/ml，且标准曲线线性系数R²＝0.9992，线性非常好。

实施例4

1)测试卡的制备

取0.2mg/ml硝基酪氨酸抗原(硝基酪氨酸与BSA载体蛋白连接形成的抗原)的PBS溶液及0.2mg/ml羊抗小鼠IgG的PBS溶液，通过划线仪在NC膜上制作T线和C线，划线量均为50μl/300mm。划线后NC膜置于37℃烘箱中干燥过夜。

取硝基酪氨酸单抗的PBS溶液30μl，及具有紫外激发可见发射性能的掺杂含铕无机荧光染料的荧光微球溶液50μl，混合均匀后加入NHS/EDC混合液，NHS终浓度为5mM，EDC终浓度为20mM，荧光微球与单抗摩尔比为10:1，室温反应1小时后10000rpm离心15分钟×3次，沉淀用PBS溶液复溶至单抗浓度为0.1mg/ml。将所得荧光标记单抗通过喷金仪在单抗垫上喷涂，喷液量为100μl/300mm。喷液后将单抗垫置于干燥柜中干燥4小时。

取出上述NC膜、单抗垫加吸水垫和样品垫组装成试条，通过切条机制作成宽度为4mm的试条，加干燥剂分装待用。

取塑料卡盒，先在卡盒的检测窗口部分人工粘贴带有压敏胶的光学薄膜，再将上述剪切好的试条放入卡盒进行组装，得到测试用的测试卡。本实施例测试卡的防潮薄层为带有压敏胶的光学薄膜，厚度为0.1～0.3mm，形状为长方形，该形状的大小为13mm×40mm，结构示意图如图1及图2所示。

2)测试卡的检测

在相对湿度为50％的条件下，取分别含有硝基酪氨酸0、100、500、1000、1500、2000ng/mL的质控液(人工尿液)，从卡盒的加样口加入，每张测试卡滴加75μL，静置9分钟后不揭掉检测窗口上的光学膜，将试条放入测试仪，通过365nm LED光源激发荧光染料，在610nm处接收发射光，分别检测T线和C线荧光强度。每个浓度测试3张试条，统计(|T|+|C|)/|T|值的平均值，对质控液浓度作图并线性拟合，得到标准曲线，再通过标准曲线回推出每个质控液的回推浓度，并计算平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。用2SD评价测试卡的检测灵敏度，用标准曲线的线性系数R²评价测试卡的线性范围。

3)测试结果

测试结果如表4所示，标准曲线如图4所示。

表4不同浓度硝基酪氨酸检测结果

由表4可见，用上述硝基酪氨酸测试卡可以实现对质控液中的硝基酪氨酸定量测试，且回推浓度准确，低浓度样品SD<50ng/ml，高浓度(≥500ng/ml)样品CV<15％。用2SD衡量，检测灵敏度可达到100ng/ml，且标准曲线线性系数R²＝0.9963，线性非常好。

最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.避免准确性受测试过程中湿气影响的测试卡，所述测试卡包括试条及卡盒，所述卡盒设置检测窗口，其中：在所述的检测窗口上方覆盖有用于隔绝环境湿气的防潮薄层；所述防潮薄层为不透光材料薄层或透光材料薄层。

2.根据权利要求1所述的测试卡，其中：所述不透光材料薄层包括防水织物薄层、防水胶带薄层、塑料片薄层或金属片薄层；

所述透光材料薄层包括透明塑料片薄层或防水光学薄膜；

优选地，所述防潮薄层为防水光学薄膜。

3.根据权利要求1或2所述的测试卡，其中，所述不透光材料薄层或所述透光材料薄层一面为带胶面，带胶面直接粘黏在所述检测窗口上方。

4.根据权利要求1所述的测试卡，其中，所述测试卡中的试条按照被检样品流动的方向自上游至下游依次包括样品垫、单抗垫、硝酸纤维膜及吸水垫，所述单抗垫中喷涂有被显色或发光物质标记的检测指标的单抗，所述硝酸纤维膜设有检测带及质控带；所述检测带包被有检测指标与载体蛋白连接形成的抗原，所述质控带包被有抗所述检测指标的单抗的二抗；

优选地，所述被显色或发光物质标记的检测指标的单抗为被显色或发光物质标记的硝基酪氨酸的单抗；

所述检测指标与载体蛋白连接形成的抗原为硝基酪氨酸与载体蛋白连接形成的抗原；

所述抗所述检测指标的单抗的二抗为抗所述硝基酪氨酸的单抗的二抗。

5.根据权利要求4所述的测试卡，其中，所述被显色或发光物质标记的检测指标的单抗是显色或发光物质与检测指标的单抗通过物理吸附或化学交联进行连接而得到的；

优选地，所述显色或发光物质与所述检测指标的单抗的摩尔比为20:1～1:200。

6.根据权利要求4或5所述的测试卡，其中，所述显色或发光物质包括胶体金、胶体碳、有机荧光染料和荧光微球中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的测试卡，其中，所述显色或发光物质为激发波长与发射波长不互相干扰的掺杂无机荧光染料的荧光微球，其可采用紫外光激发，可见光发射，采用化学交联的方法将其与所述检测指标的抗体相连；

优选地，该荧光微球为掺杂含铕无机荧光染料的荧光微球。

8.根据权利要求4所述的测试卡，其中，所述硝酸纤维膜设有的检测带及质控带是采用划线操作制得的；

用于制作所述检测带的试剂为检测指标与载体蛋白连接形成的抗原的溶液，该抗原的浓度为0.01～10mg/ml；优选地，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、血蓝蛋白、钙网蛋白、人血清白蛋白或多聚赖氨酸；

用于制作所述质控带的试剂为抗所述检测指标的单抗的二抗的溶液，该二抗的浓度为0.01～10mg/ml。

9.一种免疫层析的方法，其中，所述方法使用权利要求1～8中任一项所述的测试卡。

10.一种硝基酪氨酸的检测方法，其中，所述检测方法使用权利要求1～8中任一项所述的测试卡；

优选地，所述检测方法用于定量检测试样中硝基酪氨酸，其包括如下步骤：

(a)在所述测试卡的样品垫上加样并进行层析；

(b)待层析完后，检测检测带以及质控带的荧光强度，并计算检测值，所述检测值为检测带荧光强度绝对值及质控带荧光强度绝对值之和与检测带荧光强度绝对值的比值，并将所得检测值代入标准曲线计算样品的硝基酪氨酸浓度；

当所述防潮薄层为不透光材料时，移去所述防水薄层检测检测带以及质控带的荧光强度；

当所述防潮薄层为透光材料时，带有所述防水薄层直接检测检测带以及质控带的荧光强度；

所述标准曲线为采用浓度范围在100～3000ng/ml的系列浓度的硝基酪氨酸溶液按照步骤(a)及(b)测得系列检测值，并采用所得检测值对浓度进行线性拟合而得。