CN105603051B

CN105603051B - 胱天蛋白酶募集域蛋白9的新用途

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Publication number: CN105603051B
Application number: CN201410614227.5A
Authority: CN
Inventors: 徐萍; 杨志文; 王静; 翁成钊; 孟潇潇
Original assignee: Shanghai Songjiang District Center Hospital
Current assignee: Shanghai Songjiang District Center Hospital
Priority date: 2014-11-04
Filing date: 2014-11-04
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2034-11-04
Also published as: CN105603051A

Abstract

本发明涉及胱天蛋白酶募集域蛋白9的新用途。本发明一方面公开了胱天蛋白酶募集域蛋白9作为生物标志物在制备诊断急性胰腺炎严重程度的试剂盒中的用途。另一方面，本发明还公开了一种诊断急性胰腺炎严重程度的试剂盒。本发明以胱天蛋白酶募集域蛋白9为指标诊断急性胰腺炎严重程度，相比RANSON评分的敏感性更高。

Description

胱天蛋白酶募集域蛋白9的新用途

技术领域

本发明涉及生物技术及医药领域，具体涉及胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)的新用途。

背景技术

急性胰腺炎(AP)是常见的急腹症之一，常伴发全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征，严重危及患者生命。因此，早期诊断和预测胰腺炎的严重程度具有十分重要的临床意义。

20世纪70年代初，Ranson在研究了100名急性胰腺炎患者入院48小时的情况后，提出了Ranson评分系统。该评分系统包括入院时的5项临床指标和48小时的6项指标各项1分，合计11分，评分在3分以上时即为重症胰腺炎。3分以下病死率0.9％，3-4分为16％，5-6分为40％，6分以上为100％。Ranson评分系统在重症胰腺炎的诊疗过程中曾发挥了很大的作用，但对比CT等影像学检查发现其敏感性不高。

迄今为止，急性胰腺炎起始和发展的确切发病机制仍未完全阐明。而单核巨噬细胞系统的激活已被证实是AP发展的最初事件的启动因子，在多器官功能衰竭发展过程中是重要的病理生理步骤。CARD9是在巨噬细胞内高度表达的一种新型衔接蛋白，CARD9在抗微生物感染的天然免疫反应发挥着重要作用，而重症急性胰腺炎(SAP)病程早期的特点无菌性炎症，因此CARD9在急性胰腺炎发病期早是否起着作用是未知的。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了胱天蛋白酶募集域蛋白CARD9的新用途及相应检测急性胰腺炎严重程度的试剂盒。

本发明检测了AP患者外周血单核细胞中的CARD9mRNA和蛋白的表达，惊奇地发现，AP外周血单核细胞中CARD9mRNA和蛋白的表达在入院24小时内高于健康对照组,尤其是SAP患者CARD9mRNA和蛋白表达明显高于健康对照组和MAP(轻症AP)组，提示早期检测CARD9可能有助于判断AP病情，CARD9水平越高，病情越严重。

本发明首先提供了CARD9作为生物标志物在制备诊断急性胰腺炎严重程度的试剂盒中的用途。

所述诊断急性胰腺炎严重程度的试剂盒以检测CARD9的mRNA表达水平或CARD9蛋白表达水平为检测指标。

当以检测CARD9的mRNA表达水平为检测指标时，所述试剂盒至少包括CARD9的特异性引物、内参引物、阴性对照和阳性对照。

进一步的，所述试剂盒还应当包括正常对照。

在获得CARD9的特异性引物的情况下，可配合常规的外周血单核细胞提取试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、real time PCR试剂，通过从样本中分离出外周血单核细胞，进一步提取外周血单核细胞的RNA，经反转录和real time PCR的方法来检测CARD9的mRNA的表达水平。

当以检测CARD9蛋白表达水平为检测指标时，所述试剂盒至少包括CARD9的单克隆抗体。

在获得CARD9的单克隆抗体的情况下，可配合常规的western blot试剂、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用western blot检测CARD9蛋白表达水平。

考虑CARD9蛋白表达滞后于基因层次表达，且SAP患者CARD9高表达，虽然治疗后，mRNA表达有所下降仍高于正常水平，故蛋白表达仍然处于高水平。所以认为选择CARD9的mRNA表达比蛋白表达能更准确评估急性胰腺炎严重程度。

本发明还进一步公开了一种诊断急性胰腺炎严重程度的试剂盒，所述试剂盒包括CARD9的特异性引物、内参引物、阴性对照和阳性对照。

进一步的，所述试剂盒还应当包括正常对照。

如实施例列举的，所述CARD9的特异性引物为：

上游引物：5’－GCAGGTGTTCCAGTGTGAG－3’(SEQ ID NO:1)

下游引物5’－GGCAGCCTTTGTCTGAGAG－3’(SEQ ID NO:2)

内参选用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，所述内参引物为：

上游引物5’－AATCCCATCACCATCTTC－3’(SEQ ID NO:3)

下游引物5’－AGGCTGTTGTCATACTTC－3’(SEQ ID NO:4)

内参引物亦可选择β-actin的引物。

所述阴性对照为：DEPC去离子水

所述阳性对照为：构建的CARD9基因质粒DNA

所述正常对照为：健康成人的静脉血

进一步的，所述试剂盒中还可以包括以下试剂中的一项或多项：人外周血单核细胞提取试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、除引物以外的PCR试剂。

所述人外周血单核细胞提取试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、除引物以外的PCR试剂均为现有技术。

所述人外周血单核细胞提取试剂可采用常规，如Ficol l淋巴细胞分离液、PBS缓冲液、细胞培养基等。

所述RNA提取试剂可采用常规，如Trizol(或RNAIso Plus)、氯仿、异丙醇、75％的乙醇、去离子水等。

所述逆转录试剂可采用常规，如PrimeScript 1st Strand Cdna Synthesis Kit等。

所述除引物以外的PCR试剂一般包括：Taq酶、dNTPs、荧光染料(如SYBR Green染料等)、Mg²⁺及PCR缓冲液等。均为常见组分，其用量亦为常规。

以上PCR试剂可与引物一起配置成PCR扩增反应液，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入引物及染料配置获得。

具体的，基于本发明，可采用下列方法诊断急性胰腺炎严重程度：

(1)提取人外周血单核细胞：使用Ficol l淋巴细胞分离液按照密度梯度离心法分人外周血单核细胞。

(2)提取外周血总RNA：使用Trizol提取外周血单核细胞中总RNA。

(3)逆转录：

(4)荧光定量PCR。

(5)根据荧光定量PCR检测的CARD9水平，相比健康对照，CARD9水平越高则急性胰腺炎越严重。

本发明基于CARD9的表达与急性胰腺炎严重程度的关联的揭示，提供了早期检测急性胰腺炎严重程度的新方法。采用本发明的方法及试剂盒诊断急性胰腺炎严重程度，相比RANSON评分的敏感性更高。

附图说明

图1离心管中PBMC沉淀加入1ml PBS液吹打均匀后接种于Φ60mm玻璃培养平皿(40×10倍镜下)

图2CARD9蛋白在急性胰腺炎中的表达。*SAP组与正常组相比P<0.05；#MAP组入院第三天与SAP组相比P<0.05,##MAP组入院第五天与SAP患者相比P<0.05。

图3CARD9mRNA在急性胰腺炎的表达。*与正常组相比P<0.05；#AP患者入院第五天与第一天相比P<0.05；##SAP与MAP入院第一天相比P<0.05。

图4AP患者入院后第一天CARD9mRNA表达水平、RANSON评分、LDH、血淀粉酶的ROC曲线

具体实施方式

以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1试剂盒的制备

将以下试剂装配成试剂盒：

1)CARD9的特异性引物对：

上游引物：5’－GCAGGTGTTCCAGTGTGAG－3’

下游引物5’－GGCAGCCTTTGTCTGAGAG－3’

2)内参引物对：

上游引物5’－AATCCCATCACCATCTTC－3’

下游引物5’－AGGCTGTTGTCATACTTC－3’

3)阴性对照：DEPC去离子水

4)阳性对照：构建CARD9基因质粒DNA

4.1引物设计：

从GenBank中查询目的基因上下游的序列，用Vector NTI软件进行引物设计。

引物序列为：

上游引物：5’－GCAGGTGTTCCAGTGTGAG－3’

下游引物5’－GGCAGCCTTTGTCTGAGAG－3’

模板来源：正常人外周血单核细胞

PCR扩增目的片段：

使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的片段，反应体系和条件如下：

PCR反应条件：98℃10秒55℃5秒72℃1分钟/kb 30个循环

4.2琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：

目的片段PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过和DNA Marker的对比，目标片段大小为：62.3kb，判断目的片段扩增成功。

4.3胶回收目的片段：

把目的片段条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBESTAgaroseGel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。

4.4线性化表达载体的制备：

用限制性内切酶使用EcoRI和BamHI双酶切(构建好以后的Card9的C端带有3Flag标签)或者用限制性内切酶EcoRI和Xba I双酶切(构建好以后的Card9的C端不带标签)，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction KitVer.3.0做胶回收。

4.5目的片段同源重组到线性化表达载体中：

将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应：

混匀后在42℃孵育30min，然后转移到冰上。放置2-3min后取10μl反应液体转化到感受态细胞中。

4.6感受态细胞的制备和转化：

DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》。

4.7菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

引物序列：

上游引物：5’－GCAGGTGTTCCAGTGTGAG－3’

下游引物5’－GGCAGCCTTTGTCTGAGAG－3’

PCR反应条件：98℃10秒55℃5秒72℃1分钟/kb 30个循环

4.8阳性克隆送测序：

菌落鉴定得到的阳性克隆，送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析符合预期。

4.9质粒小提：

测序通过的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书获得CARD9基因质粒DNA。

5)Ficoll淋巴细胞分离液

6)TrizolRNA提取试剂

7)逆转录试剂

8)PCR试剂：dNTP、Mg²⁺、PCR反应液、DNA聚合酶、水

试剂盒中应至少含有1)-4)项，其余试剂由于是通用试剂，因此可以不必装配入试剂盒而是与现有的试剂配合使用。

试剂盒中正常对照亦可由使用者自行采集。

按以下步骤使用该试剂盒：

1)用Ficoll淋巴细胞分离液按Ficoll密度梯度法从样本中分离PBMC；

2)按Trizol提取外周血单核细胞中的总RNA；

3)采用逆转录试剂将总RNA逆转录为cDNA；

4)Real-time PCR可在7300实时荧光定量PCR仪(ABI)上进行，采用两步法，进行引物扩增，反应条件为:预变性95℃10min,然后按95℃15s，60℃45s，进行40个循环。GAPDH为内参，将目的基因Ct值减去内参Ct值作为△Ct值，mRNA相对定量是用2^-△△CT表示。其中△△CT＝△CT_实验组-△CT_对照组；而△CT＝△CT_目的基因-△CT_内参。

实施例1CARD9与AP严重程度的关联试验

1材料与方法

1.1主要试剂：Ficol l淋巴细胞分离液购自GE Healthcare，实时荧光定量PCR(real-time PCR)相关试剂购自Thermo，逆转录试剂盒购自Thermo，Trizol购自invitrogen，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，CARD9抗体购自Santa，羊抗鼠HRP标记二抗购自碧云天生物公司，蛋白提取试剂盒购自凯基生物公司，BCA蛋白定量试剂盒购自thermo。

1.2研究对象：选取2013年2月至2014年5月医院收治的AP患者36例作为研究对象，均符合中国急性胰腺炎诊治指南(草案)中的临床诊断及AP分类标准(中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组.中国急性胰腺炎诊治指南(草案)[J].中华消化杂志,2004,24(3):62-64)，以同期20名健康志愿者作为正常对照(正常对照组)，其中男性9例，女性11例；平均年龄39.25±3.64岁。所有患者均未在外院接受过治疗，入院后均接受内科治疗，治疗方法参照指南(中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组.中国急性胰腺炎诊治指南(草案))^]，均给予禁食、补液、抑制胰酶分泌等常规治疗，根据感染情况予以抗感染治疗。各组在年龄、性别构成上均无统计学差异。实验均得到所有观察对象同意后进行，且所有患者及健康志愿者的均签署知情同意书。

1.3方法：

1.3.1外周血单核细胞提取：经患者同意后，分别于入院后第一天、入院第三天、入院第五天清晨空腹抽取MAP患者静脉血10ml，EDTA抗凝；健康体检志愿者只抽取一次静脉血10ml，EDTA抗凝。用Ficoll淋巴细胞分离液按Ficoll密度梯度法分离PBMC(图1)。PBMC分成两份，一份是加入trizol后，冻存在-70℃，然后统一再行外周血总RNA提取；另一部分是加入细胞快速裂解液、蛋白酶抑制剂等冻存在-70℃，然后统一进行Western blot检测蛋白含量。

1.3.2外周血总RNA提取及外周血单核细胞CARD9mRNA表达检测：按Trizol提取外周血单核细胞中的总RNA，按逆转录试剂盒操作说明书将总RNA逆转录为cDNA。Real-timePCR在7300实时荧光定量PCR仪(ABI)上进行，采用两步法，进行引物扩增。CARD9上游引物：5’－GCAGGTGTTCCAGTGTGAG－3’,下游引物5’－GGCAGCCTTTGTCTGAGAG－3’,GAPDH上游引物5’－AATCCCATCACCATCTTC－3’,下游引物5’－AGGCTGTTGTCATACTTC－3’,加入荧光染料。PCR体系：

试剂	体积
		SYBR Premix Ex Taq	10μl
上游引物	0.8μl
		下游引物	0.8μl
Template	2μl
		dH2O	6.4μl

将来自样本的外周血cDNA、对照、阳性对照分别作为模板进行PCR

反应条件为:预变性95℃10min,然后按95℃15s，60℃45s，进行40个循环。GAPDH为内参，将目的基因Ct值减去内参Ct值作为△Ct值，不同标本采用2-△△Ct值进行比较，表示mRNA的相对表达量。

1.3.3Western blot检测CARD9蛋白含量：收集的PBMC经细胞快速裂解液后提取蛋白，然后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、封闭、加入一抗、4℃过夜、加入二抗、ECL化学放光试剂发光，并显色。Quantity One软件分析蛋白条带。目的蛋白定量采用灰度比值(CARD9/GAPDH)进行计算。

1.4统计学分析

应用SPSS 20.0软件包进行统计学分析，采用GraphPad Prism5软件作图。正太分布数据用均数±标准误表示，偏态分布采用M(P25，P75)表达，两组间比较采用非参数检验Mann Whitney分析，多组间比较采用非参数检(Kruskal-Wal l is单因素ANOVA检验)。Pearson方法进行相关性分析，ROC曲线分析急性胰腺炎病情评估的准确性、敏感度及特异性，计算曲线下面积，最佳截值，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1AP患者的一般情况

急性胰腺炎患者的一般情况(表1)，MAP患者均被治愈，而10例SAP患者1例死亡，其余均被治愈。MAP组、SAP组、正常对照组三组间性别构成、平均年龄差异无统计学意义(P>0.05)。SAP组Ranson评分、LDH明显高于MAP组，差异有统计学意义(P<0.05)，SAP组血钙明显低于MAP组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1急性胰腺炎患者的临床资料

*M(P25，P75)表达，#SAP组与MAP组相比P<0.05。

2.2AP患者外周血单核细胞CARD9蛋白表达的变化

CARD9蛋白的表达在MAP患者入院后第一天、第三天外周血单核细胞中的表达高于正常对照组，但差别无统计学意义(P>0.05)，SAP组患者CARD9蛋白的表达明显高于正常对照组，差别有统计学意义(P<0.05)。SAP组CARD9蛋白的表达在患者入院第一天、第三天、第五天表达显著高于MAP组，其中SAP组入院第三天、第五天分别与MAP组入院第三天、第五天相比，差别有统计学意义(P<0.05)，(图2)。

2.3AP患者外周血单核细胞CARD9mRNA水平的变化

提取外周血单核细胞总RNA，通过Real-Time PCR检测CARD9mRNA的变化。结果显示：MAP患者和SAP患者入院后第一天、第三天外周血单个核细胞中CARD9mRNA表达显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，MAP和SAP患者入院后第一天外周血单个核细胞中CARD9mRNA表达显著高于入院后第五天的表达水平(P<0.05)，所有AP患者经过治疗后CARD9mRNA表达水平逐渐下降，在入院第五天后CARD9mRNA表达仍高于正常对照组，但与正常对照组无显著性差异,且SAP组CARD9mRNA在入院时表达显著高于MAP组(P<0.05)，在入院5天后，SAP组与MAP组无明显差异(P>0.05)(图3)。

2.4Pearson相关性分析：AP患者入院后第一天外周血单核细胞中CARD9mRNA表达水平与RANSON评分呈正相关、与有无盆腔积液并发症呈正相关，与白细胞数、血淀粉酶无明显相关(表2)

表2CARD9mRNA表达水平与患者临床资料相关性分析

2.5CARD9表达、RANSON评分、LDH的ROC分析

36例AP患者，以轻症胰腺炎患者为阴性指标，重症胰腺炎患者为阳性指标，分别做AP患者入院后第一天外周血单核细胞中CARD9mRNA表达水平、RANSON评分的ROC曲线，结果如下：急性胰腺炎患者入院后第一天外周血单核细胞中CARD9mRNA表达水平的最佳截值点是5.27，通过最佳截值点，可把出现假阳性概率降低到最低程度。

约登指数(Youden index)：是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时，即可应用约登指数。约登指数是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。取约登指数最大的点作为最佳截值点。

对一筛检方法的真实性的评价使用灵敏度、特异度和约登指数三个指标。

①灵敏度：又称敏感度，是指筛检方法能将实际有病的人正确地判定为患者的比例；

②特异度：是指筛检方法能将实际无病的人正确地判定为非患者的比例；

③约登指数：是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。

ROC曲线下的面积为0.810(P<0.01),敏感度和特异性分别为90.0％、70.0％；RANSON评分的最佳截值点是2.5，ROC曲线下的面积为0.845(P<0.01)，敏感度和特异性分别为70.0％，90.O％；LDH的最佳截值点是229，ROC曲线下的面积为0.775(P<0.05)，敏感度和特异性分别为90.0％，65.5％；以上结果显示AP患者入院后第一天外周血单核细胞中CARD9mRNA表达水平曲线下的面积低于RANSON评分，但高于血清中LDH，CARD9表达在评估急性胰腺炎病情严重程度的敏感性高于RANSON评分(图4)。

3讨论

本发明检测了AP患者外周血单核细胞中的CARD9mRNA和蛋白的表达，结果表明AP外周血单核细胞中CARD9mRNA和蛋白的表达在入院24小时内高于健康对照组,尤其是SAP患者CARD9mRNA和蛋白表达明显高于健康对照组和MAP组，提示早期检测CARD9可能有助于判断AP病情，CARD9水平越高，病情越严重。患者经过内科治疗后，CARD9mRNA和蛋白表达水平逐渐下降，MAP患者在入院后第五天CARD9mRNA和蛋白表达水平与健康正常人无明显差异，而SAP患者CARD9蛋白表达水平虽然有所降低，但仍处于较高水平，考虑CARD9蛋白表达滞后于基因层次表达，且SAP患者CARD9高表达，虽然治疗后，mRNA表达有所下降仍高于正常水平，故蛋白表达仍然处于高水平。所有认为选择CARD9的mRNA表达比蛋白表达能更准确评估急性胰腺炎严重程度。

为了进一步说明CARD9指标可作为评价急性胰腺炎严重程度的指标。本发明对实验数据进行Pearson相关分析表明：AP患者入院后第一天外周血单个核细胞中CARD9mRNA表达水平与RONSAN评分相关、与有无盆腔积液并发症相关，与白细胞数、CRP等无明显相关。

为了解CARD9表达对急性胰腺炎病情诊断的准确性、敏感度及特异性，本发明对急性胰腺炎患者外周血单核细胞CARD9表达进行ROC分析，并与RANDON评分系统、LDH进行比较。结果发现虽然CARD9表达在对预测AP病情的诊断效能略低于RANSON评分，但是在对急性胰腺炎病情严重程度判断的敏感性高于传统RANSON评分。提示CARD9表达可作为评估急性胰腺炎病情的预测指标。血清LDH升高可反映细胞损害，可作为胰腺坏死的敏感标志物(Shinzeki M，Ueda T，Takeyama Y，et a1.Prediction of early deathinsevereacutepancreatitis[J].J Gastroenterol，2008，43(2):152—158)，本发明研究发现CARD9指标、RANSON评分在评估AP病情严重程度上诊断效能高于LDH。

综上所述，急性胰腺炎外周血单核细胞中CARD9在AP发病早期显著增高，并与病情严重程度相关，早期检测胰腺炎外周血单核细胞中CARD9有助于为AP的诊断和病情严重程度的判断提供依据。

Claims

1.CARD9基因表达水平的检测物或CARD9蛋白表达水平的检测物在制备诊断急性胰腺炎严重程度的试剂盒中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断急性胰腺炎严重程度的试剂盒以检测CARD9的mRNA表达水平或CARD9蛋白表达水平为检测指标。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断急性胰腺炎严重程度的试剂盒包括检测CARD9的特异性引物、内参引物、阴性对照和阳性对照。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括正常对照。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述检测CARD9的特异性引物为：

上游引物：5’－ GCAGGTGTTCCAGTGTGAG－3’

下游引物： 5’－GGCAGCCTTTGTCTGAGAG－3’。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述内参引物为检测GAPDH或β-actin的引物。

7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述阴性对照为DEPC去离子水，所述阳性对照为包含CARD9基因的质粒DNA。

8.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中还包括以下试剂中的一项或多项：人外周血单核细胞提取试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、除引物以外的PCR试剂。